用于制备二环 γ- 氨基酸衍生物的方法 技术领域 本发明涉及二环 γ- 氨基酸衍生物或其药理学上可接受的盐。具体来讲， 本发明 涉及具有作为 α2δ 配体的活性并且对电压依赖性钙通道亚基 α2δ 有亲和力的化合物， 或 者制备所述化合物的方法。
背景技术 研究表明具有结合电压依赖性钙通道亚基 α2δ 的高亲和力的化合物对治疗例如 神经性疼痛有效 ( 参见例如非专利文献 1 和 2)。在本文中， 神经性疼痛是指由神经组织损 伤等引起的慢性疼痛， 并且是一种以患者因严重疼痛发作而患有抑郁症的方式严重损害生 命质量的疾病。
目前已知 α2δ 配体的若干类型是这类神经性疼痛的治疗药物。α2δ 配体的实 例包括加巴喷丁 (gabapentine) 和普瑞巴林。α2δ 配体 ( 例如这些化合物 ) 可用于治疗 癫痫和神经性疼痛等 ( 例如专利文献 1)。
然而， 例如对于加巴喷丁， 有报道称根据患者自评， 其治疗疱疹后神经痛的功效约 为 60％ ( 参见例如非专利文献 3)， 而对于普瑞巴林， 根据患者自评， 其治疗疼痛性糖尿病神 经病变的功效约为 50％ ( 参见例如非专利文献 4)。
其它化合物公开于例如专利文献 2、 3 和 4。
引用文献
专利文献
专利文献 1 ： 国际公布号 WO 04/006836
专利文献 2 ： 国际公布号 WO 99/21824
专利文献 3 ： 国际公布号 WO 01/28978
专利文献 4 ： 国际公布号 WO 02/085839
非专利文献
非专利文献 1 ： J Biol.Chem.271(10) ： 5768-5776， 1996
非专利文献 2 ： J Med.Chem.41 ： 1838-18445， 1998
非专利文献 3 ： Acta Neurol.Scand.101 ： 359-371， 2000
非专利文献 4 ： Drugs 64(24) ： 2813-2820， 2004
发明概述
发明要解决的技术问题
本发明的一个目的是提供制备具有作为 α2δ 配体的良好活性的二环 γ- 氨基酸 衍生物、 用于制备所述衍生物的中间体、 及其盐的方法。
问题的解决方法
下面将对本发明进行描述。
(1) 一种通过光学拆分制备通式 (I) 表示的化合物或其盐的方法 ：
其中各取代基的定义如下 ： R1 ： 氢原子或 C1-C6 烷基， 和 2 R ： 氢原子或羧基保护基， 所述方法包括 将通式 (II)、 (III)、 (IV) 和 (V) 表示的化合物的混合物与旋光有机酸溶于溶剂中：
然后析出晶体。
另外， 优选将本发明的各方面表示如下。
(2) 按照 (1) 的制备通式 (I) 表示的化合物或其盐的方法， 其中 R1 为氢原子、 甲基 或乙基。
(3) 按照 (1) 或 (2) 的制备通式 (I) 表示的化合物或其盐的方法， 其中 R2 为叔丁 基。
(4) 按照 (1)-(3) 中任一项的制备通式 (I) 表示的化合物或其盐的方法， 其中所述 旋光有机酸为选自以下的任何活性有机酸 ：
D- 扁桃酸、 L- 扁桃酸、 二对甲苯甲酰基 -L- 酒石酸、 N-Boc-L- 脯氨酸、 (R)-α- 甲 氧基苯基乙酸、 O- 乙酰基 -L- 扁桃酸、 二苯甲酰基 -L- 酒石酸、 O- 乙酰基 -D- 扁桃酸、 N-Boc-L- 丙氨酸、 (S)-2-(6- 甲氧基 -2- 萘基 ) 丙酸、 二乙酰基 -L- 酒石酸、 L- 酒石酸、 L- 苹
果酸、 L- 焦谷氨酸、 (+)- 樟脑酸、 (S)-2- 甲基谷氨酸、 (+)-3- 溴樟脑 -8- 磺酸、 (-)-氧基乙酸和 (S)-2- 苯氧基丙酸。
(5) 按照 (1)-(4) 中任一项的制备通式 (I) 表示的化合物或其盐的方法， 其中所述 溶剂为选自以下的任何溶剂 ：
乙腈、 乙酸乙酯、 甲苯和环戊基甲基醚。
此外， 本发明还包括下述制备方法。(6) 一种制备通式 (X) 表示的化合物或其盐的方法 ：其中各取代基的定义如下 ：
R1 ： 氢原子或 C1-C6 烷基，
所述方法包括
使按照 (1) 的制备方法制备的通式 (I) 表示的化合物的羧基保护基脱去保护或者 进行该脱保护反应并进一步形成酸或盐。
发明的有利效果
本发明的制备方法可提供具有作为 α2δ 配体的良好活性的二环 γ- 氨基酸衍生 物、 制备所述衍生物的中间体、 或其盐。
实施方案的描述
“C1-C6 烷基” 是指具有 1-6 个碳原子的直链或支链烷基， 包括甲基、 乙基、 丙基、 异丙基、 丁基、 异丁基、 仲丁基、 叔丁基、 戊基、 异戊基、 2- 甲基丁基、 新戊基、 1- 乙基丙基、 己 基、 异己基、 4- 甲基戊基、 3- 甲基戊基、 2- 甲基戊基、 1- 甲基戊基、 3， 3- 二甲基丁基、 2， 2- 二 甲基丁基、 1， 1- 二甲基丁基、 1， 2- 二甲基丁基、 1， 3- 二甲基丁基、 2， 3- 二甲基丁基和 2- 乙 基丁基。
由于在结构中具有氨基和 / 或羧基的通式 (I) 表示的化合物等通过与酸或碱反应 形成盐， 因此 “盐” 或 “药理学上可接受的盐” 是指这种盐。 *
在本说明书的化合物的命名中， “” 表示具有由此标注的不对称碳原子的各种化 * * 合物为外消旋混合物。然而， 标识 “(1S ， 5R ， 6R*)-” 应根据相对构型表示其关系。
通式 (I) 表示的化合物等当放置在大气中或重结晶时， 可通过吸水而与吸附水缔 合形成水合物。本发明的盐还包括这类水合物。
“羧基保护基” 的实例包括甲基、 乙基、 丙基、 异丙基、 丁基、 异丁基、 仲丁基、 叔丁 基、 己基、 溴 - 叔丁基、 三氯乙基、 苄基、 对硝基苄基、 邻硝基苄基、 对甲氧基苄基、 对叔丁基 苄基、 乙酰氧基甲基、 丙酰氧基甲基、 丁酰氧基甲基、 异丁酰氧基甲基、 戊酰氧基甲基、 新戊 酰氧基甲基、 乙酰氧基乙基、 乙酰氧基丙基、 乙酰氧基丁基、 丙酰氧基乙基、 丙酰氧基丙基、 丁酰氧基乙基、 异丁酰氧基乙基、 新戊酰氧基乙基、 己酰氧基乙基、 异丁酰氧基甲基、 乙基丁
酰氧基甲基、 二甲基丁酰氧基甲基、 戊酰基氧基乙基、 甲氧基羰基氧基甲基、 乙氧基羰基氧 基甲基、 丙氧基羰基氧基甲基、 叔丁氧基羰基氧基甲基、 甲氧基羰基氧基乙基、 乙氧基羰基 氧基乙基、 异丙氧基羰基氧基乙基、 叔丁基二甲基甲硅烷基、 三甲基甲硅烷基、 甲氧基甲基、 乙氧基甲基、 丙氧基甲基、 异丙氧基甲基、 (2- 甲硫基 )- 乙基、 3- 甲基 -2- 丁烯基、 5- 茚满 基和 3-2- 苯并 [c] 呋喃酮基。保护基优选为叔丁基。
通式 (I) 表示的化合物中的羧基可通过使羧基脱保护的常用方法脱去保护， 以产 生通式 (X) 表示的化合物， 所述方法为例如， T.W.Greene 和 P.G.Wuts， “Protective Groupsin Organic Synthesis( 第 3 版， 1999)” 中披露的方法。
通式 (X) 表示的化合物或其药理学上可接受的盐具有作为 α2δ 配体的活性， 并 对电压依赖性钙通道亚基 α2δ 有亲和力， 可用作用于治疗和 / 或预防疼痛、 中枢神经系统 障碍和其它病症的药物组合物中的活性成分。
包含具有通式 (X) 的化合物或其药理学上可接受的盐的药物组合物， 当给予哺乳 动物 ( 例如人、 马、 牛或猪， 优选人 ) 时， 经由口服或胃肠外途径全身性或局部性给予。
可以根据给药方法选择的适当形式， 通过常用于各种制剂的配制方法来制备本发 明的药物组合物。
口服给药的药物组合物的形式包括片剂、 丸剂、 散剂、 颗粒剂、 胶囊剂、 溶液剂、 混 悬剂、 乳剂、 糖浆剂和酏剂。按照标准方法， 根据需要通过从以下中适当选择添加剂来制备 这类形式的药物组合物 ： 常用的赋形剂、 粘合剂、 崩解剂、 润滑剂、 膨胀剂、 膨胀助剂、 包衣 剂、 增塑剂、 稳定剂、 防腐剂、 抗氧化剂、 着色剂、 增溶剂、 助悬剂、 乳化剂、 甜味剂、 保存剂、 缓 冲剂、 稀释剂、 润湿剂等。
胃肠外给药的药物组合物的形式包括注射剂、 软膏剂、 凝胶剂、 乳膏剂、 泥罨剂、 贴 剂、 气雾剂、 吸入剂、 喷雾剂、 滴眼剂、 滴鼻剂和栓剂。 按照标准方法， 根据需要通过从以下中 适当选择添加剂来制备这类形式的药物组合物 ： 常用的稳定剂、 防腐剂、 增溶剂、 保湿剂、 保 存剂、 抗氧化剂、 香料、 胶凝剂、 中和剂、 增溶剂、 缓冲剂、 张度剂、 表面活性剂、 着色剂、 缓冲 剂、 增稠剂、 润湿剂、 填充剂、 吸收促进剂、 助悬剂、 粘合剂等。
具有通式 (X) 的化合物或其药理学上可接受的盐的剂量随症状、 年龄、 体重等而 不同， 对于口服给予成人 ( 体重 ： 约 60Kg) 为每剂 1-2000mg， 优选 10-600mg( 就化合物的量 而言 )， 对于胃肠外给予成人为每剂 0.1-1000mg， 优选 1-300mg( 就化合物的量而言 )。
实施例 ( 制剂实施例 )
使用混合器将 5g 具有通式 (X) 的化合物、 90g 乳糖、 34g 玉米淀粉、 20g 结晶纤维素 和 1g 硬脂酸镁混合， 然后用压片机压片， 得到片剂。
( 试验实施例 1) 人钙通道亚基 α2δ1( 下文称为人 Cacna2d1) 基因表达质粒的构 建以及表达人 Cacna2d1 的细胞膜部分的制备
a) 人 Cacna2d1 表达质粒 pRK/hCacna2d1 的构建
a-1)DNA 片段的制备
作为两个片段即前半片段和后半片段获得人 Cacna2d1 基因。使用 cDNA 文库 (QUICK-Clone cDNA Human Brain(Clontech Laboratories， Inc.)) 作为模板， 并且按照酶 KOD 聚合酶 (TOYOBO CO.， LTD.) 内包括的方案使用该酶进行了 PCR。对于前半片段， 所使用
的 PCR 引物是购自 SIGMA GENOSYS 的具有以下序列的引物 ：
引物 1 ： 5′ -agctgcggcc gctagcgcca ccatggctgg ctgcctgctg gc-3′ (SEQ ID NO ： 1)， 和
引物 2 ： 5′ -attaggatcg attgcaaagt aataccc-3′ (SEQ ID NO ： 2) ； 和
对于后半片段， 为具有以下序列的引物 ：
引物 3 ： 5′ -aatgggtatt actttgcaat cgatcc-3′ (SEQ ID NO ： 3)， 和
引物 4 ： 5′ -agtcggatcc tcataacagc cggtgtgtgc tg-3′ (SEQ ID NO ： 4)。
应用循环变温加热器 (GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems， Inc.))， 通过包括在 94℃下加热 1 分钟、 然后 35 次热循环 (94℃ 15 秒钟、 60℃ 30 秒钟和 68℃ 2 分 钟 )、 置于 68℃ 5 分钟并冷却至 4℃的步骤， 对前半片段和后半片段两者进行了 PCR 反应。
按 照 试 剂 盒 中 包 括 的 方 案， 采 用 PCR 产 物 纯 化 试 剂 盒 (MiniElute PCR Purification Kit(QIAGEN))， 对这两个反应产物进行纯化。 所得到的前半片段用限制性内 切酶 Not1(TOYOBO CO.， LTD.) 消化。后半片段用限制性内切酶 Cla1(TOYOBO CO.， LTD.) 和 BamH1(TOYOBO CO.， LTD.) 消化。随后按照试剂盒中包括的方案， 采用反应产物纯化试剂盒 (MiniElute Reaction Cleanup Kit(QIAGEN))， 对这些片段进行了纯化。 a-2) 载体的制备
将用于动物细胞的表达载体 pRK5(BD Pharmingen) 的多克隆位点 ( 下文称为 MCS) 变为载体 pBluescript 2(STRATAGENE) 的 MCS 以制备载体。准确地讲， 将 pRK5 用限制性内 切酶 Cla1(TOYOBO CO.， LTD.) 和 Hind3(TOYOBO CO.， LTD.) 处理， 然后， 使用 Klenow 片段 (TAKARA BIO INC.) 将该 DNA 的两端制成平端。使用小牛肠碱性磷酸酶 ( 下文称为 CIAP ； TAKARA BIO INC.) 使这两端进一步脱去磷酸， 然后使用 MiniElute Reaction Cleanup Kit(QIAGEN) 对片段进行纯化。 然后， 将该经酶处理的 DNA 在 1.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。 电泳后， 凝胶用溴化乙锭染色。然后， 在紫外线照射下用刀片分离相当于约 4.7kbp 的条带 部分。 按照试剂盒中包括的方案， 使用凝胶提取 / 纯化试剂盒 (MiniElute Gel Extraction Kit(QIAGEN))， 从条带中提取 DNA。
为了得到与 pBluescript 2 的 MCS 对应的 DNA 片段， 将 pBluescript2 用限制性 内切酶 Sac1(TOYOBO CO.， LTD.) 和 Kpn1(TOYOBO CO.， LTD.) 处理， 然后使用 Klenow 片段 (TAKARA BIO INC.)， 将该 DNA 的两端制成平端。 然后， 将该经酶处理的 DNA 在 2.0％琼脂糖 凝胶上进行电泳。电泳后， 凝胶用溴化乙锭染色。然后， 在紫外线照射下用刀片分离相当于 约 100bp 的条带部分。按照试剂盒中包括的方案， 使用凝胶提取 / 纯化试剂盒 (MiniElute Gel Extraction Kit(QIAGEN))， 从条带中提取 DNA。
按照试剂盒中包括的方案， 使用 DNA 连接试剂盒 (TAKARA BIO INC.)， 使所得到的 DNA 片段与已切割的 pRK5 连接。用该反应产物转化大肠杆菌 (E.coli)DH5α 感受态细胞 (TOYOBO CO.， LTD.)， 得到耐氨苄西林菌落。 收集一些菌落， 然后培养所收集的菌落。 从所得 到的细菌细胞中提取质粒， 并采用 DNA 序列分析仪 (3700 型 (Applied Biosystems， Inc.)) 分析其核苷酸序列， 以证实在 pRK5 中引入了 MCS 序列。在本文中， 载体中如果将 CMV 启动 子视为位于上游， 则掺入 MCS 序列使得其如下朝向下游方向 ： 5′ -ccaccgcggtggcggccgctc tagaactagtggatcccccgggctgcaggaattcgatatcaagcttatcgataccgtcgacctcgagggggggcccg3′ (SEQ ID NO ： 5)， 这种载体命名为 pRK-SK， 而将 MCS 序列以与之相反的方向掺入其中的
载体命名为 pRK-KS。
a-3) 质粒的构建
将在段落 a-2) 获得的 pRK-SK 用限制性内切酶 Xba1(TOYOBO CO.， LTD.) 处理， 使 用 Klenow 片段 (TAKARA BIO INC.) 将该 DNA 的两端制成平端。平端 DNA 进一步用限制性 内切酶 Not1(TOYOBO CO.， LTD.) 消化， 并按与段落 a-2) 同样的方法进行纯化。将由此成为 线性的该 pRK-SK 和在段落 a-1) 中得到的人 Cacna2d1 基因的头半段 DNA 片段在 1.0％琼 脂糖凝胶上进行电泳， 从凝胶中提取约 4.7kbp 和约 1.5kbp 的 DNA， 并按与段落 a-2) 同样 的方法进行纯化。按与段落 a-2) 同样的方法使所得到的两个 DNA 连接， 将大肠杆菌用连接 产物转化。从所得到的大肠杆菌克隆中提取质粒， 并用 DNA 序列分析仪 (3700 型 (Applied Biosystems， Inc.)) 分析其核苷酸序列以证实将 SEQ ID NO ： 6 所示序列引入其中。接下 来， 将所得质粒用限制性内切酶 Cla1(TOYOBO CO.， LTD.) 和 BamH1(TOYOBO CO.， LTD.) 处 理， 并按与段落 a-2) 相同的方法进行 CIAP 处理和纯化。将由此成为线性的该质粒 DNA 和 段落 a-1) 中得到的人 Cacna2d1 基因的后半段 DNA 片段在 1.0％琼脂糖凝胶上进行电泳， 从 凝胶中提取约 6.2kbp 和约 1.8kbp 的 DNA， 并按与段落 a-2) 同样的方法进行纯化。按与段 落 a-2) 同样的方法使所得到的两个 DNA 连接， 将大肠杆菌用连接产物转化。从所得到的大 肠杆菌克隆中提取质粒， 并用 DNA 序列分析仪 (3700 型 (Applied Biosystems， Inc.)) 分析 其核苷酸序列以证实 SEQ ID NO ： 7 所示序列引入到载体 pRK-SK 中。所得质粒命名为 pRK/ hCacna2d1。
b) 表达人 Cacna2d1 的 293 细胞系的获取
将 293 细胞用段落 a) 中构建的人 Cacna2d1 表达质粒 pRK/hCacna2d1 转染， 用 人 Cacna2d1 蛋白表达作为指标得到稳定表达人 Cacna2d1 的细胞系。准确地讲， 将 2×106 个 293 细胞接种到 φ6cm 培养皿中并培养 12 小时。然后， 使用转染试剂 Lipofectamine Plus(Invitrogen Corp.)， 按 照 试 剂 所 包 括 的 方 案， 将 细 胞 用 5μg pRK/hCacna2d1 和 0.5μg 新霉素抗性基因表达质粒 pSV2neo(Clontech) 共转染。
