用于治疗眼疾和眼病的组合物及方法.pdf

用于治疗眼疾和眼病的组合物及方法
相关申请
本申请要求于2006年10月27日提交的临时专利申请序列号60/855,003(代理案卷号LPT-3020-PV)、以及于2007年8月20日提交的临时专利申请序列号60/956,890(代理案卷号LPT-3020-PV2)的利益和优先权，将它们的全部内容通过引用结合于本文用于任何和所有目的。
序列表
本申请同时提交并包括序列表，该序列表依照适合的规定和程序准备并提交。因此该序列表通过引用结合于本文用于任何和所有目的。
技术领域
本发明涉及结合鞘氨醇-1-磷酸(S1P)的制剂，尤其是涉及在生理条件下与S1P具有特异反应活性的人源化单克隆抗体、抗体片段、以及抗体衍生物。这样的制剂可以通过递送包含这样的制剂的药物组合物而用于治疗和/或预防各种疾病或紊乱。
以下描述包括对理解本发明有用的信息。这不是承认本文中提到的任何信息、或本文中引用的明确指出的或暗示的任何公开是本申请要求保护的发明的现有技术，或者甚至特别相关的。
背景技术
生物活性信号转导脂质
脂类和它们的衍生物目前被认为是用于医学研究的重要对象，而不仅仅是细胞膜中的简单结构元件或用于β-氧化、糖酵解或其他代谢过程的能量来源。尤其是，某些生物活性脂类在动物和人类疾病中发挥信号转导介导物。尽管质膜的大多数脂类仅起结构性作用，但是它们中的少部分涉及将胞外刺激传递到细胞内。“脂质信号转导”是指利用细胞膜的脂类作为第二信使的多种细胞信号转导途径中的任一种，以及是指脂质信号转导分子与自己的特定受体的直接相互作用。脂质信号转导途径通过各种各样的胞外刺激(范围为从生长因子到炎症细胞因子)被激活并调节细胞命运决定如凋亡、分化和增殖。随着越来越多的生物活性脂类被鉴定以及它们的行为被表征，对于生物活性脂类信号转导的研究是一项重要的科学研究。
生物活性脂质的实例包括类花生酸类(包括大麻素、白三烯、前列腺素、脂氧素、环氧花生四烯酸以及异类花生酸)、非类花生酸大麻素递质、磷脂以及它们的衍生物如磷脂酸(PA)和磷脂酰甘油(PG)、血小板活化因子(PAF)和心磷脂，以及溶血磷脂素类如溶血磷脂酰胆碱(LPC)和各种溶血磷脂酸(LPA)。生物活性信号转导脂类递质还包括鞘脂类如鞘磷脂、神经酰胺、神经酰胺-1-磷酸、鞘氨醇、鞘氨醇磷酸胆碱(sphingosylphosphoryl choline)、二氢鞘氨醇、二氢鞘氨醇-1-磷酸(二氢-S1P)和鞘氨醇-1-磷酸。鞘脂类以及它们的衍生物代表了一组对重要细胞过程具有多效作用的胞外和胞内信号转导分子。生物活性信号转导脂类的其他实例包括磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰乙醇胺(PEA)、二乙酰基甘油酯(DG)、硫苷脂、神经节苷脂和脑苷脂。
鞘脂类由于它们最初神秘的特性而是独特的一类在Sphinx之后命名的脂类。鞘脂类最初表征为细胞膜的主要结构成分，但近来的研究表明，鞘脂类也用作细胞信号转导和调节分子(Hannun，et al.，Adv.Lipid Res.25：27-41，1993；Speigel，et al.，FASEB J.10：1388-1397，1996；Igarashi，J.Biochem 122：1080-1087，1997；Hla，T.(2004).Semin Cell Dev Biol，15，513-2；Gardell，S.E.，Dubin，A.E.&Chun，J.(2006).Trends Mol Med，12，65-75)。鞘脂类是细胞膜的主要结构成分，其也用作细胞信号转导和调节分子(Hannun and Bell，Adv.Lipid Res.25：27-41，1993；Igarashi，J.Biochem 122：1080-1087，1997)。鞘脂信号转导递质，神经酰胺(CER)、鞘氨醇(SPH)和鞘氨醇-1-磷酸(S1P)已被最广泛地研究，并且最近已经认识到它们在心血管系统、血管发生和肿瘤生物中的作用(Claus，et al.，CurrDrug Targets 1：185-205，2000；Levade，et al.，Circ.Res.89：957-968，2001；Wang，et al.，J.Biol.Chem.274：35343-50，1999；Wascholowskiand Giannis，Drug News Perspect.14：581-90，2001；Spiegel，S.&Milstien，S.(2003).Sphingosine-1-phosphate：an enigmatic signalinglipid.Nat Rev Mol Cell Biol，4，397-407)。
对于鞘脂代谢的综述，参见Liu，et al.，Crit Rev.Clin.Lab.Sci.36：511-573，1999。对于鞘磷脂信号转导途径的综述，参见Hannun，etal.，Adv.Lipid Res.25：27-41，1993；Liu，et al.，Crit.Rev.Clin.Lab.Sci.36：511-573，1999；Igarashi，J.Biochem.122：1080-1087，1997；Oral，etal.，J.Biol.Chem.272：4836-4842，1997；and Spiegel et al.，Biochemistry(Moscow)63：69-83，1998。
S1P是一种细胞增殖的递质并通过激活生存途径而防止细胞凋亡(Maceyka，et al.(2002)，BBA，vol.1585)：192-201，and Spiegel，etal.(2003)，Nature Reviews Molecular Cell Biology，vol.4：397-407)。已经提出，CER/SPH水平和S1P之间的平衡提供了一种决定细胞是否导入死亡途径或者被防止凋亡的可调机制。该可调机制的关键调节酶是鞘氨醇激酶(SPHK)，其作用是将促进死亡的生物活性信号转导脂类(CER/SPH)转换成促进生长的S1P。S1P具有两种命运：S1P可以通过S1P裂解酶降解，该S1P裂解酶是一种将S1P切割为磷酸乙醇胺和十六醛(hexadecanal)，或者更少见的，通过S1P磷酸酶水解为SPH。
S1P的多效生物学活性通过G蛋白-偶联受体(GPCR)家族(最初称为内皮分化基因(EDG))介导。5种GPCR已被鉴定为高亲和力S1P受体(S1PR)：S1P₁/EDG-1、S1P₂/EDG-5、S1P₃/EDG-3、S1P₄/EDG-6、以及直到1998年才被鉴定的S1P₅/EDG-8(Lee，et al.，1998)。由S1P引发的许多反应偶联于不同的异源三聚体G蛋白(G_q-、G_i、G_12-13)以及Rho家族的小GTP酶(Gardell，et al.，2006)。
在成人中，S1P从血小板(Murata et al.，2000)和肥大细胞释放以生成游离S1P的局部脉冲(足够超过S1PR的K_d)，用于促进伤口愈合以及参与炎性反应。在正常条件下，血浆中的总S1P相当高(300-500nM)；然而，假设了大多数S1P可以通过血清蛋白，尤其是脂蛋白(例如HDL＞LDL＞VLDL)和白蛋白“缓冲”，使得生物可利用的S1P(或S1P的游离部分)不足以可测到地活化S1PR(Murata et al.，2000)。如果不是这种情况，则会导致不恰当的血管发生和炎症。S1P的胞内行为也已经公开了(参见例如Spiegel S，Kolesnick R(2002)，Leukemia，vol.16：1596-602；Suomalainen，et al(2005)，Am J Pathol，vol.166：773-81)。
细胞表面S1P受体的广泛表达允许S1P影响各种细胞反应谱，包括增殖、粘附、收缩、运动性、形态发生、分化和存活。这种反应谱似乎依赖于细胞和组织系统内的S1P受体的重叠或不同表达类型。另外，最近已经证实了在S1P和生长因子信号转导途径之间的串扰(crosstalk)，包括血小板源性生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和基本成纤维细胞生长因子(bFGF)(参见例如Baudhuin，et al.(2004)，FASEB J，vol.18：341-3)。各种涉及S1P的细胞过程的调节对其中的神经元信号转导、血管调节、伤口愈合、免疫细胞转运、增殖、以及心血管功能具有特定影响。这些系统内的内源性S1P水平的变化可以具有有害作用，激发若干种病理情况，包括癌症、炎症、血管发生、心脏病、哮喘和自身免疫疾病。
用来治疗各种疾病和紊乱(包括心血管疾病、脑血管疾病和各种癌症)的最新方法涉及降低生物可利用的S1P水平，单独地或与其他治疗联合。尽管已经提出了靶向鞘磷脂代谢途径的关键酶例如SPHK的以鞘磷脂为基础的治疗策略，但是直到最近才强调脂质递质S1P本身的干扰，很大程度上是因为直接减轻这种脂质靶标存在困难，尤其是因为困难首先在产生针对S1P靶标的抗体上然后是检测该抗体上。
最近，描述了对S1P特异的抗体的产生。参见例如，共同拥有的美国专利申请序列号20070148168；WO2007/053447。这样的抗体，其可以例如选择性地从血清吸附S1P，充当分子海绵以中和胞外S1P。还参见共同拥有的美国专利号6,881,546和6,858,383以及美国专利申请序列号10/029,372。SPHINGOMAB^TM，由Lpath，Inc.开发并在上面列出的某些专利或专利申请中描述的鼠类单克隆抗体(mAb)，已被证实在人类疾病的模型中是有效的。在一些情形下，人源化抗体可以优选是针对鼠类抗体的，尤其是对于人类的治疗用途，其中人-抗-小鼠抗体(HAMA)反应可能出现。这样的反应可以通过中和结合活性和/或快速从身体血液循环清除该抗体而降低抗体的效力。HAMA反应还可以在给予小鼠抗体之后引起毒性。
现在已经开发了人源化抗-S1P抗体并在本文中进行描述。依据在结合S1P、中和S1P以及调节与S1P相关的疾病状态中的效力，这种抗体预期具有鼠类mAb的所有优点，但是当用于人类环境时没有鼠类mAb的任何潜在缺点。如在下文实施例中描述的，这种人源化抗体(称为LT1009或sonepcizumab)实际上已显示出比疾病动物模型中的亲代(鼠类)抗体更大的活性。
定义
在详细描述本发明之前，将限定在本发明上下文中使用的多个术语。除了这些术语之外，根据需要其他的术语在说明书其他地方进行限定。除非在本文中另外明确限定，本说明书中使用的技术术语具有它们在本领域公认的含义。如果矛盾，本说明书，包括定义起作用。
“免疫源性部分”包括任何抗体(Ab)或免疫球蛋白(Ig)，并且是指任何形式的来源于免疫球蛋白基因、仿造或由免疫球蛋白基因编码的肽或多肽，或能够结合抗原或表位的这些肽或多肽的片段(参见例如Immunobiology，5th Edition，Janeway，Travers，Walport，Shlomchiked.(editors)，Garland Publishing(2001))。在本发明中，抗原是生物活性脂质分子。
“抗-S1P抗体”或“与S1P具有反应活性的免疫源性部分”是指结合S1P的任何抗体或抗体来源分子。如根据这些定义应该理解的，抗体或免疫源性部分可以是多克隆或单克隆的，并且可以通过各种途径产生，和/或可以从动物，包括人类对象中分离。
“生物活性脂质”是指脂质信号转导分子。通常，当发挥其信号转导作用时，生物活性脂质不会存在于生物膜中，也就是说，虽然这样的脂质种类可以存在于生物膜(例如，细胞膜，细胞器的膜等)中的某个点，当与生物膜相连时，其不是“生物活性脂质”，而是“结构性脂质”分子。生物活性脂类与结构性脂类(例如膜结合磷脂)的区别在于，它们介导胞外和/或胞内信号转导，因而涉及通过调节分化、迁移、增殖、分泌、存活和其他过程而控制多种类型的细胞的功能。在体内，生物活性脂类可以在胞外液体中找到，其中它们可与其他分子络合，例如血清蛋白，如白蛋白和脂蛋白，或者为“游离”形式，即没有与另种类一分子络合。作为胞外递质，一些生物活性脂类通过活化膜结合离子通道或G-蛋白偶联受体而改变细胞信号转导，这又会激活导致细胞功能或存活发生改变的复杂信号转导系统。作为胞内递质，生物活性脂类可以通过直接与胞内成分如酶和离子通道相互作用而发挥它们的作用。生物活性脂类的代表性实例包括LPA和S1P。
术语“治疗剂”是指用来减轻血管发生和/或新生血管形成的试剂，例如，CNV和BV成熟化，水肿，血管通透性以及与眼病和眼疾相关的或其潜在病理学的部分的纤维化、纤维形成和结疤。
术语“组合治疗”是指包括提供至少两种不同治疗以实现指定疗效的治疗方案。例如，组合治疗可以涉及给予两种或更多种化学上不同的活性组分，例如抗-LPA抗体和抗-S1P抗体。可替换地，组合治疗可以包括给予对生物活性脂质具有反应性的免疫源性部分和给予一种或多种其他化学治疗剂。可替换地，组合治疗可以包括与给予另一治疗如放射治疗和/或手术一起给予抗-脂质抗体。而且，组合治疗可以包括与一种或多种其他生物学试剂(例如抗-VEGF，TGFβ，PDGF或bFGF试剂)、化学治疗剂以及另一种治疗如放射和/或手术一起给予抗-脂质抗体。在使用两种或更多种化学上不同的活性组分的联合治疗的情况下，应当理解，活性组分可以作为相同组合物的一部分或作为不同组合物加以给药。当作为单独的组合物给药时，包含不同活性组分的组合物可以在同一时间或不同时间给药，通过相同或不同途径，使用相同或不同剂量方案，所有这些根据具体情况的要求并由主治医师确定。类似地，当一个或多个抗-脂质抗体种类，例如抗-LPA抗体，单独地或联合一种或多种化疗剂与例如放射和/或手术组合时，药物可以在手术或放射治疗之前或之后递送。
“抗-S1P剂”是指与S1P具有特异反应活性的任何试剂，并且包括结合S1P及其变体的抗体或抗体来源分子或非抗体来源部分。
“半抗原”是指适于结合至半抗原的分子，由此使得该半抗原具有免疫原性。半抗原分子的代表性的非限制性种类是蛋白质，其实例包括白蛋白、钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)、血细胞凝集素(hemaglutanin)、破伤风类毒素和白喉类毒素。适合依照本发明使用的半抗原分子的其他类别和实例在本领域是已知的。这些、以及后来发现的或发明的天然或合成半抗原，可以适合依照本发明使用。
术语“化学治疗剂(或化疗剂)”是指抗癌和其他抗-过度增生试剂。简单地说，“化疗剂”是指用来破坏细胞和组织的化学物质。这样的试剂包括但不限于：(1)DNA损伤试剂和抑制DNA合成的试剂：蒽环类(多柔比星，donorubicin、表柔比星)，烷基化剂(苯达莫司汀、白消安、卡铂、卡莫司汀、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、达卡巴嗪、六甲蜜胺、异环磷酰胺(ifosphamide)、洛莫司汀、氮芥、美法仑、米托坦、丝裂霉素C、哌泊溴烷、丙卡巴肼、链脲菌素、噻替派、以及曲他胺)，铂衍生物(顺铂，卡铂，顺二氯化二氨亚铂)，端粒末端转移酶和拓扑异构酶抑制剂(Camptosar，盐酸伊立替康)；(2)微管蛋白-解聚合试剂：紫杉烷(紫杉醇，多西紫杉醇，BAY 59-8862)；(3)抗-代谢物如卡培他滨，2-氯脱氧腺苷，阿糖胞苷(及其活化形式，ara-CMP)，胞嘧啶，阿糖胞苷，达卡巴嗪(dacabazine)，氟尿苷，氟达拉滨，5-氟尿嘧啶，5-DFUR，吉西他滨，羟基脲，6-巯嘌呤，甲氨蝶呤，喷司他丁，三甲曲沙和6-硫代鸟嘌呤；(4)抗-血管生成(阿瓦斯丁、沙立度胺、舒尼替尼、来那度胺(lenalidomide))，血管破裂剂(类黄酮/黄酮、DMXAA、考布他汀衍生物如CA4DP、ZD6126、AVE8062A等)；(5)生物制产品如抗体或抗体片段(赫赛汀、阿瓦斯丁、Panorex、Rituxan、泽娃灵、麦罗塔、Campat、Bexar、爱必妥、Lucentis)；以及(6)内分泌治疗：芳香酶抑制剂(4-氢雄烯二酮(4-hydroandrostendione)、依西美坦、氨基格鲁米特(aminoglutehimide)、阿那曲唑、来曲唑(letozole))，抗-雌激素(他莫昔芬、托瑞米芬(Toremifine)、雷洛昔芬(Raoxifene)、Faslodex)，甾类如地塞米松；(7)免疫调节剂：细胞因子如IFN-β和IL-2，整联蛋白的抑制剂，其他粘着蛋白和基质金属蛋白酶；(8)组蛋白脱乙酰基酶抑制剂；(9)信号转导的抑制剂，如酪氨酸激酶抑制剂，例如伊马替尼(Gleevec)；(10)热休克蛋白抑制剂；(11)类视色素如所有反式类维生素A酸(retinoic acid)；(12)生长因子受体抑制剂或生长因子本身；(13)抗-有丝分裂化合物，如诺维本(navelbine)、紫杉醇、泰素帝(taxotere)、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨；(14)抗发炎化合物如COX抑制剂；以及(15)细胞周期调节剂，例如检查点调节剂和端粒末端转移酶抑制剂。
如本文使用的，术语“鞘脂”是指在本领域称为鞘脂类的一类化合物，包括但不限于以下化合物(参见http//www.lipidmaps.org，该网站包含通过以下括号内的字母数字串指示的链接，该链接包含相应化合物的化学式、结构信息等)：
鞘氨基醇碱基[SP01]
鞘氨醇(Sphing-4-enines)(Sphingosines)[SP0101]
二氢鞘氨醇[SP0102]
4-羟基二氢鞘氨醇(植物鞘氨醇)[SP0103]
鞘氨基醇碱类似物和变体[SP0104]
鞘氨基醇碱1-磷酸[SP0105]
溶血鞘磷脂和溶血糖苷神经鞘脂[SP0106]
N-甲基化鞘氨基醇碱[SP0107]
鞘氨基醇碱类似物[SP0108]
神经酰胺[SP02]
N-酰基鞘氨醇(神经酰胺)[SP0201]
N-酰基二氢鞘氨醇(二氢神经酰胺)[SP0202]
N-酰基-4-羟基二氢鞘氨醇(植物鞘氨醇)[SP0203]
酰基神经酰胺[SP0204]
神经酰胺1-磷酸[SP0205]
鞘磷脂[SP03]
神经酰胺磷酸胆碱(鞘磷脂)[SP0301]
神经酰胺磷酸氨基乙醇[SP0302]
神经酰胺磷酸肌醇[SP0303]
磷酰基鞘脂(Phosphonosphingolipids)[SP04]
中性糖苷神经鞘脂[SP05]
简单Glc系列(GlcCer，LacCer等)[SP0501]
GalNAcb1-3Gala1-4Galb1-4Glc-(Globo系列)[SP0502]
GalNAcb1-4Galb1-4Glc-(Ganglio系列)[SP0503]
Galb1-3GlcNAcb1-3Galb1-4Glc-(Lacto系列)[SP0504]
Galb1-4GlcNAcb1-3Galb1-4Glc-(Neolacto系列)[SP0505]
GalNAcb1-3Gala1-3Galb1-4Glc-(Isoglobo系列)[SP0506]
GlcNAcb1-2Mana1-3Manb1-4Glc-(Mollu系列)[SP0507]
GalNAcb1-4GlcNAcb1-3Manb1-4Glc-(Arthro系列)
[SP0508]
Gal-(Gala系列)[SP0509]
其他[SP0510]
酸性糖苷神经鞘脂[SP06]
神经节苷脂[SP0601]
硫糖神经鞘类脂(硫苷脂)[SP0602]
葡糖醛酸鞘脂[SP0603]
磷酸糖苷神经鞘脂(Phosphoglycosphingolipid)[SP0604]
其他[SP0600]
碱性糖苷鞘脂[SP07]
两性糖苷鞘脂[SP08]
偶砷基鞘脂[SP09]。
本发明提供了抗鞘脂S1P剂，它对于治疗或预防过度增生紊乱如癌症和心血管或脑血管疾病和紊乱以及各种眼疾很有用，如在下文更详细描述的。更具体地，本发明注意到S1P及其变体，包括但不限于鞘氨醇-1-磷酸[sphingene-1-磷酸；D-赤式-鞘氨醇-1-磷酸；鞘氨醇-1-磷酸；(E，2S，3R)-2-氨基-3-羟基-十八烷-4-烯氧基]膦酸(AS26993-30-6)，DHS1P定义为二氢鞘氨醇-1-磷酸[二氢鞘氨醇-1-磷酸]；[(2S，3R)-2-氨基-3-羟基-十八烷氧基]膦酸；D-赤式-二氢-D-鞘氨醇-1-磷酸(CAS 19794-97-9)]；SPC是神经鞘氨醇磷酸胆碱、溶血鞘磷脂、鞘氨醇磷酸胆碱、鞘氨醇磷酰胆碱、氯化三甲基铵乙酰肼(ethanaminium)、2-((((2-氨基-3-羟基-4-十八烯基)氧基)羟基氧膦基)氧基)-N，N，N-三甲基-氯化物、(R-(R^*，S^*-(E)))，2-[[(E，2R，3S)-2-氨基-3-羟基-十八烷-4-烯氧基]-羟基-磷酰基]氧乙基-三甲基-氯化铵(CAS 10216-23-6)。
当在本文中使用时，除非另有指明，术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗-S1P剂与其反应的S1P的区域。
术语“过度增生紊乱”是指与不受控制的细胞增生相关的疾病和紊乱，包括但不限于导致癌症或瘤形成和良性肿瘤的不受控制的器官和组织细胞生长。与内皮细胞相关的过度增生紊乱可以导致血管发生的疾病，如血管瘤、子宫内膜异位症、肥胖、老年性黄斑退化症和各种视网膜病变，以及由于在治疗动脉粥样硬化中放入支架而引起再狭窄结果的内皮细胞和平滑肌细胞的增生。涉及成纤维细胞的过度增生紊乱(例如纤维形成)包括但不限于过度结疤的紊乱(例如纤维化)，如老年性黄斑退化症、心脏重建(cardiacremodeling)和与心肌梗死相关的障碍，如通常作为手术或损伤结果出现的过度伤口愈合、疤痕疙瘩，以及纤维样瘤和植入支架。
本发明的组合物用于鞘脂碱基治疗。“治疗”是指疾病、紊乱或身体创伤的预防和/或治疗。
“心血管治疗”包括心脏治疗以及与心血管系统相关的其他疾病如心脏病的预防和/或治疗。术语“心脏病”包括涉及心脏或心肌组织的疾病、紊乱、创伤或手术治疗中的任一种类型。其中特别感兴趣的是涉及心肌组织缺氧和/或缺血和/或心力衰竭的心脏疾病。可以由缺血导致的一种心脏病是再灌注损伤，如在可在治疗中使用抗-凝药、血栓溶解剂、或抗-绞痛药物治疗时发生，或者当心脏血管系统通过血管成形术或冠状动脉移植术手术打开时发生。本发明涉及的另一种心脏病是冠脉疾病(CAD)，其可以由动脉硬化，特别是动脉粥样硬化(一种常见的缺血原因)引起。CAD具有诸如稳定或不稳定心绞痛的症状，并且可以导致心肌梗死(MI)和心脏性猝死。特别感兴趣的病症包括但不限于心肌缺血；急性心肌梗死(AMI)；冠脉疾病(CAD)；急性冠脉综合征(ACS)；心脏细胞和组织损伤可能在具有或没有放入支架的经皮血管重建(冠状动脉血管成形术)过程中或作为其结果发生；冠状动脉旁路移植(CABG)或者可能引起缺血或人缺血/再灌注损伤的其他手术或医疗方法或治疗；以及心血管创伤。术语“心力衰竭”涵盖急性心肌梗死、心肌炎、心肌病、充血性心力衰竭、感染性休克、心脏创伤和特发性心力衰竭。导致心力衰竭的缺血性病症谱称为急性冠脉综合征(ACS)。
术语“心脏病治疗剂”是指对由心脏和心肌疾病及紊乱引起或相关的疾病和紊乱具有治疗作用的试剂。
“脑血管治疗”是指针对与脑缺血和/或缺氧相关的疾病和紊乱的预防和/或治疗的治疗。其中特别感兴趣的是由心脏病(包括但不限于心力衰竭)引起的全脑缺血所导致的脑缺血和/或缺氧。
术语“鞘脂代谢物”是指形成鞘脂的化合物，以及特定鞘脂降解得到的化合物。换句话说，“鞘脂代谢物”是涉及鞘脂代谢途径的化合物。代谢物包括代谢前体和代谢产物。术语“代谢前体”是指形成鞘脂的化合物。特别感兴趣的代谢前体包括但不限于SPC、鞘磷脂、二氢鞘氨醇、二氢神经酰胺和3-酮基二氢鞘氨醇。术语“代谢产物”是指由鞘脂降解产生的化合物，如磷酰胆碱(例如磷酸胆碱)、脂肪酸，包括游离脂肪酸，以及十六醛(例如棕榈醛)。
如本文使用的，术语“治疗或治疗性的”包括疾病或紊乱治疗的所有内涵(fill spectrum)。本发明的“治疗”剂可以预防性或防止性方式起作用，包括设计成靶向可以鉴定处于危险中的个体的并入程序的方式(药物遗传学)；或者以缓和或治愈性的方式起作用；或者可以用来减缓所治疗疾病或紊乱的至少一种症状进展的速度或程度；或者可以用来使所需的时间最少、使任何不适或疼痛的发生或程度最小化，或者与疾病、紊乱或身体创伤的恢复相关的身体局限最少；或者可以用作其他疗法和治疗的佐剂。
“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防止性措施。需要治疗的主体包括已经具有该紊乱的主体以及需要预防该紊乱的主体。
术语“组合疗法”是指涉及提供至少两种不同治疗以实现指定疗效的治疗方案。例如，组合疗法可以涉及给予两种或更多种化学上不同的活性组分，例如抗-LPA抗体和抗-S1P抗体。可替换地，组合疗法可以包括给予与生物活性脂质反应性的免疫源性部分和给予一种或多种其他化疗剂。可替换地，组合疗法可以涉及与给予另一治疗如放射治疗和/或手术一起给予抗-脂质抗体。而且，组合疗法可以涉及与一种或多种其他生物学试剂(例如抗-VEGF，TGFβ，PDGF或bFGF试剂)、化疗剂以及另一种治疗如放射和/或手术一起给予抗-脂质抗体。在使用两种或更多种化学上不同的活性组分的联合治疗的情况下，应当理解，活性组分可以作为相同组合物的一部分或作为不同组合物加以给药。当作为单独的组合物给药时，包含不同活性组分的组合物可以在同一时间或不同时间给药，通过相同或不同途径，使用相同或不同剂量方案，所有这些根据具体情况要求并由主治医师确定。类似地，当一个或多个抗-脂质抗体物种，例如抗-LPA抗体，单独地或联合一种或多种化疗剂与例如放射和/或手术组合时，药物可以在手术或放射治疗之前或之后递送。
“单一疗法”是指基于给予一种治疗有效化合物的治疗方案，无论是以单次剂量或随时间的多次剂量给药。
“瘤形成”或“癌症”是指异常和不受控制的细胞生长。“瘤形成”或肿瘤或癌症是细胞生长的异常、不受调节且紊乱性增殖，并且通常称为癌症。瘤形成可以是良性的或恶性的。如果具有破坏性生长、侵入和转移性质，则瘤形成是恶性的或癌性的。侵入性是指瘤形成通过渗入或破坏周围组织的局部蔓延，局部地破坏限定组织边界的基底层(basal laminas)，从而经常进入身体循环系统。转移通常是指肿瘤细胞通过淋巴管或血管的传播。转移还指肿瘤细胞通过直接延伸通过浆液腔、或蛛网膜下腔或其他空间的迁移。通过转移过程，肿瘤细胞迁移至身体的其他区域而在远离初始出现部位的区域中形成。
用于治疗目的的“哺乳动物”是指任何归类为哺乳动物的动物，包括人类、家养动物和农场动物、以及动物园动物、运动动物或宠物，如狗、马、猫、牛等。优选地，哺乳动物是人类。
“天然抗体”和“天然免疫球蛋白”通常是大约150,000道尔顿的异源四聚糖蛋白，由两个相同轻(L)链和两个相同重(H)链构成。每一个轻链通过一个共价二硫键连接至重链，而键接在不同免疫球蛋白同种型的重链之间的二硫键的数量在变化。每一个重量和轻链还具有规则间隔开的链内二硫化键桥。每一个重链具有在一个末端的可变结构域(V_H)，接着是数个恒定结构域。每一个轻链具有在一个末端的可变结构域(V_L)和在另一末端的恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域相对，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域相对。认为特定的氨基酸残基形成轻链可变结构域和重链可变结构域之间的界面。
术语“可变”区包含框架和CDR(另称为高度可变区)，并且是指这样的事实，即抗体中的某些部分的可变结构域的序列在很大程度上不同并且用于每个特定抗体与其特定抗原的结合和特异性。然而，可变化性在整个抗体的可变结构域上不是均匀分布的。其集中在轻链和重链可变结构域中的称为高变区的三个片段中。可变结构域的相对高度保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链每一个的可变结构域包含4个FR(分别是FR1、FR2、FR3和FR4)，很大程度上采用β-片层结构，通过3个高变区连接，其形成环连接的β-片层结构，并且在一些情况下形成β-片层结构的一部分。每一个链中的高变区通过FR紧密接近地保持在一起，并且利用来自其他链的高变区，组成抗体的抗原结合位点(参见Kabat，et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991)，pages647-669)。恒定结构域不直接涉及抗体与抗原的结合，但表现出各种效应功能，如在抗体依赖性细胞毒性中抗体的参与。
当在本文中使用时，术语“高变区”是指负责与抗原结合的抗体的氨基酸残基。该高变区包含来自“互补性决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，轻链可变结构域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，以及重链可变结构域中的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；以上参见Kabat，et al.(1991))和/或来自“高变环”的那些残基(例如，轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)，以及重链可变结构域中的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。“框架”或“FR”残基是不同于如本文定义的高变区残基的那些可变结构域残基。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，以及残基“Fc”片段，“Fab”片段每一个具有单一抗原结合位点，“Fc”片段其名称反映了其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点且仍然能够交联的抗原的F(ab′)₂片段。
“F_V”是包含完全的抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。这个区域由以紧密非共价结合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体构成。正是在这种构造中，每一个可变结构域的三个高变区相互作用而限定在V_H-V_L二聚体表面上的抗原结合位点。总起来说，六个高变区给抗体赋予抗原结合特异性。然而，甚至单个可变结构域(或仅包含对抗原特异性的三个高变区的Fv的一半)具有识别和结合抗原的能力，尽管以比完整结合位点的亲和力降低。
Fab片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。通过在重链CH1结构域的羧基末端插入一些残基包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸，Fab’片段不同于Fab片段。Fab’-SH在本文中特指Fab’，其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离硫醇基团。F(ab’)₂抗体片段初始作为其间具有铰链半胱氨酸的Fab’片段对而产生。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可以被归类为两个基于它们的恒定结构域的氨基酸序列而明显不同的类型之一，称为κ和λ。
依据它们的重链恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可以归为不同种类。目前有5个主要的免疫球蛋白种类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这之中的多个可以进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同免疫球蛋白种类的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同免疫球蛋白种类的亚单位结构和三维构造是熟知的。
本文中的术语“抗体”以最广含义使用，并且特别包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异抗体(例如双特异抗体、抗体片段，以及采用亲代抗体的CDR(或其保持抗原结合活性的变体)的结合剂。抗体在本文中定义为保持亲代抗体的至少一种期望活性。期望活性可以包括特异性结合抗原的能力、抑制体外增生的能力、抑制体内血管发生的能力、以及改变体外细胞因子种类的能力。“抗体片段”包含全长抗体的一部分，通常是其抗原结合或可变结构域。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)₂和Fv片段；双特异抗体；线性抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异抗体。
如本文中使用的，术语“单克隆抗体”是指从基本上同源抗体群中获得的抗体，例如包含该群的单个抗体是相同的，除了可以少量存在的可能的天然突变。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，相比于通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂，每一个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。改良的“单克隆”表明抗体作为获自基本上同源抗体群的特性，并且不被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，依照本发明使用的单克隆抗体可以通过最先由Kohler，et al.，Nature256：495(1975)描述的杂交瘤方法制得，或者可以通过重组DNA方法制得(参见例如美国专利No.4,816,567)。“单克隆抗体”也可以使用例如在Clackson，et al.，Nature 352：624-628(1991)and Marks etal.，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库分离。
本文中的单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而所述链的剩余部分与来源于另一物种或属于另一抗体种类或亚类的抗体序列中的相应序列相同或同源，以及这样的抗体的片段，只要它们表现出期望的活性(美国专利No.4,816,567；以及Morrison，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。
