胰岛素脂质体冻干粉、 口服胰岛素复合制剂及其制备方法 与应用 技术领域 本发明涉及一种用于治疗 II 型糖尿病的胰岛素脂质体冻干粉、 口服胰岛素复合 制剂及其制备方法与应用。
背景技术
胰岛素作为降血糖的生化药用于治疗糖尿病已有近百年历史， 迄今仍为 I 型糖尿 病患者的首选药， 亦是越来越多的 II 型糖尿病患者的必不可少的药物。目前临床治疗更倾 向于对 II 型糖尿病患者尽早使用胰岛素， 这样可使胰岛素细胞得到修复， 同时更好的减少 糖尿病所引起的并发病。但由于胰岛素是多肽类药物， 会被肠胃道的蛋白水解酶降解而不 被吸收， 所以口服途径的治疗几乎是无效的， 为此， 临床常用胰岛素针剂治疗。 同时， 为了避 免外周给药的不便与不良影响， 以及单纯用降糖药带来的并发病， 国内外各大机构均设计 了各种非注射的胰岛素制剂， 尤其以各种方式包埋的口服胰岛素为主， 但现有采用包埋方 式生产的胰岛素仍普遍存在包埋率低、 稳定性不好， 难达成工业化生产等弱点。发明内容 本发明要解决的技术问题是提供一种包埋率高的胰岛素脂质体冻干粉和一种含 有该胰岛素脂质体冻干粉的治疗 II 型糖尿病的口服胰岛素复合制剂， 该口服胰岛素复合 制剂稳定性好、 便于工业化生产。
一种胰岛素脂质体冻干粉， 其按照以下步骤制备 ：
1) 将胰岛素加入到 0.01-0.02M 的 HCl 水溶液中充分溶解， 使胰岛素的浓度为 2.6-3.4g/l， 再加入 pH 为 6.5-7.5、 0.1-0.2M 的磷酸盐缓冲液混合均匀， 使胰岛素的浓 度达到 0.34-0.45g/l， 再加入浓度为 0.01-0.02g/ml 胆酸钠溶液， 使胰岛素的浓度达到 0.33-0.43g/l， 得到水相混合液 ；
2) 将质量比为 1 ∶ (1-3) 的胆固醇和卵磷脂的混合物共溶于无水乙醇中， 充分 溶 解 混 合 均 匀， 使 混 合 物 的 浓 度 为 0.018-0.025g/ml， 再 加 上 浓度 为 0.01-0.02g/ml 的 甘露醇水溶液， 使胆固醇和卵磷脂的混合物浓度达到 0.011-0.013g/ml， 再加入浓度为 0.01-0.02g/ml 的胆酸钠溶液， 使胆固醇和卵磷脂的混合物浓度达到 0.011-0.012g/ml， 将 所得液体放置于高压均质机均质 10-30min， 得到油相混合液 ；
3) 将体积比为 (1.3-2.9) ∶ 1 的水相混合液与油相混合液在容器中混合均匀并放 置在 2-6℃的水浴中 2-4 小时后， 减压蒸馏除去无水乙醇， 得到浓缩液 ；
4) 将浓缩液冷冻干燥后得到胰岛素脂质体冻干粉。
本发明胰岛素脂质体冻干粉， 其按照以下步骤制备 ：
1) 将胰岛素加入到 0.01M 的 HCl 水溶液中充分溶解， 使胰岛素的浓度为 2.9g/l， 再加入 pH 为 7.0、 0.2M 的磷酸盐缓冲液混合均匀， 使胰岛素的浓度达到 0.42g/l， 再加入浓 度为 0.01g/ml 胆酸钠溶液， 使胰岛素的浓度达到 0.40g/l， 得到水相混合液 ；
2) 将质量比为 1 ∶ 3 的胆固醇和卵磷脂的混合物溶于无水乙醇中， 充分溶解混合 均匀， 使混合物的浓度为 0.020g/ml， 再加上浓度为 0.02g/ml 的甘露醇水溶液， 使胆固醇和 卵磷脂的混合物浓度达到 0.0125g/ml， 再加入浓度为 0.01g/ml 的胆酸钠溶液， 使胆固醇和 卵磷脂的混合物浓度达到 0.011g/ml， 将所得液体放置于高压均质机均质 10-30min， 得到 油相混合液 ；