收集由此转染的细胞， 然后在稀释后接种到 φ15cm 培养皿中， 并在补充了 10 ％ 胎 牛 血 清 (Cansera International， Inc.) 和 500μg/ml G418(Invitrogen Corp.) 的 DMEM(Invitrogen Corp.) 中培养 2 周。分离出成功形成集落的新霉素耐受性细胞。在扩繁 培养后， 收集细胞， 细胞裂解物通过蛋白质印迹测定法评价， 以得到表达人 Cacna2d1 的 293 细胞系。在蛋白质印迹测定法中， 将抗 hCacna2d1 抗体 (Chemicon Inc.) 用作第一抗体。
c) 表达人 Cacna2d1 的 293 细胞的细胞膜部分的制备
将段落 b) 中得到的表达人 Cacna2d1 的 293 细胞在补充了 10％胎牛血清 (Cansera International， Inc.) 和 500μg/ml G418(Invitrogen Corp.) 的 DMEM(Invitrogen Corp.) 中 大 规 模 培 养 后， 收 集 细 胞。 将 蛋 白 酶 抑 制 剂 (Complete EDTA free(Roche Applied Science)) 以该试剂推荐的量加入结合测定缓冲液 (10mM MOPS(pH 7.4)、 10mM HEPES(pH 7.4)、 100mM NaCl) 中， 以制备膜部分制备缓冲液。 将收集的细胞用膜部分制备缓冲液洗涤， 然后使用超声发生器匀浆。然后使用离心机， 将匀浆物以 12,000rpm 于 4℃离心 1 小时。弃 去上清液， 将沉淀悬浮于膜部分制备缓冲液中。将从使用超声发生器进行超声处理到离心 后将沉淀悬浮的过程再重复三次， 所得悬液用作表达人 Cacna2d1 的细胞膜部分。由 280nm 波长下的紫外吸光度计算膜部分中所含蛋白质的总水平。( 试验实施例 2) 用于 Cacna2d1 与加巴喷丁 ( 下文称为 GBP) 之间的结合反应的检 测系统的构建， 以及试验化合物的 Cacna2d1/GBP 结合反应的抑制活性的检测
a) 用于 Cacna2d1 和 GBP 之间的结合反应的检测系统的构建
分 别 以 总 蛋 白 水 平 2.5mg/ml 的 终 浓 度 和 3H-GBP 4.5nM 的 终 浓 度， 将表达 3 3 人 Cacna2d1 的细胞膜部分和用放射性同位素 H 标记的 GBP( 下文称为 H-GBP ； Tocris Cookson Ltd.) 用 结 合 测 定 缓 冲 液 (10mM MOPS(pH 7.4)、 10mM HEPES(pH 7.4)、 100mM NaCl) 稀释， 以制备 120μl 的反应溶液， 接着将反应溶液于 4℃静置 3 小时。将该反应产 物加入滤板 (UniFilter 350GF/B(Whatman)) 的各孔中， 通过滤器过滤。然后， 将包括加入 350μl 结合测定缓冲液 (10mM MOPS(pH 7.4)、 10mM HEPES(pH 7.4)、 100mM NaCl) 和通过 滤器过滤的洗涤过程重复三次。将滤板充分干燥， 将底部密封。加入 50μl Microscint 20(PerkinElmer Inc.) 后， 也将上表面密封。 采用 TopCount(PerkinElmer Inc.) 统计来源 3 于保留在滤器上的放射性同位素 H 的辐射。从所得值中减去将未标记 GBP(SIGMA-ALDRICH INC.) 以 20μM 的终浓度加入本测定法中得到的值 ( 作为得自非特异性吸收的值 )， 所得值 3 用作 H-GBP 与 Cacna2d1 的特异性结合水平 ( 单位 ： “计数 (count)” )。
b) 试验化合物的 Cacna2d1/GBP 结合反应的抑制活性的检测 将各试验化合物以不同的浓度加入段落 a) 中构建的 Cacna2d1/GBP 结合反应检 测测定法中， 通过段落 a) 中描述的方法测定了结合水平。然后， 在将通过以 x nM 的浓 度加入化合物得到的 Cacna2d1/GBP 特异性结合水平定义为 “结合水平 [x]” 和与之相反 将 Cacna2d1/GBP 结合抑制率定义为 “抑制率 [x]” 的情况下， 根据以下方程式求出抑制率 (％ ) ：
抑制率 [x](％ ) ＝ (1-( 结合水平 [x]/ 结合水平 [0]))×100， 其中 3
结合水平 [0] 是指未加入化合物的情况下得到的 H-GBP 的结合水平。
将抑制率对浓度作图。 根据该结果， 计算 “IC50 值” ， IC50 值是抑制 50％的 Cacna2d1/ GBP 结合所需要的试验化合物的浓度。
( 制备实施例 1)
[6-( 氨基甲基 ) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸
(1-a)(2E)- 庚 -2， 6- 二烯酸
将 4- 戊烯醛 (4.45g， 51.4mmol) 和丙二酸 (6.41g， 61.6mmol) 溶于吡啶 (9.9mL) 中。向该溶液中加入哌啶 (1.9mL)， 然后将混合物在 90℃下搅拌 5 小时。使混合物冷却， 然 后加入 2N 盐酸使之呈酸性， 接着用乙醚萃取。有机层用饱和盐水洗涤后， 经无水硫酸镁干 燥， 然后将滤液减压浓缩。将残余物减压蒸馏， 得到目标化合物， 为无色油状物质 (3mmHg， 110-116℃， 3.27g， 50％ )。 1
H-NMR(400MHz ，CDCl 3 ) ： δ ppm ： 2.21-2.26(2H ，m) ， 2.32-2.37(2H ，m) ，
5.01-5.08(2H， m)， 5.75-6.87(2H， m)， 7.03-7.11(1H， m)。
(1-b) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 亚基乙酸叔丁酯
在 冰 冷 却 条 件 下， 将 草 酰 氯 (10mL) 滴 加 到 含 (2E)- 庚 -2， 6- 二 烯 酸 (3.27g， 25.9mmol) 的甲苯 (60mL) 溶液中。将混合物搅拌 20 分钟， 然后从冰水浴中移开， 逐渐加热 到室温。搅拌 50 分钟后， 在加热至回流下搅拌反应溶液 1 小时。使溶液冷却， 然后减压馏 出溶剂。再向残余物中加入甲苯， 然后再次减压馏出溶剂。将残余物溶于甲苯 (20mL) 中， 在 1 小时内将该溶液滴加到预先加热至 90 ℃的含三乙胺 (9.19g， 91mmol) 的甲苯 (20mL) 溶液中。完成滴加后， 再将混合物加热搅拌 2 小时。使反应溶液冷却， 然后用饱和盐水和水 稀释， 并通过硅藻土 (Celite) 过滤。把滤液分成有机层和水层。有机层然后用 1N 盐酸洗 涤， 然后经硫酸镁干燥， 并过滤。将滤液加入预先从含二甲氧基磷酰基乙酸叔丁酯 (5.98g， 25.9mmol) 的二甲氧基乙烷 (20mL) 溶液和氢化钠 ( ＞ 65％油， 986.7mg， 25.9mmol) 制备的 反应溶液中， 将混合物搅拌 1.5 小时。向反应溶液中依次加入氯化铵的饱和水溶液、 饱和盐 水和水， 用乙酸乙酯对反应溶液进行萃取。有机层经无水硫酸镁干燥， 然后过滤。减压馏出 溶剂后， 将残余物用硅胶柱色谱法纯化， 得到目标化合物， 为浅黄色油状物质 (1.73g， 32％， E/Z 混合物 )。 H-NMR(400MHz， CDCl3) ： δppm ：
主要异构体 ： 1.45(9H， S)， 2.29-2.35(1H， m)， 2.62-2.71(2H， m)， 2.89-2.98(1H， m)， 3.27-3.35(1H， m)， 3.92(1H， 宽峰 )， 5.47-5.49(1H， m)， 5.80-5.87(2H， m)。
次要异构体 ： 1.49(9H， s)， 2.42-2.48(1H， m)， 2.62-2.71(2H， m)， 2.89-2.98(2H， m)， 4.34-4.36(1H， m)， 5.37-5.38(1H， m)， 5.61-5.64(2H， m)。
(1-c)[6-( 硝基甲基 ) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯
将二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 亚基乙酸叔丁酯 (1.73g， 8.39mmol) 溶于硝基甲烷 (10mL) 中。向该溶液中加入 1， 8- 二氮杂二环 [5.4.0] 十一碳 -7- 烯 (1.3mL， 8.4mmol)， 将 混合物在室温下搅拌 1 小时， 然后在 50-60℃下加热搅拌 5 小时。使混合物冷却， 然后用 1N 盐酸和饱和盐水稀释， 接着用乙酸乙酯萃取。然后， 将有机层经无水硫酸镁干燥后， 减压馏 出溶剂。将残余物用硅胶柱色谱法纯化， 得到目标化合物， 为无色油状物质 (1.98g， 89％ )。 1
H-NMR(400MHz， CDCl3) ： δppm ： 1.45(9H， s)， 1.53(1H， dd， J ＝ 7.5， 12.9Hz)， 2.17(1H， d， J ＝ 15.2Hz)， 2.31(1H， ddd， J ＝ 2.4， 8.6， 12.1Hz)， 2.47(2H， s)， 2.52-2.58(1H， m)， 2.87(1H， 五重峰， J ＝ 7.5Hz)， 3.25-2.66(1H， m)， 4.78(1H， d， J ＝ 11.4Hz)， 4.87(1H， d， J ＝ 11.4Hz)， 5.65-5.67(1H， m)， 5.95(1H， dd， J ＝ 1.6， 5.9Hz)。
(1-d)[6-( 氨基甲基 ) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯
将 [6-( 硝基甲基 ) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯 (1.98g， 7.41mmol) 溶 于 乙 醇 (20mL) 和 水 (10mL) 中。 向 该 溶 液 中 加 入 铁 粉 (2.07g， 37.0mmol) 和 氯 化 铵 (392.7mg， 7.41mmol)， 在加热至回流下将混合物搅拌 4.5 小时。使混合物冷却， 然后用饱和 盐水、 碳酸氢钠饱和水溶液和乙酸乙酯稀释， 并通过硅藻土过滤除去不溶物质。 把滤液分成 有机层和水层。有机层用饱和盐水洗涤， 然后经无水硫酸镁干燥。然后， 减压馏出溶剂， 得 到目标化合物， 为浅黄色固体 (1.99g， 该化合物在未纯化的情况下便直接用于下一反应 )。 1
H-NMR(400MHz， CDCl3) ： δppm ： 1.39-1.49(1H， m)， 1.44(9H， s)， 1.97(1H， ddd， J＝ 2.8， 9.0， 11.7Hz)， 2.14(1H， dd， J ＝ 2.3， 16.8Hz)， 2.25(1H， d， J ＝ 13.7Hz)， 2.32(1H， d， J
11＝ 13.7Hz)， 2.47-2.55(1H， m)， 2.75(1H， 五重峰， J ＝ 7.4Hz)， 2.88(2H， s)， 2.98-2.99(1H， m)， 5.77-5.79(1H， m)， 5.87-5.89(1H， m)。
(1-e)[6-( 氨基甲基 ) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸
将 4N 含 盐 酸 的 乙 酸 乙 酯 (10mL) 溶 液 加 入 [6-( 氨 基 甲 基 ) 二 环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯 (0.99g， 4.17mmol) 中， 将混合物在室温下搅拌 1 小时。然 后， 减压馏出溶剂。通过加入二氯甲烷使残余物悬浮。然后向悬浮液中滴加三乙胺， 经过 滤收集所得粉末。所得粉末用二氯甲烷洗涤， 然后减压干燥， 得到目标化合物， 为白色粉末 (211.6mg， 35％ )。 1
H-NMR(400MHz， CDCl3) ： δppm ： 1.49(1H， dd， J ＝ 7.6， 12.5Hz)， 2.06(1H， ddd， J ＝ 2.6， 7.6， 12.5Hz)， 2.17(1H， dd， J ＝ 2.6， 16.8Hz)， 2.49(2H， s)， 2.48-2.56(1H， m)， 2.86(1H， 五重峰， J ＝ 7.6Hz)， 3.15-3.16(1H， m)， 3.18(1H， d， J ＝ 12.7Hz)， 3.22(1H， d， J ＝ 12.7Hz)， 5.75-5.78(1H， m)， 5.91-5.93(1H， m)。
( 制备实施例 2)
[6-( 氨基甲基 ) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸盐酸盐
将水 (5mL) 和 4N 含盐酸的 1， 4- 二氧杂环己烷 (22mL) 溶液加入 6-( 氨基甲基 ) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸 (320.2mg， 1.77mmol) 中， 将混合物在室温下搅拌 5 分 钟。减压馏出溶剂。向残余物中加入 1， 4- 二氧杂环己烷， 将混合物加热， 然后使之冷却到 室温。经过滤收集所得粉末。将所得粉末用 1， 4- 二氧杂环己烷洗涤， 然后干燥， 得到目标 化合物， 为白色粉末 (350.0mg， 92％ )。 1
H-NMR(400MHz， CD3OD) ： δppm ： 1.51(1H， dd， J ＝ 7.6， 12.7Hz)， 2.16(1H， ddd， J ＝ 2.8， 7.6， 15.6Hz)， 2.19(1H， dd， J ＝ 2.2， 16.8Hz)， 2.51(2H， s)， 2.53-2.59(1H， m)， 2.89(1H， 五重峰， J ＝ 7.6Hz)， 3.18-3.19(1H， m)， 3.33(1H， d， J ＝ 13.3Hz)， 3.37(1H， d， J ＝ 13.3Hz)， 5.70-5.73(1H， m)， 5.97-6.00(1H， m)。
( 制备实施例 3) [6-( 氨基甲基 ) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸苯磺酸盐将 6-( 氨 基 甲 基 ) 二 环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙 酸 (152.2g， 391mmol) 溶 于 2- 丙醇 (7.5mL) 和水 (2.6mL) 中。然后向该溶液中加入苯磺酸一水合物 (305.2mg， 1.73mmol)， 将混合物在室温下搅拌 5 分钟。 减压馏出溶剂， 接着用 2- 丙醇进一步共沸脱水。
然后， 将残余物用 2- 丙醇洗涤， 得到目标化合物， 为白色粉末 (260.4mg， 55％ )。 1
H-NMR(400MHz， CD3OD) ： δppm ： 1.51(1H， dd， J ＝ 7.4， 12.7Hz)， 2.12-2， 21(2H， m)， 2.51(2H， s)， 2.51-2.59(1H， m)， 2.89(1H，五 重 峰， J ＝ 7.4Hz)， 3.17-3.18(1H， m)， 3.32(1H， d， J ＝ 13.3Hz)， 3.36(1H， d， J ＝ 13.3Hz)， 5.69-5.71(1H， m)， 5.97-6.00(1H， m)， 7.40-7.46(3H， m)， 7.80-7.84(2H， m)。
( 制备实施例 4)
[6- 氨基甲基 -3- 甲基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸
(4-a)4- 甲基 -3- 羟基庚 -6- 烯酸甲酯
在冰冷却条件下， 将氢化钠 ( ＞ 63％油， 1.64g， 43.1mmol) 加入含 3- 氧代戊酸甲 酯 (5.10g， 39.2mmol) 的四氢呋喃 (50mL) 溶液中， 将混合物在该状态下搅拌 10 分钟。向反 应溶液中滴加正丁基锂 (1.66M 的己烷溶液， 25.9mL， 43.1mmol)， 将混合物在冰冷却条件下 再搅拌 10 分钟。然后， 向其中加入烯丙基溴 (5.18g， 43.1mmol)， 将混合物在该状态下搅拌 30 分钟， 然后再在室温下搅拌过夜。向反应溶液中加入 1N 盐酸和饱和盐水， 接着用乙醚萃 取。有机层用饱和盐水洗涤后， 经无水硫酸镁干燥， 减压馏出溶剂。将所得残余物溶于甲醇 (100mL)。在冰冷却条件下， 向该溶液中加入硼氢化钠 (1.89g， 50mmol)， 将混合物在该状态 下搅拌 1.5 小时。向其中加入 2N 盐酸 (50mL) 后， 将混合物搅拌 30 分钟。然后， 向其中加 入饱和盐水， 接着用乙酸乙酯萃取。将有机层用饱和盐水洗涤， 然后经无水硫酸镁干燥， 减 压馏出溶剂。将残余物用硅胶柱色谱法纯化， 得到目标化合物， 为浅黄色油状物质 (5.72g， 85％， 非对映体的混合物 )。
H-NMR(400MHz ，CDCl 3 ) ： δ ppm ： 0.89-0.94(3H ，m) ， 1.58-1.75(1H ，m) ， 1.91-2.03(1H， m)， 2.21-2.33(1H， m)， 2.43-2.56(2H， m)， 3.72(3H， s)， 3.84-4.00(1H， m)， 5.01-5.07(2H， m)， 5.74-5.84(1H， m)。
(4-b)4- 甲基 -3- 羟基庚 -6- 烯酸
1将 4- 甲基 -3- 羟基庚 -6- 烯酸甲酯 (5.72g， 33.2mmol) 溶于 2N 含氢氧化钾的甲 醇 (50mL) 溶液中， 将该溶液在室温下搅拌过夜。从反应溶液中减压馏出溶剂。然后向残余 物中加入 1N 氢氧化钠水溶液， 接着再次用乙醚萃取。在冰冷却条件下通过加入浓盐酸使水 层酸化， 接着再次用乙醚萃取。有机层用饱和盐水洗涤后， 经无水硫酸镁干燥。然后， 减压 馏出溶剂， 得到目标化合物， 为黄色油状物质 (2.21g， 42％， 非对映体的混合物 )。 1