非人(例如鼠类)抗体的“人源化”形式是包含来源于非人免疫球蛋白的最少序列的嵌合抗体。对于大部分，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的高变区残基被来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的高变区残基替代，具有期望的特异性、亲和力和能力。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可以包含在接受者抗体或供者抗体中没有发现的残基。形成这些修饰以进一步改进抗体性能。一般地，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个并且典型地两个可变结构域，其中所有或基本上所有的高变区对应于非人免疫球蛋白的高变区，并且所有或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体可选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的至少一部分。对于进一步的细节，参见Jones，et al.，Nature 321：522-525(1986)；Reichmann，et al.，Nature 332：323-329(1988)；and Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)and Hansen，WO2006105062。
“单链Fv”或“sFv”抗体片段包含抗体V_H和V_L结构域，其中这些结构域以单个多肽链存在。通常，Fv多肽进一步包含在V_H和V_L结构域之间的多肽连接区，其能够使sFv形成用于抗原结合的期望结构。对于sFv的综述，参见Pluckthun in The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies，vol.113，Rosenburg and Moore eds.Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)。
术语“双特异抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，这种片段包含在同一多肽链(V_H-V_L)连接于轻链可变结构域(V_L)的重链可变结构域(V_H)。通过利用太短而不允许相同链上的两个结构域之间配对的连接子(linker)，这些结构域被迫与另一链的互补结构域配对并形成两个抗原结合位点。双特异抗体更充分地描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；以及Hollinger，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。
当在本申请通篇中使用时，术语“线性抗体”是指在Zapata，etal.Protein Eng.8(10)：1057-1062(1995)中描述的抗体。简而言之，这些抗体包含形成一对抗原结合区域的一对串联Fd节段(V_H-C_H1-V_H-C_H1)。线性抗体可以是双特异性或单特异性的。
“变异”抗-鞘脂抗体在本文中是指借助于在亲代抗体序列中插入、缺失、和/或取代一个或多个氨基酸残基且保持亲代抗-结合抗体的至少一种期望活性，使得氨基酸序列不同于“亲代”抗鞘脂抗体氨基酸序列的分子。期望活性可以包括特异性结合抗原的能力、抑制增生的能力、抑制体内血管发生的能力、以及在体外改变细胞因子种类(profile)的能力。在一个实施方式中，变体包含在亲代抗体的一个或多个高变区中的一个或多个氨基酸取代。例如，变体可以包含在亲代抗体的一个或多个高变区中的至少一个，例如约1至约10个，并且优选地为约2至约5个取代。一般地，变体将具有与亲代抗体重链或轻链可变结构域序列有至少50％氨基酸序列同一性，更优选至少65％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，并且最优选至少95％序列同一性的氨基酸序列。关于这个序列的同一性或同源性在本文中定义为，候选序列中与亲代抗体残基相同的氨基酸残基的百分数，如果需要在对齐序列和引入间隙之后，以获得最大百分比序列同一性。抗体序列中的N-末端、C-末端、或内部延伸、缺失或插入中任一个都不解释为影响序列同一性或同源性。变体保持结合鞘脂的能力，并且优选地具有优于亲代抗体的期望活性。例如，变体可以具有更强的结合亲和力，加强的减少血管发生和/或停止肿瘤进展的能力。为了分析这样的期望性能(例如，更低免疫原性、更长半衰期，增强的稳定性，增强的效力)，必须对比变体的Fab形式和亲代抗体的Fab形式，或者对比变体的全长形式和亲代抗体的全长形式，例如，因为已经发现抗-鞘脂抗体的形式影响其在本文披露的生物学活性测定中的活性。本文中特别感兴趣的变异抗体可以是显示至少约5％，优选地至少约10％、25％、59％或更高的至少一种期望活性的变体。当相比于亲代抗体时，优选的变体是具有如体外测定的优异生物物理性能或如体外或体内测得的优异生物学活性的变体。
本文中的“亲代”抗体是由用于制备变体的氨基酸序列编码的抗体。优选地，亲代抗体具有人框架并且如果存在的话具有人抗体恒定区。例如，亲代抗体可以是人源化或人抗体。
“分离的”抗体是已被鉴定且从其自然环境的成分分离和/或回收的抗体。其自然环境的污染成分是会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可以包括酶、激素和其他蛋白质性质或非蛋白质性质溶解物。在优选的实施方式中，该抗体将纯化为(1)如通过Lowry法确定的，高于该抗体按重量计的95％，并且最优选地高于按重量计的99％；(2)通过使用自旋杯序列分析仪(spinning cupsequenator)，足以获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或(3)使用考马斯蓝或优选地银染色，通过在还原或非还原条件下的SDS-PAGE测定的同质性。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为该抗体自然环境的至少一个成分将不会存在。然而，通常地，分离的抗体将通过至少一个纯化步骤进行制备。
当在本文中使用时，词语“标记(物)”是指直接或间接结合至抗体的可检测化合物或组合物。标记本身通过自身是可以检测的(例如放射性同位素或荧光标记)，获在酶促标记的情况下，可以催化可检测的基底化合物或组合物的化学变化。
“固相”是指本发明的抗体可以粘附到其上或该抗体或其他抗-S1P结合剂另外可以固定到其上的非水基质。本发明包括的固相的实例包括那些部分或整体由玻璃(例如控制孔隙玻璃)、多糖(例如琼脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和硅树脂形成的。在某些实施方式中，根据内容，固相可以包括测定板的孔，而在其他情况下，其是纯化柱(例如，亲和性色谱柱)。该术语还包括分散颗粒的不连续固相，如在美国专利No.4,275,149中描述的那些。
“脂质体”是有各种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂构成的小囊泡，其对于将药物(如本文中披露的抗-鞘脂抗体以及可选地化疗剂)递送至哺乳动物很有用。脂质体的成分通常以双层形成排列，类似于生物膜的脂质排列。“分离的”核酸分子是指被鉴定且分离自至少一种污染核酸分子的核酸分子，其通常与抗体核酸的天然来源相关。分离的核酸分子通常不是在自然中发现的形式或位置。因此，分离的核酸分子与其在天然细胞中存在的核酸分子不相同。然而，分离的核酸分子包括在通常表达抗体的细胞中包含的核酸分子，其中例如核酸分子在不同于天然细胞的染色体位置中。
表达“控制序列”是指对于特定宿主有机体中的可操作连接的编码序列的表达必需的DNA序列。适合于原核细胞的控制序列例如包括启动子，可选地操作子序列以及核糖体结合位点。真核细胞已知利用启动子、多腺苷化信号和增强子。
当置于与另一核酸序列的功能关系时，核酸是“可操作地连接的”。例如，如果作为参与多肽分泌的前蛋白表达，则前序列或分泌前导序列的DNA可操作地连接于多肽的DNA；如果影响序列的转录，则启动子或增强子可操作地连接于该编码序列；或者如果被定位以便有利于翻译，则核糖体结合位点可操作地连接于编码序列。一般地，“可操作地连接”是指连接的核酸分子是连续的，并且在分泌前导序列的情况下，为连续的且在读码框中。然而，增强子不一定是连续的。连接是通过在方便限制位点处的接合而完成的。如果这样的位点不存在，则合成的寡核苷酸适配子(adaptor)或连接子(linker)依照传统实践使用。
如本文使用的，表达“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这样的名称包括后代。因此，词语“转化体”和“转化细胞”包括原代主体细胞和源于其的培养物，而不管接种转移的次数。还应理解，所有子代在DNA含量上可以不是精确相同的，这是由于故意或无意的突变。包括具有与初始转化细胞相同的功能或生物学活性的突变后代。其中使用了不同的名称，这根据上下文将会很清楚。
根据本发明“可专利的”的组合物、方法、机器或制品是指，主题满足在进行分析时对于可专利性的所有法律要求。例如，对于新颖性、创造性等，如果后续审查表明，一个或多个权利要求涵盖了一个或多个否定新颖性、创造性等的实施方式，则所述权利要求具体地排除不可专利的实施方式。而且，所附权利要求应解释为提供最宽的合理范围，以及保持它们的有效性。此外，如果从本申请提交时或者作为专利授权公告时，一个或多个所附权利要求的有效性被置疑时，修改了一个或多个对于可专利性的法律要求或者如果对于评价是否满足可专利性的特定法律要求的标准改变，则权利要求应以以下方式进行解释：(1)保持它们的有效性；和(2)在各种情形下提供最宽的合理解释。
术语“药用盐”是指保持本发明的试剂或化合物的生物学效用和性能且不是生物学或其他方面不期望的盐。在许多情况下，本发明的试剂和化合物能够借助于带电基团，例如带电氨基和/或羧基或者类似基团的存在而形成酸和/或碱性盐。药用酸加成盐可以用无机或有机酸制得，而药用碱加成盐可以从无机或有机碱制得。对于药用盐的综述参见Berge，et al.(1977)J.Pharm.Sci.，vol.66，1-19。
“多个”是指多于一个。
术语“分开的”、“纯化的”、“分离的”等是指含有容纳样品的容器中的样品的一个或多个成分在该容器中存在的一个或多个其他样品成分存在下被物理地移出或稀释。在分开或纯化步骤期间可以被移出或稀释的样品成分包括化学反应产物、未反应化学物质、蛋白质、碳水化合物、脂质、以及未结合的分子。
术语“种类”在本文不同上下文中使用，例如化疗剂的特定种类。在每一种上下文中，该术语是指在该特定上下文中提及的种类不同的化学分子种群。
“特异性地相关”和“特异相关联”等是指两个分子之间的特定非随机相互作用，该相互作用取决于允许这些分子之间的合适化学或分子相互作用的结构、疏水/亲水、和/或静电特征的存在。
“受试者”或“患者”是指需要通过本发明分子能够奇效的被治疗的动物。可依照本发明治疗的动物包括脊椎动物，其中哺乳动物如牛、犬、马、猫、羊、猪、和灵长类(包括人和非人灵长类动物)动物是特别优选的实例。
“治疗有效量”(或“有效量”)是指活性组分，例如根据本发明的一种试剂，当给予一个受试者或患者时足以使治疗有效的量。因此，什么量构成根据本发明组合物的治疗有效量可以由本领域技术人员容易地确定。在眼部治疗的上下文中，“治疗有效量”是这样的量，其在与眼疾或眼病治疗相关的一个或多个参数上产生客观检测变化，包括与该眼疾或眼病相关联的一个或多个基因的表达上的增加或降低、细胞凋亡或其他细胞死亡途径的诱导、症状的临床改进、异常新血管形成或炎症的减少等。当然，治疗有效量将根据特定受试者和治疗的症状、受试者的体重和年龄、疾病症状的严重度、所选择的具体化合物、依照的给药方案、给药时间安排、给药方式等，所有这些可通过本领域技术人员容易地确定。应当理解，在组合疗法的情况下，什么量构成特定活性成分的治疗有效量可以不同于当作为单一治疗(即，仅采用一种化学物质作为活性组分)给药时，构成活性组分的治疗有效量的量。
术语疾病或紊乱的“治疗”或“处理”包括针对该疾病或紊乱的预防或防止(即，使临床症状不进展)；抑制该疾病或紊乱(即，阻止或抑制临床症状的发展)；和/或减缓疾病或紊乱(即引起临床症状的消退)。如将理解的，“预防”与“抑制”一种疾病或紊乱不总是可以区分开，因为最终的诱发事件或多个事件可能是未知的或潜伏的。因此，术语“预防”应理解为构成包括“预防”和“抑制”的一种“治疗”。因而，术语“治疗”包括“预防”。
术语“治疗方案”是指使用化疗药物、放射治疗、手术、基因治疗、DNA疫苗和治疗、反义基因治疗包括siRNA治疗、抗血管生成治疗、免疫治疗、骨髓移植、核酸适体(aptamer)和其他生物试剂如抗体和抗体变体、受体诱饵(receptor decoy)以及其他以蛋白质为基础的治疗剂的任何疾病或紊乱的治疗。
发明内容
依据本发明，提供了可专利的方法，用于通过给予一种药物组合物来治疗眼疾或眼病，该药物组合物包含与生物活性脂质(鞘氨醇-1-磷酸)或其变体具有反应活性的免疫源性部分(例如，抗体)，以便降低有效浓度，以使所靶向的生物活性脂质完全或部分地被抑制以免引起不期望的作用或效应。在该具体实施方式中，免疫源性部分是与脱脂脂质(lysolipid)S1P具有反应活性的单克隆抗体或变体的人源化形式。还提供了用于减少或预防异常纤维形成、纤维化或结疤；炎症；异常心血管形成；调节眼睛的手术和创造性伤口愈合反应；或用于减弱眼免疫反应的方法。进一步提供的是用于减少靶标生物活性脂质的有效眼部浓度或活性的方法。S1P的代表性变体包括鞘氨醇基磷酸胆碱、二氢鞘氨醇-1-磷酸。
本发明的另一方面涉及可专利的药学或兽医学组合物，包括用于眼部给药的那些组合物，其包含载体和分离的与生物活性脂质具有反应活性的免疫源性部分，例如单克隆抗体或抗体片段、变体或衍生物。优选的载体包括药用载体，尤其是当该组合物打算用于人类的治疗应用时。对于非人治疗应用(例如在治疗伴侣动物、家畜、鱼或家禽)，可以采用兽医学可接受的载体。
根据本发明的免疫源性部分，优选地作为治疗组合物的一部分的示例性给药方式，包括全身性给药、肠胃外给药(例如经由静脉内、肌内或皮下方式的注射)、经皮、皮内或跨粘膜递送、眼内或眼周围注射、粘膜或局部给药或通过吸入。
本发明的这些和其他方面以及实施方式将在后续章节更加详细地进行讨论。本发明的前述和其他方面根据以下的详细描述、附图以及权利要求将变得更加清楚。
本发明的这些和其他方面以及实施方式将在后续章节更加详细地进行讨论。本发明的前述和其他方面根据以下的详细描述、附图以及权利要求将变得更加清楚。尽管与本文中所述描述的类似或等同的方法和材料在本发明的实践或试验中可以使用，但是以下描述了合适的方法和材料。另外，以下的材料、方法和实施例仅是举例说明性的而不用于限制。
附图说明
本申请包含至少一幅彩色图。具有彩色图的本申请的复印件在经过请求和缴纳必要费用之后提供。每一个附图的简短概括提供如下：
图1：图1有两幅图A和B。A图用曲线描述了S1P、SPH、LPA、SPC和其他结构类似的生物脂类在竞争生物素结合的抗-S1P单克隆抗体的竞争性ELISA结果。这些结果表明，该抗体对于S1P是特异性的且敏感的，并且不识别结构类似的生物活性脂类。如以下实施例1所描述的，结合的抗体通过结合有HRP的第二抗体(对于小鼠或人类IgG是特异性的)检测。检测显色反应并报告光学密度(OD)。用于竞争的脂类的浓度在X-轴上标注。未能检测到第二抗体与仅S1P涂覆的基质之间的相互作用(数据未示出)。B图示出了类似于在A图中列出的S1P的生物活性脂类的结构。
图2：该图示出了多种嵌合和重组人源化抗-S1P抗体变体的结合性能。嵌合抗体(pATH10+pATH50)与S1P的结合在ELISA结合测定中与两种形式的人源化抗-S1P单克隆抗体(pATH201+pATH308)和(pATH201+pATH309)进行比较。pATH308是具有5个鼠类回复突变的人源化轻链，而pATH309是框架区中具有3个回复突变的人源化轻链。人源化重链(pATH201)在框架区中仅包含一个鼠类回复突变。
图3是一个曲线图，示出了SPHINGOMAB对于S1P是高度特异性的。该曲线(其数据是利用竞争性ELISA得到的)证实了相比于其他生物活性脂类，SPHINGOMAB对于S1P的特异性。SPHINGOMAB表明对于鞘氨醇(SPH)没有交叉反应性，其中鞘氨醇是S1P或溶血磷脂酸(LPA)的中间代谢前体，鞘氨醇(SPH)是结构和功能类似于S1P的一种重要胞外信号转导分子。SPHINGOMAB没有识别其他结构类似的脂类和代谢物，包括神经酰胺-1-磷酸(C1P)、二氢鞘氨醇(DH-SPH)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰乙醇胺(PE)、或鞘磷脂(SM)。SPHINGOMAB与二氢鞘氨醇-1-磷酸(DH-S1P)以及在更小的程度与鞘氨醇基磷酸胆碱(SPC)发生交叉反应。SPHINGOMAB对于S1P的亲和力(Kd)低于100pM，远远高于大多数治疗用抗体，尤其是其他分子海绵。
图4：图4由两个部分A和B。得出图中表示的数据的实验在以下实施例4中具体描述。简而言之，这些数据表明，SPHINGOMAB减少了眼部病变的CNV和疤形成。小鼠用SPHINGOMAB或同种型匹配的非特异性单克隆抗体进行治疗。CNV病变通过Bruch膜的激光破裂加以诱导。示出了来自用于血管生成(A)的罗丹明结合R.普通凝集素I或用于胶原疤形成(B)的马森三色(Masson’sTrichrome)染色的每一个治疗组的病变的曲线和代表性照片。图4A示出了在鼠类CNV病变形成模型中，在Bruch膜的激光诱发破裂之后的14天和28天，SPHINGOMAB显著减弱了脉络膜心血管形成。图4B示出了，在Bruch膜的激光诱发破裂之后的14天和28天，SPHINGOMAB显著减少了与CNV病变形成相关的纤维化。
图5：图5具有两幅图A和B。在图A中，证实S1P通过诱导HUVEC管形成和迁移而促进新血管形成，其被SPHINGOMAB减少。图5A示出了在基底膜上接种并孵育6h以评价管形成的HUVEC的4幅显微照片。图5B示出了在基底膜侵入小室中用1μM S1P±SPHINGOMAB(1μg/ml)处理6h的HUVEC的数据。迁移至基底膜膜的细胞数在5个独立视野中计数。
图6：图6包含对于以下实施例6中描述的实验的多张照片(A)和柱状图(B和C)，所述实验利用SPHINGOMAB实施。SPHINGOMAB中和或无效S1P-、VEGF-和bFGF-诱导的新血管形成。图6A示出了来自基底膜栓子(Matrigel plugs)±指定生长因子的部分的多个代表性FITC-染色血管的照片。图6B示出了S1P刺激内皮细胞(EC)渗入。图6C表示作为新血管形成指示的来自用VEGF或bFGF刺激的基底膜栓子的相对荧光的定量。S1P、VEGF和bFGF的作用在用1或25mg/kg的SPHINGOMAB全身性治疗小鼠时被抑制。
图7：图7示出了5个柱状图，标为A-E以及两幅彩色照片。该数据是利用抗S1P单克隆抗体SPHINGOMAB产生的。对于实验细节参见以下的实施例7。简而言之，这些数据表明，SPHINGOMAB中和或无效S1P刺激的疤形成。在这些实验中，成纤维细胞是无血清的，然后用0、0.1、0.5或1μM S1P+/-1μg/mL SPHINGOMAB处理12-24h。该数据表明S1P刺激的Swiss 3T3成纤维细胞增生，如通过3H-胸苷并入检测的(A)、刮擦测定中的鼠类心脏成纤维细胞迁移(B)、来自表达胶原-GFP的转基因小鼠的分离心脏成纤维细胞中的胶原基因表达(相对荧光)(C)、以及如通过降低的细胞增生和增加的α-SMA表达测得的WI-38细胞分化为肌纤维细胞(D)。SPHINGOMAB中和了这些S1P作用的每一个。SPHINGOMAB减少了永久心肌梗死鼠类模型中的体内血管周纤维化(E)。
图8：图8具有三幅图8A、8B和8C。这些数据表明，S1P促进眼表皮细胞和成纤维细胞转化成收缩性、产生疤组织的肌成纤维细胞。如以下实施例8中所描述的，考察了S1P对多个人眼细胞系的肌成纤维细胞转化的作用。发现S1P刺激人视网膜色素上皮细胞(图8A)和人结膜成纤维细胞(图8B)的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA；一种肌成纤维细胞标记物)的产生。这些数据第一次表明，S1P是促进眼表皮细胞和成纤维细胞转化成收缩性、产生靶组织的肌成纤维细胞的因子之一。还考察了S1P对人结膜成纤维细胞中的纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂(PAI-1)的表达的作用。增加的PAI-1表达与结缔组织的蛋白水解降解的降低相关，并且在涉及增加结疤的多种纤维变性疾病中相关地被上调。如图8C所示，S1P以剂量依赖性方式刺激PAI-1表达。
图9：图9示出了两个柱状图A和B，示出了利用称为SPHINGOMAB的抗-S1P单克隆抗体得到的实验数据。SPHINGOMAB减少了体内免疫细胞伤口渗入。小鼠经受MI，在手术后用盐水或25mg/kg SPHINGOMAB处理48h，然后在第4天杀死。SPHINGOMAB减少了巨噬细胞(A)和肥大细胞(B)渗入到伤口中。数据用比盐水处理值降低的倍数表示。
图10：图10具有两个图10A和10B。每一图示出了用于鼠类抗-S1P单克隆抗体V_L和V_H结构域表达的克隆载体的图示。图10A是用于V_L结构域克隆的pKN100载体的图示。图10B是用于V_H结构域克隆的pG1D200载体的图示。
图11：图11提供了表明多种鼠类、嵌合和重组的人源化抗-S1P抗体的结合性能的数据。对小鼠(muMAbS1P；由方形数据点生成的曲线)和嵌合(chMAb S1P；由直角三角形数据点生成的曲线)的S1P的结合在ELISA结合测定中与人源化的抗体的第一形式(pATH200+pATH300；由倒三角形数据点生成的曲线)进行比较。
图12：图12具有两图A和B，其示出了来自利用多个人源化单克隆抗体变体实施的体外细胞测定的数据。A图示出了人源化mAb能够组织S1P保护SKOV3细胞发生泰素(Taxol)诱导的细胞凋亡。如以下实施例16中所描述的，在有或没有浓度为1μg/mL的huMAbHCLC₃(309)、huMAbHCLC₅(308)、muMAb S1P(muMAb)、或非特异性IgG1(NS)的500nM S1P下，SKOV3细胞用500nM泰素(Tax)处理48h。值表示平均值±SEM(n＝3)，其中每一个数据点一式三份地操作。“NT”是指没有处理的，而“Veh”表示仅有介质。B图示出了在用S1P以及多个不同抗-S1P单克隆抗体之一或对照单克隆抗体处理的卵巢癌(OVCAR3)细胞中的IL-8分泌情况。在以下实施例16详细描述的实验中，100,000 OVCAR3细胞/无血清孔过夜，并将1uM S1P单独加入到培养基或用1ug/ml的非特异性抗体(NS)、pATH201+pATH309(LC3)、pATH201+pATH308(LC5)、pATH207+pATH309(cysLC3)、pATH207+pATH308(cysLC5)、和0.1ug/ml(M0.1)、1ug/ml(M1)或10ug/ml(M10)的抗-S1P鼠类抗体预先孵育。在孵育22h之后，收集细胞上清液并使用R&D systemQuantikine human CXCL8/IL-8试剂盒通过ELISA检测IL-8分泌。在该图中，“NT”是指未处理的细胞。
图13：图13示出了在CNV动物模型中，相比于小鼠抗-S1P单克隆抗体和对照，多种人单克隆抗体变体的体内效力。如以下实施例17中所描述的，在这些实验中，小鼠通过玻璃体内给药以0.5ug给药两次(第0天和第6天)的鼠类(Mu)抗-S1P单克隆抗体、多种人源化抗-S1P单克隆抗体变体(即，变体LC3，LC5，HCcysLC3和HCcysLC5)、或非特异性单克隆抗体(NS)，然后进行Bruch膜的激光破裂。小鼠在激光手术后14天杀死。巩膜-RPE-脉络膜复合体切片并用罗丹明结合的R普通凝集素I抗体进行染色。CNV病变体积以平均值±SEM表示。
具体实施方式
1.化合物
本发明描述某些抗-S1P剂，特别是那些免疫原性部分，包括抗体，其与生物活性脂质S1P是特异反应性的；换句话说，与抗S1P反应的生物活性脂质是S1P。
抗体分子或免疫球蛋白是分子量约为150kDa的大糖蛋白分子，通常由两个不同的多肽链构成。一个多肽链，称为“重”链(H)，约为50kDa。另一个多肽，称为“轻”链(L)，约为25kDa。每一个免疫球蛋白分子通常由两个重链和两个轻链构成。两个重链通过二硫键彼此连接，其数量在不同免疫球蛋白同种型的重链之间变化。每一个轻链通过一个共价二硫键连接至重链。在任何给定的天然抗体分子中，两个重链和两个轻链是相同的，包含两个相同的抗原结合位点，因而被称为是二价的，即具有同时结合至两个相同分子的能力。
基于它们的恒定结构域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体分子的“轻”链可归为两个明显不同类型κ和λ之一。两种类型的轻链的比率根据物种发生变化。作为实例，平均的κ与λ比率在小鼠中为20∶1，而在人中其为2∶1，并且在牛中为1∶20。
基于它们的恒定结构域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体分子的“重”链可以归为5种明显不同类型(称为同种型)之一。一些同种型具有多种亚型。免疫球蛋白的五个主要类别为免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白D(IgD)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)和免疫球蛋白E(IgE)。IgG是最丰富的同种型并且具有多种亚类(人中的IgG1、2、3和4)。Fc片段和铰链区在不同同种型的抗体中不相同，由此确定它们的功能性质。然而，结构域的整体组织结构在所有同种型中类似。
术语“可变区”是指抗体分子或其片段的N-末端部分。一般地，四个链中的每一个在其氨基末端部分中具有可变(V)区，以及恒定(C)区，可变(V)区组成抗原结合位点，恒定(C)区决定该同种型。轻链通过许多非共价相互作用或通过二硫键结合至重链，并且重链和轻链的V区在抗体分子的每个臂中配对，从而生成两个相同的抗原结合位点。认为一些氨基酸残基形成轻链和重链可变结构域之间的界面[参见Kabat，et al.(1991)，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，Fifth Edition，National Institute of Health，Bethesda，Md.and Clothia et al.(1985)，J.Mol.Biol，vol 186：651]。
值得注意的是，变化在整个抗体的可变结构域中不是均匀分布的，而是集中在的三个节段，称为在轻链和重链可变结构域中的“补体决定区”(CDR)或“高变区”。可变结构域的更高度保守部分称为“框架区”(FR)。天然重链和轻链每一个的可变结构域包含通过三个CDR连接的4个FR区。每一个链中的CDR通过FR区紧密靠近地保持在一起，并利用来自其他链的CDR形成抗体的抗原结合位点[参见Kabat，et al.(1991)，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，Fifth Edition，National Institute of Health，Bethesda，Md.]。概括地，这6个CDR构成了抗体分子对抗原的结合性能。然而，甚至单个可变结构域(或Fv的一半，仅包含对抗原特异的三个CDR)具有识别并结合抗原的能力[参见Pluckthun(1994)，in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，vol.113，Rosenburg and Moore eds.，Springer-Verlag，New York，pp.269-315]。
术语“恒定结构域”是指抗体重链或轻链的C-末端区域。一般地，恒定结构域不直接涉及抗体分子与抗原的结合性能，但表现出各种效应功能，如抗体参与的抗体依赖的细胞毒性。这里，“效应功能”是指通过Fc结构域和免疫学的蛋白之间的分子相互作用使免疫细胞聚集所介导的抗体的不同生理作用(例如，调理作用，细胞溶解，肥大细胞，嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞脱粒、以及其他过程)。重链的同种型决定抗体的功能特性。它们的不同功能特性由重链的羧基末端部分赋予，其中它们与轻链无关。
如本文使用的，“抗体片段”是指包括抗原结合位点的完整抗体的一部分或者完整抗体的可变区，其中该部分可以没有完整抗体Fc区的恒定重链结构域(例如，CH2、CH3和CH4)。可替换地，恒定重链结构域的部分(例如，CH2、CH3和CH4)可以包括在“抗体片段”中。抗体片段的实例是那些仍然与抗原结合的那些片段，并包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd和Fv片段；双特异抗体；三特异抗体；单链抗体分子(sc-Fv)；微型抗体(minibody)；纳米抗体；以及由抗体片段形成的多特异抗体。以举例方式，Fab片段还包含轻链的恒定结构域和重链的的第一恒定结构域(CH1)。
术语“变体”是指与抗体的天然氨基酸序列在至少一个氨基酸残基或修饰上不相同的氨基酸序列。天然或亲代或野生型氨基酸序列是指在自然界发现的抗体的氨基酸序列。抗体分子的“变体”包括但不限于轻链和/或重链的可变区或恒定区，包括高变区或CDR区、Fc区、Fab区、CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、以及铰链区的改变。
术语“特异的”是指抗体与其靶表位的选择性结合。通过在给定的条件下，将该抗体与期望抗体结合以及将该抗体与不相关抗原或类似物抗原或抗原混合物的结合进行比较而可以测试抗体分子的结合特异性。优选地，根据本发明的抗体与不相关抗原，或者甚至靶抗原的类似物缺少显著的结合。这里，术语“抗原”是指由结合抗原的抗体分子或免疫源性部分识别且结合的分子。由抗体结合的抗原的特定部分称为“表位”。“半抗原”是指在大多数情况下，仅当附着至载体分子，例如蛋白质、聚乙二醇(PEG)、胶体金、硅树脂珠等时可以引发免疫反应(即，充当抗原)的小分子。载体可以是也不会通过自身引发免疫反应的载体。
术语“抗体”使用其最宽泛的含义，并且包括单克隆、多克隆、多特异性(例如，二特异性，其中抗体的每一个臂与不同表位或者与相同或不同抗原具有反应活性的)、微型抗体、异质结合物(heteroconjugate)、双特异抗体、三特异抗体、嵌合和合成抗体，以及以期望的结合性能和/或生物学活性特异结合抗原的抗体片段。
术语“单克隆抗体”(mAb)是指获自基本上同源抗体种群的抗体或类似抗体种群，并且不被解释为需要通过任何特定方法来产生该抗体。例如，单克隆抗体可以通过由Kohler and Milstein(1975)，Nature，vol 256：495-497首次描述的杂交瘤方法或者通过重组DNA方法制得。
术语“嵌合”抗体(或免疫球蛋白)是指包含与来源于特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体的相应序列相同或类似的重链和/或轻链的分子，同时所述链的剩余部分与来源于另一物种或属于另一抗体种类或亚类的相应序列相同或类似，以及这样的抗体的片段，只要它们表现出期望的生物学活性[Cabilly et al.(1984)，infra；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：6851]。
术语“人源化抗体”是指包含来自非人(例如鼠类)抗体以及人类抗体的序列的抗体形式。人源化抗体可以包括保守性氨基酸取代或不显著改变其结合和/或生物活性的来自相同或不同物种的非天然残基。这样的抗体是包含来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。对于大部分来说，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受体抗体)，其中来自该受体的互补决定区(CDR)的残基被具有期望特性的来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠、骆驼、牛、羊、或兔的CDR的残基取代。此外，人源化抗体可以包含在接受体抗体和供体抗体以及框架序列中没有发现的残基。可以形成这些修饰以进一步改进和最大化抗体特性。因此，一般地，人源化抗体将包含所有的至少一个，以及一方面两个的可变结构域，其中所有或所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，并且所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体可选地还将包含至少人免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区(Fc)的一部分、或者人免疫球蛋白的一部分。参见，例如Cabilly等的美国专利No.4,816,567；Cabilly等的欧洲专利No.0,125,023B1；Boss等的美国专利No.4,816,397；Boss等的欧洲专利No.0,120,694B1；Neuberger，M.S.等的WO 86/01533；Neuberger，M.S.等的欧洲专利No.0,194,276B 1；Winter美国专利No.5,225,539；Winter欧洲专利No.0,239,400B1；Padlan，E.A.等的欧洲专利申请No.0,519,596A1；Queen et al.(1989)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA，vol 86：10029-10033)。
术语“双特异抗体”可以指具有至少两个不同表位的结合特性的抗体或单克隆抗体。在一个实施方式中，表位来自相同抗原。在另一个实施方式中，表位来自两个不同的抗原。用于制备双特异性抗体的方法在本领域是已知的。例如，双特异性抗体可以利用两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达重组地生产。可替换地，双特异抗体可以利用化学键接制备。双特异抗体包括双特异抗体片段。
术语“异源结合抗体”可以指两个共价结合的抗体。这样的抗体可以利用合成蛋白质化学中的已知方法，包括使用交联剂制得。如本文中使用的，术语“结合物”是指通过一个或多个抗体片段或结合部分与一个或多个聚合物分子的共价连接而形成的分子。
术语“生物学活性的”是指能够结合期望表位并以一定方式施加生物作用的抗体或抗体片段。生物学作用包括但不限于生长信号的调节、抗-细胞凋亡信号的调节、细胞凋亡信号的调节、效应功能级联的调节、以及其他配体相互作用的调节。
术语“重组DNA”是指已被人为遗传改造、形成或修饰的从其表达的核酸和基因产品。“重组”多肽或蛋白质是通过重组DNA技术产生的多肽或蛋白质，例如来自通过编码期望多肽或蛋白质的外源性DNA构建体转化的细胞。“合成”多肽或蛋白质是通过化学合成制备的那些多肽或蛋白质。