3) 将体积比为 2.7 ∶ 1 的水相混合液与油相混合液在容器中混合均匀并放置在 2-6℃的水浴中 2-4 小时后， 减压蒸馏除去无水乙醇， 得到浓缩液 ；
4) 将浓缩液冷冻干燥后得到胰岛素脂质体冻干粉。
一种治疗 II 型糖尿病的口服胰岛素复合制剂， 包括按重量份计的以下组分 ：
上述胰岛素脂质体冻干粉 ： 1份；
葛根 ： 4-13 份 ；
天花粉 ： 9-29 份 ；
地黄 ： 5-15 份 ；
人参 ： 1-3 份 ；
黄芪 ： 3-9 份 ；
山药 ： 3-10 份。
本发明治疗 II 型糖尿病的口服胰岛素复合制剂， 包括按重量份计的以下组分 ：
权利要求 1 或 2 所述的胰岛素脂质体冻干粉 ： 1份；
葛根 ： 8份；
天花粉 ： 16 份 ；
地黄 ： 10 份 ；
人参 ： 2份；
黄芪 ： 6份；
山药 ： 6 份。
一种治疗 II 型糖尿病的口服胰岛素复合制剂的制备方法， 包括以下步骤 ： 按比例 称取口服胰岛素复合制剂中的各组分并混合均匀， 粉碎过 80 目筛， 湿法制粒， 将湿颗粒于 60 ～ 70℃烘干， 干颗粒用 20 目筛整粒， 灌装成胶囊。
上述胰岛素脂质体冻干粉在制备治疗 II 型糖尿病的药物中的应用。
上述口服胰岛素复合制剂在制备治疗 II 型糖尿病的药物中的应用。
本发明添加葛根、 天花粉、 地黄、 人参、 黄芪、 山药中药材作为辅料， 其中 ：
葛根 ： 味甘、 辛， 凉； 归脾、 胃经。 功能与主治 ： 解肌退热， 生津， 透疹， 升阳止泻。 《本 草纲目》 载： 葛根， 性凉、 气平、 味甘， 具清热、 降火、 排毒诸功效。
天花粉 ： 生津， 止渴， 降火， 润燥， 排脓， 消肿。用于热病烦渴， 肺热燥咳， 内热消渴， 疮疡肿毒。 《本草备要》 ： 降火润燥， 滑痰解渴， 古方多用治消渴病 ( 即糖尿病 )。行水通经， 胃热疸黄， 口燥唇干， 肿毒发背， 乳痈疮痔。 《医林纂要》 ： 补肺， 敛气， 降火， 宁心， 兼泻肝郁， 缓肝急， 清膀胱热， 止热淋小便短数， 除阳明湿热。
地黄 ： 滋阴， 养血。治阴虚发热， 消渴， 吐血， 衄血， 血崩， 月经不调， 胎动不安， 阴伤 便秘。① 《本经》 ： 主折跌绝筋， 伤中， 逐血痹， 填骨髓， 长肌肉， 作汤除寒热积聚， 除痹。生者 尤良。② 《别录》 ： 主男子五劳七伤， 女子伤中， 胞漏下血， 破恶血， 溺血， 利大小肠， 去胃中宿食， 补五脏， 内伤不足， 通血脉， 益气力， 利耳目。③ 《药性论》 ： 补虚损， 温中下气， 通血脉， 治 产后腹痛， 主吐血不止。④ 《日华子本草》 ： 治惊悸劳劣， 心肺损， 吐血， 鼻衄， 妇人崩中血晕， 助筋骨。⑤王好古 ： 主心病， 掌中热痛， 痹气痿蹙， 嗜卧， 足下热而痛。⑥ 《本草从新》 ： 治血 虚发热， 常觉饥馁， 倦怠嗜卧。
人参 ： 大补元气， 固脱生津， 安神。 《医学启源》 记录 ： 人参治脾胃阳气不足及肺气 促， 短气、 少气， 补中缓中， 泻肺脾胃中火邪。 《主治秘要》 记录 ： 人参补元气， 止泻， 生津液。 《滇南本草》 记录 ： 人参治阴阳不足， 肺气虚弱。补气固表， 利尿托毒， 排脓， 敛疮生肌。用于 气虚乏力， 食少便溏， 中气下陷， 久泻脱肛， 便血崩漏， 表虚自汗， 气虚水肿