H-NMR(400MHz ，CDCl 3 ) ： δ ppm ： 0.90-0.94(3H ，m) ， 1.64-1.74(1H ，m) ， 1.93-2.00(1H， m)， 2.24-2.32(1H， m)， 2.45-2.61(2H， m)， 3.87-4.03(1H， m)， 5.03-5.08(2H， m)， 5.75-5.83(1H， m)。
(4-c)3- 甲基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 亚基乙酸叔丁酯
将 4- 甲基 -3- 羟基庚 -6- 烯酸 (2.21g， 13.9mmol) 溶于乙酸酐 (14mL)。向该溶
液中加入乙酸钾 (3.29g， 33.4mmol)， 将混合物在室温下搅拌 2 小时。将反应溶液加热至 110-120℃并搅拌 3.5 小时。然后向反应溶液中加入冰水和甲苯， 将该混合物在室温下搅拌 1 小时。通过加入饱和盐水和甲苯， 使混合物分成水层和有机层。然后， 将有机层依次用 1N 氢氧化钠水溶液和饱和盐水洗涤， 然后经无水硫酸镁干燥， 然后过滤。 将滤液加入通过在冰 冷却条件下将氢化钠 ( ＞ 63％油， 533.3mg， 14.0mmol) 加入含二甲氧基磷酰基乙酯叔丁酯 (3.24g， 14.5mmol) 的四氢呋喃 (20mL) 溶液中而制备的反应溶液中， 将混合物再搅拌 1.5 小 时。通过加入氯化铵的饱和水溶液和饱和盐水使反应溶液分成水层和有机层。将水层用乙 酸乙酯进行萃取。合并有机层， 然后用饱和盐水洗涤， 随后经无水硫酸镁干燥。减压馏出溶 剂后， 将残余物用硅胶柱色谱法纯化， 得到目标化合物， 为浅黄色油状物质 (1.21g， 40％， E/ Z 混合物 )。 1
H-NMR(400MHz， CDCl3) ： δppm ：
主要异构体 ： 1.45(9H， s)， 2.11-2.22(4H， m)， 2.59-2.71(2H， m)， 2.87-2.97(1H， m)， 3.26-3.34(1H， m)， 3.87(1H， 宽峰 )， 5.22-5.23(1H， m)， 5.45-5.47(1H， m)。
次要异构体 ： 1.49(9H， s)， 2.11-2.21(4H， m)， 2.43-2.46(1H， m)， 2.59-2.70(1H， m)， 2.75-2.83(1H， m)， 2.87-2.97(1H， m)， 4.29(1H， 宽峰 )， 5.36(1H， s)， 5.59(1H， s)。
(4-d)[3- 甲基 -6-( 硝基甲基 ) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯
将 3- 甲基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 亚基乙酸叔丁酯 (1.21g， 5.50mmol) 溶于硝 基甲烷 (7mL)。 向该溶液中加入 1， 8- 二氮杂二环 [5.4.0] 十一碳 -7- 烯 (0.91mL， 6.0mmol)， 将混合物在 50-60℃下加热搅拌 6 小时。 使混合物冷却， 然后向其中加入磷酸二氢钾饱和水 溶液， 接着用乙酸乙酯萃取。然后， 有机层经无水硫酸镁干燥后， 减压馏出溶剂。将残余物 用硅胶柱色谱法纯化， 得到目标化合物， 为无色油状物质 (1.14g， 74％ )。 1
H-NMR(400MHz， CDCl3) ： δppm ： 1.45(9H， s)， 1.53(1H， dd， J ＝ 7.6， 12.9Hz)， 1.80(3H， s)， 2.04(1H， d， J ＝ 16.4Hz)， 2.29(1H， ddd， J ＝ 2.8， 7.6， 12.9Hz)， 2.47(2H， s)， 2.49(1H， dd， H ＝ 7.6， 16.4Hz)， 2.86(1H， 五重峰， J ＝ 7.6Hz)， 3.21-3.22(1H， m)， 4.74(1H， d， J ＝ 11.7Hz)， 4.84(1H， J ＝ 11.7Hz)， 5.25(1H， s)。
(4-e)[6- 氨基甲基 -3- 甲基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯
将 [3- 甲基 -6-( 硝基甲基 ) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯 (1.12g， 3.99mmol) 溶于乙醇 (20mL) 和水 (10mL)。向该溶液中加入铁粉 (892.8mg， 15.9mmol) 和氯 化铵 (211.5mg， 3.99mmol) 后， 将混合物在加热至回流下搅拌 4 小时。使混合物冷却， 然后 用饱和盐水、 碳酸氢钠饱和水溶液和乙酸乙酯稀释， 并通过硅藻土过滤除去不溶物质。 把滤 液分成有机层和水层。 将有机层用饱和盐水洗涤， 然后经无水硫酸镁干燥， 然后减压馏出溶 剂。向残余物中加入 4N 含盐酸的乙酸乙酯 (5mL) 溶液， 将混合物在室温下搅拌 1 小时。然 后减压馏出溶剂。将残余物悬浮于二氯甲烷中。向悬浮液中滴加三乙胺， 经过滤收集所得 粉末， 然后用二氯甲烷洗涤， 然后干燥， 得到目标化合物， 为白色粉末 (105.8mg， 28％ )。 1
H-NMR(400MHz， CD3OD) ： δppm ： 1.40(1H， dd， J ＝ 7.6， 12.3Hz)， 1.79(3H， s)， 2.02-2.08(2H， m)， 2.43-2.50(1H， m)， 2.45(1H， d， J ＝ 16.2Hz)， 2.51(1H， d， J ＝ 16.2Hz)， 2.85(1H， 五重峰， J ＝ 7.6Hz)， 3.05-3.12(1H， m)， 3.13(1H， d， J ＝ 13.0Hz)， 3.17(1H， d， J ＝ 13.0Hz)， 5.36(1H， t， J ＝ 1.6Hz)。
( 制备实施例 5)[6- 氨基甲基 -3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸(5-a)4- 乙基 -3- 羟基庚 -6- 烯酸乙酯
在冰冷却条件下， 将氢化钠 ( ＞ 63％油， 2.09g， 55mmol) 加入含 3- 氧代己酸乙酯 (7.91g， 50mmol) 的四氢呋喃 (50mL) 溶液中， 将混合物在该状态下搅拌 10 分钟。向反应溶 液中滴加正丁基锂 (1.58M 的己烷溶液， 34.8mL， 55mmol)， 将混合物在冰冷却条件下再搅拌 10 分钟。然后向其中加入烯丙基溴 (4.7mL， 55mmol)， 将混合物在该状态下搅拌 1 小时， 然 后在室温下再搅拌 4 小时。向反应溶液中加入 1N 盐酸和氯化铵的饱和水溶液， 接着用正戊 烷萃取。有机层用饱和盐水洗涤后， 经无水硫酸镁干燥， 减压馏出溶剂。将所得残余物溶于 乙醇 (80mL)。在冰冷却条件下， 向该溶液中加入硼氢化钠 (1.51g， 40mmol)， 将混合物在该 状态下搅拌 2 小时。向其中加入 1N 盐酸 (50mL)， 并将混合物搅拌 30 分钟。然后， 向其中加 入饱和盐水， 接着用乙酸乙酯萃取。将有机层用饱和盐水洗涤， 然后经无水硫酸镁干燥， 减
压馏出溶剂。将残余物用硅胶柱色谱法纯化， 得到目标化合物， 为浅黄色油状物质 (3.64g， 37％， 非对映体的混合物 )。 1
H-NMR(400MHz， CDCl3) ： δppm ： 0.91(3H， t， J ＝ 7.5Hz)， 1.28(3H， t， J ＝ 7.2Hz)， 1.43-1.55(2H， m)， 1.98-2.28(2H， m)， 2.45-2.48(2H， m)， 2.88-2.93(1H， m)， 4.07-4.10(1H， m)， 4.10-4.20(2H， m)， 5.01-5.09(2H， m)， 5.75-5.86(1H， m)。
(5-b)4- 乙基 -3- 羟基庚 -6- 烯酸
将 4- 乙基 -3- 羟基庚 -6- 烯酸乙酯 (3.64g， 18.2mmol) 溶于 2N 含氢氧化钾的甲醇 (120mL) 溶液中， 将该溶液在室温下搅拌过夜。 从反应溶液中减压馏出溶剂。 然后向残余物 中加入 1N 氢氧化钠水溶液 (200mL)， 接着用乙醚萃取。在冰冷却条件下通过加入浓盐酸使 水层酸化， 接着再次用乙醚萃取。有机层用饱和盐水洗涤后， 经无水硫酸镁干燥。然后， 减 压馏出溶剂， 得到目标化合物， 为浅黄色油状物质 (3.14g， ＜ 100％， 非对映体的混合物 )。 1
H-NMR(400MHz ，CDCl 3 ) ： δ ppm ： 0.91-0.96(3H ，m) ， 1.39-1.52(3H ，m) ， 2.01-2.28(2H， m)， 2.52-2.55(2H， m)， 4.05-4.15(2H， m)， 5.03-5.10(2H， m)， 5.74-5.86(1H， m)。
(5-c)3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 亚基乙酸叔丁酯
将 4- 乙基 -3- 羟基庚 -6- 烯酸 (3.13g， 18.2mmol) 溶于乙酸酐 (15mL)。向该溶 液中加入乙酸钾 (4.27g， 43.6mmol)， 将混合物在室温下搅拌 100 分钟。将反应溶液加热至 回流并搅拌 3.5 小时， 以在反应溶液中形成 “3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -6- 烯 -6- 酮” 。然后 向反应溶液中加入冰水和甲苯， 将混合物在室温下搅拌过夜。通过加入饱和盐水 (50mL) 和 甲苯 (20mL) 使混合物分成水层和有机层。然后， 将有机层依次用 1N 氢氧化钠水溶液和饱 和盐水洗涤， 然后经无水硫酸镁干燥， 过滤。将滤液加入通过在冰冷却条件下将氢化钠 ( ＞ 65％油， 761.9mg， 20mmol) 加入含二甲氧基磷酰基乙酯叔丁酯 (4.48g， 20mmol) 的四氢呋喃(50mL) 溶液中而制备的反应溶液中， 将混合物再搅拌 1 小时。通过加入氯化铵的饱和水溶 液和饱和盐水， 使反应溶液分成水层和有机层。水层用乙酸乙酯进行萃取。合并有机层， 然 后用饱和盐水洗涤， 之后经无水硫酸镁干燥。 减压馏出溶剂后， 将残余物用硅胶柱色谱法纯 化， 得到目标化合物， 为浅黄色油状物质 (1.32g， 31％， E/Z 混合物 )。 1
H-NMR(400MHz， CDCl3) ： δppm ：
主 要 异 构 体： 1.06(3H， t， J ＝ 7.4Hz)， 1.45(9H， s)， 2.07-2.22(3H， m)， 2.59-2.70(2H， m)， 2.87-2.96(1H， m)， 3.30(1H， ddt， J ＝ 8.6， 18.4， 2.7Hz)， 3.86-3.88(1H， m)， 5.22-5.23(1H， m)， 5.45-5.47(1H， m)。
次 要 异 构 体： 1.08(3H， t， J ＝ 7.3Hz)， 1.49(9H， s)， 2.07-2.21(3H， m)， 2.43-2.47(1H， m)， 2.59-2.70(1H， m)， 2.75-2.85(1H， m)， 2.87-2.96(1H， m)， 4.28-4.31(1H， m)， 5.35-5.38(1H， m)， 5.45-5.47(1H， m)。
(5-d)[3- 乙基 -6-( 硝基甲基 ) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯
将 [3- 乙 基 二 环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 亚 基 乙 酸 叔 丁 酯 (1.32g， 5.63mmol) 溶 于硝基甲烷 (7mL) 中。向该溶液中加入 1， 8- 二氮杂二环 [5.4.0] 十一碳 -7- 烯 (1.2mL， 7.3mmol)， 将混合物在 50-60℃下加热搅拌 7 小时。使混合物冷却， 然后向其中加入磷酸二 氢钾饱和水溶液， 接着用乙酸乙酯萃取。 然后， 将有机层经无水硫酸镁干燥， 减压馏出溶剂。 将残余物用硅胶柱色谱法纯化， 得到目标化合物， 为无色油状物质 (1.39g， 84％ )。 H-NMR(400MHz， CDCl3) ： δppm ： 1.09(3H， t， J ＝ 7.4Hz)， 1.46(9H， s)， 1.52(1H， dd， J ＝ 7.6， 13.2Hz)， 2.06(1H， d， 16.6Hz)， 2.14(2H， q， J ＝ 7.4Hz)， 2.30(1H， ddd， J ＝ 2.4， 7.6， 13.2Hz)， 2.47(2H， s)， 2.49(1H， dd， J ＝ 7.6， 16.6Hz)， 2.86(1H， 五重峰， J ＝ 7.6Hz)， 3.21-3.22(1H， m)， 4.75(1H， d， J ＝ 11.7Hz)， 4.84(1H， d， J ＝ 11.7Hz)， 5.27(1H， s)。
(5-e)[6- 氨基甲基 -3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸
将 [3- 乙基 -6-( 硝基甲基 ) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯 (1.09g， 4.71mmol) 溶于乙醇 (10mL) 和水 (5mL) 中。向该溶液中加入铁粉 (1.32g， 23.5mmol) 和氯 化铵 (249.6mg， 4.71mmol)， 将混合物在加热至回流下搅拌 2 小时。 使混合物冷却， 然后用饱 和盐水、 碳酸氢钠饱和水溶液和乙酸乙酯稀释， 并通过硅藻土过滤除去不溶物质。 把滤液分 成有机层和水层。将有机层用饱和盐水洗涤， 然后经无水硫酸镁干燥， 之后减压馏出溶剂。 向残余物中加入 4N 含盐酸的乙酸乙酯 (20mL) 溶液， 将混合物在室温下搅拌 1 小时。然后， 减压馏出溶剂。将残余物悬浮于二氯甲烷中。向悬浮液中滴加三乙胺， 经过滤收集所得粉 末， 然后用二氯甲烷洗涤， 之后干燥， 得到目标化合物， 为白色粉末 (425.1mg， 43％ )。 1
H-NMR(400MHz ， CD 3OD) ： δ ppm ： 1.10(3H， t， J ＝ 7.4Hz) ， 1.48(1H， dd ， J ＝ 7.5， 12.5Hz)， 2.03-2.08(2H， m)， 2.14(2H， q， J ＝ 7.4Hz)， 2.46(1H， d， J ＝ 16.2Hz)， 2.46-2.53(1H， m)， 2.51(1H， d， J ＝ 16.2Hz)， 2.85(1H， 五重峰， J ＝ 7.5Hz)， 3.09-3.10(1H， m)， 3.14(1H， d， J ＝ 13.0Hz)， 3.18(1H， d， J ＝ 13.0Hz)， 5.38(1H， dd， J ＝ 1.7， 3.7Hz)。
( 制备实施例 6)
[6- 氨基甲基 -3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸对甲苯磺酸盐
1将 [6-( 叔丁氧基羰基氨基 ) 甲基 -3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔 丁酯 (1152.23g， 391.6mmol) 溶于苯 (1.2L) 中。 然后向该溶液中加入苯硫基甲烷 (145.57g， 1173mmol) 和对甲苯磺酸一水合物 (89.39g)， 将混合物在回流下搅拌 2 小时。使混合物在 室温下静置过夜， 经过滤收集所得粉末。将所得粉末用乙酸乙酯洗涤， 然后干燥， 得到目标 化合物， 为白色粉末 (88.29g， 59％ )。 1
H-NMR(400MHz ， CD3OD) ： δ ppm ： 1.11(3H ， t， J ＝ 7.4Hz) ， 1.51(1H ， dd ， 7.4 ， 12.7Hz)， 2.06-2,20(4H， m)， 2.37(3H， s)， 2.49-2.56(1H， m)， 2.51(2H， s)， 2.87(1H，五 重 峰， J ＝ 7.4Hz)， 3.12-3.14(1H， m)， 3.28(1H， d， J ＝ 13.5Hz)， 3.33(1H， d， J ＝ 13.5Hz)， 5.31-5.32(1H， m)， 7.21-7.25(2H， m)， 7.69-7.72(2H， m)。
( 制备实施例 7)
[6-( 氨基甲基 )-3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸苯磺酸盐通过在 1M 苯磺酸一水合物水溶液 (22.7mL) 中加热使 6-( 氨基甲基 )-3- 乙基二 环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸 (4.50g， 20.6mmol) 溶解， 然后使溶液冷却到室温。经过 滤收集所得固体。将固体用水 (15mL) 洗涤， 然后用真空泵干燥， 得到目标化合物， 为无色固 体 (6.45g， 77％ )。 1