术语“表达盒”是指能够影响与这样的序列相容的宿主中的结构基因(即，蛋白质编码序列，如本发明的抗体)表达的核苷酸分子。表达盒至少包括可操作地与多肽-编码序列，以及可选地与其他序列例如转录终止信号连接的启动子。也可以使用在实现表达中必需或有帮助的其他调节元件，例如增强子。因此，表达盒包括质粒、表达载体、重组病毒、任何形式重组“裸露DNA”载体等。
抗体的来源不限于本文中列举的这些(例如鼠类和人源化鼠类抗体)。抗体可以在许多物种中产生，包括哺乳动物物种(例如，小鼠、大鼠、驼、牛、山羊、马、豚鼠、仓鼠、绵羊和兔)以及鸟类(鸭、鸡)。产生的抗体可以来源于与其产自的动物不相同的物种。例如，XenoMouse^TM(Abgenix，Inc.，Fremont CA)产生完全人类单克隆抗体。对于某些目的，可以使用天然人类抗体，如针对S1P的自身抗体，分离自可以表现出这样的S1P自身抗体效价的个体。可替换地，人类抗体序列文库可以用来生成包含人类序列的抗体。
2.应用
本发明设计用于治疗或预防某些疾病和病症的组合物和方法，其中使用改变一种或多种不期望生物活性脂类、或其前体或代谢物的活性或浓度的一种或多种治疗剂。本发明的治疗方法和组合物通过改变某些不期望生物活性脂类的有效浓度，即绝对、相对、有效和/或可利用浓度而起作用。降低生物活性脂质的有效浓度可以说成“中和或无效”靶脂质或其不期望作用，包括下游作用。这里“不期望”是指不期望的生物活性脂质由于涉及疾病过程，例如作为信号转导分子或者当过量存在时其促成疾病的不希望的生物活性脂质的量。
不希望受任何特定理论的限制，认为S1P和/或其代谢物或下游效应子的不恰当浓度可以引起或促使各种疾病和病症的形成。同样，所述组合物和方法可以用来治疗这些疾病和紊乱，特别是通过降低特定靶脂质例如S1P或其变体的体内有效浓度。更具体地，认为本发明的组合物和方法可以用于治疗至少部分地特征在于异常新血管形成、血管发生、纤维形成、纤维化、结疤、发炎和免疫反应的疾病。
根据本发明治疗的几类疾病的实例描述在下面。应当理解，许多疾病和病症至少部分地特征在于多发性病理过程(例如，病理性新血管形成和结疤)，并且本文中提供的分类是为了描述方便而不用于限制本发明。
S1P和过度增生紊乱
本发明的一个方面涉及用于治疗过度增生紊乱的方法。这些方法包括向已知或怀疑患有S1P相关的过度增生紊乱的哺乳动物(例如，牛、犬、马、羊、或猪动物，特别是人)给予治疗有效量的一种组合物，该组合物包含干扰S1P活性的试剂，优选地在药学或兽医学上可接受的载体中，如期望的应用需要的。S1P相关的过度增生紊乱包括瘤形成、与内皮细胞增生相关的紊乱、以及与纤维形成相关的紊乱。最常见的，瘤形成将是癌症。典型的与内皮细胞增生相关的典型紊乱是血管发生依赖性紊乱，例如由实体瘤引起的癌症、血液瘤、以及老年性黄斑退化症。与纤维形成相关的紊乱包括涉及异常心脏重建的那些紊乱，如心力衰竭。
存在许多已知的过度增生紊乱，其中各种组织和器官的细胞表现出异常的生长、增生、迁移、信号转导、衰老和死亡的特征。尽管已经开发了大量治疗方法以解决一些这样疾病，但是利用现有技术许多仍然不可治疗，同时在其他情况下，尽管可以治疗，但是它们经常不是最佳的并且很少是治愈性的。
癌症可能代表最广泛识别的一类过度增生紊乱。癌症是一类破坏性疾病，并且，它们具有仅次于心血管病的第二死亡率。许多癌症在分子水平上并没有完全了解。因此，癌症是美国政府和制药公司研究和开发项目的主要焦点。结果是以投入空前的研发工作并且生产许多有价值的治疗剂以有助于攻克癌症。
不幸地，大量癌症研究没有足以克服由癌症引起的严重损伤。仅在美国每年仍然诊断超过一百万新的癌症病例以及超过五十万例死亡。这是一个显著的证实，即使付出了大量努力开发用于癌症的新疗法，但用于抗击疾病的有效治疗剂仍然难以找到。
癌症现在主要用一种治疗或三种类型的治疗的组合：手术、放射和化疗进行治疗。手术涉及患病组织的大量去除。虽然手术有时在去除位于某些部位例如乳房、结肠和皮肤的肿瘤中是有效的，但是它不能用于治疗位于其他区域如骨架中的肿瘤，或者不能用于治疗弥漫性瘤形成病症如白血病。放射治疗涉及活组织暴露于引起暴露细胞死亡或损伤的离子化辐射。放射治疗的副作用可以是急性和暂时的，尽管其他可能是不可逆的。化疗涉及破坏细胞复制或细胞代谢。
进一步的结果是，目前的治疗剂通常会有在毒性和严重副作用方面对患者的严重缺陷。因此，许多小组最近已开始寻找攻克癌症的新方法。这些新的所谓“创造性治疗”包括基因治疗以及治疗蛋白质，如单克隆抗体。
在临床使用的用于治疗癌症的第一个单克隆抗体是Rituxan(利妥昔单抗)(rituximab)，其是在1997年开发的，并且已经证明了其作为治疗剂的生物特异性单克隆抗体的作用。因此，不出预料地，之后十六种其他单克隆抗体已被批准用于临床，包括指定用于癌症的六种单克隆抗体。这些产品的成功，以及相比于小分子，开发单克隆抗体减少的成本和时间使得单克隆抗体治疗剂成为小分子之后的第二大的药物候选类别。而且，相比于小分子治疗剂，抗体的严格特异性已证实是在效力和毒性方面的主要优点。对于单独的癌症，目前有超过270种工业抗体研发项目，其中超过50个公司涉及开发新的癌症抗体治疗剂。因此，单克隆抗体预计成为癌症治疗的主要角色并且估计它们会占据癌症治疗市场的更大份额。
促进肿瘤生长和存活的胞外递质的识别是在发现减少癌症发病率和死亡率的治疗干预中的关键步骤。如以下所述的，鞘氨醇-1-磷酸(S1P)(鞘脂信号转导级联的关键成分)被认为是一个多效的肿瘤发生的生长因子。S1P通过刺激细胞增生、细胞存活和转移而促进肿瘤生长。S1P还通过支持内皮细胞的迁移和存活而促进肿瘤生成血管，如它们在肿瘤内形成新血管。综合在一起，S1P引发有助于癌症进展的增生、促血管生成和抗凋亡一系列的事件。因此，调节并且尤其是减少体内S1P水平的治疗在癌症治疗中将是有效的。
研究已表明，鞘氨醇激酶(SPHK)是一种最近确认的癌基因，其产生促进肿瘤生长的胞外鞘脂信号转导分子鞘氨醇-1-磷酸(S1P)。与肿瘤细胞增生和转移相关的S1P生长因子作用、以及S1P促生成血管作用直接和间接地促进了肿瘤生长。本申请人已经生产出了可以用作治疗用分子海绵以选择性吸附S1P的生物特异性单克隆抗-S1P抗体(抗-S1P mAb)，由此降低这种肿瘤生长因子的胞外浓度，预期其会减小肿瘤体积和转移潜力并且同时阻断将会另外供应生长肿瘤的新血管形成。分子吸附概念的预期成功将代表一种治疗癌症的创造性方法。如以下段落将证实的，本申请人已经开发了一种针对重要肿瘤生长因子鞘氨醇-1-磷酸(S1P)的mAb。申请人认为，这种抗体在减少与许多癌症类型相关的增生、转移潜力和血管发生方面可以是有效的，并且因此一般的癌症以及伴随疾病的肿瘤血管形成方面也是有效的。
鞘磷脂酶(nSMase)的中性形式是鞘脂信号转导途径的一种关键早期成分(Chatterjee，Adv.Lipid Res.26：25-46，1993；Liu，Obein，and Hannun，Semin.Cell Dev.Biol.8：311-322，1997)。nSMase只是已被鉴定的至少5类SMase中的一种，包括碱性、酸性、酸性锌依赖性、中性镁依赖性、以及中性镁非依赖性(Liu，Obein，and Hannun，Semin.Cell Dev.Biol.8：311-322，1997)。nSMase种类通常与表面膜相关(Das，Cook，and Spence，Biochim Biophys Acta 777：339-342，1984；Dobrowsky，Cell Signal 12：81-90.，2000)并且可以通过各种刺激物激活以引起细胞凋亡，如促发炎细胞因子、肿瘤坏死因子α(TNFα)(Ségui，et al.，J.Clin.Invest.108：143-151，2001)、T细胞受体(Tonnetti，et al.，J.Exp.Med 189：1581-1589，1999)、电离辐射(Haimovitz-Friedman，et al.，J.Exp.Med 180：525-535，1994)以及蒽环类抗生素抗瘤形成试剂(Andrieu-Abadie，et al.，FASEB J.13：1501-1510，1999)。肿瘤坏死因子α(TNFα)是一种熟知的在许多细胞类型包括癌细胞系(Andrieu-Abadie，et al.，FASEB J.13：1501-1510，1999；Hannun and Obein，Trends in Biol.Sci.20：72-76，1995；Kolesnick，trends Biochem Sci 24：224-5，1999；Obeid，et al.，Science 259：1769-1771，1993)中的nSMase(Adam，et al.，J.Bio Chem271：14617-14622，1996；Dressler，Mathias，and Kolesnick，Science255：1715-1718，1992；Kim，et al.，J.Biol.Chem.266：1：484-489，1991；Kronke，Chem Phys Lipids 102：157-66.，1999；Yanaga and Watson，FEBS Letters 314：297-300，1992)、CER产生(Kronke，Chem PhysLipids 102：157-66.，1999)以及细胞凋亡(Rath and Aggarwal，J.Clin.Immuno.19：350-364，1999；Robaye，et al.，Am J Pathol 138：447-453，1991；Takeda et al.，Int.Immunol.5：691-694，1993)的激活剂，并且已经表明nsMase的活化对于TNFα诱导的细胞凋亡是关键性的(Luberto，et al.，J.Biol.Chem.277：41128-41139，2002；Ségui，et al.，J.Clin.Invest.108：143-151，2001)。因此，nSMase已被提出作为用于药物发现的靶标(Wascholowski and Giannis，Drug News Perspect.14：581-90，2001)。
鞘脂信号转导分子S1P通过鞘氨醇激酶(SPHK)的作用从SPH产生。已鉴定了该激酶的两种亚型SPHK1和SPHK2(Liu，J BiolChem 275：19513-20，2000；Nava，et al.，Exp Cell Res 281：115-127，2002)。虽然CER和SPH通常与细胞凋亡相关，但相反地，S1P是细胞增殖以及存活途径激活的一种递质(An，Ann N Y Acad Sci 905：25-33，2000；Maceyka，et al.，BBA 1585：193-201，2002；Zhang，et al.，J.Cell Biol.114：155-167，1991)。最近理解为胞外递质，其可活化一组属于S1P/LPA受体家族的G蛋白偶联受体(GPCR)，以前称为Edg受体(An，Ann N Y Acad Sci 905：25-33，2000；An，Goetzl，and Lee，J.cell biochem 30/31：147-157，1998；Lee，et al.，Science 279：1552-1555，1998；Okamoto，et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.260：203-208，1999)；然而，还提到了S1P的胞内作用(Van Brocklyn，et al.，J.Cell Biol.142：229-240，1998)。此外，已经表明，CER/SPH水平相对S1P之间的平衡提供决定细胞是否送入死亡路径或被保护以免凋亡的可变机制(Kwon，et al.，J Biol Chem 276：10627-10633，2001；Maceyka，et al.，BBA 1585：193-201，2002；Pyne，Biochem J.349：385-402，2000)。该可变机制的关键调节酶是SPHK，其作用是将死亡促进性鞘脂(CER/SPH)转换成生长促进S1P。
首次提出SPHK作为癌基因的划时代研究由来自Adelaide的研究组公布，表明稳定地用该激酶转染的NIH-3T3成纤维细胞表现出增强的细胞增生，伴随增加的S1P产生(Vadas and Gamble，Circ.Res.79：1216-1217，1996；Xia et al.，Curr Biol 10：1527-1530，2000)。另外，SPHK过表达物逃脱接触抑制，一种通过通常由转化细胞表现出来的性能。这个观察结果与最近的表明S1P增强所选人癌细胞系的转移潜力的报道一致(Igarashi，Ann.N.Y.Acad.Sci.845：19-31，1998；Takuwa，Biochim Biophys Acta.1582：112-120，2002)。此外，当皮下注入NOD/SCID小鼠时，转染者产生肿瘤。这些最近表明腹膜内(i.p.)给予的SPHK小分子抑制剂可以减少SCID小鼠(接受JC哺乳动物腺癌细胞的皮下注射)中的肿瘤体积的研究结果被确认(French，et al.，Cancer Res 63：5962-5969，2003)。重要地，SPHK可以是新型癌基因的概念通过发现SPHK在许多实体瘤，如乳房、结肠、肺、卵巢、胃、子宫、肾和直肠中的那些肿瘤中过表达而提出(Frenchet al.(2003)，above)。另外，已经证实，多个人类肿瘤来源的细胞系可以在用SPHK小分子抑制剂进行治疗时被推动进入凋亡，并且它们的效力可以归于它们降低S1P水平的能力。总起来说，这些发现证实一个重要的概念，即S1P是一种可能由肿瘤细胞本身产生的生长因子，并且降低S1P的浓度可以引起在生长因子撤退后看到的细胞凋亡。
S1P和肿瘤血管发生
血管发生是新血管通过其从现有脉管系统形成的过程。血管发生在多个生理过程中起着关键作用并且涉及各种各样的紊乱，包括肿瘤生长、侵入和转移的发病机制。认为与实体瘤和循环瘤相关的血管发生过程(肿瘤血管发生)是肿瘤生成和疾病进展的关键要素，其中相比于非癌性细胞，新血管给肿瘤细胞提供生长优势。因此，血管发生的临床控制对于癌症和其他血管发生依赖性疾病的治疗是一个关键成分。抗血管生成治疗剂特别引人注意，因为血管内皮细胞(EC)没有癌细胞那么容易发生突变；因此，EC比癌细胞更不可能获得对延长治疗的抗性，使得它们成为治疗剂的良好潜在靶标。
多个生长因子涉及癌性血管发生。发现生物脂鞘氨醇-1-磷酸(S1P)是许多对于癌症重要的细胞过程的递质。S1P作为G-蛋白-偶联受体家族(称为S1P_1-5)的特异性配体而发挥其大部分的作用。这些受体调节血管发生和血管成熟作用、细胞运动以及淋巴细胞运输。相比于S1P，S1P的前体鞘氨醇和神经酰胺与生长停止和凋亡相关。最后，在S1P和其他促血管形成生长因子如VEGF、EGF、PDGF、bFGF和IL-8之间存在复杂的串扰。通过结合至受体S1P₁，S1P反式激活生长因子受体酪氨酸激酶，如在VEGFR、EGFR和PDGFR上发现的。S1P在血管发生依赖性肿瘤中的重要性使得S1P对于癌症治疗是一个例外的靶标。基于这些观察结果，用于中和胞外S1P的抗体方法可以导致人类癌症进展的显著下降，这是由于利用对于支持肿瘤生长所需的营养和氧的相伴随的损失对血管形成的抑制的结果。此外，最近的研究表明，许多血管发生抑制剂也可以用作抗-侵入性和抗-转移性化合物，其也可以有助于癌扩散至远离初始肿瘤部位的迁移。
表明S1P作为最具潜力的促血管形成试剂的最新证据的生长体来自直接比较S1P与注入VEGF和bFGF的试剂的研究。S1P刺激人类静脉内皮细胞(HUVEC)的DNA合成和趋化运动性，同时诱导多细胞结构的分化，所有这些是S1P在早期血管形成中的作用的表示(Argraves，et al.，2004；Lee et al.，1999；Liu，et al.，2000)。而且，S1P促进骨髓来源的EC前体迁移至新血管形成部位(Annabi，etal.，2003)。过表达S1P₁的细胞对抗-形成血管剂沙立度胺(thalidomide)和新伐司他(Neovastat)具有抗性(Annabi et al.，2003)。另外，已经证实，在S1P和其他促血管形成生长因子如VEGF、EGF、PDGF、bFGF和IL-8之间存在实质性串扰。例如，S1P反式激活EGF(Shida，et al.，2004)和VEGF2受体(Spiegel &Milstien，2003)，并且VEGF上调S1P₁受体表达(Igarashi，et al.，2003)。而且，S1P，经过S1P₁和“VEGF轴”起作用，对于下肢血管发生和新血管形成是需要的(Chae，et al.，2004)。
用于癌症的抗-形成血管的方法已经被极大地促进，通过最近的由FDA批准抗-形成血管药物贝伐单抗(bevacizumab)(Genentech)作为细胞毒性化学治疗的佐剂治疗结肠癌。
新近开发了一种抗-S1P鼠类mAb LT1002，其对S1P具有高结合亲和力和特异性。LT1002在人类癌症的多个动物模型中表现出显著更慢的肿瘤进展和相关的血管发生。另外，LT1002减弱了在建立良好的用于老年性黄斑退化症(AMD)的血管发生的模型中的脉络膜新血管生成(CNV)病变形成。CNV在疾病中出现，其中存在Bruch膜和视网膜色素上皮的异常。最常见的这种类型疾病是AMD，其是老年患者严重丧失视力的主要病因。这些结果表明，LT1002具有多种作用机制，包括：(1)对肿瘤细胞生长的直接作用；(2)对血管内皮细胞的间接抗-血管形成作用；以及(3)防止其他促血管形成生长因子的释放和作用的间接抗-血管形成作用。
S1P促进肿瘤血管发生的最直接体内证据来自于我们最新的文献，其重点在于设计用来通过分子吸附中和胞外S1P的鼠类单克隆抗体(Visentin，et al.，2006)。在利用HUVEC的各种体外测定中，抗-S1P mAb中和血管内皮细胞的血管形成、迁移以及防止细胞死亡，其中的每一个都是S1P诱导的。S1P增加生长到植入小鼠的基底膜栓子中的新毛细血管，一种通过系统给予抗-S1P mAb中和的作用。该mAb在鼠类基底膜栓子测定中基本上中和了bFGF-和VEGF诱导的血管发生，并且抗体中和的S1P刺激体内外促血管形成细胞因子(VEGF、IL-8、IL-6)从肿瘤细胞释放。重要地，在同位放入的人类癌细胞异种移植的小鼠利用抗-S1P mAb治疗表现出肿瘤进展的实质性延迟。这在人乳房、卵巢和肺癌的鼠类模型以及在鼠类黑素瘤的一个同种异体移植模型中得到证实(Visentin，et al.，2006)。
单克隆抗体(mAb)作为各种各样的疾病和紊乱的治疗性应用迅速增大，因为它们已经表明是安全和有效的治疗剂。批准的治疗用mAb包括和其他的用于各种疾病的mAb处于各个临床开发阶段，其中主要靶向各种形式的癌症。一般地，单克隆抗体在非人哺乳动物中产生。然而，鼠类单克隆抗体的治疗性利用是优选的，主要是由于人患者对鼠类抗体产生它们自己的抗体反应的事实。这种相同，所谓的HAMA(人抗-鼠抗体)反应，导致鼠类mAb最终的中和并快速消除。这种局限在形成称为鼠类抗体的“人源化”方法之后被克服。人源化极大地减轻了针对所给予的治疗用mAb的免疫反应的形成，并由此避免了对HAMA的半衰期和治疗效力降低的结果。对于大部分来说，人源化过程由将鼠类互补决定区(CDR)移植到人免疫球蛋白的框架区(FR)中构成。这种策略称为“CDR移植”。经常需要对人类FR中所选残基的鼠类氨基酸残基进行“回复突变”以恢复在初始移植构建体中丧失的亲和力。
mAb的生产是一个复杂过程，源于蛋白质本身的可变性。mAb的可变性可以定位到蛋白质骨架和/或定位到糖部分。异质性可以归属于交替二硫化物配对的形成、脱酰胺化和异天冬氨酰基残基的形成、甲硫氨酸和半胱氨酸氧化、N-末端谷酰胺残基环化成焦谷氨酸以及C-末端赖氨酸通过哺乳动物羧肽酶的部分酶促切割。改造工程适用于抗体分子以改进它们的性能，如增强稳定性、蛋白酶抗性、聚集行为以及增强异源性系统中的表达水平。
这里，描述了针对S1P的鼠类MAb的人源化。整个方法由将来自LT1002的六个CDR移植到人类框架中构成。进一步的修饰设计成进一步精制和优化抗体性能。人源化mAb呈现与LT1002相同的特性，因而适合于临床试验中进行测试。
S1P和纤维化
成纤维细胞，特别是肌成纤维细胞是在对细胞损伤和发炎的疤形成中的反应的关键细胞元件[Tomasek，et al.(2002)，Nat Rev MolCell Biol，vol 3：349-63，and Virag and Murry(2003)，Am J Pathol，vol163：2433-40]。通过肌成纤维细胞的胶原基因表达是重建的标志并且对于疤形成是必需的[Sun and Weber(2000)，Cardiovasc Res，vol46：250-6，and Sun and Weber(1996)，J Mol Cell Cardiol，vol 28：851-8]。S1P通过激活成纤维细胞迁移和增生同时增加胶原生产而促进伤口愈合[Sun，et al.(1994)，J Biol Chem，vol 269：16512-7]。通过受损细胞局部产生的S1P可以负责与重建和疤形成相关的不合适伤口愈合。因此，认为S1P抑制剂在至少部分地特征在于异常纤维形成或纤维化的疾病或病症中是有用的。本文中，“纤维形成”定义为成纤维细胞的过度活性或数量，而“纤维化”定义为导致过度或不恰当胶原产生和结疤、生物组织结构破坏和/或导致这样的病理的基质的不恰当收缩(导致视网膜脱落或导致器官功能受损的其他过程)的成纤维细胞的过度活性或数量。
S1P和成纤维细胞胶原表达：S1P促进静止成纤维细胞分化成活性肌成纤维细胞，其在疤形成期间表现出增强的胶原表达[Urata，et al.(2005)，Kobe J Med Sci，vol 51：17-27]。在成纤维细胞增生和迁移到结疤区域中的同时，肌成纤维细胞沉积到主要由骨桥蛋白和纤连蛋白构成的临时粒状网络[Sun and Weber(2000)，Cardiovasc Res，vol 46：250-6]。随着重建继续进行，该临时基质被吸附并建立胶原网络[Sun and Weber(2000)，Cardiovasc Res，vol 46：250-6]。我们已经证实，S1P通过肌成纤维细胞促进胶原产生。TGFβ，一种熟知的纤维化递质，已经证实上调多种促纤维化蛋白，将成纤维细胞转化成肌成纤维细胞并刺激炎性蛋白表达，可能通过S1P的作用[Squires，et al.(2005)，J Mol Cell Cardiol，vol 39：699-707and Butt，Laurent andBishop(1995)，Eur J Cell Biol，vol 68：330-5]。TIMP1(一种涉及TGFβ刺激的成纤维细胞分化成肌成纤维细胞的信号转导分子)的上调被针对SPHK1的siRNA阻断[Yamanaka，et al.，J Biol Chem.2004Dec24；279(52)：53994-4001]，表明抗-S1P抗体的人源化形式可以减弱TGFβ的促纤维化作用以及转移S1P本身的纤维形成作用。
认为在纤维化疾病和病症中最小化不合适结疤是有用的，包括但不限于眼病或心血管病、伤口愈合以及硬皮病。
用于治疗硬皮病的抗-S1P抗体
本发明的组合物和方法在治疗至少部分特征在于异常心血管形成、血管发生、纤维形成、纤维化、结疤、炎症和免疫反应的紊乱和疾病中很有用。一种这样的疾病是硬皮病，其也称为系统性硬化病。
硬皮病是一种自身免疫疾病，其引起皮肤结疤或增厚，并且有时涉及身体的其他区域，包括肺、心脏、和/或肾。硬皮病特征在于皮肤和身体器官中形成疤组织(纤维化)，这可导致使涉及的区域变厚和变硬，伴随功能降低。如今，依据Scleroderma Foundation，大约300,000美国人患有硬皮病。受影响的这些之中的三分之一或更低具有多种的疾病，而剩余三分之二主要具有皮肤症状。当该疾病影响肺并引起结疤时，呼吸可能变得紧促，因为肺不再如它们应该那样地进行扩张。为了检测呼吸能力，医生使用评估用力肺活量能力(FVC)的装置。在具有低于50％预期读数的FVC的人中，由硬皮病相关的肺病的10年死亡率为约42％。死亡率这么高的一个原因在于目前没有可利用的有效治疗。
如在本申请的实施例中描述的，现有证据表明，S1P是可以促进成纤维细胞活化、增生、以及导致与不合适结疤和重建相关的成纤维细胞活性增强的促纤维化生长因子。此外，已经证实了S1P在皮肤和其他类型成纤维细胞的活性中的潜在作用。例如，已经表明，生物活性脂类刺激鼠类皮肤成纤维细胞的迁移(Hama，et al.，J BiolChem.2004Apr 23；279(17)：17634-9)，并且人皮肤成纤维细胞表达多种S1P受体亚型(Zhang，et al.，Blood.1999May 1；93(9)：2984-90)。除了S1P成纤维细胞活性的多种直接作用，S1P还可以对成纤维细胞活性具有许多潜在的间接作用。例如，S1P可以有利于其他熟知的促纤维化因子，如TGF-β和血小板来源的生长因子(PDGF)的作用。TGF-β是最广泛研究和识别的纤维化贡献因子之一(Desmouliere，et al.，J Cell Biol 122：103-111，1993)。TGF-β上调SphK1的表达和活性，导致金属蛋白酶1的组织抑制剂(TIMP-1)(一种抑制ECM降解的蛋白)的表达增加(Yamanaka，et al.，J BiolChem 279：53994-54001，2004)。TIMP-1表达增加关联到心力衰竭患者的间质纤维化和舒张期功能障碍(Heymans，et al.，Am J Pathol166：15-25，2005)。相反地，S1P刺激TGF-β的表达和释放(Norata，et al.，Circulation 111：2805-2811，2005)。还存在S1P和PDGF之间的串扰的明显证据。S1P直接地刺激PDGF的表达(Usui，et al.，J BiolChem 279：12300-12311，2004)。另外，S1P₁受体和PDGF受体彼此结合并且它们的结合对于有助于各种细胞类型的增生和迁移的下游信号转导的PDGF活化是必需的(Long，et al.，ProstaglandinsOther Lipid Mediat 80：74-80，2006；Baudhuin et al.，Faseb J 18：341-343，2004)。同样，TGF-β和PDGF对纤维化的作用可能部分是由于与S1P信号转导路径的串扰。同样，本发明的组合物和方法可以用来治疗硬皮病，尤其是通过降低特定靶脂质例如S1P的体内有效浓度。
认为系统性硬皮病是通过针对PDGF受体的刺激性自身抗体加重的(Baroni，et al.，N Engl J Med.2006 v354(25)：2667-76)，并且PDGF受体在硬皮病成纤维细胞中对TGF-β发生反应而被上调(Yamakage，et al.，J Exp Med.1992May 1；175(5)：1227-34)。由于S1P、PDGF和TGF-β信号转导系统之间的实质性串扰，所以利用抗-S1P剂(例如抗-S1P mAb)阻断S1P生物活性可以间接地减轻PDGF和TGF-β的促硬化作用。此外，利用这样的抗S1P剂的治疗可以通过减轻S1P促进皮肤和疾病进展的其他形式的成纤维细胞的直接作用而使硬皮病患者受益。
S1P与眼疾和眼病
病态或异常血管发生/心血管形成、异常重建、纤维化和结疤以及发炎与视网膜和眼部疾病如老年性黄斑退化症(AMD)、糖尿病视网膜病变(DR)、和早产儿视网膜病(ROP)以及其他发育障碍一起出现[Eichler，et al.(2006)，Curr Pharm Des，vol 12：2645-60]，并且可以作为眼睛感染和机械性损伤的结果而出现[Ciulla，et al.(2001)，Curr Opin Ophthalmol，vol 12：442-9and Dart et al(2003)，Eye，vol 17：886-92]。认为针对S1P的抗体在治疗眼病中很有用，对于所述眼病，病态或异常血管发生/心血管形成、异常重建、纤维化、以及结疤或发炎是一个部分。
眼部的血管发生/新血管形成：
病态眼部血管发生是各种临床病症中失明的一个主要原因。脉络膜新血管形成(CNV)在许多眼病中出现，其中最常见的是渗出性或“湿性”形式的AMD。作为逐渐增多的老龄化人群的结果，AMD如今是一种流行病并且是西方国家60岁以上患者失明的主导病因。尽管视力丧失的流行病由AMD引起，但是仅一些治疗，大多数是以抗-VEGF为基础的可以减缓AMD的进展，甚至更少可以反转视力丧失[Bylsma and Guymer(2005)，Clin Exp Optom，.vol 88：322-34，Gryziewicz(2005)，Adv Drug Deliv Rev，vol 57：2092-8，andLiu and Regillo(2004)，Curr Opin Ophthalmol，vol 15：221-6.]。因此，发现新的用于病态新血管形成的治疗是极其重要的。
这里使用AMD仅为了在描述与异常血管发生/新血管形成、异常重建、纤维化和结疤、以及炎症相关的眼病中举例说明的目的，这些病症在如本文所披露和要求保护的其他眼病和眼疾中发现。AMD涉及年龄相关的病理变化[Tezel，Bora，and Kaplan(2004)，Trends Mol Med，vol 10：417-20and Zarbin(2004)，Arch Ophthalmol，122：598-614]。存在多种理论，但准确的AMD的病因学和发病机制仍然没有被很好地理解。老化与累积氧化性损伤、Bruch膜增厚以及玻璃疣形成相关。氧化性应激导致对视网膜色素上皮(RPE)细胞以及在某些情况下脉络膜毛细血管层的损伤[Zarbin(2004)，Arch Ophthalmol，vol 122：598-614，and Gorin，et al.(1999)，Mol Vis，.vol 5：29]。对RPE的损伤可能在Bruch膜和脉络膜内引发慢性炎症反应[Johnson et al.(2000)，Exp Eye Res，.vol 70：441-9]。这种损伤和炎症培养通过刺激CNV和萎缩而控制视网膜损伤[Zarbin(2004)，Arch Ophthalmol，vol 122：598-614，and Witmer，et al.(2003)，ProgRetin Eye Res，vol 22：1-29]。CNV导致可能被认为是伤口的缺损且有漏隙的血管(BV)[Kent and Sheridan(2003)，Mol Vis，vol 9：747-55]。伤口愈合源于脉络膜并通过Bruch膜和RPE侵入视网膜下间隙(subretinal space)。伤口愈合反应的特征在于典型的早期炎性反应、显著的血管形成反应和组织形成，之后是所有涉及因素的末期成熟化。伤口重建可能不可逆地损害光感受器和RPE，由此判断不能仅仅利用抗-血管形成疗法来治疗CNV[La Cour，Kiilgaard，and Nissen(2002)，Drugs Aging，vol 19：101-33.12]。
正常视网膜和视网膜下结构由于CNV相关纤维化、水肿和炎症单独或累积地引起的改变，导致AMD相关视力损失[Tezel andKaplan(2004)，Trends Mol Med，vol 10：417-20，and Ambati，et al.(2003)，Surv Ophthalmol，vol 48：257-93]。与渗出性AMD相关的多种细胞和细胞因子相互作用在很大程度上使有效治疗的研究变得复杂。尽管CNV和水肿通过抗-VEGF治疗部分地可控，但是对于减轻疤形成和炎症的潜在治疗还没有充分解决[Bylsma and Guymer(2005)，Clin Exp Optom，vol 88：322-34，and Pauleikhoff(2005)，Retina，vol 25：1065-84]。只要新血管复合体保持完整，如看起来是利用抗-VEGF剂治疗的患者的情形，对于视网膜下纤维化以及将来视力丧失的可能就持续存在。
抗-VEGF-A治疗代表渗出性AMD治疗中的最新的显著进步。然而，利用PEGAPTANIB(一种选择性抑制VEGF-A的165中亚型的高亲和力适配子)的III期VISION试验表明，平均的患者继续丧失视力，而仅很小百分比恢复视力[Gragoudas，et al.(2004)，N EnglJ Med，vol 351：2805-16]。利用抗体片段RANIBIZUMAB对所有VEGF-A的亚型的抑制(pan-VEGF抑制)产生更加印象深刻的结果[Brown，et al.，N Eng Med(2006)，vol.355：1432-44，Rosenfeld，et al.N Eng J Med(2006)，vol.355：1419-31]。2年MARINA试验和1年ANCHOR试验表明，大约40％的患者实现一些视力恢复。尽管这些结果代表我们治疗渗出性AMD的能力的一个显著进步，但是它们也证实，60％的患者没有得到视力改善。此外，这些患者必需严格满足限定的纳入和排除标准。更大患者群中的结果可能说服力更小。
仍然存在明确的对于开发进一步的治疗剂的需要，这些治疗剂靶向CNV和最终导致光感受器破坏形成的过程中的其他步骤。首先，脉络膜BV的生长涉及许多递质而不仅仅是VEGF的交互作用，提供调节或抑制整个过程的机会[Gragoudas，et al.(2004)，N Engl JMed，vol 351：2805-16]。其次，渗出性AMD由血管和血管外成分构成。血管成分涉及血管内皮细胞(EC)、EC前体和周细胞。血管外成分，其体积上看起来是最大的成分，由炎症细胞、神经胶质细胞、和视网膜色素上皮(RPE)细胞以及成纤维细胞构成。组织损伤可以由任一成分导致。该病理过程的这些其他方面没有通过目前的抗-VEGF治疗得到解决。靶向与AMD相关的形成血管级联的其他因素可以提供对于治疗更有效和增效的途径[Spaide，RF(2006)，Am JOphthalmol，vol 141：149-156]。
眼病中的炎症：
越来越多的证据表明，炎症、特别是巨噬细胞和补体系统[Klein，et al.(2005)，Science，vol 308：385-9；and Hageman，et al.(2005)，ProcNatl Acad Sci U S A，vol 102：7227-32]在渗出性AMD发病机制中起着重要作用。手术性切除脉络膜新血管膜的组织病理学表明，巨噬细胞几乎普遍存在[Grossniklaus，et al.(1994)，Ophthalmology，vol101：1099-111，and Grossniklaus，et al.(2002)，Mol Vis，vol8：119-26]。越来越多的证据表明，巨噬细胞可以在介导CNV形成和增殖中通过多种效应起作用[Grossniklaus，et al.(2003)，Mol Vis，vol8：119-26；Espinosa-Heidmann，et al.(2003)，Invest Ophthalmol VisSci，vol 44：3586-92；Oh，et al.(1999)，Invest Ophthalmol Vis Sci，vol40：1891-8；Cousins，et al.(2004)，Arch Ophthalmol，vol 122：1013-8；Forrester(2003)，Nat Med，vol 9：1350-1，and Tsutsumi，et al.(2003)，JLeukoc Biol，vol 74：25-32]，包括可以损害细胞和降解Bruch膜以及释放促血管形成细胞因子的酶的分泌[Otani，et al.(1999)，Ophthalmol Vis Sci，vol 40：1912-20，and Amin，Puklin，and Frank(1994)，Invest Ophthalmol Vis Sci，vol 35：3178-88]。在损伤部位，巨噬细胞表现出激活的微小形态表征，如去粒化[Oh，et al.(1999)，Invest Ophthalmol Vis Sci，vol 40：1891-8，and Trautmann et al.(2000)，J Pathol，vol 190：100-6]。因此，认为限制巨噬细胞渗入到脉络膜新血管复合体中的分子可以有助于限制CNV形成。