黄芪 ： 痈疽难溃， 久溃不敛， 血虚痿黄， 内热消渴 ； 慢性肾炎蛋白尿， 糖尿病。
山药 ： 补脾养胃， 生津益肺， 补肾涩精。 用于脾虚食少， 久泻不止， 肺虚喘咳， 肾虚遗 精， 带下， 尿频， 虚热消渴。
本发明提供的胰岛素脂质体冻干粉的包埋率高， 胰岛素的包埋率均在 90％以上 ； 含有该胰岛素脂质体冻干粉的口服胰岛素复合制剂稳定性好， 保存 24 个月后， 口服胰岛素 复合制剂中的胰岛素含量仍保持了 99％以上， 而胰岛素脂质体的包埋率与 0 个月时相比， 仅降低了 2％左右， 说明包埋在脂质体中的胰岛素泄露的情况不显著 ； 由于包埋率高、 稳定 性好使得该口服胰岛素复合制剂便于工业化生产。 胰岛素脂质体包埋过程在做包膜的过程 中选用无水乙醇作为溶剂较用乙醚、 氯仿作为溶剂毒副作用小， 且形成包膜与胰岛素溶液 结合力强。 具体实施方式 实施例 1 胰岛素脂质体冻干粉的制备
1) 将 100mg 胰岛素加入 30ml 0.01M 的 HCl 水溶液中充分溶解， 再加入 200ml 的 pH6.5、 0.1M 的磷酸盐缓冲液混合均匀， 再加入 10ml 浓度为 0.01g/ml 胆酸钠溶液混合均匀， 得到水相混合液 ；
2) 将胆固醇 0.5g、 卵磷脂 0.5g 共溶于 40ml 无水乙醇中， 充分溶解混合均匀， 再加 上 40ml 浓度为 0.01g/ml 的甘露醇溶液和 10ml 浓度为 0.01g/ml 的胆酸钠溶液， 将所得液 体放置于高压均质机均质 10min， 得到油相混合液 ；
3) 将上述水相混合物和油相混合物倒入容器中混合均匀并放在 2℃的水浴中 2 小 时后， 减压蒸去无水乙醇， 得到浓缩液 ；
4) 将浓缩液冷冻干燥后得到胰岛素脂质体冻干粉。
实施例 2 口服胰岛素复合制剂的制备
按重量份计， 将实施例 1 所得胰岛素脂质体冻干粉作为 1 份， 再加入 4 份葛根、 9份 天花粉、 5 份地黄、 1 份人参、 3 份黄芪、 3 份山药混合均匀， 粉碎过 80 目筛， 湿法制粒， 将湿颗 粒于 60℃烘干， 干颗粒用 20 目筛整粒， 灌装成胶囊。
实施例 3 胰岛素脂质体冻干粉的制备
1) 将 400mg 胰岛素加入 150ml 0.02M 的 HCl 水溶液中充分溶解， 再加入 1000ml、 pH7.5 的 0.2M 磷酸盐缓冲液混合均匀， 再加入 60ml 浓度为 0.02g/ml 胆酸钠溶液混合均匀， 得到水相混合液 ；
2) 将胆固醇 2.5g、 卵磷脂 7.5g 共溶于 450ml 无水乙醇中， 充分溶解混合均匀， 再
加上 400ml 浓度为 0.02g/ml 的甘露醇溶液和 40ml 浓度为 0.02g/ml 的胆酸钠溶液， 将所得 液体放置于高压均质机均质 30min， 得到油相混合液 ；
3) 将上述所得水相混合液和油相混合液倒入容器中混合均匀并放置在 6℃的水 浴中 4 小时后， 减压蒸去无水乙醇， 得到浓缩液 ；
4) 将浓缩液冷冻干燥后得到胰岛素脂质体冻干粉。
实施例 4 口服胰岛素复合制剂的制备
按重量份计， 将实施例 3 所得胰岛素脂质体冻干粉作为 1 份， 再加入 13 份葛根、 29 份天花粉、 15 份地黄、 3 份人参、 9 份黄芪、 10 份山药混合均匀， 粉碎过 80 目筛， 湿法制粒， 将 湿颗粒于 70℃烘干， 干颗粒用 20 目筛整粒， 灌装成胶囊。