H-NMR(400MHz， CD3OD) ： δppm ： 1.11(3H， t， J ＝ 7.4Hz)， 1.50(1H， dd， J ＝ 7.5， 12.6Hz)， 2.08(1H， d， 16.5Hz)， 2.10-2.20(3H， m)， 2.46-2.56(3H， m)， 2.87(1H， 五重峰， J＝ 7.5Hz)， 3.12-3.13(1H， m)， 3.28(1H， d， J ＝ 13.4Hz)， 3.33(1H， d， J ＝ 13.4Hz)， 5.31(1H， d， J ＝ 1.8Hz)， 7.39-7.45(3H， m)， 7.80-7.85(2H， m)。
( 还原硝基的步骤 ) ( 制备实施例 8) [6- 氨基甲基 -3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯
将阮内镍 (Raney nickel)(102.3g， 0.15w/w) 和乙醇 (5.5L， 8.0v/w) 加入 [3- 乙基 -6-( 硝基甲基 ) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯 (709.0g， 净重 ： 681.8g， 2.31mol， 85 ∶ 15 非对映体的混合物 ) 中， 并搅拌混合物。向反应溶液中加入一水合肼 (458.0ml， 9.23mol， 4.00eq.)， 并将混合物在 40℃下搅拌 2 小时。使混合物冷却至室温后， 滤出阮内镍。然后， 馏出溶剂， 得到目标化合物， 为褐色油状物质 (637.0g， 净重 ： 552.3g， 收 率： 90.2％， 85 ∶ 15 非对映体的混合物 )。 1
H-NMR(400MHz ，CDCl 3 ) ： δ ppm ： 1.05-1.10( 各 个 t) ， 1.44-1.61(m) ， 1.86-2.38(m)， 2.42-2.55(m)， 2.73-3.05(m)， 5.40-5.48(m)。
(ii)
将阮内镍 (96mg， 0.16w/w) 和乙醇 (200μL) 加入 [3- 乙基 -6-( 硝基甲基 ) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯 (59mg， 85 ∶ 15 非对映体的混合物 ) 中， 在氢气氛 下， 将混合物在室温下搅拌 12 小时。滤出阮内镍。然后， 馏出溶剂， 得到目标化合物， 为褐 色油状物质 (49mg， 收率 ： 92％， 85 ∶ 15 非对映体的混合物 )。
( 制备实施例 9)
[6-( 氨基甲基 ) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯
将 阮 内 镍 (0.4g) 和 乙 醇 (24ml) 加 入 [6-( 硝 基 甲 基 ) 二 环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯 (4.0g， 90 ∶ 10 非对映体的混合物 ) 中， 并搅拌混合物。向 反应溶液中加入一水合肼 (2.9ml)， 将混合物搅拌 0.5 小时。 通过薄层色谱法证实起始原料 的消耗， 然后滤出阮内镍。将溶剂馏出， 得到目标化合物， 为褐色油状物质 (3.62g， 90 ∶ 10 非对映体的混合物 )。
薄层色谱法展开剂 ： 己烷∶乙酸乙酯＝ 9 ∶ 1
硝基形式的 Rf 值 ： 0.7， 还原形式的 Rf 值 ： 0.1( 带拖尾 ) 1
H-NMR(400MHz， CDCl3) ： δppm ： 1.44-1.51(m)， 1.93-2.17(m)， 2.23-2.35(m)， 2.48-2.60(m)， 2.70-2.90(m)， 2.95-3.30(m)， 5.75-5.80(m)， 5.83-5.90(m)。
( 制备实施例 10)
[6- 氨基甲基 -3- 甲基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯
将 阮 内 镍 (0.28g) 和 乙 醇 (20ml) 加 入 [6-( 硝 基 甲 基 )-3- 甲 基 二 环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯 (2.81g， 90 ∶ 10 非对映体的混合物 ) 中， 并搅拌混合物。 向反 应溶液中加入一水合肼 (1.9ml)， 将混合物搅拌 0.75 小时。通过薄层色谱法证实起始原料 的消耗， 然后滤出阮内镍。将溶剂馏出， 得到目标化合物， 为褐色油状物质 (2.50g， 90 ∶ 10 非对映体的混合物 )。
薄层色谱法展开剂 ： 己烷∶乙酸乙酯＝ 9 ∶ 1
硝基形式的 Rf 值 ： 0.7， 还原形式的 Rf 值 ： 0.1( 带拖尾 )
18102356061 A CN 102356071
1说明书16/22 页H-NMR(400MHz， CDCl3) ： δppm ： 1.44-1.61(m)， 1.80-1.90(m)， 1.93-2.06(m)， 2.10-2.20(m) ， 2.23-2.38(m) ， 2.40-2.60(m) ， 2.73-2.90(m) ， 2.92-3.30(m) ， 5.40-5.45(m)。
( 拆分非对映体的步骤 )
( 制备实施例 11)
[(1R*， 5S*， 6S*)-6- 氨基甲基 -3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯 对甲苯磺酸盐
将 乙 酸 乙 酯 (70ml， 10.4v/w) 加 入 [6- 氨 基 甲 基 -3- 乙 基 二 环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯 (7.8g， 纯度 ： 86.7 ％， 22.03mmol， 87 ∶ 13 非对映体的混合 物 ) 中， 并将混合物在室温下搅拌。加入对甲苯磺酸一水合物 (4.2g， 22.03mmol， 0.87eq.) 后， 将混合物在室温下搅拌 3 小时， 经过滤收集晶体。然后， 在 40℃的条件下将晶体减压干 * * * 燥， 得到 [(1R ， 5S ， 6S )-6- 氨基甲基 -3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯 对甲苯磺酸盐， 为白色晶体 (7.8g， 收率 ： 80.6％， 非对映体比率 ： 99.7 ∶ 0.3)。 1
H-NMR(400MHz ， DMSO-d6) ： δ ppm ： 1.04(3H ， t， J ＝ 7.4Hz) ， 1.31-1.40(1H ， m)， 1.40(9H， s)， 1.98-2.15(4H， m)， 2.25(3H， s)， 2.25-2.50(3H， m)， 2.76(1H，五 重 峰， J ＝ 7.4Hz)， 3.05-3.18(3H， m)， 3.35(1H， br s)， 5.20-5.22(1H， m)， 7.10-7.12(2H， m)， 7.45-7.48(2H， m)， 7.74(1H， brs)。
C23H35NO5S 的分析计算值 ： C， 63.13 ； H， 8.06 ； N， 3.20 ； S， 7.33 ； 实测值 C， 63.10 ； H， 8.14 ； N， 3.29 ； S， 7.30。
GC 分析条件 ( 非对映体比率测定 )
柱： 用于胺的 CP-Sil 8CB(GL Science， 30m×0.25mm， 0.25μm)
检测器 ： FID
温度 ： 柱式加热炉 (130℃ )， 注射 (250℃ )， 检测器 (250℃ )
温度条件 ： (i)130℃ (5.5 分钟 )， (ii)130-270℃ (10℃ / 分钟 )， (iii)270℃ (4.5 分钟 )
流速 ： 1.5ml/ 分钟 ( 平均线速度 ： 38cm/ 秒钟 )
分流比 ： 1/10
载气 ： 氦气
分析时间 ： 25 分钟
削减峰值 (Peak cut) ： 0.0-2.0 分钟
保留时间 ： 13.8 分钟， 14.0 分钟
( 光学拆分步骤 )
( 制备实施例 12)
[(1R， 5S， 6S)-6- 氨基甲基 -3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯羧 酸盐 ( 旋光羧酸盐 )
将 [(1R*， 5S*， 6S*)-6- 氨基甲基 -3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔 丁酯对甲苯磺酸盐悬浮于乙酸乙酯 (20v/w) 中。通过加入碳酸氢钠水溶液 (4v/w) 将悬浮 液分成水层和有机层， 得到游离形式的 [(1R*， 5S*， 6S*)-6- 氨基甲基 -3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯。向该 [(1R*， 5S*， 6S*)-6- 氨基甲基 -3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙 酸 叔 丁 酯 (200mg， 0.754mmol) 加 入 二 异 丙 醚 (IPE) 或 乙 腈 (MeCN) (1.0mL， 5.0v/w)， 然后加入旋光羧酸 (0.5eq.)， 并将混合物在室温下搅拌。 将沉淀的晶体过 滤， 用所使用的溶剂 (0.5mL， 2.5v/w) 洗涤。将所得晶体减压干燥， 以下表 1 所示收率和光 学纯度得到对应的盐形式。
通过用碳酸氢钠水溶液将所获得的盐转化成游离形式， 然后将游离形式衍生化成 3， 5- 二硝基苯甲酰基形式， 从而分析光学纯度。
HPLC 分析条件 ( 光学纯度测定， 在衍生化成 3， 5- 二硝基苯甲酰基形式后进行分 析)
柱： CHIRALPAK AS-RH×2(Daisel， 4.6mm×150mm， 5μm)
检测 ： 220nm， 柱温 ： 40℃， 流速 ： 0.8ml/ 分钟
流动相 ： MeCN/5mM 磷酸盐缓冲液 (pH 7.0) ＝ 55/45
保留时间 ： 29.6 分钟， 31.8 分钟， 36.1 分钟
( 表 1)
( 由非对映体的混合物进行光学拆分的步骤 )
( 实施例 1)
[(1R， 5S， 6S)-6- 氨基甲基 -3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯 D- 扁桃酸盐
将乙腈 (4.7L， 8.6v/w) 加入 [6- 氨基甲基 -3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯 (627.0g， 净重 ： 543.6g， 2.05mol， 85 ∶ 15 非对映体的混合物 ) 中， 将混合物在 40 ℃下搅拌。向反应溶液中加入 D- 扁桃酸 (116.3g， 0.76mmol， 0.37eq.)， 并将混合物在 40℃下搅拌 1 小时， 然后使之慢慢冷却到 3℃。在 3℃下搅拌 1 小时后， 经过滤收集所得晶 体。然后， 在 40℃的条件下将晶体减压干燥， 得到 [(1R， 5S， 6S)-6- 氨基甲基 -3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯 D- 扁桃酸盐， 为白色粉末 (251.2g， 收率 ： 29.4 ％， 97.6％ ee， 99.6％ de)。 1
H-NMR(400MHz， DMSO-d6)δppm ： 1.04(3H， t， J ＝ 7.6Hz)， 1.28-1.35(1H， m)，
1.39(9H， s)， 1.96-2.11(4H， m)， 2.28(1H， d， J ＝ 15.6Hz)， 2.33(1H， d， J ＝ 15.6Hz)， 2.36-2.40(1H， m)， 2.72(1H，五 重 峰， J ＝ 7.6Hz)， 3.00(1H， d， J ＝ 13.2Hz)， 3.03(1H， d， J ＝ 13.2Hz)， 3.31(1H， br s)， 4.54(1H， s)， 5.21-5.23(1H， m)， 7.13-7.25(3H， m)， 7.35-7.37(2H， m)。
[α]20D-104.4° (C ＝ 0.108， MeOH)。
C24H35NO5 的 分 析 计 算 值 ： C， 69.04 ； H， 8.45 ； N， 3.35 ； 实 测 值 C， 69.15 ； H， 8.46 ； N， 3.46。
( 实施例 2)
[(1R， 5S， 6S)-6-( 氨基甲基 ) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯 (S)-O- 乙 酰基 - 扁桃酸盐
将乙腈 (10mL， 5.0v/w) 加入 [6-( 氨基甲基 ) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙 酸叔丁酯 (1.9g， 8.0mmol， 90 ∶ 10 非对映体的混合物 ) 中。向该混合物中加入 (S)-O- 乙 酰基 - 扁桃酸 (0.45eq.)， 并将混合物在室温下搅拌。2.5 小时后， 将沉淀的晶体过滤， 并 用乙腈洗涤。将所得晶体减压干燥， 得到 [(1R， 5S， 6S)-6- 氨基甲基 -3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙 酸 叔 丁 酯 (S)-O- 乙 酰 基 - 扁 桃 酸 盐， 为 白 色 晶 体 (0.904g， 收率 ： 26.2％， 90.4％ ee， 99％ de)。将这种白色晶体 (620mg) 悬浮于乙腈 (6.2mL， 10.0v/w) 中， 将悬浮液在室温下搅拌 10 分钟。将所得晶体过滤后， 将所得晶体减压干燥， 得到 (S)-O- 乙 酰基 - 扁桃酸盐， 为白色粉末 (557.6mg， 光学纯度 ： 95.7％ ee)。 1
H-NMR(400MHz， CD3OD)δppm ： 1.44-1.51(1H， m)， 1.45(9H， s)， 2.08-2.22(2H， m)， 2.13(3H， s)， 2.42(2H， s)， 2.50-2.57(1H， m)， 2.86(1H， 五重峰， J ＝ 7.6Hz)， 3.06-3.16(1H， m)， 3.25-3.33(2H， m)， 5.65-5.70(1H， m)， 5.74(1H， s)， 5.95-5.99(1H， m)， 7.25-7.34(3H， m)， 7.47-7.51(2H， m)。 D
[α]20 -18.9° (C 0.095， MeOH)。 -1
IR(KBr) ： cm ： 3046、 2977、 1726、 1584、 1235、 1144、 1028、 752。
MS(FAB+) ： m/z ： 238( 游离 +H)+， MS(FAB+NaI) ： m/z ： 260( 游离 +Na)+， 217(O- 乙酰 + 基 - 扁桃酸 +Na) 。
C24H33NO6 的 分 析 计 算 值 ： C， 66.80 ； H， 7.71 ； N， 3.25 ； 实 测 值 C， 66.60 ； H， 7.72 ； N， 3.36。
( 实施例 3)
[(1R， 5S， 6S)-6- 氨基甲基 -3- 甲基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯 D- 扁桃酸盐
将溶剂 (2.5mL， 10v/w) 加入 [6- 氨基甲基 -3- 甲基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯 (237mg， 1mmol， 90 ∶ 10 非对映体的混合物 ) 中。向混合物中加入 D- 扁桃酸 (0.5eq.)， 将混合物在冰冷却条件下搅拌 2 小时。将沉淀的晶体过滤。将所得晶体减压干 燥， 以下表 2 所示收率和光学纯度得到 D- 扁桃酸盐。通过用碳酸氢钠水溶液将所获得的盐 转化成游离形式， 然后使游离形式衍生化成 3， 5- 二硝基苯甲酰基形式， 从而对光学纯度进 行了分析。
( 表 2)溶剂 1 2 3 4 乙腈 乙酸乙酯 甲苯 环戊基甲基醚 收率 8.5％ 4.6％ 11.2％ 13.8 ee％ a) 48.5％ ee 79.9％ ee 85.0％ ee 82.4％ eea)3， 5- 二硝基苯甲酰氯， HPLC HPLC 分析条件 ( 光学纯度测定， 在衍生化成 3， 5- 二硝基苯甲酰基形式后进行分析) 柱： CHIRALPAK AS-RH×2(Daisel， 4.6mm×150mm， 5μm)
检测 ： 220nm， 柱温 ： 40℃， 流速 ： 0.8ml/ 分钟
流动相 ： MeCN/5mM 磷酸盐缓冲液 (pH 7.0) ＝ 55/45
保留时间 ： 28.0 分钟， 23.6 分钟， 26.0 分钟 1
H-NMR(400MHz ，CD 3 OD) ： δ ppm ： 1.45-1.51(1H ，m) ， 1.45(9H ，s) ， 1.82(3H ， s)， 2.02-2.14(2H， m)， 2.41(2H， s)， 2.42-2.55(1H， m)， 2.85(1H，五 重 峰， J ＝ 7.2Hz)， 3.06-3.13(1H， m)， 3.23(1H， d， J ＝ 13.2Hz)， 3.26(1H， d， J ＝ 13.2Hz)， 4.84(1H， s)， 5.25-5.28(1H， m)， 7.19-7.30(3H， m)， 7.44-7.47(2H， m)。 D
[α]20 -97.4° (C 0.102， MeOH)。 -1
IR(KBr) ： cm ： 3424、 2974、 2929、 1722、 1571、 1366、 1152、 1060、 755、 701。 + +
MS(FAB ) ： m/z ： 252( 游离 +H) ， MS(FAB+NaI) ： m/z ： 274( 游离 +Na)+， 175( 扁桃酸 + +Na) .