眼病中的脉络膜新血管形成和血管成熟化：
血管发生是正常伤口愈合的一个基本成分，因其将氧和营养递送至炎症细胞并有助于碎片清除[Lingen(2001)，Arch Pathol LabMed，vol 125：67-71]。进展性血管发生由两个不同过程构成：I期：对附近刺激物反应，血管EC迁移至毛细血管尖端，在这里它们增生并形成内腔结构；以及II期：血管网络的修剪(pruning)以及脉管系统的优化[Guo，et al.(2003)，Am J Pathol，vol 162：1083-93]。
I期：新血管形成。血管发生经常有助于伤口愈合。然而，当不受控制时，新血管通常是不健全的并且促使漏出、出血和发炎。通过靶向促血管形成的GF，消除功能障碍且漏出的BV已经显示出一些减慢的AMD进展的能力[Pauleikhoff(2005)，Retina，vol 25：1065-84.14，and van Wijngaarden，Coster，and Williams(2005)，JAMA，vol 293：1509-13]。
II期：血管成熟化和药物脱敏作用。Pan-VEGF抑制看起来大多数经由导致视网膜内和视网膜下水肿消退的抗-通透作用而发挥其有益作用，因为实际CNV病变没有显著退化。缺乏显著CNV退化可能部分是新形成的血管由于周细胞覆盖而成熟化的结果。周细胞在血管组织形成和保持中起着关键作用。周细胞的存在似乎赋予了抗-VEGF剂抗性并损害它们抑制血管发生的能力[Bergers andSong(2005)，Neuro-oncol，vol 7：452-64；Yamagishi and Imaizumi(2005)，Int J Tissue React，vol 27：125-35；Armulik，Abramsson andBetsholtz(2005)，Circ Res，vol 97：512-23；Ishibashi et al.(1995)，ArchOphthalmol，vol 113：227-31]。对周细胞聚集具有抑制作用的试剂可能会破坏血管通道组装体以及脉络膜心血管通道的成熟化，从而保持它们对抗血管形成剂的敏感性。
血管网络的重建涉及血管(BV)密度的调节以满足营养需要[Gariano and Gardner(2005)，Nature，438：960-6]。BV不成熟时间段对应于其中新血管发挥功能但还没有获得周细胞覆层的时间段[Benjamin，Hemo，and Keshet(1998)，Development，125：1591-8，andGerhardt and Betsholtz(2003)，Cell Tissue Res，2003.314：15-23]。这个延迟实质上是提供一个可塑性窗口，用于根据视网膜或脉络膜的营养需要形成血管的精细调节。
生物活性脂质鞘氨醇-1-磷酸(S1P)、VEGF、PDGF、血管生成素(Ang)和其他生长因子(GF)增加血管生长并将平滑肌细胞(SMC)和周细胞聚集至天然血管，其促进新出现的血管的重建[Allende and Proia(2002)，Biochim Biophys Acta，vol 582：222-7；Gariano and Gardner(2005)，Nature，vol 438：960-6；Grosskreutz，et al.(1999)，Microvasc Res，vol 58：128-36；Nishishita，and Lin(2004)，JCell Biochem，vol 91：584-93，and Erber，et al.(2004)，FASEB J，vol18：338-40.32]。周细胞，最可能是通过在EC出芽时间之前由间叶细胞原位分化产生，或者来自动脉平滑肌细胞的迁移和去分化，紧密地与导致整个血管成熟和存活的EC相关并包裹合适的部位[Benjamin，Hemo，and Keshet(1998)，Development，vol 125：1591-8]。最新研究已表明，S1P和S1P1受体涉及细胞表面运输以及细胞之间粘附分子N-钙连蛋白的活化[Paik，et al.(2004)，Genes Dev，vol 18：2392-403]。N-钙连蛋白对于EC、周细胞和促进稳定血管床层形成的周细胞之间的相互作用是必需的[Gerhardt and Betsholtz(2003)，Cell Tissue Res，vol 314：15-23]。S1P1基因的总体缺失导致对于胚胎发育期间的BV稳定化所需的初生BV的异常周细胞包围(ensheathment)[Allende and Proia(2002)，Biochim Biophys Acta，vol1582：222-7]。针对S1P1的siRNA局部注入抑制异源移植模型中的血管稳定化[Chae，et al.(2004)，J Clin Invest，vol 114：1082-9]。转基因小鼠研究已经证实，VEGF和PDGF-B促进新BV的成熟和稳定[Guo，et al.(2003)，Am J Pathol，162：1083-93，and Gariano andGardner(2005)，Nature，vol 438：960-6.50]。VEGF上调Ang-1(mRNA和蛋白质)[Asahara，et al.(1998)，Circ Res，vol 83：233-40]。Ang-1在通过周细胞聚集和维持外周内皮支撑中起到主要作用[Asahara，etal.(1998)，Circ Res，vol 83：233-40]。眼内注射VEGF加速EC丛的周细胞覆盖[Benjamin，Hemo，and Keshet(1998)，Development，vol125：1591-8]。PDGF-B缺陷型小鼠胚胎缺乏微小血管周细胞，这导致水肿、微型动脉瘤和致死性出血[Lindahl，et al.(1997)，Science，vol277：242-5]。鼠类分娩前研究已证实，另外的对于血管床成熟的信号的完整VEGF-和PDGF-刺激是需要的。基于上文所述的S1P的反式激活，该因子可以是S1P[Erber et al.(2004)，FASEB J，vol18：338-40]。血管稳定化和成熟化与可塑性丧失以及对VEGF和其他GF撤退的消退以及对抗-血管形成治疗的抗性的缺乏相关[Erber，et al.(2004)，FASEB J，vol 18：338-40，and Hughes and Chan-Ling(2004)，Invest Ophthalmol Vis Sci，vol 45：2795-806]。BV对形成血管抑制剂的抗性是由最初使血管稳定以及通过治疗被募集到未成熟血管的那些周细胞所赋予[Erber，et al.(2004)，FASEB J，vol 18：338-40]。在包围未成熟EC之后，周细胞表达补充存活因子(Ang-1和PDGF-B)以保护EC受促凋亡试剂的作用。
眼病中的水肿和血管通透性：
CNV膜由易于将其血管内容物遗漏到周围孔隙而导致视网膜下出血、渗出物和流体积聚的有孔血管EC构成[Gerhardt andBetsholtz(2003)，Cell Tissue Res，vol14：15-23]。很多年CNV组织本身，以及最近视网膜内新血管形成，已经暗示是负责与AMD相关的视敏度的降低。然而，现在认为，由血管通透性(VP)增大以及随后的血管视网膜屏障(BRB)破裂引起的黄斑水肿在与AMD相关视力丧失和其他眼病，包括与糖尿病相关的失明中起主要作用[Hughes and Chan-Ling(2004)，Invest Ophthalmol Vis Sci，vol 45：2795-806；Felinski and Antonetti(2005)，Curr Eye Res，vol 30：949-57；Joussen，et al.(2003)，FASEB J，vol 17：76-8，and Strom，et al.(2005)，Invest Ophthalmol Vis Sci，vol 46：3855-8]。尤其是，糖尿病视网膜病变(DR)和糖尿病性黄斑水肿(DME)在患有糖尿病的患者中是常见的微血管并发症，并且是糖尿病相关失明的最常见病因。DME由增大的微血管通透性导致。Joussen，et al.(2003)，FASEB J，vol 17：76-8。总的说来，这些是工作年龄的人群中新的失明的最常见病因。认为诸如靶向S1P的抗体的化合物对于这些病症来说是治疗上有用的。
可以依据本发明治疗的多种眼病的实例在下文描述。应当理解，许多疾病和病症至少部分特征在于多种病理学过程，例如，病态新血管形成和结疤，并且本文中提供的分类是为了描述方便而不是限制本发明。
a.与病态新血管形成相关的缺血性视网膜病变和特征在于视网膜外层和/或视网膜下膜形成的疾病
缺血性视网膜病变(IR)是特征在于受损视网膜的血流紊乱的多种病变。IR的实例包括糖尿病性视网膜病变(DR)、早产儿视网膜病(ROP)、镰状红细胞性视网膜病变和视网膜静脉闭塞性疾病。所有这些紊乱可能与病态视网膜新血管形成的VEGF导致的增生相关，其可以最终导致眼内出血、视网膜外膜形成和牵拉视网膜脱落。特发性视网膜外膜(ERM)，也称为黄斑皱褶或玻璃纸视网膜病变，可以引起次于视网膜结构变形的视力降低。尽管手术移除这些膜有时会再出现，并且有时与视网膜缺血相关。VEGF及其受体定位至ERM。与增生性糖尿病视网膜病变、增生性玻璃体视网膜病变和黄斑皱褶相关的膜中存在VEGF，进一步表明这种细胞因子在缺血性视网膜疾病以及增生性玻璃体视网膜紊乱的膜生长中起作用。另外，在ERM细胞上也鉴定出了VEGF受体VEGFR1和VEGFR2。这些数据表明，VEGF可以是可能促进血管和无血管ERM进展的自分泌和/或旁分泌刺激因子。PDGF及其受体[Robbins，et al.(1994)，Invest Ophthalmol Vis Sci；vol 35：3649-3663]在患有增生性视网膜疾病的眼中进行过描述[Cassidy，et al.(1998)，Br J Ophthamol；vol 82：181-85，and Freyberger，et al.(2000)，Exp Clin Endocrinol Diabetes，vol 108：106-109]。这些发现表明，PDGF配体和受体在不同起源的增生性视网膜中是广泛存在的，并且表明利用PDGF的自分泌和旁分泌刺激可能涉及ERM的发病机制。转化生长因子-β(TGF-β)涉及ERM的形成[Pournaras，et al.(1998)，Klin Monatsbl Augenheilkd，vol212：356-358]，如通过TGF染色和免疫反应证实的。另外，TGF-β受体II在糖尿病和PVR膜的ERM的肌成纤维细胞中表达。这些结果表明，TGF-β(在视网膜和ERM的多个细胞型中产生的)是引人注意的用于治疗PVR、糖尿病和继发ERM的靶标。已报道白介素-6(IL-6)在增生性糖尿病视网膜病变(PDR)中的人玻璃体中是增多的[La Heij，et al.(2002)，Am J Ophthal，134：367-375]并且在一个研究中，研究的100％的糖尿病ERM表达IL-6蛋白[Yamamoto，et al.(2001)Am J Ophthal，vol 132：369-377]。
已证实外源性给予碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，诱导内皮增生和VEGF表达[Stavri，et al.(1995)，Circulation，vol 92：11-14]。与这些观察结果一致，bFGF浓度在来自患有PDR患者的玻璃体中增大[Sivalingam，et al.(1990)，Arch Ophthalmol，vol 108：869-872，and Boulton，et al.(1997)，Br J Ophthalmol，vol 81：228-233]。bFGF还涉及ERM的形成[Hueber，et al.(1996)，Int.Ophthalmol，vol 20：345-350]，证实了所研究的10个PDR膜中的8个中有bFGF。此外，这些研究者发现了对应于相应受体FGFR1的阳性染色。对bFGF的免疫反应性也已在非血管特发性ERM中证实。这些结果表明在形成血管和无血管ERM中的bFGF。Harada，et al.(2006)，Prog inRetinal and Eye Res，vol 25；149-164。增高的bFGF还在患有ROP的患者血清中检测到[Becerril，et al.(2005)，Ophthalmology，vol 112，2238]。
假定S1P的已知多效作用及其与VEGF、bFGF、PDGF、TGF-β和IL-6的相互作用，认为结合、拮抗、抑制S1P的作用或生产的试剂有效抑制缺血性视网膜病变以及特征在于血管或无血管ERM形成的后段疾病中的病态视网膜新血管形成。至少部分特征在于异常新血管形成或血管发生的其他眼疾包括老年性黄斑退化症，角膜移植排斥，新生血管性青光眼，隐形眼镜超时戴镜症，角膜感染，包括单纯疱疹感染、带状疱疹感染、原虫感染，翼状胬肉，感染性葡萄膜炎，慢性视网膜脱落，激光损伤，镰状红细胞性视网膜病变，静脉闭塞性疾病，脉络膜新血管生成，视网膜血管瘤增生，以及特发性息肉状脉络膜血管病变。
b.增生性视网膜玻璃体病变(PVR)
在自发性裂孔源性(spontaneous rhegmatogenous)视网膜脱落之后以及在创伤性视网膜脱落之后观察到PVR。其是失败的视网膜脱落手术的主要原因。其特征在于细胞膜在视网膜两侧上、在后玻璃体表面和玻璃体基质上的生长和收缩。这种眼中的过度疤组织形成可以导致形成牵拉性视网膜脱落(tractional retinal detachment)，因此针对预防或抑制增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的治疗是视网膜脱落处理的逻辑原理。组织病理学上，PVR特征在于过度胶原产生、收缩和细胞增生[Michels，Retinal Detachment 2nd Edition.Wilkinsin CP，Rice TA Eds，Complicated types of retinal detachment，pp 641-771，Mosby St Louis 1997]。在PVR膜中鉴定的细胞类型主要包括视网膜色素上皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞和血管内皮细胞[Jerdan，et al.(1989)，Ophthalmology，vol 96：801-10，and Vidinova，et al.(2005)，Klin Monatsbl Augenheilkd；vol 222：568-571]。这种过度结疤反应的病理生理学看起来是通过多个细胞因子介导的，包括血小板源性生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF)β、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、白介素-6(IL-6)、以及白介素-8(IL-8)[Nagineni，et al.(2005)，J Cell Physiol，vol 203：35-43；La Heij，et al(2002)，Am J Ophthalmol，134：367-75；Planck，et al.(1992)，Curr EyeRes；vol 11：1031-9；Canataroglu et al.(2005)Ocul Immunol Inflamm；vol 13：375-81，and Andrews，et al.(1999)，Ophthalmol Vis Sci；vol 40：2683-9]。这些细胞因子的抑制如果以及时方式给予可以有助于防止PVR形成，或限制其严重度[Akiyama，et al(2006)，J Cell Physiol，vol207：407-12，and Zheng，et al(2003)，Jpn J Ophthalmolm，vol47：158-65]。
鞘氨醇-1-磷酸(S1P)是具有多效作用的生物活性溶血脂质。其是促血管形成、促发炎(刺激巨噬细胞和肥大细胞的聚集)和促纤维化(刺激疤形成)。S1P通常刺激细胞发生增生和迁移，并且是抗细胞凋亡的。S1P通过其与多个细胞因子和生长因子的相互作用而实现这些生物学不同的功能。已经证实S1P经过单克隆抗体(SPHINGOMAB)的抑制阻断血管内皮生长因子(VEGF)、bFGF、IL-6和IL-8的功能[Visentin，B et al.(2006)，Cancer Cell，vol 9：1-14]。S1P与S1P₁受体的结合也可增加PDGF的产生；因此，结合S1P的试剂也预期可以消除PDGF产生[Milstien and Spiegel(2006)，Cancer Cell，vol 9：148-150]。如在以下实施方式中所表明的，现已经证实，体外S1P将人RPE细胞转化成类似于在PVR中观察到的肌成纤维细胞样表型。假定最终导致在PVR中观察到的过度结疤和S1P对这些相同关键递质的已知作用的病理生理学，认为结合、拮抗或抑制S1P的作用或产生的试剂在消除或最小化PVR形成或其对眼睛的严重损害效果中是有效的。
c.葡萄膜炎
葡萄膜炎是眼葡萄膜的炎性紊乱。其可以影响眼的前部或后部或者这二者。其在病因学上可以是特发性的或感染性的，并且可以威胁到视力。特发性葡萄膜炎与前室中增高的CD4+表达相关[Calder，et al.(1999)，Invest Ophthalmol Vis Sci，vol 40：2019-24]。数据还表明，T淋巴细胞及其趋化物IP-10在葡萄膜炎的发病机制中的病理学作用[Abu El-Asrar(2004)，Am J Ophthalmol，vol 138：401-11]。急性促葡萄膜炎中的其他趋化因子包括巨噬细胞炎症蛋白、单细胞趋化物蛋白-1和IL-8。这些细胞因子可能在急性促葡萄膜炎的白细胞聚集中起关键作用。Verma，et al.(1997)，Curr Eye Res；vol 16；1202-8。假定S1P信号转导级联意义深远且具有多效作用，认为SPHINGOMAB和减少生物活性脂质有效浓度的其他免疫部分将用作减少或调节与葡萄膜炎相关的眼内炎症的有效方法。
d.屈光手术
角膜伤口愈合反应与屈光手术方式是特别相关的，因为其是安全性和效力的主要决定因素。这些程序实施用于治疗近视眼、远视眼和散光。激光原位角膜磨镶术(LASIK)和屈光性角膜切除术(PRK)是最常见的屈光手术方式，然而，也已经开发了其他手术方式试图克服并发症。这些并发症其中包括过度矫正、矫正不足、退化(regression)和间质浑浊。大量常见的并发症涉及愈合反应并且具有对手术的生物反应的根源。角膜生物学中的最大困难之一是经过再生而不是纤维化促进组织修复。认为再生和纤维化之间的选择在于控制成纤维细胞活化[Stramer，et al(2003)，Invest OphthalmolVis Sci；vol 44：4237-4246，and Fini(1999)Prog Retin Eye Res，vol 18：529-551]。称为肌成纤维细胞的细胞可以在手术或损伤之后1-2周在上皮下间质中出现。肌成纤维细胞假定在TGF-β影响下来源于角膜细胞[Jester，et al.(2003)，Exp Eye Res，vol 77：581-592]。角膜混浊和间质结疤的特征在于降低的角膜透明度，并且可以与成纤维细胞和肌成纤维细胞产生相关。原位和体外研究已经表明，TGF-β和PDGF在刺激肌成纤维细胞分化中很重要[Folger，et al.(2001)，InvestOphthalmol Vis Sci；42：2534-2541]。混浊可以在某些情况下在LASIK之后的中心界面中注意到。这些包括弥散性层状角膜炎、圈形皮瓣(donut-shaped flap)和界面处上皮碎片的保持。有可能的是，这些中的每一个与TGF-β对从上皮细胞至活化的角膜细胞的增加接触相关[Netto，et al.(2005)，Cornea，vol 24：509-522]。退化最可能是由于增高的上皮-间质伤口愈合相互作用，如通过角膜成纤维细胞和/或肌成纤维细胞增高的上皮调节生长因子的产生[Netto，et al.(2005)，如上]。利用局部抗-TGF-β抗体对TGF-β与受体的结合的抑制已经证实降低由PRK诱导的混浊[Jester，et al.(1997)，Cornea，vol16：177-187]。假定抗生物活性脂质抗体对纤维化过程和TGF-β的已知作用，我们认为其可以有助于治疗一些屈光手术的并发症如混浊、间质结疤和复原。
e.青光眼过滤手术的调节
青光眼典型地认为是这样的一种疾病，其中升高的眼内压引起对感光神经细胞的损害并且最终损害视野和/或视敏度。其他形式的青光眼存在，其中光学神经损害可以出现在正常压力情况中或所谓的“正常眼压性青光眼”。对于许多患者，药物治疗能够控制它们的疾病，但是对于其他青光眼，需要过滤手术，由此手术地在眼中形成瘘以允许流体吸出。这可以通过小梁切除术、医疗装置植入或其他手术干预方法完成。青光眼过滤手术由于特征在于成纤维细胞增生和最终结疤的伤口愈合过程而失败。抗-代谢物如5-氟尿嘧啶和丝裂霉素C可以减少随后的结疤；然而，即使利用这些药物，长期的跟踪表明手术失败仍然是一个严重的临床问题[Mutsch andGrehn(2000)，Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol；vol 238：884-91，and Fontana，et al.(2006)，Ophthalmology，vol 113：930-936]。人类Tenon囊成纤维细胞(human Tenon’s fibroblasts)的研究表明，它们具有合成bFGF和PDGF以及TGF-β的能力，并且这些生长因子涉及促进该手术方式失败的青光眼过滤手术之后的组织修复过程。Trpathi，et al.(1996)，Exp Eye Res，vol 63：339-46。另外的研究也在过滤后伤口反应中暗示了这些生长因子[Denk，et al.(2003)，Curr EyeRes；vol 27：35-44]，推断不同的PDGF同种型是青光眼过滤手术之后的眼球筋膜成纤维细胞增生的主要刺激物，同时TGF-β对于眼球筋膜成纤维细胞转化成肌成纤维细胞是必需的。我们已经证实，S1P存在于人眼球筋膜/结膜成纤维细胞中，并且S1P在伤口愈合响应中强烈表达。S1P还刺激多个成纤维细胞类型的促纤维化功能以及转化肌成纤维细胞表型和胶原产生。假定S1P的特异性多效作用以及其与bFGF、PDGF和TGF-β的已知相互作用，认为结合、拮抗、抑制S1P的作用或产生的试剂在调节导致青光眼手术失败的伤口愈合和/或纤维化反应中是有效的，并且将是增强手术成功结果的有效治疗方法。预想该试剂可以例如经过玻璃体内或结膜下注射或局部进行给药。
f.角膜移植
角膜移植(渗透性角膜移植术(PK))是人类最成功的组织移植程序。在美国每年实施的47,000个角膜移植中，角膜异体移植排斥仍然是角膜移植失败的主导原因[Ing，et al.(1998)，Ophthalmology，vol 105：1855-1865]。当前，没有足够避开异体移植排斥的能力，尽管免疫抑制和免疫调节可能是有希望的方法。近来，已经发现，CD4(+)T细胞如效应细胞一样直接起作用并且在角膜异体移植的排斥中不是辅助细胞。Hegde，et al.(2005)，Transplantation，vol 79：23-31。鼠类研究已经表现出，经历排斥的角膜间质中数量增加的嗜中性粒细胞、巨噬细胞和肥大细胞。巨噬细胞是主要的过滤细胞型，之后是T细胞、肥大细胞和嗜中性粒细胞。高危险角膜移植中的早期趋化因子表达是IL-8的小鼠类似物(巨噬细胞炎症蛋白-2)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)[Yamagami，et al.(2005)，Mol Vis，vol 11，632-40]。
FTY720(FTY)是一种新型免疫抑制性药物，通过改变淋巴细胞运输起作用；导致外周血淋巴细胞减少和淋巴节中增高的淋巴细胞数。FTY通过结合至一些在淋巴细胞上表达的S1P受体而介导其免疫调节作用[Bohler，et al.(2005)，Transplantation，vol 79：492-5]。药物口服给药，并且单个口服剂量减少30-70％的外周淋巴细胞数。FTY减少T细胞亚组CD4(+)比CD8(+)细胞更多。Bohler，et al.(2004)，Nephrol Dial Transplant，vol 19：702-13。当口服给药时，FTY治疗的小鼠表现出同位角膜移植存活的显著延长。Zhang，et al.(2003)，Transplantation，vol 76：1511-3。FTY口服治疗还显著延迟在大鼠至小鼠模型中的角膜异种移植排斥并降低其严重度[Sedlakova，et al.(2005)，Transplantation，vol 79，297-303]。假定异体移植排斥的已知发病机制结合该数据表明，调节S1P信号转导的作用可以改善角膜移植物存活，认为降低生物活性脂类有效浓度的免疫部分例如SPHINGOMAB在治疗免疫病症如异体移植物排斥中也将是有用的，例如通过减弱免疫反应，因而可能改善PK之后的角膜移植物存活。该药物还可能具有其它的优点，除了系统性给药外，也可能是局部给药，例如经由局部眼周围或眼内递送。
具有炎性或免疫成分的其他眼病包括慢性玻璃体炎、感染，包括单纯疱疹感染、带状疱疹感染、原虫感染，以及眼组织胞浆菌病。
g.特征为结疤的前段(anterior segment)疾病
利用靶向生物活性脂质的抗体的治疗还认为对于特征在于眼前段部分结疤的多种病症是有益的。这些包括以下：
i.创伤
作为眼的最前方结构，角膜暴露于各种危害，包括可导致机械创伤的气载碎片至钝伤。眼睛的角膜和前表面也可能暴露于其他形式的来自手术、以及化学物质如酸碱的创伤、损伤。这些类型的损伤的结果可以是灾难性的，经常导致角膜和结膜结疤睑球粘连(symblephera)形成。另外，角膜新血管形成可能跟着发生。嗜中性粒细胞积累，它们释放白细胞三烯、以及白介素-1和白介素-6，用于聚集炎症细胞的连续变化[Sotozono，et al.(1997)，Curr Eye Res，vol 19：670-676]，其渗入角膜并释放蛋白水解酶，这导致角膜组织的进一步损害和破坏以及角膜熔化。另外，角膜和结膜成纤维细胞被激活并侵入，导致胶原沉积和纤维化。过度炎症和结疤的不期望作用由TGF-β促进。Saika，et al.(2006)，Am J Pathol vol 168，1848-60。这个过程导致角膜透明度丧失以及视觉损伤。减少的炎症，包括导致碱烧伤角膜的鼠类模型中更快和更完全愈合的降低的嗜中性粒细胞渗入和减少的纤维化[Ueno，et al.(2005)，Ophthalmol VisSci，vol 46：4097-106]。
ii.眼瘢痕性类天疱疮(OCP)
OCP是一种主要影响结膜的慢性瘢痕性(疤形成)自身免疫疾病。该疾病是持续进展性的并且预后十分差。在其最终阶段，结膜结疤以及相关角膜病变导致双目失明。组织学上，结膜表现出粘膜下结疤和慢性炎症，其中肥大细胞参与令人惊奇地多[Yao，et al.(2003)，Ocul Immunol Inflamm，vol 11：211-222]。自身抗原导致形成自身抗体。自身抗体与自身抗原的结合在运动中具有复杂的一系列的具有T淋巴细胞渗入的事件，其中CD4(辅助)细胞远远超过CD8(抑制)细胞数。巨噬细胞和肥大细胞渗入以及促炎症和促纤维化细胞因子的释放也可随即发生。细胞因子诱导的结膜成纤维细胞增生和活化结果，具有所得到的上皮下纤维化(参见下文的实施例)。研究已经证实了TGF-β和IL-1在患有OCP患者的结膜纤维化中的作用[Razzaque，et al.(2004)，Invest Ophthalmol Vis Sci，vol 45：1174-81]。
iii.斯-约二氏综合征(SJS)和中毒性表皮坏死松解症(TEN)
SJS和TEN是对药物治疗的威胁生命的有害反应。这两种相关病症的眼部后遗症可能是严重的并且涉及球结膜和睑结膜、眼皮和角膜的病态变化。药物和感染是最常见的诱因。慢性眼部结果包括结疤、睑球粘连形成以及作为初始炎症过程结果的结膜瘢痕形成。这导致睑内翻形成、倒睫、泪膜的不稳定性。眼表面破坏导致角膜结疤、新血管形成以及严重情况下的角化。如在OCP中，结膜的上皮下纤维化发生。对药物或感染的严重自身免疫淋巴细胞反应认为在形成SJS/TEN中起作用。Harilaos，et al.(2005)，ErythemaMultiforme，Stevens Johnson Syndrome，and Toxic EpidermalNecrolysis，in Cornea 2^nd edition.Krachmer，Mannis，Hollandeds.Elesevier Mosby Philadelphia。SJS中的渗入性细胞种类包括巨噬细胞、CD4阳性T细胞和CD8阳性T细胞。该细胞种群类似于在化学损伤中观察到的那些。Kawasaki，et al.(2000)，J Ophthalmol，vol84：1191-3。
iv.翼状胬肉
临床上，翼状胬肉看起来是肉质的、血管实体，其出现在睑间裂隙中。翼状胬肉受试者是一个肉质纤维血管体。活性翼状胬肉特征在于显著的血管充血和进展性生长。它们紧紧地粘附于眼球。在严重的病例中，翼状胬肉侵入到角膜上并且可能引起视轴线内仅次于角膜透明度丧失的视力损失或不规则散光。在症状上，患者可能经历外来体觉、撕裂和视力模糊。组织病理学表明，(巩膜)固有质(substantia propria)的上皮下结缔组织的玻璃变性、增多数量的成纤维细胞和增加的肥大细胞。Butrus，et al.(1995)，Am JOphthalmol，vol 119：236-237。翼状胬肉的控制处理仍然是个难题。经常实施手术切除，然而，复发率高[Krag，et al.(1992)，ActaOphthalmol，vol 70：530]。为了帮助降低翼状胬肉的复发率，已经采用了各种药学佐剂，如丝裂霉素C和柔红霉素。尽管这些可以是有帮助的，但是长期数据有限并且它们可能与巩膜变薄和角膜熔化有关。Dougherty等[(1996)，Cornea，vol 15：537-540，and Lee，et al.(2001)，Cornea，vol 20：238-42]首先证实了，VEGF可能在翼状胬肉形成中起重要作用并且在翼状胬肉的上皮中鉴定了VEGF和氧化一氮。这些研究人员假设了这些以及其他细胞因子负责翼状胬肉的纤维血管向内生长特性。已经证实在原发性和复发翼状胬肉中存在碱性FGF和TGF-β1[Kira，et al.(1998)，Graefes Arch Clin ExpOphthalmol，vol 236：702-8]，并且公布的形态测定和免疫组织化学证据进一步支持血管发生可能在翼状胬肉形成中起作用的观点[Marcovich，et al(2002)，Curr Eye Res，vol 25：17-22]。其他研究表明，作为递质的IL-6和IL-8以及VEGF可能与翼状胬肉形成相关[DiGirolamo，et al.(2006)，Invest Ophthalmol Vis Sci，vol 47：2430-7]。针对翼状胬肉形成和生长的一种有效试剂可以消除对于手术干预的需要或者降低复发率。
具有纤维生成、纤维化或结疤成分的其他眼病和眼疾包括AMD、糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病、镰状红细胞性视网膜病变、缺血性视网膜病变、视网膜静脉闭塞性疾病、以及隐形眼镜超时佩戴症。
概括地，过度结疤是许多眼病以及非眼病和病症的病理生理学的一个潜在成分。生物活性脂类如S1P在这个过程中起作用，并且用来减少这些试剂的浓度的抗体相关治疗可能导致对接受该治疗的患者的治疗益处。在一个实施方式中，认为生物活性脂类的抑制剂，特别是针对S1P的单克隆抗体和/或其变体在调节手术和创伤性伤口愈合反应中是有用的。
纤维化、纤维形成和疤形成：
视网膜下纤维化的形成导致对光感受器不可逆的损害以及永久性视力丧失。只要新血管复合体保持完整，如看起来是用抗-VEGF剂治疗患者的情况一样，对于视网膜下纤维化和将来视力丧失的可能持续存在。在RANIBIZUMAB的最新PRONTO研究中，发现那些丧失视力的患者缺失由于视网膜下纤维化或RPE撕裂的结果导致。可以降低成纤维细胞渗入和胶原沉积的程度的试剂将是有价值的。
成纤维细胞，尤其是肌成纤维细胞是对细胞损伤和发炎的疤形成反应的关键细胞元件[Tomasek，et al.(2002)，Nat Rev Mol CellBiol，vol 3：349-63，and Virag and Murry(2003)，Am J Pathol，vol 163：2433-40]。通过肌成纤维细胞的胶原基因表达是重建的标识并且对于疤形成是必需的[Sun and Weber(2000)，Cardiovasc Res，vol 46：250-6，and Sun and Weber(1996)，J Mol Cell Cardiol，vol 28：851-8]。S1P通过激活成纤维细胞迁移和增生同时增加胶原产生而促进伤口愈合[Sun，et al.(1994)，J Biol Chem，vol 269：16512-7]。由受损细胞局部产生的S1P可能负责与重建和疤形成相关的不合适的伤口愈合。因此，认为S1P抑制剂在至少部分特征在于异常血管发生或纤维化的疾病或病症中是有用的。
视网膜下纤维化的形成导致对光感受器不可逆的损害以及永久性视力丧失。只要新血管复合体保持完整，如看起来是用抗-VEGF剂治疗患者的情况一样，对于视网膜下纤维化和将来视力丧失的可能持续存在。
通过中和SlP而最小化不合适疤形成可能是有益的，并且通过限制视网膜下纤维化和随后光感受器损害的程度而防止视敏度的不可逆丧失。增多的证据表明，S1P可以促进早期和晚期与渗出性AMD相关的不合适视网膜重建。S1P具有显著的非VEGF依赖性促血管形成作用。S1P还刺激多个细胞类型，包括成纤维细胞、EC、周细胞和炎症细胞-残余渗出性AMD和其他眼紊乱的多个不合适的过程中的相同细胞的迁移、增生和存活。S1P关联于涉及渗出性AMD的发病机制的VEGF、bFGF、PDGF和其他生长因子(GF)的产生和激活。最后，S1P可以调节天然脉管系统的成熟，一种导致对抗-血管形成剂敏感性丧失的过程。抑制S1P的作用对于渗出性AMD可以是一种有效的治疗，可以提供相对于排他地抗-VEGF方法的显著优点或者可以与它们协同作用而最终导致与视力丧失相关的AMD的复杂过程和多个步骤。