实施例 5 胰岛素脂质体冻干粉的制备
1) 将 200mg 胰岛素加入 70ml 0.01M 的 HCl 水溶液中充分溶解， 再加入 400ml、 pH7.0 的 0.2M 磷酸盐缓冲液混合均匀， 再加入 20ml 浓度为 0.01g/ml 胆酸钠溶液混合均匀， 得到水相混合液 ；
2) 将胆固醇 0.5g、 卵磷脂 1.5g 共溶于 100ml 无水乙醇中， 充分溶解混合均匀， 再 加上 60ml 浓度为 0.02g/ml 的甘露醇溶液和 20ml 浓度为 0.01g/ml 的胆酸钠溶液， 将所得 液体放置于高压均质机均质 20min， 得到油相混合液 ； 3) 将上述所得水相混合液和油相混合液倒入容器中混合均匀并放置在 6℃的水 浴中 3 小时后， 减压蒸去无水乙醇， 得到浓缩液 ；
4) 将浓缩液冷冻干燥后得到胰岛素脂质体冻干粉。
实施例 6 口服胰岛素复合制剂的制备
按重量份计， 将实施例 5 所得胰岛素脂质体冻干粉作为 1 份， 再加入 8 份葛根、 16 份天花粉、 10 份地黄、 2 份人参、 6 份黄芪、 6 份山药混合均匀， 粉碎过 80 目筛， 湿法制粒， 将 湿颗粒于 65℃烘干， 干颗粒用 20 目筛整粒， 灌装成胶囊。
实施例 7 胰岛素脂质体冻干粉的制备
1) 将 270mg 胰岛素加入 100ml 0.01M 的 HCl 水溶液中充分溶解， 再加入 500ml、 pH7.0 的 0.1M 磷酸盐缓冲液混合均匀， 再加入 30ml 浓度为 0.01g/ml 胆酸钠溶液混合均匀， 得到水相混合液 ；
2) 将胆固醇 1.5g、 卵磷脂 1.5g 共溶于 160ml 无水乙醇中， 充分溶解混合均匀， 再 加上 80ml 浓度为 0.01g/ml 的甘露醇溶液和 30ml 浓度为 0.01g/ml 的胆酸钠溶液， 将所得 液体放置于高压均质机均质 20min， 得到油相混合液 ；
3) 将上述所得水相混合液和油相混合液倒入容器中混合均匀并放置在 6℃的水 浴中 3 小时后， 减压蒸去无水乙醇， 得到浓缩液 ；
4) 将浓缩液冷冻干燥后得到胰岛素脂质体冻干粉。
实施例 8 口服胰岛素复合制剂的制备
按重量份计， 将实施例 7 所得胰岛素脂质体冻干粉作为 1 份， 再加入 8 份葛根、 16 份天花粉、 10 份地黄、 2 份人参、 6 份黄芪、 6 份山药混合均匀， 粉碎过 80 目筛， 湿法制粒， 将 湿颗粒于 65℃烘干， 干颗粒用 20 目筛整粒， 灌装成胶囊。
实施例 9 胰岛素脂质体冻干粉的胰岛素包埋率检测
精确称取实施例 2、 4、 6 和 8 中所得胶囊的内容物各 2.5g， 分别加入三蒸水 10ml
使内容物均匀分散且使冻干粉溶解， 在低温离心机中 4℃、 12000rpm 分别离心 10min 去除中 药粉末， 取上清液， 分别用截留分子量为 12000 的滤膜进行超滤， 游离胰岛素溶液可通过滤 膜， 分别测量各游离胰岛素溶液体积， 依中华人民共和国药典 2010 年版二部胰岛素检验方 法采用 HPLC 法测定游离胰岛素浓度， 色谱条件如下。包埋率＝ (1- 游离胰岛素浓度 × 游 离胰岛素溶液体积 / 总胰岛素质量 )×100％， 其中总胰岛素质量是指在实施例 1、 3、 5、 7中 进行包埋时， 投入包埋体系中总的胰岛素质量。包埋率检测结果见表 1。