( 使酯基脱保护和形成盐的步骤 )
( 实施例 4)
[(1R， 5S， 6S)-6- 氨基甲基 -3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸对甲苯磺 酸盐
将 [(1R， 5S， 6S)-6- 氨基甲基 -3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯 D- 扁桃酸盐 (4.17g， 10mmol) 悬浮于甲苯 (21ml) 中。 向悬浮液中依次加入三乙胺 (2.09ml) 和水 (21ml)， 并将混合物在室温下搅拌。20 分钟后， 分离并萃取有机层。将有机层用水 (10ml) 再次洗涤， 然后减压浓缩， 得到游离形式的 [(1R， 5S， 6S)-6- 氨基甲基 -3- 乙基二 环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯， 为油状物质。向其中依次加入甲苯 (16ml) 和 对甲苯磺酸一水合物 (2.28g)， 并将混合物在 70℃下搅拌。搅拌期间， 再加入甲苯 (15ml)， 3 小时后， 使混合物冷却。将沉淀的固体过滤， 然后用甲苯洗涤后减压干燥， 得到 [(1R， 5S， 6S)-6- 氨基甲基 -3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸对甲苯磺酸盐， 为白色粉末 (3.90g)。 1
H-NMR(400MHz， CD3OD)δppm ： 1.10(3H， t， J ＝ 7.2Hz)， 1.49(1H， dd， J ＝ 7.4， 12.4Hz)， 2.06-2.20(4H， m)， 2.37(3H， s)， 2.49-2.55(1H， m)， 2.51(2H， s)， 2.87(1H，五 重 峰， J ＝ 7.4Hz)， 3.12(1H， br S)， 3.29(1H， d， J ＝ 13.3Hz)， 3.33(1H， d， J ＝ 13.3Hz)， 5.31-5.32(1H， m)， 7.22-7.25(2H， m)， 7.69-7.72(2H， m)。 D
[α]20 -56.1° (C 0.108， MeOH)。 -1
IR(KBr) ： cm ： 3149、 2962、 1708、 1498、 1237、 1164、 1038、 1011、 813、 680、 566。 + + +
MS(FAB ) ： m/z ： 210( 游离 +H) ， 412(2M 游离 +H) 。
( 实施例 5)
[(1R， 5S， 6S)-6-( 氨基甲基 ) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸苯磺酸盐
将 [(1R， 5S， 6S)-6-( 氨 基 甲 基 ) 二 环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙 酸 叔 丁 酯 (S)-O- 乙酰基 - 扁桃酸盐 (116mg， 0.269mmol) 悬浮于茴香醚 (0.58ml) 中。向悬浮液中依
次加入水 (0.6ml) 和三乙胺 (0.045ml)， 并将混合物在室温下搅拌。15 分钟后， 分离并萃 取有机层。将有机层再次用水 (300ml) 洗涤， 然后减压浓缩， 得到含游离形式的 [(1R， 5S， 6S)-6-( 氨基甲基 ) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯的茴香醚溶液。向其中加 入苯磺酸 (46mg)， 并将混合物在 70℃下搅拌 1.25 小时后使之冷却。将沉淀的固体过滤， 经 过滤的粉末通过倒入丙酮再次洗涤后， 减压干燥， 得到 [(1R， 5S， 6S)-6-( 氨基甲基 ) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸苯磺酸盐， 为白色粉末 (55.5mg)。 1
H-NMR(400MHz， CD3OD)δppm ： 1.51(1H， dd， J ＝ 7.6， 12.4Hz)， 2.12-2.20(2H， m)， 2.51(2H， s)， 2.51-2.57(1H， m)， 2.88(1H，五 重 峰， J ＝ 7.4Hz)， 3.17-3.18(1H， m)， 3.32(1H， d， J ＝ 13.3Hz)， 3.36(1H， d， J ＝ 13.3Hz)， 5.69-5.71(1H， m)， 5.97-5.99(1H， m)， 7.39-7.44(3H， m)， 7.81-7.84(2H， m)。 D
[α]20 -99.7° (C 0.09， MeOH)。 -1
IR(KBr) ： cm ： 3125、 3054、 2988、 1705、 1515、 1412、 1237、 1163、 1121、 1016、 730、 689、 621、 563。
MS(FAB+) ： m/z ： 182( 游离 +H)+， m/z ： 363(2M 游离 +H)+。
C16H21NO5S 的分析计算值 ： C， 56.62 ； H， 6.24 ； N， 4.13 ； 实测值 C， 56.19 ； H， 6.21 ； N， 4.13。
序列表的自由原文
SEQ ID NO ： 1： 人 Cacna2d1 前半片段的 PCR 正义引物。
SEQ ID NO ： 2： 人 Cacna2d1 前半片段的 PCR 反义引物。
SEQ ID NO ： 3： 人 Cacna2d1 后半片段的 PCR 正义引物。
SEQ ID NO ： 4： 人 Cacna2d1 后半片段的 PCR 反义引物。
背景技术 研究表明具有结合电压依赖性钙通道亚基 α2δ 的高亲和力的化合物对治疗例如 神经性疼痛有效 ( 参见例如非专利文献 1 和 2)。在本文中， 神经性疼痛是指由神经组织损 伤等引起的慢性疼痛， 并且是一种以患者因严重疼痛发作而患有抑郁症的方式严重损害生 命质量的疾病。
目前已知 α2δ 配体的若干类型是这类神经性疼痛的治疗药物。α2δ 配体的实 例包括加巴喷丁 (gabapentine) 和普瑞巴林。α2δ 配体 ( 例如这些化合物 ) 可用于治疗 癫痫和神经性疼痛等 ( 例如专利文献 1)。
目前已知 α2δ 配体的若干类型是这类神经性疼痛的治疗药物。α2δ 配体的实 例包括加巴喷丁 (gabapentine) 和普瑞巴林。α2δ 配体 ( 例如这些化合物 ) 可用于治疗 癫痫和神经性疼痛等 ( 例如专利文献 1)。
然而， 例如对于加巴喷丁， 有报道称根据患者自评， 其治疗疱疹后神经痛的功效约 为 60％ ( 参见例如非专利文献 3)， 而对于普瑞巴林， 根据患者自评， 其治疗疼痛性糖尿病神 经病变的功效约为 50％ ( 参见例如非专利文献 4)。
其它化合物公开于例如专利文献 2、 3 和 4。
引用文献
专利文献
专利文献 1 ： 国际公布号 WO 04/006836
专利文献 2 ： 国际公布号 WO 99/21824
专利文献 3 ： 国际公布号 WO 01/28978
专利文献 4 ： 国际公布号 WO 02/085839
非专利文献
非专利文献 1 ： J Biol.Chem.271(10) ： 5768-5776， 1996
非专利文献 2 ： J Med.Chem.41 ： 1838-18445， 1998
非专利文献 3 ： Acta Neurol.Scand.101 ： 359-371， 2000
非专利文献 4 ： Drugs 64(24) ： 2813-2820， 2004
发明概述
发明要解决的技术问题
本发明的一个目的是提供制备具有作为 α2δ 配体的良好活性的二环 γ- 氨基酸 衍生物、 用于制备所述衍生物的中间体、 及其盐的方法。
问题的解决方法
下面将对本发明进行描述。
(1) 一种通过光学拆分制备通式 (I) 表示的化合物或其盐的方法 ：
其它化合物公开于例如专利文献 2、 3 和 4。
引用文献
专利文献
专利文献 1 ： 国际公布号 WO 04/006836
专利文献 2 ： 国际公布号 WO 99/21824
专利文献 3 ： 国际公布号 WO 01/28978
专利文献 4 ： 国际公布号 WO 02/085839
非专利文献
非专利文献 1 ： J Biol.Chem.271(10) ： 5768-5776， 1996
非专利文献 2 ： J Med.Chem.41 ： 1838-18445， 1998
非专利文献 3 ： Acta Neurol.Scand.101 ： 359-371， 2000
非专利文献 4 ： Drugs 64(24) ： 2813-2820， 2004
发明概述
发明要解决的技术问题
本发明的一个目的是提供制备具有作为 α2δ 配体的良好活性的二环 γ- 氨基酸 衍生物、 用于制备所述衍生物的中间体、 及其盐的方法。
问题的解决方法
下面将对本发明进行描述。
(1) 一种通过光学拆分制备通式 (I) 表示的化合物或其盐的方法 ：
其中各取代基的定义如下 ： R1 ： 氢原子或 C1-C6 烷基， 和 2 R ： 氢原子或羧基保护基， 所述方法包括 将通式 (II)、 (III)、 (IV) 和 (V) 表示的化合物的混合物与旋光有机酸溶于溶剂中：
然后析出晶体。
另外， 优选将本发明的各方面表示如下。
(2) 按照 (1) 的制备通式 (I) 表示的化合物或其盐的方法， 其中 R1 为氢原子、 甲基 或乙基。
(3) 按照 (1) 或 (2) 的制备通式 (I) 表示的化合物或其盐的方法， 其中 R2 为叔丁 基。
(4) 按照 (1)-(3) 中任一项的制备通式 (I) 表示的化合物或其盐的方法， 其中所述 旋光有机酸为选自以下的任何活性有机酸 ：
D- 扁桃酸、 L- 扁桃酸、 二对甲苯甲酰基 -L- 酒石酸、 N-Boc-L- 脯氨酸、 (R)-α- 甲 氧基苯基乙酸、 O- 乙酰基 -L- 扁桃酸、 二苯甲酰基 -L- 酒石酸、 O- 乙酰基 -D- 扁桃酸、 N-Boc-L- 丙氨酸、 (S)-2-(6- 甲氧基 -2- 萘基 ) 丙酸、 二乙酰基 -L- 酒石酸、 L- 酒石酸、 L- 苹
果酸、 L- 焦谷氨酸、 (+)- 樟脑酸、 (S)-2- 甲基谷氨酸、 (+)-3- 溴樟脑 -8- 磺酸、 (-)-氧基乙酸和 (S)-2- 苯氧基丙酸。
(5) 按照 (1)-(4) 中任一项的制备通式 (I) 表示的化合物或其盐的方法， 其中所述 溶剂为选自以下的任何溶剂 ：
乙腈、 乙酸乙酯、 甲苯和环戊基甲基醚。
此外， 本发明还包括下述制备方法。(6) 一种制备通式 (X) 表示的化合物或其盐的方法 ：其中各取代基的定义如下 ：
R1 ： 氢原子或 C1-C6 烷基，
所述方法包括
使按照 (1) 的制备方法制备的通式 (I) 表示的化合物的羧基保护基脱去保护或者 进行该脱保护反应并进一步形成酸或盐。
发明的有利效果
本发明的制备方法可提供具有作为 α2δ 配体的良好活性的二环 γ- 氨基酸衍生 物、 制备所述衍生物的中间体、 或其盐。
实施方案的描述
“C1-C6 烷基” 是指具有 1-6 个碳原子的直链或支链烷基， 包括甲基、 乙基、 丙基、 异丙基、 丁基、 异丁基、 仲丁基、 叔丁基、 戊基、 异戊基、 2- 甲基丁基、 新戊基、 1- 乙基丙基、 己 基、 异己基、 4- 甲基戊基、 3- 甲基戊基、 2- 甲基戊基、 1- 甲基戊基、 3， 3- 二甲基丁基、 2， 2- 二 甲基丁基、 1， 1- 二甲基丁基、 1， 2- 二甲基丁基、 1， 3- 二甲基丁基、 2， 3- 二甲基丁基和 2- 乙 基丁基。
由于在结构中具有氨基和 / 或羧基的通式 (I) 表示的化合物等通过与酸或碱反应 形成盐， 因此 “盐” 或 “药理学上可接受的盐” 是指这种盐。 *
在本说明书的化合物的命名中， “” 表示具有由此标注的不对称碳原子的各种化 * * 合物为外消旋混合物。然而， 标识 “(1S ， 5R ， 6R*)-” 应根据相对构型表示其关系。
通式 (I) 表示的化合物等当放置在大气中或重结晶时， 可通过吸水而与吸附水缔 合形成水合物。本发明的盐还包括这类水合物。
“羧基保护基” 的实例包括甲基、 乙基、 丙基、 异丙基、 丁基、 异丁基、 仲丁基、 叔丁 基、 己基、 溴 - 叔丁基、 三氯乙基、 苄基、 对硝基苄基、 邻硝基苄基、 对甲氧基苄基、 对叔丁基 苄基、 乙酰氧基甲基、 丙酰氧基甲基、 丁酰氧基甲基、 异丁酰氧基甲基、 戊酰氧基甲基、 新戊 酰氧基甲基、 乙酰氧基乙基、 乙酰氧基丙基、 乙酰氧基丁基、 丙酰氧基乙基、 丙酰氧基丙基、 丁酰氧基乙基、 异丁酰氧基乙基、 新戊酰氧基乙基、 己酰氧基乙基、 异丁酰氧基甲基、 乙基丁
酰氧基甲基、 二甲基丁酰氧基甲基、 戊酰基氧基乙基、 甲氧基羰基氧基甲基、 乙氧基羰基氧 基甲基、 丙氧基羰基氧基甲基、 叔丁氧基羰基氧基甲基、 甲氧基羰基氧基乙基、 乙氧基羰基 氧基乙基、 异丙氧基羰基氧基乙基、 叔丁基二甲基甲硅烷基、 三甲基甲硅烷基、 甲氧基甲基、 乙氧基甲基、 丙氧基甲基、 异丙氧基甲基、 (2- 甲硫基 )- 乙基、 3- 甲基 -2- 丁烯基、 5- 茚满 基和 3-2- 苯并 [c] 呋喃酮基。保护基优选为叔丁基。
通式 (I) 表示的化合物中的羧基可通过使羧基脱保护的常用方法脱去保护， 以产 生通式 (X) 表示的化合物， 所述方法为例如， T.W.Greene 和 P.G.Wuts， “Protective Groupsin Organic Synthesis( 第 3 版， 1999)” 中披露的方法。
通式 (X) 表示的化合物或其药理学上可接受的盐具有作为 α2δ 配体的活性， 并 对电压依赖性钙通道亚基 α2δ 有亲和力， 可用作用于治疗和 / 或预防疼痛、 中枢神经系统 障碍和其它病症的药物组合物中的活性成分。
包含具有通式 (X) 的化合物或其药理学上可接受的盐的药物组合物， 当给予哺乳 动物 ( 例如人、 马、 牛或猪， 优选人 ) 时， 经由口服或胃肠外途径全身性或局部性给予。
可以根据给药方法选择的适当形式， 通过常用于各种制剂的配制方法来制备本发 明的药物组合物。
口服给药的药物组合物的形式包括片剂、 丸剂、 散剂、 颗粒剂、 胶囊剂、 溶液剂、 混 悬剂、 乳剂、 糖浆剂和酏剂。按照标准方法， 根据需要通过从以下中适当选择添加剂来制备 这类形式的药物组合物 ： 常用的赋形剂、 粘合剂、 崩解剂、 润滑剂、 膨胀剂、 膨胀助剂、 包衣 剂、 增塑剂、 稳定剂、 防腐剂、 抗氧化剂、 着色剂、 增溶剂、 助悬剂、 乳化剂、 甜味剂、 保存剂、 缓 冲剂、 稀释剂、 润湿剂等。
胃肠外给药的药物组合物的形式包括注射剂、 软膏剂、 凝胶剂、 乳膏剂、 泥罨剂、 贴 剂、 气雾剂、 吸入剂、 喷雾剂、 滴眼剂、 滴鼻剂和栓剂。 按照标准方法， 根据需要通过从以下中 适当选择添加剂来制备这类形式的药物组合物 ： 常用的稳定剂、 防腐剂、 增溶剂、 保湿剂、 保 存剂、 抗氧化剂、 香料、 胶凝剂、 中和剂、 增溶剂、 缓冲剂、 张度剂、 表面活性剂、 着色剂、 缓冲 剂、 增稠剂、 润湿剂、 填充剂、 吸收促进剂、 助悬剂、 粘合剂等。
具有通式 (X) 的化合物或其药理学上可接受的盐的剂量随症状、 年龄、 体重等而 不同， 对于口服给予成人 ( 体重 ： 约 60Kg) 为每剂 1-2000mg， 优选 10-600mg( 就化合物的量 而言 )， 对于胃肠外给予成人为每剂 0.1-1000mg， 优选 1-300mg( 就化合物的量而言 )。
实施例 ( 制剂实施例 )
使用混合器将 5g 具有通式 (X) 的化合物、 90g 乳糖、 34g 玉米淀粉、 20g 结晶纤维素 和 1g 硬脂酸镁混合， 然后用压片机压片， 得到片剂。
( 试验实施例 1) 人钙通道亚基 α2δ1( 下文称为人 Cacna2d1) 基因表达质粒的构 建以及表达人 Cacna2d1 的细胞膜部分的制备
a) 人 Cacna2d1 表达质粒 pRK/hCacna2d1 的构建
a-1)DNA 片段的制备
作为两个片段即前半片段和后半片段获得人 Cacna2d1 基因。使用 cDNA 文库 (QUICK-Clone cDNA Human Brain(Clontech Laboratories， Inc.)) 作为模板， 并且按照酶 KOD 聚合酶 (TOYOBO CO.， LTD.) 内包括的方案使用该酶进行了 PCR。对于前半片段， 所使用
的 PCR 引物是购自 SIGMA GENOSYS 的具有以下序列的引物 ：
引物 1 ： 5′ -agctgcggcc gctagcgcca ccatggctgg ctgcctgctg gc-3′ (SEQ ID NO ： 1)， 和
引物 2 ： 5′ -attaggatcg attgcaaagt aataccc-3′ (SEQ ID NO ： 2) ； 和
对于后半片段， 为具有以下序列的引物 ：
引物 3 ： 5′ -aatgggtatt actttgcaat cgatcc-3′ (SEQ ID NO ： 3)， 和
引物 4 ： 5′ -agtcggatcc tcataacagc cggtgtgtgc tg-3′ (SEQ ID NO ： 4)。
应用循环变温加热器 (GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems， Inc.))， 通过包括在 94℃下加热 1 分钟、 然后 35 次热循环 (94℃ 15 秒钟、 60℃ 30 秒钟和 68℃ 2 分 钟 )、 置于 68℃ 5 分钟并冷却至 4℃的步骤， 对前半片段和后半片段两者进行了 PCR 反应。
按 照 试 剂 盒 中 包 括 的 方 案， 采 用 PCR 产 物 纯 化 试 剂 盒 (MiniElute PCR Purification Kit(QIAGEN))， 对这两个反应产物进行纯化。 所得到的前半片段用限制性内 切酶 Not1(TOYOBO CO.， LTD.) 消化。后半片段用限制性内切酶 Cla1(TOYOBO CO.， LTD.) 和 BamH1(TOYOBO CO.， LTD.) 消化。随后按照试剂盒中包括的方案， 采用反应产物纯化试剂盒 (MiniElute Reaction Cleanup Kit(QIAGEN))， 对这些片段进行了纯化。 a-2) 载体的制备
将用于动物细胞的表达载体 pRK5(BD Pharmingen) 的多克隆位点 ( 下文称为 MCS) 变为载体 pBluescript 2(STRATAGENE) 的 MCS 以制备载体。准确地讲， 将 pRK5 用限制性内 切酶 Cla1(TOYOBO CO.， LTD.) 和 Hind3(TOYOBO CO.， LTD.) 处理， 然后， 使用 Klenow 片段 (TAKARA BIO INC.) 将该 DNA 的两端制成平端。使用小牛肠碱性磷酸酶 ( 下文称为 CIAP ； TAKARA BIO INC.) 使这两端进一步脱去磷酸， 然后使用 MiniElute Reaction Cleanup Kit(QIAGEN) 对片段进行纯化。 然后， 将该经酶处理的 DNA 在 1.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。 电泳后， 凝胶用溴化乙锭染色。然后， 在紫外线照射下用刀片分离相当于约 4.7kbp 的条带 部分。 按照试剂盒中包括的方案， 使用凝胶提取 / 纯化试剂盒 (MiniElute Gel Extraction Kit(QIAGEN))， 从条带中提取 DNA。
为了得到与 pBluescript 2 的 MCS 对应的 DNA 片段， 将 pBluescript2 用限制性 内切酶 Sac1(TOYOBO CO.， LTD.) 和 Kpn1(TOYOBO CO.， LTD.) 处理， 然后使用 Klenow 片段 (TAKARA BIO INC.)， 将该 DNA 的两端制成平端。 然后， 将该经酶处理的 DNA 在 2.0％琼脂糖 凝胶上进行电泳。电泳后， 凝胶用溴化乙锭染色。然后， 在紫外线照射下用刀片分离相当于 约 100bp 的条带部分。按照试剂盒中包括的方案， 使用凝胶提取 / 纯化试剂盒 (MiniElute Gel Extraction Kit(QIAGEN))， 从条带中提取 DNA。