目前对于AMD的有利治疗模式包括和(Genentech，Inc.)的标示以外的使用，这二者靶向单个生长因子(VEGF-A)并且看起来经过抗-渗透作用而发挥它们的大多数有益作用，导致视网膜下和视网膜内水肿消退，同时急性脉络膜新血管(CNV)病变还没有显著消退。然而，渗出性AMD相关的视力丧失不仅仅是由于CNV诱导的视网膜下和视网膜内水肿。由CNV、视网膜下纤维化、水肿和炎症一起引起视网膜和视网膜下结构的病态破坏和重建，导致与AMD相关的视敏度丧失。这些多个病因没有可利用的治疗，包括Lucentis^TM。因此，可治疗引起视力丧失的多个机制的治疗剂将是有价值的，作为单一治疗或组合另一试剂，如抗-VeGF剂(例如或)。
因此，不希望受限于任何特定理论，认为不期望的鞘脂如S1P的水平、和/或一种或多种它们的代谢物引起或促进各种眼病和眼疾的形成，其中不恰当炎症、纤维化和/或血管发生涉及疾病的发病机制。其中抗-S1P抗体可能在临床上有用的眼病和眼疾包括糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、PVR、前段疾病和年龄相关的黄斑水肿，湿性和干性的，以及诸如青光眼中的小梁切除术或瓣膜移植手术之后。
用于治疗硬皮病的抗-S1P抗体
本发明的组合物和方法在治疗至少部分特征在于异常新血管形成、血管发生、纤维形成、纤维化、结疤、炎症和免疫反应的紊乱和疾病中很有用。一种这样的疾病是硬皮病，其也称为系统性硬化病。
硬皮病是引起皮肤结疤或增厚的自身免疫疾病，并且有时涉及身体的其他区域，包括肺、心脏和/或肾。硬皮病的特征在于在皮肤和身体的器官中形成疤痕组织(纤维化)，这可导致所涉及区域的增厚和硬度，其功能随后减弱。如今，根据硬皮病基金会，大约300,000美国人患有硬皮病。受影响的这些之中的三分之一或更低具有多种疾病，而剩余三分之二主要具有皮肤症状。当该疾病影响肺并引起结疤时，呼吸可能变得紧促，因为肺不再如它们应该的那样进行扩张。为了检测呼吸能力，医生使用评估用力肺活量能力(FVC)的装置。在具有低于50％预期读数的FVC的人中，来自硬皮病相关的肺病的10年死亡率为约42％。死亡率这么高的一个原因在于目前没有可利用的有效治疗。
不希望受任何特定理论的限制，认为脂类如S1P和/或其代谢物的不恰当浓度引起或促进硬皮病形成。因而，本发明的组合物和方法可以用来治疗硬皮病，特别是通过降低特定靶脂质例如S1P的有效体内浓度。
如本申请其他地方描述的，现有证据表明，S1P是一种促纤维化生长因子，其可以促进成纤维细胞活化、增生，并导致与不合适结疤和重建相关的成纤维细胞活性增大。认为利用抗S1P剂(例如抗-S1P mAb)的S1P生物活性可以间接地减轻PDGF和TGF-的促硬化作用。此外，利用这样的抗-S1P剂的治疗通过减轻S1P对皮肤或促进疾病进展的其他形式的成纤维细胞的直接作用而有益于硬皮病患者。
心血管和脑血管障碍
不希望受限于任何特定理论，不期望的鞘脂类如CER、SPH或S1P，和/或一种或多种它们的代谢物的水平可以直接导致心功能障碍，在心脏缺血期间或之后如在再灌注损伤以及所产生的心脏重建和心力衰竭期间。
因为鞘脂类如S1P涉及肝组织的纤维形成和伤口愈合(Davaille，et al.，J.Biol.Chem.275：34268-34633，2000；Ikeda，et al.，Am J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol 279：G304-G310，2000)，受伤脉管系统的愈合(Lee，et al.，Am.J.Physiol.Cell Physiol.278：C612-C618，2000)，以及其他疾病状态，或与这样的疾病如癌症、血管发生和炎症相关的事件(Pyne，et al.，Biochem.J.349：385-402，2000)，本发明的组合物和方法可以应用来治疗不仅这些疾病而且包括心脏病。
这表明，来源于心脏或其他非大脑来源的鞘脂可以促使中风发生。因此，干扰鞘脂产生和/或作用可以在减少中风、特别是由外周血管疾病、动脉粥样硬化和心脏紊乱引起的中风中是有益的。最新证据表明，外源性给予的S1P越过血脑屏障并促进大脑血管收缩(Tosaka，et al.，Stroke 32：2913-2919.2001)。
已经表明，心脏缺血(即，缺少向心脏的血液供应)的过程中的早期事件是通过心肌的过量产生天然化合物鞘氨醇，以及其他代谢物，特别是S1P也通过心脏组织本身或血液成分产生，作为心脏鞘脂产生和随后血液中转化的结果。本发明提供了用于利用特定人源化单克隆抗体中和S1P的方法。由此，本发明提供了人源化抗-鞘脂抗体以及相关组合物和方法以降低关键鞘脂S1P的血液和组织水平。这样的抗体是有用的，例如对于全血中不期望鞘脂的结合以及由此降低其有效浓度。
本发明的治疗用方法和组合物被说成是“基于鞘脂的”以表明这些治疗可以改变某些而不期望的、有毒的或心脏毒性的鞘脂的相对、绝对或可利用浓度。“毒性鞘脂”是指可引起或增强细胞坏死和/或凋亡或者损伤器官或组织功能(例如通过过度纤维化)、在某些情况下包括在特定组织或器官中发现的特定细胞型的任何鞘脂。“心脏毒性鞘脂”是毒性鞘脂，其通过不合适结疤(纤维形成)直接或间接促进心力衰竭并引起负面变力性(negative inotropic state)，或者引起或增强在心脏中发现或与心脏相关的细胞坏死和/或凋亡，包括但不限于心肌细胞、心脏神经元等，和/或由于该鞘脂和/或它们的代谢物的负面变力性、心律失常冠脉收缩/痉挛作用而可以引起心脏功能丧失。“不期望的鞘脂”包括有毒或心脏毒性鞘脂，以及有毒或心脏毒性鞘脂的代谢物，特别是代谢前体。特别感兴趣的不期望的、心脏毒性、和/或毒性鞘脂包括但不限于神经酰胺(CER)、神经酰胺-1-磷酸(C1P)、鞘氨醇-1-磷酸(S-1-P)、二氢-S1P(DHS1P)、鞘氨醇基磷酰胆碱(SPC)、鞘氨醇(SPH；D(+)-赤式-2-氨基-4-反式-十八烯-1，3-二醇，或二氢(神经)鞘氨醇以及各种代谢物。
已知，心肌细胞对缺氧或再氧合的最早反应之一是中性鞘磷脂酶激活以及神经酰胺积累。Hernandez，et al.(2000)，Circ.Res.86：198-204，2000。SPH已被假定涉及介导各种细胞型的凋亡细胞死亡中的早期信号转导事件(Ohta，et al.，FEBS Letters 355：267-270，1994；Ohta，et al.，Cancer Res.55：691-697，1995；Cuvlilier，et al.，Nature 381：800-803，1996)。假定缺氧的心脏毒性作用可以部分由鞘脂产生和/或其他代谢物(例如质子、钙、和某些自由基)不恰当产生或有害地影响心脏功能的信号转导分子(例如MAP激酶，半胱天冬酶)不恰当产生所引起。
S1P储存在血小板中并且是人血浆和血清的常规组分((Yatomi，et al.，J.Biochem.121：969-973，1997)。S1P是对犬心脏具有其他生物学作用的冠状血管收缩剂。Sugiyama，et al.(2000)，CardiovascularRes.46：119-125。假设了S1P在动脉粥样硬化中的作用(Siess，et al.，IUBMB Life 49：161-171，2000)。这已由其他数据支持，包括HDL保护性作用是由于阻断S1P产生的证据(Xia，et al.，PNAS95：14196-14201，1988；Xia，et al.，J Biol Chem 274：33143-33147，1999)。
已经报道鞘磷脂(神经酰胺的代谢前体)在经受缺氧的实验动物中是增加的(Sergeev，et al.，Kosm.Biol.Aviakosm.Med.(Russian)15：71-74，1981)。其他研究报道了肌肉细胞的内膜包含很高的SPH和鞘磷脂量(Sumnicht，et al.，Arch.Biochem.Biophys.215：628-637，1982；Sabbadini，et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.193752-758，1993)。利用串珠镰孢菌素B真菌毒素治疗实验动物导致SPH和DHSPH血清水平增高(S1P没有检测)，其中同时发生对心脏的负面变力性作用(Smithe，et al.，Toxicological Sciences 56：240-249，2000)。
其他疾病或病症
由于生物活性脂质信号转导涉及许多过程，包括新血管形成、血管发生、异常纤维形成、纤维化和结疤，以及炎症和免疫反应，所以认为这些生物活性脂类的抑制剂将促进与这些过程中的一种或多种相关的各种疾病和病症。这样的疾病和病症可以是系统性的(例如系统性硬皮病)或位于一个或多个特定身体系统、部分或器官(例如，皮肤，肺，心血管系统或眼睛)。
控制患者的不期望鞘脂的一种方法是通过提供包含一种或多种人源化抗-鞘脂抗体以结合一种或多种鞘脂的组合物，从而充当降低游离的不期望的鞘脂水平的治疗用“海绵”。当一个化合物称为“游离”时，该化合物不以任何方式被限制到达其发挥不期望作用的位点或部位。通常，游离化合物存在于血液和组织，其是或包含该游离化合物作用的部位，或者化合物从其可以自由地迁移至其作用部位。游离化合物也可以用来被任何将该化合物转化成不期望化合物的酶所作用。
不希望受限于任何特定理论，认为不期望的鞘脂如SPH或S1P，和/或一种或多种它们的代谢物的水平引起或促进心脏和心肌疾病和紊乱的形成。
因为鞘脂也涉及肝组织的纤维形成和伤口愈合(Davaille，et al.，J.Biol.Chem.275：34268-34633，2000；Ikeda，et al.，Am J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol 279：G304-G310，2000)，受伤脉管系统的愈合(Lee，et al.，Am.J.Physiol.Cell Physiol.278：C612-C618，2000)，以及其他疾病状态，或与这样的疾病如癌症、血管发生和炎症相关的事件(Pyne，et al.，Biochem.J.349：385-402，2000)，本发明的组合物和方法可以用来治疗不仅这些疾病而且心脏病。
基于鞘脂的治疗的一种形式涉及操控鞘脂的代谢路径以便降低不期望的毒性鞘脂的实际、相对和/或可利用的体内浓度。本发明提供了用于治疗或预防疾病、紊乱或身体创伤的组合物和方法，其中给予患者人源化抗-鞘脂抗体以结合不期望的、毒性鞘脂，或其代谢物。
这样的人源化抗-鞘脂抗体可以配制到用于各种目的，包括治疗疾病、紊乱或紊乱创伤的药物组合物中。包含本发明的一种或多种人源化抗-鞘脂抗体的药物组合物可以整合到用于这样的治疗的试剂盒和医疗装置中。医疗装置可以用来将本发明的药物组合物给予到需要其的患者，并且根据本发明的一个实施方式，提供的试剂盒包括这样的装置。这样的装置和试剂盒可以设计用于本发明的药物组合物的常规给药，包括自身给药。这样的装置和试剂盒还可以设计用于紧急用途，例如在救护车中或急诊室，或者手术期间，或者在可能发生损伤但完备的医疗紧急情况可能不会立即到来的活动中(例如，徒步旅行和野营，或者战争情形)。
给药方法
用于本文中讨论的疾病和病症的治疗可以通过采用不同制剂和装置的各种方式给予本发明的试剂和组合物而实现。合适的药用稀释剂、载体和赋形剂在本领域是熟知的。本领域技术人员将理解，对于任何具体治疗方案要给予的量易于确定。合适的量可以预期落入10μg/剂量～10g/剂量，优选地10mg/剂量～1g/剂量的范围。
药物可以通过本领域已知的技术给予，包括但不限于全身、皮下、皮内、粘液给药，包括通过吸入，以及局部给药。粘膜是指位于身体内腔的上皮组织。例如，粘膜消化道，包括嘴、食道、胃、肠和肛门；呼吸道，包括鼻通道、气管、支气管和肺；以及外生殖器。对于本说明书的目的，粘膜还包括眼的外表面，即角膜和结膜。局部给药(相对于全身给药)可以是有利的，因为这种方法可以限制潜在的系统副作用，但仍然允许治疗作用。
在本发明中使用的药物组合物包括但不限于溶液、乳液和含脂质体制剂。这些组合物可以从各种成分形成，包括但不限于预成形液体、自乳化固体和自乳化半固体。
在本发明中使用的药物制剂可以根据制药工业中熟知的常规技术进行制备。这样的技术包括使活性成分与药学载体或赋形剂混合的步骤。优选的载体包括药学上可接受的那些，特别是当所述组合物用于人类的治疗用途时。对于非人治疗应用(例如，在治疗伴侣动物、家畜、鱼、或家禽)，可以采用兽医学可接受的载体。一般地，制剂通过均匀且紧密地使活性成分与液体载体或细分的固体载体或这二者混合，然后如果需要，可使该产品成形。
本发明的组合物可以配制成许多可能的剂型的任何形式，例如但不限于片剂、胶囊、液体糖浆、软凝胶、栓剂和灌肠剂。本发明的组合物还可以配制成在含水、非水或混合介质中的悬浮液。含水悬液可以进一步包含增大悬液粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。悬液还可以包含稳定剂。
在一个实施方式中，药物组合物可以配制和用作泡沫。药物泡沫包括这样的制剂，例如但不限于乳液、微乳液、霜剂、胶冻剂和脂质体。
尽管性质基本类似，但是这些制剂在成分和最终产品的稠度上不同。这样的组合物和制剂的如何制备对于药学和配制领域的技术人员来说通常是已知的，并且可以用来配制本发明的组合物。
在一个实施方式中，免疫源性部分可以递送至眼，例如，经由局部滴药或抹膏剂、眼周注射、从前房进入前室或玻璃体，通过植入储药，或者系统地通过注射或口服给药。使用的抗体的量可以由本领域技术人员容易地确定。
将治疗剂递送至眼的传统途径包括局部涂覆、在全身性给药之后再分配到眼或者直接眼内/眼周注射[Sultana，et al.(2006)，CurrentDrug Delivery，vol 3：207-217；Ghate and Edelhauser(2006)，ExpertOpinion，vol 3：275-287；and Kaur and Kanwar(2002)，Drug DevelopIndustrial Pharmacy，vol 28：473-493]。抗-S1P或其他抗-生物活性脂质抗体治疗剂有可能利用这些方法中的任一种，尽管所有方法都具有某些已知的优点和缺点。局部滴入方便，但主要被洗掉，因为鼻泪排出经常将少于5％所涂覆的药物递送入眼的前部，并且甚至该剂量的更小部分递送至眼球的后段。除了滴入，喷雾提供局部给药的另一种模式。第三种模式是眼膏，或者乳剂可以用来延长制剂与眼表面的接触时间，尽管视力模糊和眼皮无光洁很烦。这样的局部给药方法仍然是优选的，因为用于治疗眼部紊乱的治疗剂的全身性给药将整个身体暴露于该药物是潜在有毒。
眼后段的治疗在医疗上很重要，因为老年性黄斑退化症、糖尿病视网膜病变、后葡萄膜炎、以及青光眼是美国和其他发达国家中视力丧失的主导病因。Myles，et al.(2005)，Adv Drug Deliv Rev；57：2063-79。药物递送至后段的最有效模式是通过睫状环的玻璃体内注射。然而，直接注射要求熟练的医疗人员实现该递送，并且可能在许多患者中引起限制治疗性焦虑。眼周注射，一种包括结膜下、眼球后、眼球周和眼后节注射的方法，比玻璃体内注射侵入性更小。重复和长期的玻璃体内注射可能引起并发症，如玻璃体出血、视网膜脱落、或眼内炎。
抗-生物活性脂质抗体治疗还可以使用更新的眼递送系统之一进行给药[Sultana，et al.(2006)，Current Drug Delivery，vol 3：207-217；and Ghate and Edelhauser(2006)，Expert Opinion，vol 3：275-287]，包括持续或受控释放系统，如(a)眼置入物(可溶，易蚀，非易蚀或水凝胶基)，角膜防护物，例如胶原基绷带以及提供药物受控释放到眼的隐形眼镜；(b)原位凝胶化系统，其如滴剂一样给药便利，提供在眼中转成凝胶形式，由此提供一些药物在眼中的持续作用；(c)囊泡状系统，如脂质体，类脂质体/discomes等，其提供靶向递送、生物相容和没有视力模糊的优点；(d)粘膜附着剂系统，其在眼中提供更好的滞留；(e)前药；(f)渗入增强剂；(g)冻干载体系统；(h)颗粒；(i)亚微米乳液；(j)电离子透入；(k)树状高分子；(l)微球体，包括生物粘附性微球体；(m)纳米球体和其他纳米颗粒；(n)collasomes；以及(o)药物递送系统，其组合上述系统中的一个或多个来提供添加剂，或者甚至协同有益作用。这些途径的大多数靶向眼的前段，并且可以有益于治疗前段疾病。然而，这些途径中的一种或多种仍然可以有用地影响眼后区中的生物活性脂质浓度，因为脂质相对的相对低分子量将可能允许脂质在眼内的大量运动。另外，引入到眼前区中的抗体可以能够在整个眼睛迁移，特别是如果其是以较低分子量抗体变体如Fab片段生产。用于后段的持续药物递送系统如批准的或处于开发的那些(参见参考文献，supra)也可以采用。
如之前提到的，后视网膜、脉络膜和黄斑的疾病治疗在医学上非常重要。在这方面，经巩膜的电离子透入法[Eljarrat-Binstock andDomb(2006)，Control Release，110：479-89]是一个重要的进步，并且可以提供一种有效方式以将抗体递送至眼后段。
各种赋形剂也可以加入到配制的抗体，以改善治疗的性能，使得该治疗更方便或者明确地确保配制的抗体仅用于其预计的批准的目的。赋形剂的实例包括控制pH的化学物质、抗菌剂、防腐剂以防止抗体效力损失、染料以识别仅用于眼用途的制剂、增溶剂以增大抗体在制剂中的浓度、渗透增强剂和调节等渗性和/或粘度的试剂的使用。例如可以加入蛋白酶的抑制剂以延长抗体半衰期。在一个实施方式中，抗体在包含适合眼睛pH的磷酸缓冲盐水的溶液中通过玻璃体内注射而递送至眼。
抗-S1P剂(例如人源化抗体)也可进行化学修饰以产生在前述制剂或装置之一中给予的前药。抗体的活性形式然后通过内源性酶的作用释放。在本申请中可以考虑的可能的眼用酶是各种细胞色素p450、醛还原酶、酮还原酶、酯酶或N-乙酰基-β-葡萄糖酰胺酶。对抗体的其他化学修饰可以增加其分子量，并作为结果，增加抗体在眼中的停留时间。这样的化学修饰的一个实例是聚乙二醇化[Harris and Chess(2003)，Nat Rev Drug Discov；2：214-21]，一种对于官能团如二硫化物通常或特定的过程[Shaunak，et al.(2006)，NatChem Biol；2：312-3]or a thiol[Doherty，et al.(2005)，BioconjugChem；16：1291-8]。
本文下面的实施例描述了人源化和变异的抗-鞘脂抗体的生产，具有有治疗前景的期望性能，包括对于鞘脂的强结合亲和力。更具体地，本发明注意到S1P及其变体，其可以包括S1P本身，定义为鞘氨醇-1-磷酸[sphingene-1-phosphate；D-赤式-鞘氨醇-1-磷酸；sphing-4-enine-1-phosphate；(E，2S，3R)-2-氨基-3-羟基-十八-4-烯氧]膦酸(AS 26993-30-6)，DHS1P定义为二氢鞘氨醇-1-磷酸[二氢神经鞘氨醇-1-磷酸；[(2S，3R)-2-氨基-3-羟基-十八氧]膦酸；D-赤式-二氢-D-鞘氨醇-1-磷酸(CAS 19794-97-9)]；SPC是鞘氨醇基磷酰胆碱，溶血鞘磷脂，鞘氨醇基磷酸胆碱，鞘氨醇磷酰胆碱，乙醇铵；2-((((2-氨基-3-羟基-4-十八烯基)氧)羟基氧膦基)氧)-N，N，N-三甲基-，氯化物，(R-(R^*，S^*-(E)))，2-[[(E，2R，3S)-2-氨基-3-羟基-十八-4-烯氧基]-羟基-磷酰基]氧乙基-三甲基-氯化铵(CAS 10216-23-6)。
抗体产生和表征
抗体亲和力可以如本文中以下实施例中描述的进行确定。优选的人源化或变异抗体是以不大于约1x10^-7M，优选地不大于约1x10^-8M，并且最优选地不大于约5x10^-9M的K_d值结合鞘脂的那些抗体。
除了对鞘脂具有强结合亲和力的抗体之外，还期望选择具有来自治疗前景的其他有益性能的人源化或变异抗体。例如，抗体可以是减少血管发生和改变肿瘤进展的抗体。优选地，抗体具有不大于约10μg/ml，优选地不大于约1μg/ml，并且最优选不大于约0.1μg/ml的有效浓度50(EC50)值，如在直接结合ELISA测定中测定的。优选地，当存在1μM的S1P的细胞测定中进行检测时，抗体具有不大于约10μg/ml，优选不大于约1μg/ml，并且最优选不大于约0.1μg/ml的有效浓度值，例如，在这些浓度下，抗体能够抑制至少10％的体外鞘脂诱导的IL-8释放。优选地，当在激光烧伤之后的CNV动物模型中进行检测时，抗体具有不大于约10μg/ml，优选不大于约1μg/ml，并且最优选不大于约0.1μg/ml的有效浓度值，例如，在这些浓度下，抗体能够抑制至少50％的体内鞘脂诱导的新血管形成。
用于确定本发明的抗-鞘脂抗体活性的测定包括ELISA测定，如在下文实施例中所示的。
优选地，人源化或变异抗体在将治疗有效量的该抗体给予人类患者之后不能引发免疫源性反应。如果免疫源性反应被引发，则优选地，该反应使得抗体仍然对所治疗的患者提供治疗性益处。
根据本发明的一个实施方式，人源化抗-鞘脂抗体结合如本文定义的“表位”。为了筛选结合至鞘脂上的表位的抗体，该鞘脂结合至感兴趣的抗体(例如，阻断抗体与鞘脂结合的那些抗体)，可以实施常规交叉阻断实验，如在Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Ed Harlow and David Lane(1988)中描述的。可替换地，表位定位例如在Champe，et al.[J.Biol.Chem.270：1388-1394(1995)]中描述的，可以实施以确定抗体是否结合感兴趣的表位。
本发明的抗体具有包含由下式表示的氨基酸序列的重链可变结构域：FR1-CDRH1-FR2-CDRH2-FR3-CDRH3-FR4，其中“FR1-4”表示4个框架区而“CDRH1-3”表示抗-鞘脂抗体可变重链结构域的3个高变区。FR1-4可以来源于如在以下实施例中的“共有序列”(例如，人类免疫球蛋白重链或轻链种类、亚类或亚群的最常见氨基酸)，或者可以来源于单个人类抗体框架区或来源于不同框架区序列的组合。许多人类抗体框架区序列例如由以上的Kabat等编序。在一个实施方式中，可变重链FR是由上述Kabat等编序的人类免疫球蛋白亚群的共有序列。优选地，人类免疫球蛋白亚群是人重链亚群III(例如，如SEQ ID NO：16中的)。
人类可变重链FR序列优选地其中具有一个或多个替换，例如，其中人类FR残基被相应的非人残基取代(通过“相应的非人残基”是指当人类和非人序列对齐时，具有与感兴趣的人类残基相同的Kabat位置编号的非人残基)，但利用非人残基的取代不是必需的。例如，不同于相应的非人残基取代FR残基可以通过噬菌体展示加以选择。示例性的可以替换的可变重链FR残基包括FR残基号：37H，49H，67H，69H，71H，73H，75H，76H，78H，以及94H(这里采用Kabat残基编号)中的一个或多个。优选地，这些残基中的至少两个、或至少三个、或至少四个被替换。FR替换的一个特别优选的组合是：49H，69H，71H，73H，76H，78H，以及94H。对于重链高变区，这些优选地具有在以下表2中列出的氨基酸序列。
本文中优选实施方式的抗体具有包含由下式表示的氨基酸序列的轻链可变结构域：FR1-CDRL1-FR2-CDRL2-FR3-CDRL3-FR4，其中“FR1-4”表示4个框架区而“CDRL1-3”表示抗-鞘脂抗体可变重链结构域的3个高变区。FR1-4可以来源于如在以下实施例中的“共有序列”(例如，人类免疫球蛋白重链或轻链种类、亚类或亚组的最常见氨基酸)，或者可以来源于单个人类抗体框架区或来源于不同框架区序列的组合。在一个优选实施方式中，可变轻FR由人类免疫球蛋白亚组的共有序列提供，如由以上的Kabat等编序的。优选地，人类免疫球蛋白亚群是人κ轻链亚群I(例如，如SEQ IDNO：17中的)。人类可变轻FR序列优选地其中具有替代，例如，其中人类FR残基被相应的小鼠残基取代，但利用非人残基的取代不是必需的。例如，不同于相应的非人残基的取代残基可以通过噬菌体展示加以选择。示例性的可以取代的可变轻FR残基包括FR残基编号，包括但不限于F4、Y36、Y49、G64、S67中的任意一个或多个。
对于CDR，这些优选地具有在下表2中列出的氨基酸序列。
用于产生本文中感兴趣的人源化抗-鞘脂抗体的方法在下文更详细地描述。
A.抗体制备
用于人源化非人抗-鞘脂抗体以及产生抗-鞘脂抗体的变体的方法在以下实施例中描述。为了使抗-鞘脂抗体人源化，制备非人抗体起始材料。在要产生变体的情况下，制备亲代抗体。用于产生这样的非人抗体起始材料和亲代抗体的示例性技术将在以下部分进行描述。
(i)抗原制备
用于生产抗体的鞘脂抗原可以是例如完整鞘脂或鞘脂的一部分(例如，包含“表位”的鞘脂片段)。对于产生抗体有用的其他形式的抗原对于本领域技术人员是显而易见的。用于产生抗体的鞘脂抗原在以下实施例中描述。在一个实施方式中，抗原是鞘脂的一种衍生形式，并且可以与载体蛋白相连。
(ii)多克隆抗体
多克隆抗体优选通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂而在动物中产生。有用的是，将相关抗原结合到在待免疫化的物种中是免疫原性的蛋白，例如匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂，利用双功能基团或衍生试剂，例如马来酰亚胺苯甲酰基磺酰基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基结合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl₂、或R¹N＝C＝NR，其中R和R¹是不同的烷基基团。
通过将例如100μg或5μg的蛋白或结合物(分别用于兔或小鼠)与三体积的弗氏佐剂混合并在多个部位皮内注射该溶液，将动物针对所述抗原、免疫原性结合物、或衍生物进行免疫。一个月之后，动物用0.1～0.2倍原始量的在弗氏佐剂中的蛋白或结合物通过在多个部位皮下注射进行加强免疫。7至14天之后，动物放血并测定血清的抗体效价。动物加强免疫直至效价稳定。优选地，动物利用相同抗原的结合物(conjugate)，但结合于不同蛋白和/或通过不同交联剂的结合物进行加强免疫。结合物也可在重组细胞培养物中制成蛋白融合体。而且，诸如白矾的聚集剂可以合适地用来增强免疫反应。
(iii)单克隆抗体
单克隆抗体可以利用首次由Kohler，et al.，Nature，256：495(1975)描述的杂交瘤方法，或者通过其他合适方法包括通过重组DNA方法(参见例如美国专利No.4,816,567)制得。在杂交瘤方法中，小鼠或其他恰当宿主动物，如仓鼠或猕猴如上文所述进行免疫，以引发产生或能够产生特异性结合用于免疫的蛋白的抗体的淋巴细胞。可替换地，淋巴细胞可以体外进行免疫。然后利用合适融合剂如聚乙二醇，将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103(Academic Press，1986))。
由此制得的杂交瘤细胞进行接种并在合适培养基中生长，培养基优选地包含抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞的生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏酶-次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基喋呤、和胸苷(HAT介质)，这些物质阻止HGPRT缺陷型细胞生长。
优选的骨髓瘤细胞是指那些有效融合、支持被选的抗体生成细胞进行稳定地高水平生产抗体，并且对培养基诸如HAT培养基敏感的细胞。这之中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠类骨髓瘤系，如来源于MOP-21和M.C.-11小鼠肿瘤(可从Salk Institute Cell DistributionCenter，San Diego，Calif.USA获得)、以及SP-2或X63-Ag8-653细胞(可从American Type Culture Collection，Rockville，Md.USA获得)的那些细胞。人类骨髓瘤和小鼠-人异种骨髓瘤细胞系也已描述用于生产人类单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur，et al.，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。
其中杂交瘤细胞生长的培养基对于针对抗原的单克隆抗体的产生进行测定。优选地，通过杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或酮体外结合测定，如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)进行确定。
单克隆抗体的结合亲和力可以例如通过Munson，et al.，Anal.Biochem.，107：220(1980)的Scatchard分析加以确定。
在鉴定杂交瘤细胞产生具有期望特异性、亲和力、和/或活性的抗体之后，该克隆体可以通过有限稀释方法进行亚克隆分类并通过标准方法生长(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles andPractice，pp.59-103(Academic Press，1986))。用于这个目的的合适培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以在动物体内作为腹水肿瘤生长。
通过亚克隆体分泌的单克隆抗体被合适地从培养基、腹水流体、或血清中通过传统免疫球蛋白纯化程序，例如蛋白A-琼脂糖、羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、渗析、或亲和色谱法分离。
编码单克隆抗体的DNA利用传统程序(例如通过使用能够特异性地结合编码该单克隆抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)易于分离和测序。杂交瘤细胞是这样的DNA优选来源。一旦分离，该DNA可以置入表达载体，其然后转染到宿主细胞如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞、或不另外产生免疫球蛋白的杂交瘤细胞中，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。抗体的重组生产在以下更详细地进行描述。
(iv)人源化和氨基酸序列变体
以下的实施例12描述了用于抗-鞘脂抗体的人源化的方法。用于人源化的一般方法例如描述在US5861155、US19960652558、US6479284、US20000660169、US6407213、US19930146206、US6639055、US20000705686、US6500931、US19950435516、US5530101、US5585089、US19950477728、US5693761、US19950474040、US5693762、US19950487200、US6180370、US19950484537、US2003229208、US20030389155、US5714350、US19950372262、US6350861、US19970862871、US5777085、US19950458516、US5834597、US19960656586、US5882644、US19960621751、US5932448、US19910801798、US6013256、US19970934841、US6129914、US19950397411、US6210671、US6329511、US19990450520、US2003166871、US20020078757、US5225539、US19910782717、US6548640、US19950452462、US5624821、以及US19950479752中。在某些实施方式中，可能期望产生这些人源化抗体的氨基酸序列变体，特别是在这些变体改进该人源化抗体的结合亲和力或其他生物学性能的情况下。实施例12描述了用于产生相对于亲代抗体具有增强亲和力的抗-鞘脂抗体的氨基酸序列变体的方法。
抗-鞘脂抗体的氨基酸序列变体通过将恰当核苷酸变化引入到抗-鞘脂抗体DNA中、或者通过肽合成而进行制备。这样的变体包括例如本文实施例的抗-鞘脂抗体的氨基酸序列内的残基的缺失、和/或插入和/或替代。缺失、插入和替代的任意组合可以达到最终的构建体，假定最终构建体具有期望的特性。氨基酸变化还可以改变人源化或变异抗-鞘脂抗体的翻译后过程，如改变糖基化位点的数量或位置。
用于鉴定抗-鞘脂抗体的某些残基或区域(其是优选的用于诱发突变的位置)的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如由Cunninghamand Wells Science，244：1081-1085(1989)所描述的。这里，靶残基的一个残基或基团被鉴定(例如，带电残基如arg，asp，his，lys和glu)并被中性或带负电的氨基酸(最优选丙氨酸或多聚丙氨酸)替代，以影响氨基酸与鞘脂抗原的相互作用。然后，那些表明对取代具有功能敏感性的氨基酸位置通过对取代位点引入进一步的或其他变体进行细化确认(refined)。因此，尽管用于引入氨基酸序列变异的位点是预定的，但是突变本身的特性不需要预定。例如，为了分析给定位点的突变性能，丙氨酸扫描或随机诱变在靶密码子处或区域进行，并筛选表达具有期望活性的抗-鞘脂抗体变体。氨基酸序列插入包括长度范围从一个残基至包含一百个或更多残基的多肽的氨基-和/或羧基-末端融合体，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N-末端甲硫氨酰基残基的抗-鞘脂抗体或融合至表位标签的抗体。抗-鞘脂抗体分子的其他插入变体包括融合到抗-鞘脂抗体的N-或C-末端的增大抗体血清半衰期的酶或多肽。
变体的另一种类型是氨基酸取代变体。在这些变体中抗体-鞘脂抗体分子中的至少一个氨基酸残基被去除并在其位置中插入不同的残基。对于取代诱变最感兴趣的部位包括高变区，但也考虑了FR改变。保守取代是优选的取代。如果这样的取代导致生物学活性改变，则可以引入更多实质性改变并筛选产品，以下列出了占优势的“示例性”取代，或者如参照氨基酸种类在以下进一步描述的。
表1：示例性氨基酸残基取代