色谱条件 ： 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 ； 以 0.2mo l/L 硫酸盐缓冲液 ( 取 无水硫酸钠 28.4g， 加水溶解后， 加磷酸 2.7ml、 水 800ml， 用乙醇胺调节 pH 值至 2.3， 加水至 1000ml)- 乙腈 ( 体积比 74 ∶ 26)) 为流动相， 流速为 1.0ml/min ； 柱温为 40 ℃ ； 检测波长 214nm。
表 1 胰岛素脂质体冻干粉包埋率检测结果
样品 实施例 2 实施例 4 实施例 6 实施例 8
包埋率 91.7％ 91.2％ 92.0％ 91.5％结果表明 ： 胰岛素脂质体冻干粉中能够包埋 90％以上的胰岛素， 包埋率高。
实施例 10 口服胰岛素复合制剂中胰岛素稳定性的检测
将实施例 2、 4、 6 和 8 中所得口服胰岛素复合制剂置于温度 25±2 ℃、 湿度 60 ％ ±10％的条件下保存， 于 0、 3、 6、 9、 12、 18、 24 个月分别取样。精确称取实施例 2、 4、 6和8中 所得胶囊的内容物各 2.5g， 加入 10ml 的 0.1mol/L 盐酸水溶液使内容物均匀分散且使冻干 粉溶解， 将其静置过夜使脂质体破裂， 在低温离心机中 4℃、 12000rpm 分别离心 10min 去除 中药粉末， 取上清液， 分别测量各上清液体积， 依中华人民共和国药典 2010 年版二部胰岛 素检验方法采用 HPLC 法测定上清液中胰岛素浓度。保留的胰岛素含量百分比＝上清液中 胰岛素浓度 × 上清液体积 / 总胰岛素质量 ×100％， 其中总胰岛素质量是指在实施例 1、 3、 5、 7 中进行包埋时， 投入包埋体系中总的胰岛素质量。具体检验结果见表 2。
表 2 口服胰岛素复合制剂中胰岛素稳定性检测结果
保存 24 个月后， 口服胰岛素复合制剂中的胰岛素仍非常稳定， 保留的胰岛素在 99％以上。
实施例 11
将实施例 2、 4、 6 和 8 中所得口服胰岛素复合制剂置于温度 25±2 ℃、 湿度 60 ％ ±10％的条件下保存， 于 0、 3、 6、 9、 12、 18、 24 个月分别取样。按照实施例 9 中的方法进行胰 岛素包埋率检测， 即检测口服胰岛素复合制剂的稳定性和口服胰岛素复合制剂中脂质体的 稳定性， 看是否存在因口服胰岛素复合制剂中脂质体不稳定， 导致所包埋的胰岛素泄露变 为游离胰岛素的情况， 结果见表 3。
表 3 胰岛素包埋率稳定性试验
结果表明 ： 口服胰岛素复合制剂保存 24 个月后， 胰岛素包埋率同 0 个月时相比， 只 降低了 2％左右， 说明脂质体的稳定性好、 口服胰岛素复合制剂稳定性好。
实施例 12 口服胰岛素复合制剂对 II 型糖尿病 SD 大鼠模型的降糖实验
1、 受试药物 ： 实施例 8 制备的口服胰岛素复合制剂 ； 阳性对照 ： 降糖宁胶囊， 规格 ： 0.4g/ 粒。
2、 实验动物 ： 雄性 SPF 级 wistar 大鼠 50 只， 180-200g， 山东大学实验动物中心提 供， 合格证号 ： SCXK( 鲁 )2003004， NO.0006088。
3、 实验设计及分组 ：