按照试剂盒中包括的方案， 使用 DNA 连接试剂盒 (TAKARA BIO INC.)， 使所得到的 DNA 片段与已切割的 pRK5 连接。用该反应产物转化大肠杆菌 (E.coli)DH5α 感受态细胞 (TOYOBO CO.， LTD.)， 得到耐氨苄西林菌落。 收集一些菌落， 然后培养所收集的菌落。 从所得 到的细菌细胞中提取质粒， 并采用 DNA 序列分析仪 (3700 型 (Applied Biosystems， Inc.)) 分析其核苷酸序列， 以证实在 pRK5 中引入了 MCS 序列。在本文中， 载体中如果将 CMV 启动 子视为位于上游， 则掺入 MCS 序列使得其如下朝向下游方向 ： 5′ -ccaccgcggtggcggccgctc tagaactagtggatcccccgggctgcaggaattcgatatcaagcttatcgataccgtcgacctcgagggggggcccg3′ (SEQ ID NO ： 5)， 这种载体命名为 pRK-SK， 而将 MCS 序列以与之相反的方向掺入其中的
载体命名为 pRK-KS。
a-3) 质粒的构建
将在段落 a-2) 获得的 pRK-SK 用限制性内切酶 Xba1(TOYOBO CO.， LTD.) 处理， 使 用 Klenow 片段 (TAKARA BIO INC.) 将该 DNA 的两端制成平端。平端 DNA 进一步用限制性 内切酶 Not1(TOYOBO CO.， LTD.) 消化， 并按与段落 a-2) 同样的方法进行纯化。将由此成为 线性的该 pRK-SK 和在段落 a-1) 中得到的人 Cacna2d1 基因的头半段 DNA 片段在 1.0％琼 脂糖凝胶上进行电泳， 从凝胶中提取约 4.7kbp 和约 1.5kbp 的 DNA， 并按与段落 a-2) 同样 的方法进行纯化。按与段落 a-2) 同样的方法使所得到的两个 DNA 连接， 将大肠杆菌用连接 产物转化。从所得到的大肠杆菌克隆中提取质粒， 并用 DNA 序列分析仪 (3700 型 (Applied Biosystems， Inc.)) 分析其核苷酸序列以证实将 SEQ ID NO ： 6 所示序列引入其中。接下 来， 将所得质粒用限制性内切酶 Cla1(TOYOBO CO.， LTD.) 和 BamH1(TOYOBO CO.， LTD.) 处 理， 并按与段落 a-2) 相同的方法进行 CIAP 处理和纯化。将由此成为线性的该质粒 DNA 和 段落 a-1) 中得到的人 Cacna2d1 基因的后半段 DNA 片段在 1.0％琼脂糖凝胶上进行电泳， 从 凝胶中提取约 6.2kbp 和约 1.8kbp 的 DNA， 并按与段落 a-2) 同样的方法进行纯化。按与段 落 a-2) 同样的方法使所得到的两个 DNA 连接， 将大肠杆菌用连接产物转化。从所得到的大 肠杆菌克隆中提取质粒， 并用 DNA 序列分析仪 (3700 型 (Applied Biosystems， Inc.)) 分析 其核苷酸序列以证实 SEQ ID NO ： 7 所示序列引入到载体 pRK-SK 中。所得质粒命名为 pRK/ hCacna2d1。
b) 表达人 Cacna2d1 的 293 细胞系的获取
将 293 细胞用段落 a) 中构建的人 Cacna2d1 表达质粒 pRK/hCacna2d1 转染， 用 人 Cacna2d1 蛋白表达作为指标得到稳定表达人 Cacna2d1 的细胞系。准确地讲， 将 2×106 个 293 细胞接种到 φ6cm 培养皿中并培养 12 小时。然后， 使用转染试剂 Lipofectamine Plus(Invitrogen Corp.)， 按 照 试 剂 所 包 括 的 方 案， 将 细 胞 用 5μg pRK/hCacna2d1 和 0.5μg 新霉素抗性基因表达质粒 pSV2neo(Clontech) 共转染。
收集由此转染的细胞， 然后在稀释后接种到 φ15cm 培养皿中， 并在补充了 10 ％ 胎 牛 血 清 (Cansera International， Inc.) 和 500μg/ml G418(Invitrogen Corp.) 的 DMEM(Invitrogen Corp.) 中培养 2 周。分离出成功形成集落的新霉素耐受性细胞。在扩繁 培养后， 收集细胞， 细胞裂解物通过蛋白质印迹测定法评价， 以得到表达人 Cacna2d1 的 293 细胞系。在蛋白质印迹测定法中， 将抗 hCacna2d1 抗体 (Chemicon Inc.) 用作第一抗体。
c) 表达人 Cacna2d1 的 293 细胞的细胞膜部分的制备
将段落 b) 中得到的表达人 Cacna2d1 的 293 细胞在补充了 10％胎牛血清 (Cansera International， Inc.) 和 500μg/ml G418(Invitrogen Corp.) 的 DMEM(Invitrogen Corp.) 中 大 规 模 培 养 后， 收 集 细 胞。 将 蛋 白 酶 抑 制 剂 (Complete EDTA free(Roche Applied Science)) 以该试剂推荐的量加入结合测定缓冲液 (10mM MOPS(pH 7.4)、 10mM HEPES(pH 7.4)、 100mM NaCl) 中， 以制备膜部分制备缓冲液。 将收集的细胞用膜部分制备缓冲液洗涤， 然后使用超声发生器匀浆。然后使用离心机， 将匀浆物以 12,000rpm 于 4℃离心 1 小时。弃 去上清液， 将沉淀悬浮于膜部分制备缓冲液中。将从使用超声发生器进行超声处理到离心 后将沉淀悬浮的过程再重复三次， 所得悬液用作表达人 Cacna2d1 的细胞膜部分。由 280nm 波长下的紫外吸光度计算膜部分中所含蛋白质的总水平。( 试验实施例 2) 用于 Cacna2d1 与加巴喷丁 ( 下文称为 GBP) 之间的结合反应的检 测系统的构建， 以及试验化合物的 Cacna2d1/GBP 结合反应的抑制活性的检测
a) 用于 Cacna2d1 和 GBP 之间的结合反应的检测系统的构建
分 别 以 总 蛋 白 水 平 2.5mg/ml 的 终 浓 度 和 3H-GBP 4.5nM 的 终 浓 度， 将表达 3 3 人 Cacna2d1 的细胞膜部分和用放射性同位素 H 标记的 GBP( 下文称为 H-GBP ； Tocris Cookson Ltd.) 用 结 合 测 定 缓 冲 液 (10mM MOPS(pH 7.4)、 10mM HEPES(pH 7.4)、 100mM NaCl) 稀释， 以制备 120μl 的反应溶液， 接着将反应溶液于 4℃静置 3 小时。将该反应产 物加入滤板 (UniFilter 350GF/B(Whatman)) 的各孔中， 通过滤器过滤。然后， 将包括加入 350μl 结合测定缓冲液 (10mM MOPS(pH 7.4)、 10mM HEPES(pH 7.4)、 100mM NaCl) 和通过 滤器过滤的洗涤过程重复三次。将滤板充分干燥， 将底部密封。加入 50μl Microscint 20(PerkinElmer Inc.) 后， 也将上表面密封。 采用 TopCount(PerkinElmer Inc.) 统计来源 3 于保留在滤器上的放射性同位素 H 的辐射。从所得值中减去将未标记 GBP(SIGMA-ALDRICH INC.) 以 20μM 的终浓度加入本测定法中得到的值 ( 作为得自非特异性吸收的值 )， 所得值 3 用作 H-GBP 与 Cacna2d1 的特异性结合水平 ( 单位 ： “计数 (count)” )。
b) 试验化合物的 Cacna2d1/GBP 结合反应的抑制活性的检测 将各试验化合物以不同的浓度加入段落 a) 中构建的 Cacna2d1/GBP 结合反应检 测测定法中， 通过段落 a) 中描述的方法测定了结合水平。然后， 在将通过以 x nM 的浓 度加入化合物得到的 Cacna2d1/GBP 特异性结合水平定义为 “结合水平 [x]” 和与之相反 将 Cacna2d1/GBP 结合抑制率定义为 “抑制率 [x]” 的情况下， 根据以下方程式求出抑制率 (％ ) ：
抑制率 [x](％ ) ＝ (1-( 结合水平 [x]/ 结合水平 [0]))×100， 其中 3
结合水平 [0] 是指未加入化合物的情况下得到的 H-GBP 的结合水平。
将抑制率对浓度作图。 根据该结果， 计算 “IC50 值” ， IC50 值是抑制 50％的 Cacna2d1/ GBP 结合所需要的试验化合物的浓度。
( 制备实施例 1)
[6-( 氨基甲基 ) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸
(1-a)(2E)- 庚 -2， 6- 二烯酸
将 4- 戊烯醛 (4.45g， 51.4mmol) 和丙二酸 (6.41g， 61.6mmol) 溶于吡啶 (9.9mL) 中。向该溶液中加入哌啶 (1.9mL)， 然后将混合物在 90℃下搅拌 5 小时。使混合物冷却， 然 后加入 2N 盐酸使之呈酸性， 接着用乙醚萃取。有机层用饱和盐水洗涤后， 经无水硫酸镁干 燥， 然后将滤液减压浓缩。将残余物减压蒸馏， 得到目标化合物， 为无色油状物质 (3mmHg， 110-116℃， 3.27g， 50％ )。 1
H-NMR(400MHz ，CDCl 3 ) ： δ ppm ： 2.21-2.26(2H ，m) ， 2.32-2.37(2H ，m) ，
5.01-5.08(2H， m)， 5.75-6.87(2H， m)， 7.03-7.11(1H， m)。
(1-b) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 亚基乙酸叔丁酯
在 冰 冷 却 条 件 下， 将 草 酰 氯 (10mL) 滴 加 到 含 (2E)- 庚 -2， 6- 二 烯 酸 (3.27g， 25.9mmol) 的甲苯 (60mL) 溶液中。将混合物搅拌 20 分钟， 然后从冰水浴中移开， 逐渐加热 到室温。搅拌 50 分钟后， 在加热至回流下搅拌反应溶液 1 小时。使溶液冷却， 然后减压馏 出溶剂。再向残余物中加入甲苯， 然后再次减压馏出溶剂。将残余物溶于甲苯 (20mL) 中， 在 1 小时内将该溶液滴加到预先加热至 90 ℃的含三乙胺 (9.19g， 91mmol) 的甲苯 (20mL) 溶液中。完成滴加后， 再将混合物加热搅拌 2 小时。使反应溶液冷却， 然后用饱和盐水和水 稀释， 并通过硅藻土 (Celite) 过滤。把滤液分成有机层和水层。有机层然后用 1N 盐酸洗 涤， 然后经硫酸镁干燥， 并过滤。将滤液加入预先从含二甲氧基磷酰基乙酸叔丁酯 (5.98g， 25.9mmol) 的二甲氧基乙烷 (20mL) 溶液和氢化钠 ( ＞ 65％油， 986.7mg， 25.9mmol) 制备的 反应溶液中， 将混合物搅拌 1.5 小时。向反应溶液中依次加入氯化铵的饱和水溶液、 饱和盐 水和水， 用乙酸乙酯对反应溶液进行萃取。有机层经无水硫酸镁干燥， 然后过滤。减压馏出 溶剂后， 将残余物用硅胶柱色谱法纯化， 得到目标化合物， 为浅黄色油状物质 (1.73g， 32％， E/Z 混合物 )。 H-NMR(400MHz， CDCl3) ： δppm ：
主要异构体 ： 1.45(9H， S)， 2.29-2.35(1H， m)， 2.62-2.71(2H， m)， 2.89-2.98(1H， m)， 3.27-3.35(1H， m)， 3.92(1H， 宽峰 )， 5.47-5.49(1H， m)， 5.80-5.87(2H， m)。
次要异构体 ： 1.49(9H， s)， 2.42-2.48(1H， m)， 2.62-2.71(2H， m)， 2.89-2.98(2H， m)， 4.34-4.36(1H， m)， 5.37-5.38(1H， m)， 5.61-5.64(2H， m)。
(1-c)[6-( 硝基甲基 ) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯
将二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 亚基乙酸叔丁酯 (1.73g， 8.39mmol) 溶于硝基甲烷 (10mL) 中。向该溶液中加入 1， 8- 二氮杂二环 [5.4.0] 十一碳 -7- 烯 (1.3mL， 8.4mmol)， 将 混合物在室温下搅拌 1 小时， 然后在 50-60℃下加热搅拌 5 小时。使混合物冷却， 然后用 1N 盐酸和饱和盐水稀释， 接着用乙酸乙酯萃取。然后， 将有机层经无水硫酸镁干燥后， 减压馏 出溶剂。将残余物用硅胶柱色谱法纯化， 得到目标化合物， 为无色油状物质 (1.98g， 89％ )。 1
H-NMR(400MHz， CDCl3) ： δppm ： 1.45(9H， s)， 1.53(1H， dd， J ＝ 7.5， 12.9Hz)， 2.17(1H， d， J ＝ 15.2Hz)， 2.31(1H， ddd， J ＝ 2.4， 8.6， 12.1Hz)， 2.47(2H， s)， 2.52-2.58(1H， m)， 2.87(1H， 五重峰， J ＝ 7.5Hz)， 3.25-2.66(1H， m)， 4.78(1H， d， J ＝ 11.4Hz)， 4.87(1H， d， J ＝ 11.4Hz)， 5.65-5.67(1H， m)， 5.95(1H， dd， J ＝ 1.6， 5.9Hz)。
(1-d)[6-( 氨基甲基 ) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯
将 [6-( 硝基甲基 ) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯 (1.98g， 7.41mmol) 溶 于 乙 醇 (20mL) 和 水 (10mL) 中。 向 该 溶 液 中 加 入 铁 粉 (2.07g， 37.0mmol) 和 氯 化 铵 (392.7mg， 7.41mmol)， 在加热至回流下将混合物搅拌 4.5 小时。使混合物冷却， 然后用饱和 盐水、 碳酸氢钠饱和水溶液和乙酸乙酯稀释， 并通过硅藻土过滤除去不溶物质。 把滤液分成 有机层和水层。有机层用饱和盐水洗涤， 然后经无水硫酸镁干燥。然后， 减压馏出溶剂， 得 到目标化合物， 为浅黄色固体 (1.99g， 该化合物在未纯化的情况下便直接用于下一反应 )。 1
H-NMR(400MHz， CDCl3) ： δppm ： 1.39-1.49(1H， m)， 1.44(9H， s)， 1.97(1H， ddd， J＝ 2.8， 9.0， 11.7Hz)， 2.14(1H， dd， J ＝ 2.3， 16.8Hz)， 2.25(1H， d， J ＝ 13.7Hz)， 2.32(1H， d， J
11＝ 13.7Hz)， 2.47-2.55(1H， m)， 2.75(1H， 五重峰， J ＝ 7.4Hz)， 2.88(2H， s)， 2.98-2.99(1H， m)， 5.77-5.79(1H， m)， 5.87-5.89(1H， m)。
(1-e)[6-( 氨基甲基 ) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸
将 4N 含 盐 酸 的 乙 酸 乙 酯 (10mL) 溶 液 加 入 [6-( 氨 基 甲 基 ) 二 环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯 (0.99g， 4.17mmol) 中， 将混合物在室温下搅拌 1 小时。然 后， 减压馏出溶剂。通过加入二氯甲烷使残余物悬浮。然后向悬浮液中滴加三乙胺， 经过 滤收集所得粉末。所得粉末用二氯甲烷洗涤， 然后减压干燥， 得到目标化合物， 为白色粉末 (211.6mg， 35％ )。 1
H-NMR(400MHz， CDCl3) ： δppm ： 1.49(1H， dd， J ＝ 7.6， 12.5Hz)， 2.06(1H， ddd， J ＝ 2.6， 7.6， 12.5Hz)， 2.17(1H， dd， J ＝ 2.6， 16.8Hz)， 2.49(2H， s)， 2.48-2.56(1H， m)， 2.86(1H， 五重峰， J ＝ 7.6Hz)， 3.15-3.16(1H， m)， 3.18(1H， d， J ＝ 12.7Hz)， 3.22(1H， d， J ＝ 12.7Hz)， 5.75-5.78(1H， m)， 5.91-5.93(1H， m)。
( 制备实施例 2)
[6-( 氨基甲基 ) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸盐酸盐
将水 (5mL) 和 4N 含盐酸的 1， 4- 二氧杂环己烷 (22mL) 溶液加入 6-( 氨基甲基 ) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸 (320.2mg， 1.77mmol) 中， 将混合物在室温下搅拌 5 分 钟。减压馏出溶剂。向残余物中加入 1， 4- 二氧杂环己烷， 将混合物加热， 然后使之冷却到 室温。经过滤收集所得粉末。将所得粉末用 1， 4- 二氧杂环己烷洗涤， 然后干燥， 得到目标 化合物， 为白色粉末 (350.0mg， 92％ )。 1
H-NMR(400MHz， CD3OD) ： δppm ： 1.51(1H， dd， J ＝ 7.6， 12.7Hz)， 2.16(1H， ddd， J ＝ 2.8， 7.6， 15.6Hz)， 2.19(1H， dd， J ＝ 2.2， 16.8Hz)， 2.51(2H， s)， 2.53-2.59(1H， m)， 2.89(1H， 五重峰， J ＝ 7.6Hz)， 3.18-3.19(1H， m)， 3.33(1H， d， J ＝ 13.3Hz)， 3.37(1H， d， J ＝ 13.3Hz)， 5.70-5.73(1H， m)， 5.97-6.00(1H， m)。
( 制备实施例 3) [6-( 氨基甲基 ) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸苯磺酸盐将 6-( 氨 基 甲 基 ) 二 环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙 酸 (152.2g， 391mmol) 溶 于 2- 丙醇 (7.5mL) 和水 (2.6mL) 中。然后向该溶液中加入苯磺酸一水合物 (305.2mg， 1.73mmol)， 将混合物在室温下搅拌 5 分钟。 减压馏出溶剂， 接着用 2- 丙醇进一步共沸脱水。
然后， 将残余物用 2- 丙醇洗涤， 得到目标化合物， 为白色粉末 (260.4mg， 55％ )。 1
H-NMR(400MHz， CD3OD) ： δppm ： 1.51(1H， dd， J ＝ 7.4， 12.7Hz)， 2.12-2， 21(2H， m)， 2.51(2H， s)， 2.51-2.59(1H， m)， 2.89(1H，五 重 峰， J ＝ 7.4Hz)， 3.17-3.18(1H， m)， 3.32(1H， d， J ＝ 13.3Hz)， 3.36(1H， d， J ＝ 13.3Hz)， 5.69-5.71(1H， m)， 5.97-6.00(1H， m)， 7.40-7.46(3H， m)， 7.80-7.84(2H， m)。
( 制备实施例 4)
[6- 氨基甲基 -3- 甲基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸
(4-a)4- 甲基 -3- 羟基庚 -6- 烯酸甲酯
在冰冷却条件下， 将氢化钠 ( ＞ 63％油， 1.64g， 43.1mmol) 加入含 3- 氧代戊酸甲 酯 (5.10g， 39.2mmol) 的四氢呋喃 (50mL) 溶液中， 将混合物在该状态下搅拌 10 分钟。向反 应溶液中滴加正丁基锂 (1.66M 的己烷溶液， 25.9mL， 43.1mmol)， 将混合物在冰冷却条件下 再搅拌 10 分钟。然后， 向其中加入烯丙基溴 (5.18g， 43.1mmol)， 将混合物在该状态下搅拌 30 分钟， 然后再在室温下搅拌过夜。向反应溶液中加入 1N 盐酸和饱和盐水， 接着用乙醚萃 取。有机层用饱和盐水洗涤后， 经无水硫酸镁干燥， 减压馏出溶剂。将所得残余物溶于甲醇 (100mL)。在冰冷却条件下， 向该溶液中加入硼氢化钠 (1.89g， 50mmol)， 将混合物在该状态 下搅拌 1.5 小时。向其中加入 2N 盐酸 (50mL) 后， 将混合物搅拌 30 分钟。然后， 向其中加 入饱和盐水， 接着用乙酸乙酯萃取。将有机层用饱和盐水洗涤， 然后经无水硫酸镁干燥， 减 压馏出溶剂。将残余物用硅胶柱色谱法纯化， 得到目标化合物， 为浅黄色油状物质 (5.72g， 85％， 非对映体的混合物 )。
H-NMR(400MHz ，CDCl 3 ) ： δ ppm ： 0.89-0.94(3H ，m) ， 1.58-1.75(1H ，m) ， 1.91-2.03(1H， m)， 2.21-2.33(1H， m)， 2.43-2.56(2H， m)， 3.72(3H， s)， 3.84-4.00(1H， m)， 5.01-5.07(2H， m)， 5.74-5.84(1H， m)。