  氨基酸残基(符号)  示例性取代  Ala(A)  val；leu；ile val  Arg(R)  lys；gln；asn lys  Asn(N)  gln；his；asp，lys；gln arg  Asp(D)  glu；asn glu  Cys(C)  ser；ala ser  Gln(Q)  asn；glu asn  Glu(E)  asp；gln asp  Gly(G)  ala ala  His(H)  asn；gln；lys；arg arg  Ile(I)  leu；val；met；ala；leu phe；正亮氨酸  Leu(L)  正亮氨酸；ile；val；ile met；ala；phe  Lys(K)  arg；gln；asn arg  Met(M)  leu；phe；ile leu  Phe(F)  leu；val；ile；ala；tyr tyr  Pro(P)  ala ala  Ser(S)  thr thr  Thr(T)  ser ser  Trp(W)  tyr；phe tyr  Tyr(Y)  trp；phe；thr；ser phe  Val(V)  ile；leu；met；phe；leu ala；正亮氨酸
抗体生物学性能的实质性修饰通过选择取代完成，其中该取代在保持(a)替代区域中的多肽骨架的结构，例如作为层状或螺旋构象；(b)靶部位的分子的电荷或疏水性；或(c)侧链的体积上的作用显著不同。基于共同的侧链特性天然残基被分成组：
(1)疏水性的：正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；
(2)中性亲水性的：cys，ser，thr；
(3)酸性的：asp，glu；
(4)碱性的：asn，gln，his，lys，arg；
(5)影响链定位的残基：gly，pro；以及
(6)芳香性的：trp，tyr，phe。
非保守性取代(subsititution，替代)需要将一个单元从一个种类换成这些种类中的另一类。
不涉及保持人源化或变体抗-鞘脂抗体的正确构象的任何半胱氨酸残基也可以替代，以改进该分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反地，半胱氨酸键可以加入到抗体以改善其稳定性(特别是抗体是抗体片段如Fv片段的情况)。
一种类型的替代变体包括替代亲代抗体(例如，人源化或人类抗体)的一个或多个高变区残基。一般地，选择用于进一步开发所得到变体将相对于产生其的亲代抗体具有改进的生物特性。用于产生这样的替代变体的方便方法是使用噬菌体展示的亲和性突变。简而言之，多个高变区部位(例如6-7个部位)发生突变以在每一个部位产生所有可能的氨基替代。由此产生的抗体变体以单价形式从丝状噬菌体颗粒作为与包装在每一个颗粒内的M13的基因IIII产物的融合体展示。噬菌体展示的变体然后如本文披露的对其生物活性(例如，结合亲和力)进行筛选。为了鉴定用于修饰的候选高变区，实施丙氨酸扫描诱变以鉴定显著贡献于抗原结合的高变区残基。可替换地，或另外地，有利地分析抗原-抗体复合体的晶体结构以鉴定抗体和鞘脂之间的接触点。这样的接触残基和相邻残基是用于根据本文描述的技术进行替代的候选。一旦产生这样的变体，一组变体如本文所述进行筛选，并且在一个或多个相关测定中具有优异特性的抗体可以选择用于进一步开发。
抗体氨基酸变体的另一种类型改变该抗体的原始糖基化形式。通过改变是指缺失抗体中发现的一个或多个糖基部分，和/或插入在该抗体中不存在的一个或多个糖基化位点。
抗体的糖基化通常是N-连接的和/或O-连接的。N-连接的是指糖基部分连接至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除了脯氨酸的任意氨基酸)是用于糖基部分部分酶促连接至天冬酰胺侧链的最常见识别序列。因此，多肽中存在这些三肽序列任一个创造了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖、或木糖之一连接至羟氨酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸也可以使用。
糖基化位点插入到抗体中通过改变氨基酸序列以使其包含上述三肽序列的一个或多个(用于N-连接的糖基化部位)可以方便地完成。改变也可以通过向原始抗体序列插入或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基(用于O-连接的羰基化位点)而制成。
编码抗-鞘脂抗体的氨基酸序列变体的核酸分子通过本领域已知的各种方法进行制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然氨基酸序列变体的情况下)或通过寡核苷酸介导的(或定点的)诱变的制备、PCR诱变、以及早期制得的变体或抗-鞘脂抗体的非变异形式的盒式诱变。
(v)人类抗体
作为人源化的一种替代方案，可以产生人类抗体。例如，在缺少内源性免疫球蛋白产生下，在免疫后可以产生能够产生人类抗体全组成的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中的抗体重链接合区(J_H)基因的纯合子缺失导致内源性抗体产生的完全抑制。在这样的种系突变小鼠中的人种系免疫球蛋白基因阵列的转移将导致在抗原攻击时产生人类抗体。参见例如Jakobovits，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits，et al.，Nature，362：255-258(1993)；Bruggermann，et al.，Year in Immuno.，7：33(1993)；以及美国专利No.5,591,669、5,589,369和5,545,807。人类抗体也可以来源于噬菌体展示文库(Hoogenboom，et al.，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks，et al.，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)；以及美国专利No.5,565,332和5,573,905)。如上所述的，人类抗体还可以通过体外活化的B细胞(参见，例如美国专利No.5,567,610和5,229,275)或者通过其他合适方法产生。
(vi)抗体片段
在某些实施方式中，人源化或变异抗-鞘脂抗体是抗体片段。已经开发了各种技术用于产生抗体片段。传统地，这些片段经过完整抗体的蛋白水解消化而得到(参见，例如Morimoto，et al.，Journal ofBiochemical and Biophysical Methods 24：107-117(1992)；and Brennan，et al.，Science 229：81(1985))。然而，这些片段现在可以直接通过重组宿主细胞产生。例如，Fab′-SH片段可以直接从大肠杆菌回收并化学偶联以形成F(ab′)₂片段(Carter，et al.，Bio/Technology 10：163-167(1992))。在另一实施方式中，F(ab′)₂是利用亮氨酸拉链GCN4形成的以促进F(ab′)₂分子的组装。根据另一种方法，F_V、Fab或F(ab′)₂片段可以直接从重组宿主细胞培养分离。用于产生抗体片段的其他技术对于熟练工作者来说是明显的。
(vii)多特异性抗体
在一些实施方式中，可以期望产生多特异性(例如，双特异性)人源化或变异抗-鞘脂抗体，其对至少两个不同的表位具有结合特异性。示例性双特异性抗体可以结合至鞘脂的两个不同表位。可替换地，抗-鞘脂臂可以与结合不同分子的臂组合。双特异性抗体可以制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab′)₂双特异性抗体)。
根据用于制备双特异性抗体的另一种方法，一对抗体分子之间的界面可以进行改造以使从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大。优选的界面包含至少抗体恒定结构域的C_H3结构域的一部分。在这种方法中，来自第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链被更大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替代。与该大侧链相同或类似大小的互补“空穴”通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替代大氨基酸侧链而在第二抗体分子的界面上形成。这提供了一种用于增大异二聚体而不是其他不希望终产物如同二聚体的产率的机制。参见例如美国专利No.5,731,168。
双特异性抗体包括交联或“异质轭合(heteroconjugate)”抗体。例如，异源结合物中的抗体之一可以偶联于抗生物素蛋白，其他偶联于生物素。异源结合抗体可以利用任何便利的交联方法制得。合适的交联剂在本领域是熟知的，并在例如美国专利No.4,676,980中披露，其中还有大量的交联技术。
用于从抗体片段产生双特异性抗体的技术在文献中已描述。例如，双特异性抗体可以利用化学键接进行制备。Brennan，et al.，Science 229：81(1985)描述了一种方法，其中完整抗体被蛋白水解地切割以产生F(ab′)₂片段。这些片段在二硫醇络合剂亚砷酸钠存在下被还原，以使邻近的二硫醇稳定并防止分子内二硫化物形成。产生的Fab′片段然后转成硫代硝基苯甲酸(TNB)衍生物。Fab’-TNB衍生物之一接着通过利用巯基乙胺还原而再转化成Fab’-硫醇，并与等摩尔量的其他Fab’-TNB衍生物混合以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可以用作用于酶选择性固定化的试剂。在又一个实施方式中，直接从大肠杆菌回收的Fab’-SH片段可以在体外化学偶联从而形成双特异性抗体。Shalaby，et al.，J.Exp.Med.175：217-225(1992)。
也已经描述了用于从重组细胞培养物直接制备和分离双特异性抗体片段的各种技术。例如，双特异性抗体利用亮氨酸拉链产生。Kostelny，et al.，J.Immunol.148(5)：1547-1553(1992)。来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合而连接至两个不同抗体的Fab’部分。抗体同二聚体在铰链区被还原以形成单体，然后再氧化以形成抗体异二聚体。这种方法可以用于抗体同二聚体的产生。由Hollinger，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)描述的“双特异抗体”技术提供了用于制备双特异性抗体片段的一种可选择机制。这些片段包含通过连接区连接于轻链可变结构域(V_L)的重链可变结构域(V_H)，其中该连接区太短而不允许相同链上的两个结构域之间配对。因此，一个片段的V_H和V_L结构域被迫与另一片段的互补V_L和V_H结构域配对，由此形成两个抗原结合部位。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一方法。参见例如Gruber，et al.，J.Immunol.152：5368(1994)。可替换地，双特异性抗体可以是“线性抗体”，如在例如Zapata，et al.Protein Eng.8(10)：1057-1062(1995)中所述产生的。
还考虑了具有多于两个效价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。Tutt et al.，J.Immunol.147：60(1991)。
每一个臂或其片段包含一个或多个结合部位的本发明抗体(或聚合物或多肽)在本文中将称为“多价”抗体。例如，本发明的“二价”抗体每个Fab或其片段包含两个结合部位，而本发明的“三价”多肽每个Fab或其片段包含三个结合部位。在本发明的一种多价聚合物中，每个Fab的两个或更多个结合部位可以结合至相同或不同抗原。例如，本发明多价多肽中的两个或更多个结合部位可以针对相同抗原，例如针对所述抗原的相同部分或表位，或者针对所述抗原的两个或更多个相同或不同部分或表位；和/或可以针对不同抗原；或它们的组合。因此，本发明的二价多肽例如可以包含两个相同的结合部位，可以包含针对抗原第一部分或表位的第一结合部位以及针对所述抗原相同部分或表位或者针对所述抗原另一部分或表位的第二结合部位；或者可以包含针对抗原第一部分或表位的第一结合部位以及针对不同抗原的第二结合部位。然而，如根据上文描述将清楚的，，本发明并不局限于此，意思就是本发明的多价多肽可以包含任何数量的针对相同或不同抗原的结合部位。
每个Fab或其片段包含至少两个结合部位的本发明抗体(或聚合物或多肽)，其中至少一个结合部位针对第一抗原并且第二结合部位针对不同于该第一抗原的第二抗原，也将称为“多特异性的”。因此，“双特异性”聚合物包含至少一个针对第一抗原的部位以及至少一个针对第二抗原的第二部位，而“三特异性”聚合物包含至少一个针对第一抗原的结合部位、至少一个针对第二抗原的另一结合部位、以及至少一个针对第三抗原的另一结合部位等。因此，以它们最简单的形式，本发明的双特异性多肽是本发明的二价多肽(每个Fab)。然而，如根据上文描述将清楚的，本发明并不局限于此，意思就是本发明的多特异性多肽可以包含任何数量的针对两个或更多个不同抗原的结合部位。
(viii)其他修饰
考虑了人源化或变异抗-鞘脂抗体的其他修饰。例如，本发明还涉及免疫结合物，其包含结合至细胞毒性剂如毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物起源的酶促活性毒素或其片段)、或放射性同位素(例如放射结合物)的本文所述的抗体。结合物利用各种双官能蛋白偶联剂制得，如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(盐)(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、亚酰胺酯的双官能衍生物(如己二亚胺二甲酯(HCL)、活性酯(如辛二酸琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、双叠氮基化合物(如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双-二重氮盐衍生物(如双-(对二重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如亚苄基2，6-二异氰酸酯)、以及双活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。
本文中披露的抗-鞘脂抗体还可以配制成免疫脂质体。包含该抗体的脂质体通过本领域已知的方法进行制备，如在Epstein et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688(1985)；Hwang，et al.，Proc.NatlAcad.Sci.USA 77：4030(1980)；以及美国专利No.4,485,045和4,544,545中描述的那些方法。具有增强循环时间的脂质体披露于美国专利No.5,013,556。例如，脂质体可以通过反相蒸发方法利用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物产生。脂质体通过限定孔尺寸的过滤器挤出以产生具有期望直径的脂质体。本发明抗体的Fab’片段可以经过二硫化物互换反应而结合至如在Martin，et al.，J.Biol.Chem.257：286-288(1982)中描述的脂质体。另一活性组分可选地包含在该脂质体中。
酶或其他多肽可以通过本领域熟知的技术如利用上述的异源双官能交联剂而共价地键接至抗-鞘脂抗体。可替换地，至少包含本发明抗体(连接于本发明酶的至少一个功能活性部分)的抗原结合区的融合蛋白可以利用本领域熟知的重组DNA技术进行构建(参见，例如Neuberger，et al.，Nature 312：604-608(1984))。
在本发明的某些实施方式中，可以期望使用抗体片段而不是完整抗体，以增大例如靶组织和细胞的渗透性。在这种情况下，可以期望修饰该抗体片段以便增大其血清半衰期。这可以通过例如将补救受体(salvage receptor)结合表位整合到抗体片段(例如通过抗体片段中的恰当区域的突变或者通过将表位整合到肽标签中，肽标签随后在抗体片段的任一端或中间融合至抗体片段，例如通过DNA或肽合成)而实现。参见，例如美国专利No.6,096,871。
人源化或变异抗-鞘脂抗体的共价修饰也包括在本发明的范围内。它们可以通过化学合成或通过抗体的酶促或化学切割(如果可采用)而制成。抗体其他类型的共价修饰通过使抗体的靶向氨基酸残基与能够和所选侧链或N-或C-末端残基反应的有机衍生化试剂反应而引入该分子。多肽的示例性共价修饰描述于美国专利No.5,534,615中，特别将其通过引用结合于本文。抗体的一种优选共价修饰包括将抗体连接至各种非蛋白质性质的聚合物，例如聚乙二醇、聚丙二醇、或聚氧化烯，并以在美国专利No.4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192或4,179,337中提出的方式进行。
B.载体、宿主细胞和重组方法
本发明还提供了分离的编码人源化或变异抗-鞘脂抗体的核酸、包含该核酸的载体和宿主细胞，以及用于产生抗体的重组技术。
对于抗体的重组生产，编码其的核酸可以分离并插入到用于进一步克隆(DNA扩增)或用于表达的可复制载体中。在另一实施方式中，抗体可以通过同源性重组例如在美国专利No.5,204,244中描述的进行生产。编码单克隆抗体的DNA利用传统程序(例如通过使用能够特异性地结合编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)而易于分离和测序。可以获得许多载体。载体成分一般包括但不限于以下中的一个或多个：信号肽序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子、以及转录终止序列，例如在美国专利No.5,534,615中描述的。
用于克隆或表达本文载体中的DNA的合适宿主细胞是如上所述的原核生物、酵母或更高级真核生物细胞。用于该目的的合适原核生物包括真细菌(eubacteria)，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科，如埃希氏菌，例如大肠杆菌，肠杆菌属，欧文氏菌属，克雷伯菌属，变形杆菌属、沙门氏菌属，例如鼠伤寒沙门氏菌，沙雷菌属，例如粘质沙雷菌(Serratia marcescans)，和志贺菌属，以及杆菌，如枯草杆菌和藓样芽胞杆菌(例如藓样芽胞杆菌41P)，假单胞菌属如铜绿假单胞菌，和链霉菌属。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，尽管其他菌株如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)也是合适的。这些实例是举例说明性的而不是限制性的。
除了原核生物外，真核微生物如丝状真菌或酵母是用于抗-鞘脂抗体编码载体的合适克隆或表达宿主。在低级真核宿主微生物中，最常使用的是酿酒酵母菌或普通面包酵母。然而，大量其他属、种和株常常可获得并且在本文中有用，如裂殖酵母菌丝；克鲁维酵母属宿主例如乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(ATCC 16,045)，K.wickeramii(ATCC 24,178)、克鲁雄酵母(ATCC 56,500)、嗜露酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)、以及马克思克鲁维酵母(K.marxianus)；子囊菌酵母属(EP 402,226)；毕赤氏酵母(EP 183,070)；念珠菌属；里氏木菌(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙链孢霉；许旺酵母属如西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；以及丝状真菌例如链孢霉属，青霉属，弯颈霉(Tolypocladium)、以及曲霉菌属宿主如构巢曲霉菌和黑曲霉。
用于糖基化抗-鞘脂抗体的表达的合适宿主细胞来源于多细胞生物体。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。大量杆状病毒(baculoviral)株和变体以及来自宿主如草地贪夜蛾(毛毛虫)、埃及伊蚊(蚊子)、白纹伊蚊(蚊子)、黑腹果蝇(果蝇)、以及家蚕的相应允许的昆虫宿主细胞已被鉴定。各种用于转染的病毒株可公开获得，例如苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5株，并且这样的病毒在本文中可以用作根据本发明的病毒，特别是用于草地贪夜蛾细胞的转染。棉花、玉米、土豆、大豆、矮牵牛花、番茄和烟草也可用作宿主。
然而，最大的兴趣在于脊椎动物细胞，并且培养物(组织培养物)中的脊椎动物细胞的增殖已经成为常规程序。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是通过SV40(COS-7，ATCC CRL 1651)转化的猴肾CV1系；人类胚胎肾系(293或293细胞，亚克隆用于在悬浮培养基中生长，Graham，et al.，J.Gen Virol.36：59(1977))；婴仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中华仓鼠卵细胞/-DHFR(CHO，Urlaub，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；小鼠睾丸支持细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)；布法罗大鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳房瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather，et al.，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；以及人肝细胞瘤细胞系(Hep G2)。
宿主细胞用上述用于抗-鞘脂抗体产生的表达或克隆载体转化并在作为对于诱导启动子，选择转化子、或扩增编码期望序列的基因合适的修饰的常规营养介质中进行培养。
用来生产本发明的抗-鞘脂抗体的宿主细胞可以在各种介质中培养。商业可获得的介质如Ham′s F10(Sigma)、最小必需培养基((MEM)，(Sigma))、RPMI-1640(Sigma)、以及达尔伯克改良伊格尔培养基((DMEM)，Sigma)适合用于培养宿主细胞。另外，在Ham，etal.，Meth.Enz.58：44(1979)，Barnes，et al.，Anal.Biochem.102：255(1980)、美国专利No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；美国专利Re.30,985中描述的任何介质可以用作用于宿主细胞的培养介质。这些介质中的任一种可以根据需要补充激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白、或上皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCIN^TM药物)、痕量元素(定义为通常以毫摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、以及葡萄糖或等价能量源。也可以包括恰当浓度的任何其他必需的补充物，这对于本领域技术人员是已知的。培养条件如温度、pH等是之前所选的用于表达的宿主细胞的培养条件，并且对于本领域技术人员是明显的。
当使用重组技术时，抗体可以在细胞内、壁膜间隙中生产，或者直接分泌到培养基中。如果是细胞内生产抗体，作为第一步，分离特定的碎片，宿主细胞或溶解的片段，例如通过离心或超滤。Carter，et al.，Bio/Technology 10：163-167(1992)描述了一种用于分离分泌到大肠杆菌壁膜间隙中的抗体的程序。简而言之，细胞浆体在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA、和苯基甲基磺酰基氟(PMSF)存在下解冻约30min。细胞碎片可以通过离心分离出来。在抗体分泌到培养基中的情况下，来自这样的表达系统的上清液一般首先利用商业上可获得的蛋白浓度过滤器例如Amicon或Millipore Pellicon超滤装置进行浓缩。蛋白酶抑制剂如PMSF可以包括在前述步骤的任一个中以抑制蛋白水解，并且也可以包括抗生素以防止偶然性污染物的生长。
从所述细胞制得的抗体组合物可以利用例如羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、渗析、以及亲和性色谱进行纯化，其中亲和性色谱是优选的提纯技术。作为亲和配体的蛋白A的合适性依赖于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可以用来纯化基于人类重链的抗体(Lindmark，et al.，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和用于人类γ3(Guss，etal.，EMBO J.5：15671575(1986))。亲和配体附着的基质最经常是琼脂糖，但其他基质也可利用。机械稳定的基质如受控有孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯比利用琼脂糖能够实现更快的流动速度和更短的加工时间。在包含C_H13结构域的抗体的情况下，Bakerbond ABX^TM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)可以用于纯化。用于蛋白纯化的其他技术，如在离子交换柱上的分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶上的层析、肝素SEPHAROSE^TM上层析、阳离子或阴离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上层析、色谱聚焦、SDS-PAGE、以及也可以根据要回收的抗体利用硫酸铵沉淀。
任何初步纯化步骤之后，包含感兴趣抗体和污染物的混合物可以经受低pH疏水性相互作用色谱，使用pH在约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度(例如约0-0.25M盐)下实施。
C.药物制剂
本发明的抗体或免疫源性部分的治疗用制剂通过混合具有期望纯度的抗体与可选的生理上可接受载体、赋形剂或稳定剂(参见，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980))制备并储存，以冻干制剂或含水溶液的形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂型和浓度下对受体没有毒性，并且包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲铵；杀藻胺；苄索氯铵；苯酚；丁醇或苄醇；烷基苯甲酸酯类如苯甲酸甲酯或苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质如血清白蛋白，明胶，或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸，或赖氨酸；单糖，二糖，或其他糖类包括葡萄糖，山梨糖醇，或糊精；螯合剂如EDTA；糖类如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨糖醇；盐形成抗衡离子如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂如TWEEN^TM，PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。
本文中的制剂还可以包含如对于治疗的特定病征所需的多于一种的活性化合物，优选地具有不会彼此不利地互相影响的具有互补活性的活性化合物。这样的分子合适地以对于预计目的有效的量组合存在。
活性成分还可以包括在例如通过凝聚技术或通过表面聚合制备的微胶囊中，例如分别在胶态药物递送系统(例如，脂质体，白蛋白微球体，微乳液，纳米粒子和纳米胶囊)中或在粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶-微胶囊以及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊中。这样的技术披露于Remington′s Pharmaceutical Sciences，16th edition，Osol，A.Ed.(1980)。
要用于体内给药的制剂必需是消毒的。这易于实现例如通过无菌过滤膜过滤。
可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括包含抗体的固体疏水聚合物的半渗透性基质，该基质为成型制品例如膜、或微胶囊形式。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、或聚(乙烯醇)、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷酰胺的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如Lupron Depot^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)、以及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然聚合物如乙烯-醋酸乙酯和乳酸-乙醇酸能够使分子释放超过100天，但是某些水凝胶在更短时间期内释放蛋白。当包封的抗体在体内保持长时间时，由于暴露于37℃下的湿度，它们可能变性或聚集，导致失去生物活性或免疫原性的可能变化。合理的方法是可以根据涉及的机制设计稳定的方法。例如，如果发现聚集机制为通过硫-二硫化物交换的分子间S-S键形成，则稳定化可以通过修饰巯基残基而实现，从酸性溶液冻干，控制湿度，使用恰当添加剂，以及开发特定聚合物基质组合物。
D.抗体的非治疗性应用
本发明的抗体可以用作亲和性纯化试剂。在这个过程中，抗体使用本领域熟知的方法被固定至固体相如Sephadex树脂或滤纸上。固定的抗体与包含待纯化的鞘脂进行接触，之后用合适溶剂洗脱支持物，这将基本上除去样品中的所有材料，除了鞘脂，其结合于固定的抗体。最后，支持物用另一种合适溶剂如甘氨酸缓冲液，例如在pH 3～pH 5.0之间进行清洗，这将从抗体释放鞘脂。
抗-鞘脂抗体在对于鞘脂的诊断测定中也是有用的，例如检测其在特定细胞、组织(如活组织样品)、或体液中的表达。这样的诊断方法在心血管或脑血管疾病或紊乱中可以是有用的。
对于诊断应用，抗体通常用可检测部分加以标记。多种标记可以利用，其可以总体分成以下种类：
(a)放射同位素，如³⁵S，¹⁴C，¹²⁵I，³H和¹³¹I。抗体可以使用如在例如Current Protocols in Immunology，Volumes 1and 2，Coligen etal.，Ed.Wiley-Interscience，New York，N.Y.，Pubs.(1991)中描述技术用放射同位素标记，并且放射活性可以利用闪烁计数进行检测。
(b)荧光标记如稀土螯合物(铕螯合物)或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰酰(dansyl)、丽丝胺(lissamine)、藻红蛋白和德克萨斯红是可利用的。荧光标记可以使用在例如Current Protocols in Immunology，supra中披露的技术结合至抗体。荧光可以利用荧光计进行定量。
(c)可利用各种酶-底物标记物。例如，美国专利No.4,275,149提供这些中的一部分综述。酶通常催化可利用各种技术检测的生色底物的化学改变。例如，酶可以催化底物的颜色改变，这可用分光光度计检测。可替换地，酶可以改变底物的荧光或化学发光。用于量化荧光改变的技术如上所述。化学发光底物通过化学反应激发电子，然后可以发出可以进行检测(例如利用化学发光计)的光或向荧光受体贡献的能量。酶促标记物的实例包括荧光素酶(例如，荧火虫荧光素酶和细菌荧光素酶；美国专利No.4,737,456)、荧光素、2，3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(heterocyclicoxidases)(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶(lactoperoxidase)、微过氧化物酶(microperoxidase)等。用于将酶结合至抗体的技术描述于O′Sullivan，et al.，Methods for the Preparation of Enzyme-AntibodyConjugates for use in Enzyme Immunoassay，in Methods in Enzym.(edJ.Langone & H.Van Vunakis)，Academic press，New York，73：147-166(1981)。
酶-底物组合的实例包括，例如：
(i)以过氧化氢酶作为底物的辣根过氧化物酶(HRPO)，其中过氧化氢酶氧化染料前体(例如邻苯二胺(OPD)或3，3′，5，5′-四甲基联苯胺化盐酸(TMB))；
(ii)以对硝基苯基磷酸作为生色底物的碱性磷酸酶(AP)；以及(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)与生色底物(例如对硝基苯基β-D-半乳糖苷酶)或荧光底物4-甲基伞形酮β-D-半乳糖苷酶。
对于本领域技术人员来说，大量其他酶-底物组合可以利用。对于这些一般性综述，参见美国专利No.4,275,149和4,318,980。
有时，标记物间接地与抗体结合。技术人员就会注意到用于实现此目的的各种技术。例如，抗体可以与生物素结合，并且上述三种宽类别的标记物中的任一种可以与抗生物素蛋白结合，或反之亦然。生物素选择性地结合于抗生物素蛋白，因而，标记物可以以这种间接方式与抗体结合。可替换地，为了实现标记物与抗体的间接结合，将抗体与小半抗原(例如地高辛)结合并且上述不同标记物之一与抗-半抗原抗体(例如抗-地高辛抗体)结合。由此，可实现标记物与抗体的间接结合。