1) 动物模型 ： 大鼠购进后适应性饲养 3 天， 随机抽取 10 只测定正常血糖值， 于禁
食 24h 后腹腔注射链脲佐菌素 50mg/kg( 溶于浓度为 0.01g/ml 的柠檬酸水溶液 )。注射后 72h 断尾法测定空腹血糖一次， 剔除造模不成功大鼠。
2) 实验分组 ： 将塑造、 筛选好的合格大鼠按照血糖值和体重均衡随机分为模型对 照组、 降糖宁组和受试药高、 中、 低剂量组， 共计 5 组， 每组 9 只。
3) 给药途径 ： 口服
4) 给 药 剂 量 ： 降 糖 宁 胶 囊， 大 鼠 的 临 床 等 效 量 为 0.648g/kg， 给药前配置成 0.0648g/ml， 以 10ml/kg 灌胃。口服胰岛素复合制剂 ： 实施例 8 中制备的口服胰岛素复合 制剂 4mg ＝ 1IU， 受试药高、 中、 低剂量组的剂量定为口服胰岛素复合制剂临床等效量的 4、 2、 1 倍， 即： 28.8mg/kg， 14.4mg/kg， 7.2mg/kg。给药前分别配制成 2.88mg/ml， 1.44mg/ml， 0.72mg/ml， 以 10ml/kg 灌胃。
5) 实验方法
5.1 给药与检测 ：
一次给药 ： 分组后次日， 禁食 2h 后给药， 测定给药后 1h、 2h、 4h、 和 8h 血糖值。
连续多天给药 ： 测定一次给药后， 继续给药 4 天， 每日禁食 2h 后给药， 每日给药一 次。于第六日， 测定禁食 2h 后血糖值。 5.2 测量指标 ： 一次给药后不同时段的血糖值和连续多天给药后的血糖值。
5.3 统计学方法 ： 所有数据以 X±s 表示， 组间采用 t 检验。
4、 实验结果 ：
1) 分组前血糖值 ：
如表 4 所示， 造模后大鼠血糖值明显升高， 与正常大鼠血糖具有非常显著地差异。 以血糖为指标分组后， 模型组及其各受试药物血糖组间无差异性。
表 4 选模后各组血糖值 (X±s， n ＝ 9)
2) 一次给药后血糖变化
断尾法分别测定各组一次给药后 1h、 2h、 4h 和 8h 的血糖值， 结果显示高、 中、 低三 个剂量组在 1-4h 明显降低大鼠血糖值， 与模型对照组比较均具有显著性差异。降糖宁对照 组也具有显著降低血糖作用， 其作用强度与低剂量组接近。结果如表 5 所示。
表 5 一次给药后各组的血糖值变化 (X±s， n ＝ 9)
3) 多天连续给药后血糖变化 连续给药 5 天后， 于第 6 天禁食 2h 后直接测定各组大鼠血糖值， 如表 6 所示。 表 6 多天连续给药后各组的血糖值变化 (X±s， n ＝ 9)
4) 疗效评价结论
通过一次性给药和多次给药， 观察复合制剂对 II 型糖尿病大鼠模型血糖值的改 变， 可以认为 ： 本口服胰岛素复合制剂口服给药对血糖具有明确的降低作用， 且有效时间内 呈现明显的量效关系 ； 多次给药后亦可维持较模型组更低的血糖水平。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述， 并非对本发明的范 围进行限定， 在不脱离本发明设计精神的前提下， 本领域普通技术人员对本发明的技术方 案作出的各种变形和改进， 均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
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