(4-b)4- 甲基 -3- 羟基庚 -6- 烯酸
1将 4- 甲基 -3- 羟基庚 -6- 烯酸甲酯 (5.72g， 33.2mmol) 溶于 2N 含氢氧化钾的甲 醇 (50mL) 溶液中， 将该溶液在室温下搅拌过夜。从反应溶液中减压馏出溶剂。然后向残余 物中加入 1N 氢氧化钠水溶液， 接着再次用乙醚萃取。在冰冷却条件下通过加入浓盐酸使水 层酸化， 接着再次用乙醚萃取。有机层用饱和盐水洗涤后， 经无水硫酸镁干燥。然后， 减压 馏出溶剂， 得到目标化合物， 为黄色油状物质 (2.21g， 42％， 非对映体的混合物 )。 1
H-NMR(400MHz ，CDCl 3 ) ： δ ppm ： 0.90-0.94(3H ，m) ， 1.64-1.74(1H ，m) ， 1.93-2.00(1H， m)， 2.24-2.32(1H， m)， 2.45-2.61(2H， m)， 3.87-4.03(1H， m)， 5.03-5.08(2H， m)， 5.75-5.83(1H， m)。
(4-c)3- 甲基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 亚基乙酸叔丁酯
将 4- 甲基 -3- 羟基庚 -6- 烯酸 (2.21g， 13.9mmol) 溶于乙酸酐 (14mL)。向该溶
液中加入乙酸钾 (3.29g， 33.4mmol)， 将混合物在室温下搅拌 2 小时。将反应溶液加热至 110-120℃并搅拌 3.5 小时。然后向反应溶液中加入冰水和甲苯， 将该混合物在室温下搅拌 1 小时。通过加入饱和盐水和甲苯， 使混合物分成水层和有机层。然后， 将有机层依次用 1N 氢氧化钠水溶液和饱和盐水洗涤， 然后经无水硫酸镁干燥， 然后过滤。 将滤液加入通过在冰 冷却条件下将氢化钠 ( ＞ 63％油， 533.3mg， 14.0mmol) 加入含二甲氧基磷酰基乙酯叔丁酯 (3.24g， 14.5mmol) 的四氢呋喃 (20mL) 溶液中而制备的反应溶液中， 将混合物再搅拌 1.5 小 时。通过加入氯化铵的饱和水溶液和饱和盐水使反应溶液分成水层和有机层。将水层用乙 酸乙酯进行萃取。合并有机层， 然后用饱和盐水洗涤， 随后经无水硫酸镁干燥。减压馏出溶 剂后， 将残余物用硅胶柱色谱法纯化， 得到目标化合物， 为浅黄色油状物质 (1.21g， 40％， E/ Z 混合物 )。 1
H-NMR(400MHz， CDCl3) ： δppm ：
主要异构体 ： 1.45(9H， s)， 2.11-2.22(4H， m)， 2.59-2.71(2H， m)， 2.87-2.97(1H， m)， 3.26-3.34(1H， m)， 3.87(1H， 宽峰 )， 5.22-5.23(1H， m)， 5.45-5.47(1H， m)。
次要异构体 ： 1.49(9H， s)， 2.11-2.21(4H， m)， 2.43-2.46(1H， m)， 2.59-2.70(1H， m)， 2.75-2.83(1H， m)， 2.87-2.97(1H， m)， 4.29(1H， 宽峰 )， 5.36(1H， s)， 5.59(1H， s)。
(4-d)[3- 甲基 -6-( 硝基甲基 ) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯
将 3- 甲基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 亚基乙酸叔丁酯 (1.21g， 5.50mmol) 溶于硝 基甲烷 (7mL)。 向该溶液中加入 1， 8- 二氮杂二环 [5.4.0] 十一碳 -7- 烯 (0.91mL， 6.0mmol)， 将混合物在 50-60℃下加热搅拌 6 小时。 使混合物冷却， 然后向其中加入磷酸二氢钾饱和水 溶液， 接着用乙酸乙酯萃取。然后， 有机层经无水硫酸镁干燥后， 减压馏出溶剂。将残余物 用硅胶柱色谱法纯化， 得到目标化合物， 为无色油状物质 (1.14g， 74％ )。 1
H-NMR(400MHz， CDCl3) ： δppm ： 1.45(9H， s)， 1.53(1H， dd， J ＝ 7.6， 12.9Hz)， 1.80(3H， s)， 2.04(1H， d， J ＝ 16.4Hz)， 2.29(1H， ddd， J ＝ 2.8， 7.6， 12.9Hz)， 2.47(2H， s)， 2.49(1H， dd， H ＝ 7.6， 16.4Hz)， 2.86(1H， 五重峰， J ＝ 7.6Hz)， 3.21-3.22(1H， m)， 4.74(1H， d， J ＝ 11.7Hz)， 4.84(1H， J ＝ 11.7Hz)， 5.25(1H， s)。
(4-e)[6- 氨基甲基 -3- 甲基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯
将 [3- 甲基 -6-( 硝基甲基 ) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯 (1.12g， 3.99mmol) 溶于乙醇 (20mL) 和水 (10mL)。向该溶液中加入铁粉 (892.8mg， 15.9mmol) 和氯 化铵 (211.5mg， 3.99mmol) 后， 将混合物在加热至回流下搅拌 4 小时。使混合物冷却， 然后 用饱和盐水、 碳酸氢钠饱和水溶液和乙酸乙酯稀释， 并通过硅藻土过滤除去不溶物质。 把滤 液分成有机层和水层。 将有机层用饱和盐水洗涤， 然后经无水硫酸镁干燥， 然后减压馏出溶 剂。向残余物中加入 4N 含盐酸的乙酸乙酯 (5mL) 溶液， 将混合物在室温下搅拌 1 小时。然 后减压馏出溶剂。将残余物悬浮于二氯甲烷中。向悬浮液中滴加三乙胺， 经过滤收集所得 粉末， 然后用二氯甲烷洗涤， 然后干燥， 得到目标化合物， 为白色粉末 (105.8mg， 28％ )。 1
H-NMR(400MHz， CD3OD) ： δppm ： 1.40(1H， dd， J ＝ 7.6， 12.3Hz)， 1.79(3H， s)， 2.02-2.08(2H， m)， 2.43-2.50(1H， m)， 2.45(1H， d， J ＝ 16.2Hz)， 2.51(1H， d， J ＝ 16.2Hz)， 2.85(1H， 五重峰， J ＝ 7.6Hz)， 3.05-3.12(1H， m)， 3.13(1H， d， J ＝ 13.0Hz)， 3.17(1H， d， J ＝ 13.0Hz)， 5.36(1H， t， J ＝ 1.6Hz)。
( 制备实施例 5)[6- 氨基甲基 -3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸(5-a)4- 乙基 -3- 羟基庚 -6- 烯酸乙酯
在冰冷却条件下， 将氢化钠 ( ＞ 63％油， 2.09g， 55mmol) 加入含 3- 氧代己酸乙酯 (7.91g， 50mmol) 的四氢呋喃 (50mL) 溶液中， 将混合物在该状态下搅拌 10 分钟。向反应溶 液中滴加正丁基锂 (1.58M 的己烷溶液， 34.8mL， 55mmol)， 将混合物在冰冷却条件下再搅拌 10 分钟。然后向其中加入烯丙基溴 (4.7mL， 55mmol)， 将混合物在该状态下搅拌 1 小时， 然 后在室温下再搅拌 4 小时。向反应溶液中加入 1N 盐酸和氯化铵的饱和水溶液， 接着用正戊 烷萃取。有机层用饱和盐水洗涤后， 经无水硫酸镁干燥， 减压馏出溶剂。将所得残余物溶于 乙醇 (80mL)。在冰冷却条件下， 向该溶液中加入硼氢化钠 (1.51g， 40mmol)， 将混合物在该 状态下搅拌 2 小时。向其中加入 1N 盐酸 (50mL)， 并将混合物搅拌 30 分钟。然后， 向其中加 入饱和盐水， 接着用乙酸乙酯萃取。将有机层用饱和盐水洗涤， 然后经无水硫酸镁干燥， 减
压馏出溶剂。将残余物用硅胶柱色谱法纯化， 得到目标化合物， 为浅黄色油状物质 (3.64g， 37％， 非对映体的混合物 )。 1
H-NMR(400MHz， CDCl3) ： δppm ： 0.91(3H， t， J ＝ 7.5Hz)， 1.28(3H， t， J ＝ 7.2Hz)， 1.43-1.55(2H， m)， 1.98-2.28(2H， m)， 2.45-2.48(2H， m)， 2.88-2.93(1H， m)， 4.07-4.10(1H， m)， 4.10-4.20(2H， m)， 5.01-5.09(2H， m)， 5.75-5.86(1H， m)。
(5-b)4- 乙基 -3- 羟基庚 -6- 烯酸
将 4- 乙基 -3- 羟基庚 -6- 烯酸乙酯 (3.64g， 18.2mmol) 溶于 2N 含氢氧化钾的甲醇 (120mL) 溶液中， 将该溶液在室温下搅拌过夜。 从反应溶液中减压馏出溶剂。 然后向残余物 中加入 1N 氢氧化钠水溶液 (200mL)， 接着用乙醚萃取。在冰冷却条件下通过加入浓盐酸使 水层酸化， 接着再次用乙醚萃取。有机层用饱和盐水洗涤后， 经无水硫酸镁干燥。然后， 减 压馏出溶剂， 得到目标化合物， 为浅黄色油状物质 (3.14g， ＜ 100％， 非对映体的混合物 )。 1
H-NMR(400MHz ，CDCl 3 ) ： δ ppm ： 0.91-0.96(3H ，m) ， 1.39-1.52(3H ，m) ， 2.01-2.28(2H， m)， 2.52-2.55(2H， m)， 4.05-4.15(2H， m)， 5.03-5.10(2H， m)， 5.74-5.86(1H， m)。
(5-c)3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 亚基乙酸叔丁酯
将 4- 乙基 -3- 羟基庚 -6- 烯酸 (3.13g， 18.2mmol) 溶于乙酸酐 (15mL)。向该溶 液中加入乙酸钾 (4.27g， 43.6mmol)， 将混合物在室温下搅拌 100 分钟。将反应溶液加热至 回流并搅拌 3.5 小时， 以在反应溶液中形成 “3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -6- 烯 -6- 酮” 。然后 向反应溶液中加入冰水和甲苯， 将混合物在室温下搅拌过夜。通过加入饱和盐水 (50mL) 和 甲苯 (20mL) 使混合物分成水层和有机层。然后， 将有机层依次用 1N 氢氧化钠水溶液和饱 和盐水洗涤， 然后经无水硫酸镁干燥， 过滤。将滤液加入通过在冰冷却条件下将氢化钠 ( ＞ 65％油， 761.9mg， 20mmol) 加入含二甲氧基磷酰基乙酯叔丁酯 (4.48g， 20mmol) 的四氢呋喃(50mL) 溶液中而制备的反应溶液中， 将混合物再搅拌 1 小时。通过加入氯化铵的饱和水溶 液和饱和盐水， 使反应溶液分成水层和有机层。水层用乙酸乙酯进行萃取。合并有机层， 然 后用饱和盐水洗涤， 之后经无水硫酸镁干燥。 减压馏出溶剂后， 将残余物用硅胶柱色谱法纯 化， 得到目标化合物， 为浅黄色油状物质 (1.32g， 31％， E/Z 混合物 )。 1
H-NMR(400MHz， CDCl3) ： δppm ：
主 要 异 构 体： 1.06(3H， t， J ＝ 7.4Hz)， 1.45(9H， s)， 2.07-2.22(3H， m)， 2.59-2.70(2H， m)， 2.87-2.96(1H， m)， 3.30(1H， ddt， J ＝ 8.6， 18.4， 2.7Hz)， 3.86-3.88(1H， m)， 5.22-5.23(1H， m)， 5.45-5.47(1H， m)。
次 要 异 构 体： 1.08(3H， t， J ＝ 7.3Hz)， 1.49(9H， s)， 2.07-2.21(3H， m)， 2.43-2.47(1H， m)， 2.59-2.70(1H， m)， 2.75-2.85(1H， m)， 2.87-2.96(1H， m)， 4.28-4.31(1H， m)， 5.35-5.38(1H， m)， 5.45-5.47(1H， m)。
(5-d)[3- 乙基 -6-( 硝基甲基 ) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯
将 [3- 乙 基 二 环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 亚 基 乙 酸 叔 丁 酯 (1.32g， 5.63mmol) 溶 于硝基甲烷 (7mL) 中。向该溶液中加入 1， 8- 二氮杂二环 [5.4.0] 十一碳 -7- 烯 (1.2mL， 7.3mmol)， 将混合物在 50-60℃下加热搅拌 7 小时。使混合物冷却， 然后向其中加入磷酸二 氢钾饱和水溶液， 接着用乙酸乙酯萃取。 然后， 将有机层经无水硫酸镁干燥， 减压馏出溶剂。 将残余物用硅胶柱色谱法纯化， 得到目标化合物， 为无色油状物质 (1.39g， 84％ )。 H-NMR(400MHz， CDCl3) ： δppm ： 1.09(3H， t， J ＝ 7.4Hz)， 1.46(9H， s)， 1.52(1H， dd， J ＝ 7.6， 13.2Hz)， 2.06(1H， d， 16.6Hz)， 2.14(2H， q， J ＝ 7.4Hz)， 2.30(1H， ddd， J ＝ 2.4， 7.6， 13.2Hz)， 2.47(2H， s)， 2.49(1H， dd， J ＝ 7.6， 16.6Hz)， 2.86(1H， 五重峰， J ＝ 7.6Hz)， 3.21-3.22(1H， m)， 4.75(1H， d， J ＝ 11.7Hz)， 4.84(1H， d， J ＝ 11.7Hz)， 5.27(1H， s)。
(5-e)[6- 氨基甲基 -3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸
将 [3- 乙基 -6-( 硝基甲基 ) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯 (1.09g， 4.71mmol) 溶于乙醇 (10mL) 和水 (5mL) 中。向该溶液中加入铁粉 (1.32g， 23.5mmol) 和氯 化铵 (249.6mg， 4.71mmol)， 将混合物在加热至回流下搅拌 2 小时。 使混合物冷却， 然后用饱 和盐水、 碳酸氢钠饱和水溶液和乙酸乙酯稀释， 并通过硅藻土过滤除去不溶物质。 把滤液分 成有机层和水层。将有机层用饱和盐水洗涤， 然后经无水硫酸镁干燥， 之后减压馏出溶剂。 向残余物中加入 4N 含盐酸的乙酸乙酯 (20mL) 溶液， 将混合物在室温下搅拌 1 小时。然后， 减压馏出溶剂。将残余物悬浮于二氯甲烷中。向悬浮液中滴加三乙胺， 经过滤收集所得粉 末， 然后用二氯甲烷洗涤， 之后干燥， 得到目标化合物， 为白色粉末 (425.1mg， 43％ )。 1
H-NMR(400MHz ， CD 3OD) ： δ ppm ： 1.10(3H， t， J ＝ 7.4Hz) ， 1.48(1H， dd ， J ＝ 7.5， 12.5Hz)， 2.03-2.08(2H， m)， 2.14(2H， q， J ＝ 7.4Hz)， 2.46(1H， d， J ＝ 16.2Hz)， 2.46-2.53(1H， m)， 2.51(1H， d， J ＝ 16.2Hz)， 2.85(1H， 五重峰， J ＝ 7.5Hz)， 3.09-3.10(1H， m)， 3.14(1H， d， J ＝ 13.0Hz)， 3.18(1H， d， J ＝ 13.0Hz)， 5.38(1H， dd， J ＝ 1.7， 3.7Hz)。
( 制备实施例 6)
[6- 氨基甲基 -3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸对甲苯磺酸盐
1将 [6-( 叔丁氧基羰基氨基 ) 甲基 -3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔 丁酯 (1152.23g， 391.6mmol) 溶于苯 (1.2L) 中。 然后向该溶液中加入苯硫基甲烷 (145.57g， 1173mmol) 和对甲苯磺酸一水合物 (89.39g)， 将混合物在回流下搅拌 2 小时。使混合物在 室温下静置过夜， 经过滤收集所得粉末。将所得粉末用乙酸乙酯洗涤， 然后干燥， 得到目标 化合物， 为白色粉末 (88.29g， 59％ )。 1
H-NMR(400MHz ， CD3OD) ： δ ppm ： 1.11(3H ， t， J ＝ 7.4Hz) ， 1.51(1H ， dd ， 7.4 ， 12.7Hz)， 2.06-2,20(4H， m)， 2.37(3H， s)， 2.49-2.56(1H， m)， 2.51(2H， s)， 2.87(1H，五 重 峰， J ＝ 7.4Hz)， 3.12-3.14(1H， m)， 3.28(1H， d， J ＝ 13.5Hz)， 3.33(1H， d， J ＝ 13.5Hz)， 5.31-5.32(1H， m)， 7.21-7.25(2H， m)， 7.69-7.72(2H， m)。
( 制备实施例 7)
[6-( 氨基甲基 )-3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸苯磺酸盐通过在 1M 苯磺酸一水合物水溶液 (22.7mL) 中加热使 6-( 氨基甲基 )-3- 乙基二 环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸 (4.50g， 20.6mmol) 溶解， 然后使溶液冷却到室温。经过 滤收集所得固体。将固体用水 (15mL) 洗涤， 然后用真空泵干燥， 得到目标化合物， 为无色固 体 (6.45g， 77％ )。 1
H-NMR(400MHz， CD3OD) ： δppm ： 1.11(3H， t， J ＝ 7.4Hz)， 1.50(1H， dd， J ＝ 7.5， 12.6Hz)， 2.08(1H， d， 16.5Hz)， 2.10-2.20(3H， m)， 2.46-2.56(3H， m)， 2.87(1H， 五重峰， J＝ 7.5Hz)， 3.12-3.13(1H， m)， 3.28(1H， d， J ＝ 13.4Hz)， 3.33(1H， d， J ＝ 13.4Hz)， 5.31(1H， d， J ＝ 1.8Hz)， 7.39-7.45(3H， m)， 7.80-7.85(2H， m)。
( 还原硝基的步骤 ) ( 制备实施例 8) [6- 氨基甲基 -3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯
将阮内镍 (Raney nickel)(102.3g， 0.15w/w) 和乙醇 (5.5L， 8.0v/w) 加入 [3- 乙基 -6-( 硝基甲基 ) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯 (709.0g， 净重 ： 681.8g， 2.31mol， 85 ∶ 15 非对映体的混合物 ) 中， 并搅拌混合物。向反应溶液中加入一水合肼 (458.0ml， 9.23mol， 4.00eq.)， 并将混合物在 40℃下搅拌 2 小时。使混合物冷却至室温后， 滤出阮内镍。然后， 馏出溶剂， 得到目标化合物， 为褐色油状物质 (637.0g， 净重 ： 552.3g， 收 率： 90.2％， 85 ∶ 15 非对映体的混合物 )。 1
H-NMR(400MHz ，CDCl 3 ) ： δ ppm ： 1.05-1.10( 各 个 t) ， 1.44-1.61(m) ， 1.86-2.38(m)， 2.42-2.55(m)， 2.73-3.05(m)， 5.40-5.48(m)。
(ii)
将阮内镍 (96mg， 0.16w/w) 和乙醇 (200μL) 加入 [3- 乙基 -6-( 硝基甲基 ) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯 (59mg， 85 ∶ 15 非对映体的混合物 ) 中， 在氢气氛 下， 将混合物在室温下搅拌 12 小时。滤出阮内镍。然后， 馏出溶剂， 得到目标化合物， 为褐 色油状物质 (49mg， 收率 ： 92％， 85 ∶ 15 非对映体的混合物 )。
( 制备实施例 9)
[6-( 氨基甲基 ) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯
将 阮 内 镍 (0.4g) 和 乙 醇 (24ml) 加 入 [6-( 硝 基 甲 基 ) 二 环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯 (4.0g， 90 ∶ 10 非对映体的混合物 ) 中， 并搅拌混合物。向 反应溶液中加入一水合肼 (2.9ml)， 将混合物搅拌 0.5 小时。 通过薄层色谱法证实起始原料 的消耗， 然后滤出阮内镍。将溶剂馏出， 得到目标化合物， 为褐色油状物质 (3.62g， 90 ∶ 10 非对映体的混合物 )。