在本发明另一实施方式中，抗-鞘脂抗体不需要进行标记，并且其存在可以利用标记的抗体(其结合抗-鞘脂抗体)进行检测。
本发明的抗体可以在任何已知方法中采用，如竞争性结合测定、直接和间接夹心测定、以及免疫沉淀测定。参见例如Zola，Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques，pp.147-158(CRCPress，Inc.1987)。
竞争性结合测定依赖于标记的标准物与试验样品分析物对有限量抗体的结合的能力。试验样品中鞘脂的量与已结合抗体的标准物的量成反比。为了有利于确定已结合的标准物的量，抗体通常在竞争之前或之后是不可溶的，以使结合于抗体的标准物和分析物可以方便地从仍然未结合的标准物和分析物分离。
夹心测定涉及使用两种抗体，每一种能够结合至待检测蛋白的不同免疫原性部分、或表位。在夹心测定中，试验样品分析物由固定在固定支持物上的第一载体结合，之后第二抗体结合至分析物，由此形成不溶的三部分复合体。参见例如美国专利No.4,376,110。第二抗体本身可以用可检测部分标记(直接夹心测定)或者可以利用可检测部分标记的抗-免疫球蛋白抗体进行检测(间接夹心测定)。例如，一种类型的夹心测定是ELISA测定，在这种情况下可检测部分是酶。
对于免疫组织化学，血液或组织样品可以是新鲜或冷冻的，或者可以埋入石蜡并用防腐剂例如福尔马林固定。
抗体还可以用于体内诊断测定。一般地，抗体用放射性核素(如¹¹¹In，⁹⁹Tc，¹⁴C，¹³¹I，¹²⁵I，³H，³²P，或³⁵S)标记以使结合的靶分子可以利用免疫闪烁显像加以定位。
E.诊断试剂盒
为了方便，本发明的抗体可以提供在试剂盒中，例如一个包括预定量的试剂和用于实施诊断测定的说明书的包装组合。在抗体用酶标记的情况下，试剂盒将包括该酶所需的底物和辅助因子(例如提供可检测发色团或荧光团的底物前体)。例如，可以包括其他添加剂，如稳定剂、缓冲剂(例如封闭缓冲剂或溶解/裂解缓冲剂)等。各种试剂的相对量可以广泛地变化以提供试剂在溶液中的各种浓度，其实质上优化测定的灵敏度。特别地，试剂可以作为干燥粉末提供，通常冻干的，包括溶解后提供具有恰当浓度的试剂溶液的赋形剂。
F.抗体的治疗性用途
对于治疗应用，本发明的抗-鞘脂抗体以上述的药用剂量形式给予哺乳动物，优选人类，包括可以静脉内作为推注剂或通过在一定时期内的连续灌注、通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、动脉内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径给予人类。
对于疾病的预防或治疗，抗体的恰当剂量如上所述，取决于待治疗的疾病类型、疾病严重度和病程、抗体给药是用于预防或治疗目的、之前的治疗、患者临床病史和对抗体的反应，以及参与医师的判断。抗体合适地在一个时间或一系列治疗内给予患者。
根据疾病的类型和严重度，大约1μg/kg至约50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)的抗体是用于给药至患者的初始候选剂量，例如无论是通过一次或多次分开的给药，或者是通过连续灌注。根据上述因素，典型的每天或每周剂量可以在约1μg/kg至约20mg/kg或更高的范围。对于在数天或更长时间内的重复给药，根据病症，重复治疗直至发生疾病症状按期望地被抑制。然而，其他剂量方案可以是有用的。这种治疗的进展易于通过传统技术和试验，包括例如放射显像进行监控。
根据本发明的另一实施方式，抗体在预防或治疗疾病中的效力可以通过对于这些目的有效的另一试剂-例如化疗用抗癌药物-连续地或组合地给予抗体而得到改进。这样的其他试剂可以存在于给药的组合物中或者可以单独给药。抗体合适地与其他试剂连续给药或组合给药。
G.制品
在本发明的另一实施方式中，提供了包含用于治疗上述紊乱的材料的制品。该制品包括容器和标记物。合适的容器包括例如玻璃瓶、药瓶、注射器和试管。容器可以由各种材料如玻璃或塑料制成。容器容纳对治疗病症有效的组合物，并且可以具有无菌入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针头刺穿的塞子的药瓶)。组合物中的活性剂是抗-鞘脂抗体。容器上或与其相关的标记表明组合物用于治疗选择的病症。制品可以进一步包括包含药用缓冲液如磷酸盐缓冲盐水、林格溶液或葡聚糖溶液的第二容器。可以进一步包括从商业或使用者角度认为期望的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器以及放入了使用说明书的包装。
本发明通过参考以下实施例将被更好地理解，这些实施例用于举例说明，仅限制对于实施本发明已知的最佳模式。本发明的范围不认为局限于此。
实施例
实施例1：针对S1P的鼠类单克隆抗体(Sphingomab^TM；LT1002)
一种类型的治疗用抗体特异性地结合不期望的鞘脂以实现优异的效果，例如(1)降低不期望的有毒鞘脂的有效浓度(和/或它们的代谢物前体的浓度)，该鞘脂促进不期望的作用如心脏毒性、致瘤性、或生成血管的作用；(2)抑制不期望的、有毒的、致瘤的或生成血管的鞘脂与细胞受体的结合，因此，和/或降低可用于结合这样的受体的鞘脂的浓度。这样的治疗作用的实例包括但不限于，使用抗-S1P抗体降低可利用S1P的有效体内血清浓度，从而阻断或至少限制S1P致瘤和血管生成作用，以及它在MI后心力衰竭、癌症、或纤维形成疾病中的作用。
合成硫醇化S1P以含有能够将S1P的基本结构特征与载体分子如KLH交联的反应性基团。在免疫之前，硫代-S1P类似物利用标准方法经过IOA或SMCC交联至蛋白载体(例如KLH)而结合。SMCC是一种杂二官能团交联剂，其与伯胺和巯基基团反应，并且代表优选的交联剂。
Swiss Webster或BALB-C小鼠利用每次注射50μg的免疫原(SMCC有利于硫醇化S1P和KLH的结合)在两个月期间免疫化4次。血清样品在第二次、第三次和第四次免疫化之后两周收集并通过直接ELISA筛选抗-S1P抗体的存在。来自显示高效价的抗体的动物的脾随后用标准融合方法产生杂交瘤。所得杂交瘤生长至融合，之后收集细胞上清液用于ELISA分析。在免疫的55只小鼠中，8只是良好的反应者，表现出对S1P具有反应活性的抗体的显著血清效价。接着利用这些小鼠的脾和骨髓瘤根据已有方法实施融合。所得1500个杂交瘤然后通过直接ELISA筛选，产生287个阳性杂交瘤。在这287个杂交瘤之中，通过直接ELISA筛选，159个显示显著效价。这159个杂交瘤中的每一个然后扩展到24-孔板中。扩展杂交瘤的细胞调节介质然后进行再筛选以鉴定能够分泌感兴趣的抗体的稳定杂交瘤。在60个最高效价稳定的杂交瘤上实施竞争性ELISA。
在筛选的55只小鼠和几乎1500个杂交瘤中，发现一个杂交瘤显示被认为是有限稀释克隆的性能特征，如对于最终产生真正单克隆抗体所需的。这个过程产生47个克隆体，其中大部分被认为产生S 1P抗体是阳性的。在这47个克隆体中，6个扩展到24-孔板中并接着通过竞争性ELISA进行筛选。从保持阳性的4个克隆体中，选择一个来启动S1P单克隆抗体的大规模生产。将这些细胞注射给SCID小鼠并且所得腹水经过蛋白A纯化(50％收率)并分析内毒素水平(＜3EU/mg)。对于一轮腹水生产，注射50只小鼠，产生总共125ml腹水。抗体同种型为IgG1κ，并且认为通过HPLC达到＞95％纯度。抗体在具有150mM氯化钠(pH 7.2)的20mM磷酸钠中制备并在-70℃下储存。这种抗体指定为LT1002或Sphingomab^TM。
阳性杂交瘤克隆体(称为克隆体306D326.26)保藏在ATCC(安全保藏号SD-5362)，并且代表针对S1P的第一鼠mAb。该克隆还包含可以用于产生“人源化”抗体变体的抗体重链和轻链的可变区，以及构建嵌合抗体所需的序列信息。
筛选血清和细胞上清液中的S1P特异性抗体是利用硫醇化S1P类似物作为抗原的直接ELISA。如以下所述实施标准ELISA，只是将50μl的样品(血清或细胞上清液)用等体积的PBS/0.1％Tween-20(PBST)在初始孵育期间加以稀释。ELISA在96-孔高结合ELISA板(Costar)中实施，该板用0.1μg的化学合成的硫醇化-S1P(在结合缓冲液(33.6mM Na₂CO₃，100mM NaHCO₃；pH 9.5)中结合至BSA)涂覆。硫醇化-S1P-BSA在ELISA板孔中在37℃孵育1小时，在4℃过夜。然后该板用PBS(137mM NaCl，2.68mM KCl，10.14mMNa₂HPO₄，1.76mM KH₂PO₄；pH 7.4)清洗4次并在室温下用PBST封闭1h。对于初始孵育步骤，将75μl样品(包含待检测S1P)用25μl的在PBST中稀释的0.1μg/mL抗-S1P mAb孵育并加入到ELISA板孔中。每一个样品在三个孔实施。在室温孵育1h之后，ELISA板用PBS清洗4次并用100μl/孔的0.1μg/mL HRP羊抗-小鼠二级抗体在室温下孵育1h(Jackson Immunoresearch)。然后板用PBS清洗4次并暴露于四甲基联苯胺(Sigma)1-10分钟。检测反应通过加入等体积的1M H₂SO₄而终止。样品的光学密度通过在450nm处利用EL-X-800ELISA板读数器(Bio-Tech)检测而确定。
对于交叉反应性，如上所述实施竞争性ELISA，只是有以下改变。初始孵育由竞争剂(S1P，SPH、LPA等)和生物素-结合的抗-S1P mAb组成。纯化的单克隆抗体的生物素化利用EZ-LinkSulfo-NHS-生物素化试剂盒(Pierce)实施。生物素整合根据试剂盒方法确定并且范围在每个抗体对应7-11个生物素分子。竞争剂制备如下：脂质原液进行声处理并在氩气下干燥，然后在DPBS/BSA[DPBS(Invitrogen 14040-133)中的1mg/ml无脂肪酸的BSA(Calbiochem)]中进行重建。纯化的抗-S1P mAb根据需要在PBS/0.5％Triton X-100中稀释。竞争剂和抗体溶液混合在一起使3份竞争剂对应1份抗体。HRH结合的链霉抗生物素二级抗体(Jackson Immunoresearch)用来产生信号。
竞争性ELISA数据(图1A所示)的另一方面在于，其表明了抗-S1P mAb不能区分在竞争实验中添加的硫醇化S1P与天然S1P。还证实了该抗体不识别任何氧化产物，因为类似物该在没有任何双键的情况下构建的。抗-S1P mAb还针对包含允许在室温下保持48小时的双键的天然产物进行测试。天然S1P的反相HPLC根据之前报道的方法实施(Deutschman，et al.(July 2003)，Am Heart J.，vol.146(1)：62-8)，并且结果表明保留/滞留时间上没有差别。而且，单克隆抗体与各种脂质的结合特性的比较在图1A中示出，表明有抗体识别的表位不涉及天然S1P双键的区域中的烃链。另一方面，由单克隆抗体识别的表位是包含在鞘氨醇基本骨架加上游离磷酸上的氨基醇的区域。如果游离磷酸与胆碱连接(如在SPC情况下)，然后结合会减少。如果氨基集团被酯化成脂肪酸(如在C1P的情况下)，没有观察到抗体结合。如果鞘氨醇氨基醇骨架被甘油骨架取代(如在LPA的情况下)，S1P特异性单克隆没有表现出结合。这些表位定位数据表明，在S1P上仅有一个表位被该单克隆抗体识别，并且该表位通过S1P的独特极性头部基团被限定。
在利用ELISA检测的类似实验中，评价合适的对照材料以确保这种抗-S1P单克隆抗体不识别蛋白载体或交联剂。例如，正常交联剂SMCC在将硫醇化S1P结合至作为ELISA中的涂敷材料的BSA中交换IOA。当使用IOA时，抗体的结合特性几乎与当使用BSA-SMCC-硫醇化-S1P时相同。类似地，KLH交换作为与涂敷材料硫醇化-S1P复合的蛋白的BSA。在这个实验中，在抗体的结合特性上也没有显著差异。
结合动力学：S1P与其受体或其他部分的结合动力学传统地由于脂质的特性而一直是个问题。许多问题与脂类的不溶性相关。对于BIAcore检测，这些问题通过直接将S1P固定至BIAcore芯片而克服。抗体然后在芯片表面上流过，并且检测光学密度的改变以确定抗体与S1P的结合特性。为了避免抗体的二价结合特性，S1P以低密度涂覆到芯片上。另外地，芯片用各种密度的S1P(7、20和1000RU)涂覆，并且抗体结合数据全部拟合至1∶1相互作用模型。图2中所示的结果证实，由于单克隆抗体与S1P在三个不同密度的S1P下的结合导致的光学密度改变。总的说来，确定单克隆抗体与S1P的亲和力是非常高的，在大约88皮摩尔(pM)至99nM的范围内，取决于单价或二价结合模型是否用来分析结合数据。
实施例2：ELISA测定
1.定量ELISA
微滴定ELISA板(Costar，Cat No.3361)用兔抗-小鼠IgG涂覆，在37℃在1M碳酸盐缓冲液(pH 9.5)中稀释F(ab’)₂片段特异性抗体(Jackson，315-005-047)1h。板用PBS清洗并在37℃用PBS/BSA/Tween-20封闭1h。对于初始孵育，将非特异性小鼠IgG或人类IgG、完全分子(用于校准曲线)和待检侧样品的稀释液加入到孔中。清洗板并用每孔100μl的HRP结合的羊抗-小鼠(H+L)(1∶40000稀释)在37℃(Jackson，cat No 115-035-146)孵育1h。在清洗之后，酶促反应利用四甲基联苯胺(Sigma，cat No T0440)检测并通过加入1M H₂SO₄终止。光学密度(OD)在450nm利用ThermoMultiskan EX检测。原始数据转换成GraphPad软件用于分析。
2.直接ELISA
微滴定ELISA板(Costar，Cat No.3361)在37℃下用在1M碳酸盐缓冲液(pH 9.5)中稀释的LPA-BSA涂覆1h。板用PBS(137mMNaCl，2.68mM KCl，10.1mM Na₂HPO₄，1.76mM KH₂PO₄；pH 7.4)清洗并在室温下用PBS/BSA/Tween-20封闭1h或在4℃过夜。待测试的样品以0.4μg/mL、0.2μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL、0.0125μg/mL和0μg/mL稀释并向每一个孔加入100μl。清洗板并用每孔100μl的HRP结合羊抗-小鼠(1∶20,000稀释液)(Jackson，cat.no.115-035-003)在室温下孵育1h。在清洗之后，酶促反应用四甲基联苯胺(Sigma，cat.no.T0440)检测并通过加入1M H₂SO₄终止。光学密度(OD)在450nm利用Thermo Multiskan EX检测。原始数据转换成GraphPad软件用于分析。
3.竞争测定
mAb的特异性在ELISA测定中测试。微滴定板ELISA板(Costar，Cat No.3361)在37℃下用稀释在1M碳酸盐缓冲液(pH9.5)的18:0 LPA-BSA涂覆1h。板用PBS(137mM NaCl，2.68mMKCl，10.1mM Na₂HPO₄，1.76mM KH₂PO₄；pH 7.4)清洗并用PBS/BSA/Tween-20在37℃下封闭1h或室温下过夜。对于初始孵育，将0.4μg/mL抗-LPA mAb和指定量的(14:0，16:0，18:0，18:1，18:2和20:4)LPA、DSPA、18:1LPC(溶血磷脂酰胆碱)、S1P、神经酰胺和神经酰胺-1-磷酸加入ELISA板的孔中并在37℃下孵育1h。清洗板并在37℃下用每孔100μl的HRP结合羊抗-小鼠(1∶20,000稀释液)(Jackson，cat No 115-035-003)或HRP结合羊抗-人类(H+L)(1∶50,000稀释)(Jackson，cat No109-035-003)孵育1h。在清洗之后，酶促反应利用四甲基联苯胺检测并通过加入1M H₂SO₄终止。光学密度(OD)在450nm利用Thermo Multiskan EX检测。原始数据转换成GraphPad软件用于分析。
实施例3：SPHINGOMAB鼠mAb对S1P是高度特异性的
竞争性ELISA证实，相比于其他生物活性脂类，SPHINGOMAB对S1P的特异性。SPHINGOMAB证实对鞘氨醇(SPH)没有交叉反应性，鞘氨醇是S1P或溶血磷脂酸(LPA)的直接代谢前体，一种结构和功能类似于S1P的重要胞外信号转导分子。SPHINGOMAB不识别其他结构上类似的脂类和代谢物，包括神经酰胺-1-磷酸(C1P)、二氢鞘氨醇(DH-SPH)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰乙醇胺(PE)或鞘磷脂(SM)。SPHINGOMAB确实与二氢鞘氨醇-1-磷酸(DH-S1P)具有交叉反应，并且在更小程度上与鞘氨醇基磷酸胆碱(SPC)交叉反应(图3)。
实施例4：SPHINGOMAB在CNV鼠类模型中显著减少CNV和疤痕形成
雌性C57BL6/J小鼠经历Bruch膜的激光诱导破裂并给予在2μl生理盐水中稀释的0.5μg Sphingomab或同种型匹配的非特异性(NS)抗体。小鼠在激光破裂之后14和28天杀死。
为了诱导CNV病变，瞳孔用眼用托品酰胺(0.5％)和苯肾上腺素(2.5％)扩散。将遮盖片置于眼上。偶联至狭缝灯装置以递送具有50μm斑点大小在150mW的100msec脉冲的Oculight GL 532nm(Iridex Corporation，Mountain View，CA)用来破裂右眼三个象限中的Bruch膜，在相当于9、12和3点位置距离视神经盘大约50μm。左眼用作所有情况下的未受损对照。与蒸气泡不相关的任何病变或融合的病变在分析中排除。
为了测量CNV病变尺寸，制备巩膜-脉络膜-RPE复合体的脉络膜平铺片并对脉管系统染色(蓖麻凝集素I；红色)和周细胞(CD140b；绿色)。数字照片利用具有RGB斑点高分辨率数字照相机和激光扫描共焦显微镜的表面荧光Zeiss Axioplan 2(BioRadMRC 1024，BioRad Corporation，Temecula，CA)捕获。对于体积分析，使用z-系列捕获并将整个z-系列上的病变区域的总和乘以z厚度(4μm)以获得病变体积。
为了评价胶原沉积，巩膜-脉络膜-RPE复合体用马森三色进行染色。巩膜-脉络膜-RPE复合体埋入石蜡中，然后连续切成厚度为6毫米的切片。评价每个病变的大约30个切片。胶原沉积体积的定量以如对于CNV病变体积描述的相同方式进行计算。
捕获的数字照片利用ImageJ软件(Research Services Branch，National Institutes of Health，Bethesda，MD)形态度量地进行评价。图4A示出了SPHINGOMAB显著减弱在Bruch膜激光诱导破裂之后14和28天的脉络膜新血管形成。图4B示出了SPHINGOMAB显著减少与在Bruch膜激光诱导破裂之后28天CNV病变形成相关的纤维化。
实施例5：SPHINGOMAB通过包括抑制内皮细胞迁移和管形成的多种机制而抑制新血管形成
S1P促进人脐静脉内皮细胞(HUVEC)以及基底膜和其他试验中的迁移，促进从头开始的体外BV形成；SPHINGOMAB可以中和S1P的这些作用。如按照Visentin et al.(Cancer Cell 2006Mar；9(3)：225-38)所述实施实验。图5A中的数据表明，接种到GF-还原的基底膜上的HUVEC在S1P存在下形成多个毛细管样结构，并且在没有S1P或当用SPHINGOMAB和S1P共同孵育时不能形成毛细管样结构。图5B中的数据证实，在基底膜趋化侵袭试验中，0.1-1μM S1P刺激HUVEC迁移的能力高出未处理的HUVEC，或与SPHINGOMAB共孵育的HUVEC2-2.5倍。总起来，这些研究证实，SPHINGOMAB可以有效地减轻S1P对EC的促血管形成作用。
实施例6：SPHINGOMAB通过包括减轻S1P、VEGF和bFGF的体内作用的多种机制而抑制新血管形成
基于体内研究表明，S1P增加内皮毛细血管生长到皮下植入的基底膜栓子中，我们推测SPHINGOMAB可以减少从头开始的体内BV形成。为了考察这个推测，我们对新血管形成采用了体内基底膜栓子测定。在一组实验中，基底膜补充了1μM S1P、0.5μg/mLbFGF或1μg/mL VEGF，然后在腹膜内注入到小鼠(n＝4)。10天之后，小鼠肝素化并用荧光凝集素、异凝集素B4-FITC(其结合至有形成生长BV的血管EC表达的粘附分子)注射。然后栓子切除，在OCT中冷冻，切片并观察FITC染色的BV。图6A中的数据表明，S1P是比bFGF或VEGF更有效的体内新血管形成的刺激剂[Lee，et al.，(1999)，Biochem Biophys Res Commun，.vol 264：743-50]，如通过与包含bFGF或VEGF的栓子相比，在大量包含S1P的栓子中的FITC染色的BV证实的。
栓子的切片然后用苏木素&署红染色用于评价EC渗入(图6B)。EC的渗入是新血管形成中的关键步骤。包含S1P的栓子相比于仅基底膜栓子具有增加3倍的EC渗入。细胞渗入假设是EC，尽管我们认为其他细胞型如免疫细胞也可以染色。小鼠系统性地每48h给予SPHINGOMAB(在栓子植入先1天开始)，证实即使当S1P加入到基底膜栓子时EC渗入量也减少。这些结果证实，SPHINGOMAB抑制体内EC渗入的能力。
来自血液和周围组织的内源性S1P可以给伤口供应促形成血管刺激。考察了SPHINGOMAB减少伤口中的内源性S1P的能力。最佳刺激的栓子(补充了0.5μg/mL bFGF或10mg/mL VEGF的基底膜)植入到小鼠中。小鼠接受从基底膜植入之前1天开始每48h腹膜内注射25mg/kg SPHINGOMAB或盐水。每个治疗组(基底膜，基底膜加GF或基底膜加GF并给予SPHINGOMAB)由最少6只小鼠组成。在10天之后，小鼠用肝素处理，注射异凝集素B4-FITC，栓子切除，埋入OCT冷冻介质中并切片。微血管密度通过凝集素-FITC染色血管定性地评价，如图6C所示。BV染色零星地出现在对照(未处理)栓子中，而包含bFGF或VEGF的栓子显示了血管形成的显著证据。来自用SPHINGOMAB处理的小鼠的栓子相比于来自盐水处理小鼠的bFGF或VEGF栓子，显示显著减少BV形成。染色血管的量化表明，用SPHINGOMAB处理的动物的含VEGF或bFGF的栓子，相比于盐水处理的动物，在新血管形成上减少5至8.5倍(图6C)。这个评价进一步表明，内源性血清和组织S 1P增强微血管形成的能力以及SPHINGOMAB中和内源性S1P促血管形成作用的能力。
实施例7：SPHINGOMAB抑制体内疤形成
S1P通过激活成纤维细胞迁移、增生和胶原产生而对伤口愈合具有深远的贡献；SPHINGOMAB中和这些作用。利用多种类型的成纤维细胞的多个研究确认了S1P促进伤口愈合的能力：1)S1P增大Swiss-3T3成纤维细胞增生，如利用标准方法通过³H-胸苷整合测得的(图7A)；2)S1P在标准刮伤口愈合试验中促进心脏成纤维细胞的迁移(图7B)；3)S1P促进通过从具有胶原1a GFP报告子的转基因小鼠分离的心脏成纤维细胞的胶原表达，如通过免疫荧光显微镜指示的(图7C)；以及4)S1P诱导WI-38肺成纤维细胞分化成肌成纤维细胞，其在疤重建中是活性细胞，如利用免疫印迹分析，通过肌成纤维细胞标记物蛋白-平滑肌肌动蛋白的表达增多所暗示的(图7D)。在这些测定的每一个中，SPHINGOMAB中和S1P的作用。预期眼成纤维细胞将类似地对S1P和SPHINGOMAB发生反应。已经注意到在心血管疾病和AMD的新血管病变，包括疤重建和随后的不合适纤维组织形成之间的类似性(Vine，et al.(2005)，Ophthalmology，.vol 112：2076-80and Seddon and Chen(2004)，IntOphthalmol Clin，.vol 44：17-39)；因此，认为SPHINGOMAB对眼新血管形成和结疤具有类似于在心血管系统中证实的作用。
研究评价了SPHINGOMAB在永久性心肌梗死(MI)之后经过小鼠左降冠状动脉连接而减少心脏疤形成的效率。系统性给予25mg/kg SPHINGOMAB或盐水在手术后48h启动。选择在48h的抗体给药以允许在早期重建阶段期间出现正常的修补性疤形成，并允许在MI后立即的有益的S1P刺激的血管发生。在梗死之后两周，小鼠杀死并通过心脏组织的马森三色染色进行评价。接受SPHINGOMAB治疗的动物表现出血管周围纤维化的几乎完全消失(图7，照片)。作为用于任何特定伤口愈合反应的对照，假手术动物进行开胸手术但没有进行冠状动脉连接(图7E)。
实施例8：S1P促进眼上皮细胞和成纤维细胞转化成收缩性的产生疤组织的肌成纤维细胞
病理性组织纤维化(疤形成)是许多眼紊乱中的一种原发性促进因素，包括：年龄相关性黄斑退化症、糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变、增生性玻璃体视网膜病变以及青光眼手术后遗症。在这些紊乱的许多中，血液循环生长因子和趋化因子促进正常眼细胞转化成纤维收缩性、产生疤组织的细胞(称为“肌成纤维细胞”)。通常，肌成纤维细胞作为损伤后伤口愈合反应的一部分而负责组织修复。然而，肌成纤维细胞数量和功能的变化涉及特征在于肝、皮肤、肺、肾、心脏和眼中的病态疤组织形成。在眼中，视网膜色素上皮(RPE)细胞转化成肌成纤维细胞表型与纤维收缩性膜的形成有关，其引起视网膜脱落和随后的视力受损。另外，眼成纤维细胞的肌成纤维细胞转化可以在眼损伤后导致异常疤组织产生，导致随后的视力丧失。尽管已经鉴定了眼中促进肌成纤维细胞形成的许多血液循环蛋白因子，但是关于溶血脂类如S1P在该过程中的作用还一无所知。因此，我们考察了S1P对多种人类眼细胞系的肌成纤维细胞转化的作用。如在图8中所示的，S1P刺激人视网膜色素上皮细胞(图8A)和人类结膜成纤维细胞(图8B)中的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA；一种肌成纤维细胞标记物)的产生。这些数据第一次表明，S1P是周围环境中促进眼上皮细胞和成纤维细胞转化成收缩性产生疤组织的肌成纤维细胞的化学因子，其可以促进视网膜脱落、眼部纤维化以及随后的视力受损。
在这些实验中，S1P促进α-SMA表达的能力在视网膜色素上皮细胞和结膜成纤维细胞之间以浓度依赖性方式不同。如所示的，在上皮细胞中在0.001μM浓度下观察到α-SMA表达显著增加，其然后在10μM浓度下降至基本水平。相反，在结膜成纤维细胞中仅在10μM浓度下观察到α-SMA表达显著增加。这种差异认为是由上皮细胞中相比于成纤维细胞增加的S1P受体表达导致的。由于增高的S1P受体表达水平，视网膜色素上皮细胞可能在低浓度下就对S1P更敏感。相反，在高S1P水平下，受体变得敏感化或者可能地甚至内化，导致降低的S1P的刺激。
胶原是原始结构蛋白之一，其支持体内所有的组织，并且是疤组织主要成分之一。在非病态环境下，组织内的总胶原总量通过在成纤维细胞的胶原产生和被某些酶的降解之间的平衡得以保持。涉及增高的疤组织水平的许多紊乱部分地由抑制对于疤形成所需的胶原的降解的生理学和分子过程所导致。假设S1P促进疤组织形成的能力由其抑制胶原降解，从而导致器官内疤组织净增加的能力所导致的。因此，考察了S1P对人结膜成纤维细胞中的纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)的表达的作用。增加的PAI-1表达与结缔组织的蛋白水解降解减少相关并且与涉及疤痕增加的多种纤维化疾病相关地被上调。如图8C所示，S1P以剂量依赖性方式刺激PAI-1表达。这些数据表明，还可以通过刺激抑制其降解的蛋白表达来促进疤痕组织形成，表明S1P通过多种机理途径起作用以促进和保持与眼病相关的病态疤痕。
实施例9：SPHINGOMAB抑制发炎和免疫细胞渗入
发炎是重建过程中的第一反应。其由缺血和细胞受损触发，并导致刺激巨噬细胞和嗜中性粒细胞迁移至吞噬死亡细胞的受损区域的细胞因子的上调并进一步上调炎性反应[Jordan，et al.(1999)，Cardiovasc Res，.vol 43：860-78]。肥大细胞也是炎性反应的重要细胞递质。从肥大细胞释放的S1P与在炎症的实验动物模型中的许多有害反应有关[Jolly，et al(2004)，J Exp Med，.vol 199：959-70and Jollyet al(2005)，Blood，.vol 105：4736-42]。
基于CNV和CVD中的免疫和炎性反应的类似性，在鼠类梗死模型中评价了SPHINGOMAB减轻免疫细胞渗入到伤口中的作用，作为SPHINGOMAB在AMD期间减轻这些损伤中潜在作用的指示[Vine，et al.(2005)，Ophthalmology，.vol 112：2076-80；and Seddon andChen(2004)，Int Ophthalmol Clin，.vol 44：17-39]。MI后4天，利用MAC-1和MCG35抗体分别评价了危险区域中的巨噬细胞和肥大细胞渗入。SPHINGOMAB显著减弱炎症巨噬细胞(图9A)和肥大细胞(图9B)的密度，表明SPHINGOMAB可以在AMD期间中和免疫和炎性损伤。
实施例10：S1P鼠类单克隆抗体(LT1002；SPHINGOMAB)的可变结构域的克隆和表征
这个实施例报道了针对S1P的鼠类mAb的克隆。整个方法由克隆的轻链(VL)和重链(VH)的鼠类可变结构域构成。306D VH的共有序列表明，恒定区片段与γ2b同种型一致。鼠类可变结构域与轻链的恒定结构域(CL)和重链的恒定结构域(CH1、CH2和CH3)克隆在一起，得到嵌合抗体构建体。
1.鼠类mAb克隆
来自抗-S1P杂交瘤细胞系306D326.1(ATCC#SD-5362)的克隆在DMEM(Dulbecco改性Eagle培养基，具有GlutaMAX^TM I、4500mg/L D-葡萄糖、丙酮酸钠；Gibco/Invitrogen，Carlsbad，CA，111-035-003)、10％FBS(无菌胎儿克隆体I，Perbio Science)、以及1X谷酰胺/青霉素/链霉菌素(Gibco/Invitrogen)中生长。总RNA利用基于RNA酶微型试剂盒(Qiagen，Hilden Germany)的方法从10⁷杂交瘤细胞分离。该RNA用于根据制造商的试验方法产生第一链cDNA(第一链合成试剂盒，Amersham Biosciences)。
免疫球蛋白重链可变区(VH)cDNA利用MHV7引物(MHV7：5’-ATGGRATGGAGCKGGRTCTTTMTCTT-3’[SEQ ID NO：1])结合IgG2b恒定区引物MHCG1/2a/2b/3混合物(MHCG1：5’-CAGTGGATAGACAGATGGGGG-3’[SEQ ID NO：2]、MHCG2a：5’-CAGTGGATAGACCGATGGGGC-3[SEQ ID NO：3]、MHCG2b：5’-CAGTGGATAGACTGATGGGGG-3’[SEQ ID NO：4]、MHCG3：5’-CAAGGGATAGACAGATGGGGC-3’[SEQ ID NO：5])通过PCR扩增。反应的产物利用TOPO-TA克试剂盒和顺序连接到载体(Invitrogen)中。重链可变结构域然后从该载体通过PCR扩增并作为Hind III和Apa I片段插入，并连接到包含HCMVi启动子、前导序列和γ-1恒定区的表达载体pG1D200(参见美国专利No.7,060,808)或pG4D200(同前)中，以产生质粒pG1D200306DVH(图10)。306D V_H的共有序列(如下所示)表明，该恒定区片段与γ2b同种型一致。
类似地，免疫球蛋白κ链可变区(VK)利用MKV 20引物(5’-GTCTCTGATTCTAGGGCA-3’[SEQ ID NO：6])结合κ恒定区引物MKC(5’-ACTGGATGGTGGGAAGATGG-3’[SEQ ID NO：7])扩增。该反应的产物利用TOPO-TA克试剂盒和顺序连接到载体中。轻链的可变结构域然后通过PCR扩增，然后作为Bam HI和Hind III片段插入到包含HCMV启动子、前导序列以及人类κ恒定结构域的表达载体pKN100(参见美国专利no.7,060,808)中，产生质粒pKN100306DVK。
将重链和轻链质粒pG1D200306DVH+pKN100306DVK转化到DH4a细菌中并储存在甘油中。大规模质粒DNA如由制造商(Qiagen，无内毒素MAXIPREP^TM试剂盒)所述进行制备。DNA样品，利用Qiagen’s QIAprep Spin Miniprep试剂盒或EndoFree PlasmidMega/Maxi试剂盒纯化，利用ABI 3730xl自动化测序仪进行测序，其还将荧光信号翻译成它们对应的核酸碱基序列。引物在5’端和3’端进行设计以使获得序列重叠。引物的长度为18-24个碱基，并且优选地，它们包含50％GC含量并且没有预测到二聚体或二级结构。对于来自Sphingomab^TM的小鼠V_H和V_L结构域的氨基酸序列分别是SEQ ID NO：8和9(表2)。CDR残基(参见Kabat，EA(1982)，Pharmacol Rev，vol.34：23-38)在表2中加了下划线，并在以下表3中分别示出。
表2：来自鼠mAb，Sphingomab^TM的V_H和V_L结构域

表3：小鼠V_H和V_L结构域的小鼠Sphingomab^TM CDR序列
  V_L CDR  CDR  ITTTDIDDDMN(SEQ ID NO：10)  CDR1  EGNILRP(SEQ ID NO：11)  CDR2  LQSDNLPFT(SEQ ID NO：12)  CDR3  V_H CDR  DHTIH(SEQ ID NO：13)  CDR1  CISPRHDITKYNEMFRG(SEQ ID NO：14)  CDR2  GGFYGSTIWFDF(SEQ ID NO：15)  CDR3
多个嵌合抗体可变(V_H和V_L)结构域的氨基酸序列在表4中进行比较。这些变体克隆入Lonza表达载体中。鼠V_H和V_L结构域的序列用来构建分子模型以确定哪个框架残基应整合到人源化抗体中。


对应的核苷酸序列在表5中示出：
表5：pATH和CDR序列