薄层色谱法展开剂 ： 己烷∶乙酸乙酯＝ 9 ∶ 1
硝基形式的 Rf 值 ： 0.7， 还原形式的 Rf 值 ： 0.1( 带拖尾 ) 1
H-NMR(400MHz， CDCl3) ： δppm ： 1.44-1.51(m)， 1.93-2.17(m)， 2.23-2.35(m)， 2.48-2.60(m)， 2.70-2.90(m)， 2.95-3.30(m)， 5.75-5.80(m)， 5.83-5.90(m)。
( 制备实施例 10)
[6- 氨基甲基 -3- 甲基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯
将 阮 内 镍 (0.28g) 和 乙 醇 (20ml) 加 入 [6-( 硝 基 甲 基 )-3- 甲 基 二 环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯 (2.81g， 90 ∶ 10 非对映体的混合物 ) 中， 并搅拌混合物。 向反 应溶液中加入一水合肼 (1.9ml)， 将混合物搅拌 0.75 小时。通过薄层色谱法证实起始原料 的消耗， 然后滤出阮内镍。将溶剂馏出， 得到目标化合物， 为褐色油状物质 (2.50g， 90 ∶ 10 非对映体的混合物 )。
薄层色谱法展开剂 ： 己烷∶乙酸乙酯＝ 9 ∶ 1
硝基形式的 Rf 值 ： 0.7， 还原形式的 Rf 值 ： 0.1( 带拖尾 )
18102356061 A CN 102356071
1说明书16/22 页H-NMR(400MHz， CDCl3) ： δppm ： 1.44-1.61(m)， 1.80-1.90(m)， 1.93-2.06(m)， 2.10-2.20(m) ， 2.23-2.38(m) ， 2.40-2.60(m) ， 2.73-2.90(m) ， 2.92-3.30(m) ， 5.40-5.45(m)。
( 拆分非对映体的步骤 )
( 制备实施例 11)
[(1R*， 5S*， 6S*)-6- 氨基甲基 -3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯 对甲苯磺酸盐
将 乙 酸 乙 酯 (70ml， 10.4v/w) 加 入 [6- 氨 基 甲 基 -3- 乙 基 二 环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯 (7.8g， 纯度 ： 86.7 ％， 22.03mmol， 87 ∶ 13 非对映体的混合 物 ) 中， 并将混合物在室温下搅拌。加入对甲苯磺酸一水合物 (4.2g， 22.03mmol， 0.87eq.) 后， 将混合物在室温下搅拌 3 小时， 经过滤收集晶体。然后， 在 40℃的条件下将晶体减压干 * * * 燥， 得到 [(1R ， 5S ， 6S )-6- 氨基甲基 -3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯 对甲苯磺酸盐， 为白色晶体 (7.8g， 收率 ： 80.6％， 非对映体比率 ： 99.7 ∶ 0.3)。 1
H-NMR(400MHz ， DMSO-d6) ： δ ppm ： 1.04(3H ， t， J ＝ 7.4Hz) ， 1.31-1.40(1H ， m)， 1.40(9H， s)， 1.98-2.15(4H， m)， 2.25(3H， s)， 2.25-2.50(3H， m)， 2.76(1H，五 重 峰， J ＝ 7.4Hz)， 3.05-3.18(3H， m)， 3.35(1H， br s)， 5.20-5.22(1H， m)， 7.10-7.12(2H， m)， 7.45-7.48(2H， m)， 7.74(1H， brs)。
C23H35NO5S 的分析计算值 ： C， 63.13 ； H， 8.06 ； N， 3.20 ； S， 7.33 ； 实测值 C， 63.10 ； H， 8.14 ； N， 3.29 ； S， 7.30。
GC 分析条件 ( 非对映体比率测定 )
柱： 用于胺的 CP-Sil 8CB(GL Science， 30m×0.25mm， 0.25μm)
检测器 ： FID
温度 ： 柱式加热炉 (130℃ )， 注射 (250℃ )， 检测器 (250℃ )
温度条件 ： (i)130℃ (5.5 分钟 )， (ii)130-270℃ (10℃ / 分钟 )， (iii)270℃ (4.5 分钟 )
流速 ： 1.5ml/ 分钟 ( 平均线速度 ： 38cm/ 秒钟 )
分流比 ： 1/10
载气 ： 氦气
分析时间 ： 25 分钟
削减峰值 (Peak cut) ： 0.0-2.0 分钟
保留时间 ： 13.8 分钟， 14.0 分钟
( 光学拆分步骤 )
( 制备实施例 12)
[(1R， 5S， 6S)-6- 氨基甲基 -3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯羧 酸盐 ( 旋光羧酸盐 )
将 [(1R*， 5S*， 6S*)-6- 氨基甲基 -3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔 丁酯对甲苯磺酸盐悬浮于乙酸乙酯 (20v/w) 中。通过加入碳酸氢钠水溶液 (4v/w) 将悬浮 液分成水层和有机层， 得到游离形式的 [(1R*， 5S*， 6S*)-6- 氨基甲基 -3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯。向该 [(1R*， 5S*， 6S*)-6- 氨基甲基 -3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙 酸 叔 丁 酯 (200mg， 0.754mmol) 加 入 二 异 丙 醚 (IPE) 或 乙 腈 (MeCN) (1.0mL， 5.0v/w)， 然后加入旋光羧酸 (0.5eq.)， 并将混合物在室温下搅拌。 将沉淀的晶体过 滤， 用所使用的溶剂 (0.5mL， 2.5v/w) 洗涤。将所得晶体减压干燥， 以下表 1 所示收率和光 学纯度得到对应的盐形式。
通过用碳酸氢钠水溶液将所获得的盐转化成游离形式， 然后将游离形式衍生化成 3， 5- 二硝基苯甲酰基形式， 从而分析光学纯度。
HPLC 分析条件 ( 光学纯度测定， 在衍生化成 3， 5- 二硝基苯甲酰基形式后进行分 析)
柱： CHIRALPAK AS-RH×2(Daisel， 4.6mm×150mm， 5μm)
检测 ： 220nm， 柱温 ： 40℃， 流速 ： 0.8ml/ 分钟
流动相 ： MeCN/5mM 磷酸盐缓冲液 (pH 7.0) ＝ 55/45
保留时间 ： 29.6 分钟， 31.8 分钟， 36.1 分钟
( 表 1)
( 由非对映体的混合物进行光学拆分的步骤 )
( 实施例 1)
[(1R， 5S， 6S)-6- 氨基甲基 -3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯 D- 扁桃酸盐
将乙腈 (4.7L， 8.6v/w) 加入 [6- 氨基甲基 -3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯 (627.0g， 净重 ： 543.6g， 2.05mol， 85 ∶ 15 非对映体的混合物 ) 中， 将混合物在 40 ℃下搅拌。向反应溶液中加入 D- 扁桃酸 (116.3g， 0.76mmol， 0.37eq.)， 并将混合物在 40℃下搅拌 1 小时， 然后使之慢慢冷却到 3℃。在 3℃下搅拌 1 小时后， 经过滤收集所得晶 体。然后， 在 40℃的条件下将晶体减压干燥， 得到 [(1R， 5S， 6S)-6- 氨基甲基 -3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯 D- 扁桃酸盐， 为白色粉末 (251.2g， 收率 ： 29.4 ％， 97.6％ ee， 99.6％ de)。 1
H-NMR(400MHz， DMSO-d6)δppm ： 1.04(3H， t， J ＝ 7.6Hz)， 1.28-1.35(1H， m)，
1.39(9H， s)， 1.96-2.11(4H， m)， 2.28(1H， d， J ＝ 15.6Hz)， 2.33(1H， d， J ＝ 15.6Hz)， 2.36-2.40(1H， m)， 2.72(1H，五 重 峰， J ＝ 7.6Hz)， 3.00(1H， d， J ＝ 13.2Hz)， 3.03(1H， d， J ＝ 13.2Hz)， 3.31(1H， br s)， 4.54(1H， s)， 5.21-5.23(1H， m)， 7.13-7.25(3H， m)， 7.35-7.37(2H， m)。
[α]20D-104.4° (C ＝ 0.108， MeOH)。
C24H35NO5 的 分 析 计 算 值 ： C， 69.04 ； H， 8.45 ； N， 3.35 ； 实 测 值 C， 69.15 ； H， 8.46 ； N， 3.46。
( 实施例 2)
[(1R， 5S， 6S)-6-( 氨基甲基 ) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯 (S)-O- 乙 酰基 - 扁桃酸盐
将乙腈 (10mL， 5.0v/w) 加入 [6-( 氨基甲基 ) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙 酸叔丁酯 (1.9g， 8.0mmol， 90 ∶ 10 非对映体的混合物 ) 中。向该混合物中加入 (S)-O- 乙 酰基 - 扁桃酸 (0.45eq.)， 并将混合物在室温下搅拌。2.5 小时后， 将沉淀的晶体过滤， 并 用乙腈洗涤。将所得晶体减压干燥， 得到 [(1R， 5S， 6S)-6- 氨基甲基 -3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙 酸 叔 丁 酯 (S)-O- 乙 酰 基 - 扁 桃 酸 盐， 为 白 色 晶 体 (0.904g， 收率 ： 26.2％， 90.4％ ee， 99％ de)。将这种白色晶体 (620mg) 悬浮于乙腈 (6.2mL， 10.0v/w) 中， 将悬浮液在室温下搅拌 10 分钟。将所得晶体过滤后， 将所得晶体减压干燥， 得到 (S)-O- 乙 酰基 - 扁桃酸盐， 为白色粉末 (557.6mg， 光学纯度 ： 95.7％ ee)。 1
H-NMR(400MHz， CD3OD)δppm ： 1.44-1.51(1H， m)， 1.45(9H， s)， 2.08-2.22(2H， m)， 2.13(3H， s)， 2.42(2H， s)， 2.50-2.57(1H， m)， 2.86(1H， 五重峰， J ＝ 7.6Hz)， 3.06-3.16(1H， m)， 3.25-3.33(2H， m)， 5.65-5.70(1H， m)， 5.74(1H， s)， 5.95-5.99(1H， m)， 7.25-7.34(3H， m)， 7.47-7.51(2H， m)。 D
[α]20 -18.9° (C 0.095， MeOH)。 -1
IR(KBr) ： cm ： 3046、 2977、 1726、 1584、 1235、 1144、 1028、 752。
MS(FAB+) ： m/z ： 238( 游离 +H)+， MS(FAB+NaI) ： m/z ： 260( 游离 +Na)+， 217(O- 乙酰 + 基 - 扁桃酸 +Na) 。
C24H33NO6 的 分 析 计 算 值 ： C， 66.80 ； H， 7.71 ； N， 3.25 ； 实 测 值 C， 66.60 ； H， 7.72 ； N， 3.36。
( 实施例 3)
[(1R， 5S， 6S)-6- 氨基甲基 -3- 甲基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯 D- 扁桃酸盐
将溶剂 (2.5mL， 10v/w) 加入 [6- 氨基甲基 -3- 甲基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯 (237mg， 1mmol， 90 ∶ 10 非对映体的混合物 ) 中。向混合物中加入 D- 扁桃酸 (0.5eq.)， 将混合物在冰冷却条件下搅拌 2 小时。将沉淀的晶体过滤。将所得晶体减压干 燥， 以下表 2 所示收率和光学纯度得到 D- 扁桃酸盐。通过用碳酸氢钠水溶液将所获得的盐 转化成游离形式， 然后使游离形式衍生化成 3， 5- 二硝基苯甲酰基形式， 从而对光学纯度进 行了分析。
( 表 2)溶剂 1 2 3 4 乙腈 乙酸乙酯 甲苯 环戊基甲基醚 收率 8.5％ 4.6％ 11.2％ 13.8 ee％ a) 48.5％ ee 79.9％ ee 85.0％ ee 82.4％ eea)3， 5- 二硝基苯甲酰氯， HPLC HPLC 分析条件 ( 光学纯度测定， 在衍生化成 3， 5- 二硝基苯甲酰基形式后进行分析) 柱： CHIRALPAK AS-RH×2(Daisel， 4.6mm×150mm， 5μm)
检测 ： 220nm， 柱温 ： 40℃， 流速 ： 0.8ml/ 分钟
流动相 ： MeCN/5mM 磷酸盐缓冲液 (pH 7.0) ＝ 55/45
保留时间 ： 28.0 分钟， 23.6 分钟， 26.0 分钟 1
H-NMR(400MHz ，CD 3 OD) ： δ ppm ： 1.45-1.51(1H ，m) ， 1.45(9H ，s) ， 1.82(3H ， s)， 2.02-2.14(2H， m)， 2.41(2H， s)， 2.42-2.55(1H， m)， 2.85(1H，五 重 峰， J ＝ 7.2Hz)， 3.06-3.13(1H， m)， 3.23(1H， d， J ＝ 13.2Hz)， 3.26(1H， d， J ＝ 13.2Hz)， 4.84(1H， s)， 5.25-5.28(1H， m)， 7.19-7.30(3H， m)， 7.44-7.47(2H， m)。 D
[α]20 -97.4° (C 0.102， MeOH)。 -1
IR(KBr) ： cm ： 3424、 2974、 2929、 1722、 1571、 1366、 1152、 1060、 755、 701。 + +
MS(FAB ) ： m/z ： 252( 游离 +H) ， MS(FAB+NaI) ： m/z ： 274( 游离 +Na)+， 175( 扁桃酸 + +Na) .
( 使酯基脱保护和形成盐的步骤 )
( 实施例 4)
[(1R， 5S， 6S)-6- 氨基甲基 -3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸对甲苯磺 酸盐
将 [(1R， 5S， 6S)-6- 氨基甲基 -3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯 D- 扁桃酸盐 (4.17g， 10mmol) 悬浮于甲苯 (21ml) 中。 向悬浮液中依次加入三乙胺 (2.09ml) 和水 (21ml)， 并将混合物在室温下搅拌。20 分钟后， 分离并萃取有机层。将有机层用水 (10ml) 再次洗涤， 然后减压浓缩， 得到游离形式的 [(1R， 5S， 6S)-6- 氨基甲基 -3- 乙基二 环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯， 为油状物质。向其中依次加入甲苯 (16ml) 和 对甲苯磺酸一水合物 (2.28g)， 并将混合物在 70℃下搅拌。搅拌期间， 再加入甲苯 (15ml)， 3 小时后， 使混合物冷却。将沉淀的固体过滤， 然后用甲苯洗涤后减压干燥， 得到 [(1R， 5S， 6S)-6- 氨基甲基 -3- 乙基二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸对甲苯磺酸盐， 为白色粉末 (3.90g)。 1
H-NMR(400MHz， CD3OD)δppm ： 1.10(3H， t， J ＝ 7.2Hz)， 1.49(1H， dd， J ＝ 7.4， 12.4Hz)， 2.06-2.20(4H， m)， 2.37(3H， s)， 2.49-2.55(1H， m)， 2.51(2H， s)， 2.87(1H，五 重 峰， J ＝ 7.4Hz)， 3.12(1H， br S)， 3.29(1H， d， J ＝ 13.3Hz)， 3.33(1H， d， J ＝ 13.3Hz)， 5.31-5.32(1H， m)， 7.22-7.25(2H， m)， 7.69-7.72(2H， m)。 D
[α]20 -56.1° (C 0.108， MeOH)。 -1
IR(KBr) ： cm ： 3149、 2962、 1708、 1498、 1237、 1164、 1038、 1011、 813、 680、 566。 + + +
MS(FAB ) ： m/z ： 210( 游离 +H) ， 412(2M 游离 +H) 。
( 实施例 5)
[(1R， 5S， 6S)-6-( 氨基甲基 ) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸苯磺酸盐
将 [(1R， 5S， 6S)-6-( 氨 基 甲 基 ) 二 环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙 酸 叔 丁 酯 (S)-O- 乙酰基 - 扁桃酸盐 (116mg， 0.269mmol) 悬浮于茴香醚 (0.58ml) 中。向悬浮液中依
次加入水 (0.6ml) 和三乙胺 (0.045ml)， 并将混合物在室温下搅拌。15 分钟后， 分离并萃 取有机层。将有机层再次用水 (300ml) 洗涤， 然后减压浓缩， 得到含游离形式的 [(1R， 5S， 6S)-6-( 氨基甲基 ) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸叔丁酯的茴香醚溶液。向其中加 入苯磺酸 (46mg)， 并将混合物在 70℃下搅拌 1.25 小时后使之冷却。将沉淀的固体过滤， 经 过滤的粉末通过倒入丙酮再次洗涤后， 减压干燥， 得到 [(1R， 5S， 6S)-6-( 氨基甲基 ) 二环 [3.2.0] 庚 -3- 烯 -6- 基 ] 乙酸苯磺酸盐， 为白色粉末 (55.5mg)。 1
H-NMR(400MHz， CD3OD)δppm ： 1.51(1H， dd， J ＝ 7.6， 12.4Hz)， 2.12-2.20(2H， m)， 2.51(2H， s)， 2.51-2.57(1H， m)， 2.88(1H，五 重 峰， J ＝ 7.4Hz)， 3.17-3.18(1H， m)， 3.32(1H， d， J ＝ 13.3Hz)， 3.36(1H， d， J ＝ 13.3Hz)， 5.69-5.71(1H， m)， 5.97-5.99(1H， m)， 7.39-7.44(3H， m)， 7.81-7.84(2H， m)。 D
[α]20 -99.7° (C 0.09， MeOH)。 -1
IR(KBr) ： cm ： 3125、 3054、 2988、 1705、 1515、 1412、 1237、 1163、 1121、 1016、 730、 689、 621、 563。
MS(FAB+) ： m/z ： 182( 游离 +H)+， m/z ： 363(2M 游离 +H)+。
C16H21NO5S 的分析计算值 ： C， 56.62 ； H， 6.24 ； N， 4.13 ； 实测值 C， 56.19 ； H， 6.21 ； N， 4.13。
序列表的自由原文
SEQ ID NO ： 1： 人 Cacna2d1 前半片段的 PCR 正义引物。
SEQ ID NO ： 2： 人 Cacna2d1 前半片段的 PCR 反义引物。
SEQ ID NO ： 3： 人 Cacna2d1 后半片段的 PCR 正义引物。
SEQ ID NO ： 4： 人 Cacna2d1 后半片段的 PCR 反义引物。
SEQ ID NO ： 5： 载体 pBluescript 2 的多克隆位点。25102356061 A CN 102356071
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