  名称  序列 SEQ ID NO：  CDR1V_L：  ataaccaccactgatattgatgatgatatgaac  18  CDR2V_L：  gaaggcaatattcttcgtcct  19  CDR3V_L：  ttgcagagtgataacttaccattcacg  20  CDR1V_H  gaccatacttcac  21  CDR2V_H：  tgtatttctcccagacatgatattactaaatacaatgagatgttcaggggc  22  CDR3V_H：  ggggggttctacggtagtactatctggtttgacttt  23  CDR2V_H  (pATH  207)：  gctatttctcccagacatgatattactaaatacaatgagatgttcaggggc  24  pATH200  核苷酸序  列：  cgccaagcttgccgccaccatggggtcaaccgccatcctcgccctcctcctg  gctgttctccaaggagtctgttccgaggtgcagctggtgcagtctggagcag  aggtgaaaaagcccggggagtctctgaagatctcctgtcagagttttggatac  atctttatcgaccatacttcactgggtgcgccagatgcccgggcaaggcctg  gagtggatgtgtatttctcccagacatgatattactaaatacaatgagatgttca  ggggccaggtcaccatctcagccgacaagtccagcagcaccgcctacttgc  agtggagcagcctgaaggcctcggacaccgccatgtatttctgtgcgagag  gggggttctacggtagtactatctggtttgacttttggggccaagggacaatg  gtcaccgtctcttcagcctccaccaagggcccatcg  25  pATH207  核苷酸序  列：  cgccaagcttgccgccaccatggggtcaaccgccatcctcgccctcctcctg  gctgttctccaaggagtctgttccgaggtgcagctggtgcagtctggagcag  aggtgaaaaagcccggggagtctctgaagatctcctgtcagagttttggatac  atcgaccatacttcactggatgcgccagatgcccgggcaaggcctggagtg  gatgggggctatttctcccagacatgatattactaaatacaatgagatgttcag  gggccaggtcaccatctcagccgacaagtccagcagcaccgcctacttgca  gtggagcagcctgaaggcctcggacaccgccatgtatttctgtgcgagagg  ggggttctacggtagtactatctggtttgacttttggggccaagggacaatggt  caccgtctcttcagcctccaccaagggcccatcg  26  pATH207  氨基酸序  列  mgstailalllavlqgvcsevqlvqsgaevkkpgeslkiscqsfgyifidhti  hwmrqmpgqglewmgaisprhditkynemfrgqvtisadkssstaylq  wsslkasdtamyfcarggfygstiwfdfwgqgtmvtvssastkgps  27  pATH300  核苷酸序  列：  cgccaagcttgccgccaccatggacatgagggtccccgctcagctcctggg  gctcctgctgctctggctcccaggtgccagatgtgaaacgacactcacgcag  tctccatccttcctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacataacca  ccactgatattgatgatgatatgaactggtatcagcaggaaccagggaaagc  ccctaagctcctgatctatgaaggcaatattcttcgtcctggggtcccatcaag  gttcagcggcagtggatctggcacagatttcactctcaccatcagcaaattgc  agcctgaagattttgcaacttattactgtttgcagagtgataacttaccattcacg  ttcggccaagggaccaagctggagatcaaacgtgagtggatcccgcg  28  pATH308  核苷酸序  cgccaagcttgccgccaccatggacatgagggtccccgctcagctcctggg  gctcctgctgctctggctcccaggggccagatgtgaaacgacagtgacgca  29
  列  gtctccatccttcctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgcata  accaccactgatattgatgatgatatgaactggttccagcaggaaccaggga  aagcccctaagctcctgatctccgaaggcaatattcttcgtcctggggtcccat  caagattcagcagcagtggatatggcacagatttcactctcaccatcagcaaa  ttgcagcctgaagattttgcaacttattactgtttgcagagtgataacttaccatt  cactttcggccaagggaccaagctggagatcaaac  pATH308  氨基酸序  列  mrvpaqllgllllwlpgarcettvtqspsflsasvgdrvtitcitttdidddmn  wfqepgkapkllisegnilrpgvpsrfsssgygtdftltisklqpedfatyycl  qsdnlpftfgqgtkleik  30
2.嵌合抗体的表达和结合性能
将pG1D200306DVH+pKN100306DVK二者的重链和轻链质粒转化到DH4a细菌中并储存在甘油中。大规模质粒DNA如制造商(Qiagen，无内毒素MAXIPREP^TM试剂盒批号12362)所述进行制备。
对于非人哺乳动物系统中的抗体表达，利用10μg每一种质粒，通过电穿孔(0.7ml，10⁷个细胞/ml)将质粒转染到非洲绿猴肾成纤维细胞细胞系COS 7中。转染的细胞在8ml生长介质中放入4天。嵌合306DH1x 306DVK-2抗体以1.5μg/ml在瞬时共转染COS细胞条件培养基中表达。这种抗体与S1P的结合利用S1P ELISA进行检测。
嵌合抗体的表达水平在定量ELISA中测定如下。微滴定板(Nunc MaxiSorp immunoplate，Invitrogen)用在PBS中稀释的0.4μg/ml羊抗-人IgG抗体(Sigma，St.Louis，MO)的100μl等份涂覆并在4℃下孵育过夜。板然后用200μl/孔的清洗缓冲液(1x PBS，0.1％TWEEN)清洗三次。将200μL每一个稀释血清样品或融合上清液的等份转移到毒素涂覆的板并在37℃孵育1h。在用清洗缓冲液清洗6次之后，将羊抗-人κ轻链过氧化物酶结合物(JacksonImmuno Research)以1∶5000稀释加入每一个孔。反应在室温下进行1h，板用清洗缓冲液清洗6次，并将150μL的K-BLUE底物(Sigma)加入到每个孔，在室温下黑暗中孵育10min。反应通过加入50μl的RED STOP溶液(SkyBio Ltd.)而终止，并利用MicroplaterReader 3550(Bio-Rad Laboratories Ltd.)在655nm确定吸收率。抗体结合测定的结果在图11中示出。
3.293F表达
重链和轻链质粒转化到Top 10大肠杆菌(一种Shot Top 10化学竞争性大肠杆菌细胞(Invitrogen，C4040-10))中并储存在甘油中。大规模质粒DNA如制造商(Qiagen，无内毒素MAXIPREP^TM试剂盒批号12362)所述进行制备。
对于在人类系统中的抗体表达，利用293fectin(Invitrogen)将质粒转染入人类胚胎肾细胞系293F(Invitrogen)并利用293F-FreeStyle Media(Invitrogen)培养。轻链和重链质粒均以0.5g/mL进行转染。转染以10⁶个细胞/mL的细胞密度进行。上清液在转染后3天，通过以1100rpm在25℃离心5分钟加以收集。表达水平通过定量ELISA(参见前面的实施例)进行定量并且对于嵌合抗体在～0.25-0.5g/mL变化。
4.抗体纯化
单克隆抗体通过使培养物上清液以0.5mL/min流过蛋白A/G柱(Pierce，Cat.No 53133)而从培养物上清液纯化。流动相由1XPierce IgG结合缓冲液(批号21001)和0.1M甘氨酸pH 2.7(Pierce，洗脱缓冲液，批号21004)构成。在0.1M甘氨酸中的抗体收集物利用1M磷酸缓冲液pH 8.0稀释，以中和pH。集中IgG₁收集物并仅针对1X PBS(Pierce Slide-A-Lyzer Cassette，3,500MWCO，Cat.No66382)进行渗析。洗脱液利用Centricon YM-3(10,000MWCOAmicon Cat.No 4203)通过以2,500rcf离心1h浓缩。利用商业骨髓瘤IgG₁原溶液作为标准，抗体浓度通过如上所述的定量ELISA确定。mAb的重链类型利用单克隆抗体同种型化试剂盒通过ELISA确定(Sigma，ISO-2)。
5.抗体变体与S1P的对比结合
下表6示出了突变体与嵌合抗体的对比分析。为了产生这些结果，结合的抗体通过第二抗体(对于小鼠或人类IgG，结合有HRP)进行检测。检测显色反应并作为光学密度(OD)报告。一组抗体的浓度为0.1μg/ml。没有检测到该第二抗体与单独S1P涂覆的基质的相互作用。
表6：在嵌合抗-S1P抗体的变体上与S1P的对比结合

6.通过表面等离子体共振(SPR)确定结合动力学
所有结合数据用Biacore 2000光学生物传感器(Biacore AB，Uppsala Sweden)收集。S1P偶联至马来酰亚胺CM5传感器芯片。首先，CM5芯片用NHS/EDC均等混合物活化7分钟，然后是利用乙二胺封闭7分钟的步骤。接着使磺基-MBS(Pierce Co.)以在HBS运行缓冲液(10mM HEPES，150mM NaCl，0.005％p20，pH 7.4)中的0.5mM浓度流过这些表面。S1P稀释到HBS运行缓冲液中至0.1mM浓度并注射不同时间长度，产生2个不同密度的S1P表面(305和470RU)。接着，利用3倍稀释系列，从16.7nM、50.0nM、50.0nM、16.7nM和16.7nM开始，分别对小鼠201308、201309和207308抗体收集mAb的结合数据。
每一个浓度一式二份地测试。表面利用50mM NaOH再生。所有数据在25℃收集。反应数据利用参照表面以及空白注射进行处理。来自两个表面的反应并且每一个变体测试两次的数据组拟合到相互作用模型以获得结合参数。来自不同mAb浓度的数据利用1∶1(小鼠)或1∶2(变体)相互作用模型全部拟合至确定的明显的结合速率常数。括号中的数字表示尾数的误差。
实施例11：针对S1P的嵌合mAb
如本文使用的，术语“嵌合”抗体(或“免疫球蛋白”)是指包含与来源于特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源的重链和/或轻链，而剩余的链与来源于另一物种或属于另一抗体种类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源的分子，以及这样的抗体的片段，只要它们表现出期望的生物学活性(Cabilly，et al.，supra；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：6851(1984))。
针对S1P的嵌合抗体利用包含来自特定杂交瘤(ATCC安全保藏号SD-5362)的鼠类抗体的活性S1P结合区的可变区(Fv)与人类IgG₁免疫球蛋白的Fc区产生。该Fc区包含人类抗体的CL、ChL和Ch3结构域。不希望受限于特定方法，嵌合抗体还可以从人类IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA或IgM的Fc区产生。如本领域技术人员理解的，“人源化”抗体可以通过将人类抗体框架区(例如Fr1、Fr4等)如IgG1的框架区嫁接到鼠类抗-S1P mAb的补体决定区(CDR，例如CDR1-4)而产生。图11示出了利用硫醇化S1P作为涂覆材料嵌合mAb和全长鼠类mAb在直接ELISA检测中的结合。
对于图11所示的直接ELISA实验，针对S1P的嵌合抗体具有与全长鼠类单克隆抗体类似的结合特性。在用0.1μg化学合成的硫醇化S1P(结合至结合缓冲液(33.6mM Na₂CO₃、100mM NaHCO₃；pH9.5)中的BSA)涂覆的96-孔高度结合ELISA板(Costar)中实施ELISA。硫醇化S1P-BSA在ELISA板中在37℃孵育1h或4℃过夜。然后这些板用PBS(137mM NaCl、2.68mM KCl、10.14mMNa₂HPO₄、1.76mM KH₂PO₄；pH 7.4)清洗4次并用PBST在室温下封闭1h。对于初始孵育步骤，75μl的样品(包含待检测的S1P)用25μL的在PBST中稀释的0.1μg/mL抗-S1P单克隆抗体孵育，并加入到ELISA板的孔中。每个样品一式三份地实施。在室温下孵育1h后，ELISA板用PBS清洗4次并每孔用100μl的0.1μg/mL HRP羊抗-小鼠二级抗体(Jackson Immunoresearch)在室温下孵育1h。然后板用PBS清洗4次并暴露于四甲基联苯胺(Sigma)1-10分钟。检测反应通过加入等体积的1M H₂SO₄而终止。样品的光学密度通过利用EL-X-800ELISA板读数器(Bio-Tech)在450nm检测确定。
同样，检测免疫动物血清中或产生抗体的细胞如杂交瘤细胞的细胞条件培养基(例如上清液)中的抗体效价的优选方法涉及用已共价连接至蛋白载体如BSA的靶配体(例如S1P、LPA等的硫醇化类似物)涂覆ELISA板。
不希望受限于具体方法或实施例，嵌合抗体可以针对其他脂质靶如LPA、PAF、神经酰胺、硫苷脂、脑苷脂、心磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、类花生酸和其他白三烯等。而且，如果期望，这些脂类中的许多也可以被糖基化和/或乙酰基化。
实施例12：人源化抗-S1P单克隆抗体LT1009(Sonepcizumab)的产生和表征
鼠类抗-S1P单克隆抗体306D(LT1002；Sphingomab^TM)，其特异性地结合S1P，已经证实在各种动物模型中有效地抑制血管发生和肿瘤生长。如以下讨论的，LT1002利用研究在鼠类CDR和计算机产生模型中寻找人类框架的序列同一性和同源性来指导一些框架回复突变而进行人源化。两个变体HuMAbHCLC₃(LT1004)(在轻链中具有3个回复突变)和HuMAbHCLC₅(LT1006)(在轻链中具有5个回复突变)表现出在纳摩尔范围内的结合亲和力。实施进一步的改造以努力改进该人源化变体的生物物理和生物学性能。人源化变体HuMAbHC_CysAlaLC₃(LT1007)和HuMAbHC_CysAlaLC₅(LT1009)(其中HCDR2中的游离半胱氨酸残基被丙氨酸替代)表现出在皮摩尔范围内的结合亲和力。所有人源化变体在老年性黄斑退化症(AMD)的脉络膜新血管形成(CNV)模型中抑制血管发生，其中相比于亲代鼠类抗体，HuMAbHC_CysAlaLC₅(LT1009)表现出优异的稳定性和体内效力。变体huMAbHCcysalaLC₅(LT1009)称为Sonepcizumab^TM。
a.抗-S1P抗体的人源化设计
鼠类mAb LT1002(Sphingomab^TM)的可变结构域经过CDR嫁接进行人源化(Winter美国专利No.5,225,539)。CDR残基基于如Kabatet al.1991所述的序列高变性加以鉴定。
在这个研究中，合适的受体结构利用结构比对程序(SR v7.6)，基于IMGT和Kabat数据库中的人类抗体的同源性研究进行选择。初始步骤是查询这些分别具有LT1002VH和VL蛋白序列的人类重链可变(VH)和轻链可变(VL)序列数据库，以鉴定在FR中具有高序列同一性的人类框架(FR)，在Vernier(Foote，J.& Winter，G.Antibody framework residues affecting the conformation of thehypervariable loops.J Mol.Biol.224，487-499(1992))、Canonical(Morea，et al.，Antibody modeling：implications for engineering anddesign，Methods  20，267-279(2000)(Chothia，C.，Novotny，J.，Bruccoleri，R.，& Karplus，M.Domain association in immunoglobulinmolecules.The packing of variable domains.J Mol.Biol.186，651-663(1985))VH-VL界面残基，具有相同的canonical种类和/或长度。这个文库每一个成员与小鼠抗体的单个对齐残基的同一性利用该程序计算。鉴定了具有与小鼠FR最相同的FR序列的那些人类序列，产生人类“受体”序列的最初的候选名单。也计算了与小鼠抗体在Vernier、Canonical和VH-VL界面(VCI)残基处具有最大同一性的那些序列。在人类和小鼠之间的这些位置处的差别分成保守性和非保守性取代，以使最佳框架选择与LT1002具有最小数量的非保守性VCI差别。LT1002的CDR环L3和H1可以归为canonical结构。这些L3和H1结构用来选择具有相同canonical结构的人类抗体FR。对于未分类的CDR，试图选择具有与小鼠抗体相同的CDR长度的人类框架。原理是CDR环结构不仅仅依赖于CDR环序列本身，而且依赖于潜在的框架残基(canonical残基)。因此具有匹配的canonical CDR结构和/或CDR长度的人类框架可能保持嫁接的小鼠CDR具有最恰当的结构以保持抗原结合亲和力。这对于所有CDR(除了CDR H13)通过选择人类框架序列而实现。另外，具有不常用半胱氨酸或脯氨酸残基的框架尽可能排除。这些计算对于重链和轻链序列单独实施。最后，在整个框架区域中，最佳匹配序列中的单个序列差别进行比对。在上述最匹配比对计算的人类抗体中，选择抗体AY050707和AJ002773分别作为对轻链和重链的最恰当人类框架提供者。
第二步骤是产生LT1002可变区的分子模型，以及鉴定可能影响抗原结合但不包括在Vernier、Canonical和界面残基组中的FR残基。考察了嫁接供体和接受体可变结构域的许多结构特征以便更好理解各个FR残基如何影响CDR环的构象，反之亦然。LT1002中可能影响CDR的非保守FR残基根据Vernier和Canonical定义(参见上文)进行鉴定，因而人类FR的多个残基恢复至原始的鼠类氨基酸(回复突变)。
b.诱变
可变区序列中的突变利用QuikChange定点突变试剂盒(Stratagene，Catalog#200524)产生。单个反应利用50ng的双链DNA模板、2.5U的PfuUltre HF DNA聚合酶及其对应的缓冲剂(Stratagene，Catalog#200524)、10mM dNTP混合物以及125ng的再悬浮在5mM Tris-HCl(pH 8.0)和0.1mM EDTA中的每一个突变寡核苷酸实施。初始变性在95℃实施30s，接着16个循环的扩增：95℃30s，55℃60s以及68℃8min。在温度循环之后，最终反应接着用DpnI消化剂在37℃消化1h以除去甲基化亲代DNA。最终的突变体转化入竞争性XL1-Blue大肠杆菌中并接种到在含50μg/ml青霉素的LB-琼脂上。然后通过测序检测克隆。每一个突变体然后在1升摇瓶中培养并利用EndoFree质粒纯化试剂盒(Qiagen，catalog#12362)进行纯化。
c.人源化抗体变体的产生
小鼠-人类嵌合抗体(chMAb S1P)通过将LT1002的可变结构域克隆入包含κ和重链的人类恒定区的载体中，以允许全长抗体在哺乳动物细胞中表达。人源化重链的产生是将来自LT1002V_H的Kabat CDR1、2和3嫁接到AJ002773的受体框架中的结果。与AJ002773最接近的种系基因是VH5-51，其前导序列作为前导序列整合到人源化重链变体中。pATH200的蛋白序列在表4中示出，pATH200是LT1002V_H的第一个人源化形式，具有VH5-51前导序列。在LT1002的V_H结构域的情况下，在位置2、27、37、48、67和69处的残基是Verier残基或者在V_H和V_L结构域的界面处，并且可能影响CDR的结构方向。位置37看起来对V_H和V_L结构域之间的界面很关键。在人类框架中的这些位置处的残基利用在相应位置处发现的鼠类残基进行回复突变。突变V37M、M48I和Y27F单个地进行测试。一种形式(pATH205)包含所有3个突变以及V67A和I69L，而另一形式(pATH206)包含所有5个突变和V2A。
人源化轻链的产生是将LT1002V_L的Kabat CDR1、2和3嫁接到AY050707的受体框架中的结果。与AY050707最接近的种系基因是L11，其前导序列被整合到人源化轻链构建体中。pATH300(LT1002轻链)的蛋白和DNA序列分别是SEQ ID NO：17和28(对于氨基酸序列参见表4)。在V_L的情况下，4个非保守Vernier位置4、36、49、64选择对鼠类残基的回复突变，因为它们涉及支持CDR环的结构。LT1002的分子模型的考察表明，Tyr 67靠近CDR表面并定向朝向抗原结合平面，并且可以与S1P相互作用。因此，S67Y回复突变也加入到后一个人源化形式。两个突变分别引入以产生包含Y49S或Y36F的两种形式。多种形式利用以下突变组合产生：(Y49S，F4V)、(Y49S，Y36F)、(Y49S，Y36F，F4V)、(Y49S，G64S)、(Y49S，Y36F，F4V，G64S)、(Y49S，Y36F，F4V，G64S，S67Y)、(Y49S，G64S，S67Y)。
d.人源化前导候选的选择
基本嫁接形式(pATH 200和pATH 300)和所有包含回复突变的变体的可变区克隆入包含人类V_H或V_L恒定区的表达载体中。所有人源化变体在相同条件下在哺乳动物细胞中作为嵌合(chMABb)抗体产生，并通过ELISA测试与S1P结合。产率对于人源化变体为约10-20mg/l而对chMAb S1P为0.3-0.5mg/l。在还原条件下的SDS-PAGE显示在25kDa和50kDa处具有高纯度(＞98％)的两个带，与轻链和重链预期质量一致。单个带在非还原条件下观察，具有预期质量为～150k。chMAb在人源化抗体结合测定中用作标准，因为其包含作为亲代小鼠抗体的相同可变区，并且带有作为人源化抗体的相同恒定区，因此可以利用相同ELISA方案进行检测。
初始人源化抗体，其中六个鼠类CDR嫁接到未突变的人类框架中，没有显示可检测的与S1P的结合(图11)。包含4个回复突变(Y49S，Y36F，F4V和G64S)的κ轻链，与嵌合重链相关，表现出如在ELISA中检测的低于最佳的与S1P的结合。在位置Y67处的另外突变的整合显著改善该结合。包含回复突变Y49S、Y36F、F4V、G64S和S67Y的形式pATH308以及包含回复突变Y49S、G64S和S67Y的形式pATH309，与嵌合重链相关，都产生与嵌合抗体类似地如通过ELISA确定的结合S1P的抗体。2个突变Y36F和F4V从S1P结合的角度看不认为是必需的回复突变。需要在VL框架中的3～5个回复突变的改造以恢复活性。
Vernier回复突变V37M整合到重链的人类框架中，与嵌合轻链相关，足以恢复与嵌合抗体类似的结合行为(图11)。
概括地，LT1002V_H结构域的人源化仅需要一个来自鼠类框架序列的氨基酸，而鼠类V_L框架结构域，必需保留3至5个鼠类残基以实现等同于鼠类亲代LT1002的结合。
e.人源化前导候选物的优化
鼠类抗-S1P抗体包含在可以潜在地引起抗体分子某些不稳定性的重链的CDR2(Cys50)中的游离半胱氨酸残基。利用定点诱变，pATH201的变体是利用丙氨酸(huMAbHCcysalaLC₃)(pATH207)、甘氨酸(huMAbHCcysalaLC₃)、丝氨酸(huMAbHCcysserLC₃)、以及苯丙氨酸(huMAbHCcyspheLC₃)代替半胱氨酸残基产生的。半胱氨酸突变重链也利用包含5个回复突变的人源化轻链(pATH308)进行检测(huMAbHCcysalaLC₅＝LT1009)。变体在哺乳动物细胞中表达，然后在一组体外测定中进行表征。重要地，人源化变体的表达速率显著高于chMAb S1P。
f.人源化前导候选的深入表征
i.特异性。人源化变体在竞争性ELISA测定中针对S1P和多种其他生物脂类测试特异性。该测定增加了允许表位定位的功能。人源化抗体LT1009没有显示对鞘氨醇(SPH)的交叉反应性，鞘氨醇是S1P或LPA(溶血磷脂酸，lysophosphatidic acid)的中间代谢前体，LPA是一种结构上和功能上类似于S1P的重要胞外信号转导分子。此外，rhuMAb S1P不识别其他结构类似脂类和代谢物，包括神经酰胺(CER)、神经酰胺-1-磷酸(C1P)。然而，如预期的，LT1009不与鞘氨醇基磷酸胆碱(SPC)交叉反应，SPC是一种其中S1P的游离磷酸基与胆碱残基连接的脂质。重要地，所有人源化变体表现出与小鼠抗体相当的特异性表现。
ii.结合亲和力。结合于S1P涂覆芯片的IgG的Biacore检测表明，变体LT1004或LT1006表现出类似于chMAb S1P的在低纳摩尔范围内的结合亲和力，如图11所示。其中半胱氨酸残基被丙氨酸替代的人源化变体LT1007和LT1009表现出类似于鼠类亲代LT1002(Sphingomab^TM)的在皮摩尔范围的结合亲和力。
iii.稳定性。人源化变体在高温刺激后测试稳定性。通过从60至74℃变化上清液的温度范围确定每一个人源化变体的热变构温度的恰当中点(T_M)对。基于在宽温度范围50～80℃之间的热攻击之后对鼠类抗体分子进行变性特性研究。每一个变体的结合性能在热刺激之前和之后确定。鼠类抗体表现出的T_M为65℃。变体huMAbHCcysalaLC₅(LT1009)相比于所有其他变体表现出优异的T_M。表7示出了前导人源化候选以及它们的特性。
表7：前导人源化S1P mAb的候选物和特性(指出了重链和轻链中的突变数量。说明一栏中给出重链和轻链的同一性。)

iv.序列
如利用天然抗体，LT1009在组成每一个抗体分子的两个轻链多肽的每一个中和两个重链多肽的每一个中包括三个互补决定区(每一个为“CDR”)。对于这六个CDR每一个的氨基酸序列在下面提供(“VL”表示免疫球蛋白轻链的可变区，而“VH”表示免疫球蛋白重链的可变区)：
CDR1VL：ITTTDIDDDMN[SEQ ID NO：10]
CDR2VL：EGNILRP[SEQ ID NO：11]
CDR3VL：LQSDNLPFT[SEQ ID NO：12]
CDR1VH：DHTIH [SEQ ID NO：13
CDR3VH：GGFYGSTIWFDF [SEQ ID NO：15]
CDR2VH：AISPRHDITKYNEMFRG [SEQ ID NO：31]
对于LT1009的重链和轻链多肽的核苷酸和氨基酸序列在以下列出：
LT1009HC可变结构域的氨基酸序列[SEQ ID NO：32]：
1   mewswvflff lsvttgvhse vqlvqsgaev kkpgeslkis cqsfgyifid
51  htihwmrqmp gqglewmgai sprhditkyn emfrgqvtis adkssstayl
101 qwsslkasdt amyfcarggf ygstiwfdfw gqgtmvtvss
LT1009LC可变结构域的氨基酸序列[SEQ ID NO：33]：
1   msvptqvlgl lllwltdarc ettvtqspsf lsasvgdrvt itcitttdid
51  ddmnwfqqep gkapkllise gnilrpgvps rfsssgygtd ftltisklqp
101 edfatyyclq sdnlpftfgq gtkleik
LT1009HC核苷酸序列[SEQ ID NO：34]：
1   aagcttgccg ccaccatgga atggagctgg gtgttcctgt tctttctgtc
51  cgtgaccaca ggcgtgcatt ctgaggtgca gctggtgcag tctggagcag
101 aggtgaaaaa gcccggggag tctctgaaga tctcctgtca gagttttgga
151 tacatcttta tcgaccatac tattcactgg atgcgccaga tgcccgggca
201 aggcctggag tggatggggg ctatttctcc cagacatgat attactaaat
251 acaatgagat gttcaggggc caggtcacca tctcagccga caagtccagc
301 agcaccgcct acttgcagtg gagcagcctg aaggcctcgg acaccgccat
351 gtatttctgt gcgagagggg ggttctacgg tagtactatc tggtttgact
401 tttggggcca agggacaatg gtcaccgtct cttcagcctc caccaagggc
451 ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac
501 agcggccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg
551 tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct
601 gtcctacagt cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc
651 ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg aatcacaagc
701 ccagcaacac caaggtggac aagagagttg gtgagaggcc agcacaggga
751 gggagggtgt ctgctggaag ccaggctcag cgctcctgcc tggacgcatc
801 ccggctatgc agtcccagtc cagggcagca aggcaggccc cgtctgcctc
851 ttcacccgga ggcctctgcc cgccccactc atgctcaggg agagggtctt
901 ctggcttttt ccccaggctc tgggcaggca caggctaggt gcccctaacc
951 caggccctgc acacaaaggg gcaggtgctg ggctcagacc tgccaagagc
1001catatccggg aggaccctgc ccctgaccta agcccacccc aaaggccaaa
1051ctctccactc cctcagctcg gacaccttct ctcctcccag attccagtaa
1101ctcccaatct tctctctgca gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca
1151tgcccaccgt gcccaggtaa gccagcccag gcctcgccct ccagctcaag
1201gcgggacagg tgccctagag tagcctgcat ccagggacag gccccagccg
1251ggtgctgaca cgtccacctc catctcttcc tcagcacctg aactcctggg
1301gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga
1351tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa
1401gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa
1451tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg
1501tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac
1551aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat
1601ctccaaagcc aaaggtggga cccgtggggt gcgagggcca catggacaga
1651ggccggctcg gcccaccctc tgccctgaga gtgaccgctg taccaacctc
1701tgtccctaca gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat
1751cccgggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa
1801ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc
1851ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct
1901tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg
1951aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac
2001gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa atag
LT1009HC氨基酸序列[SEQ ID NO：35]：
1   mewswvflff lsvttgvhse vqlvqsgaev kkpgeslkis cqsfgyifid
51  htihwmrqmp gqglewmgai sprhditkyn emfrgqvtis adkssstayl
101 qwsslkasdt amyfcarggf ygstiwfdfw gqgtmvtvss astkgpsvfp
151 lapsskstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv htfpavlqss
201 glyslssvvt vpssslgtqt yicnvnhkps ntkvdkrvap ellggpsvfl
251 fppkpkdtlm isrtpevtcv vvdvshedpe vkfnwyvdgv evhnaktkpr
301 eeqynstyrv vsvltvlhqd wlngkeykck vsnkalpapi ektiskakgq
351 prepqvytlp psreemtknq vsltclvkgf ypsdiavewe sngqpennyk
401 ttppvldsdg sfflyskltv dksrwqqgnv fscsvmheal hnhytqksls
451 lspgk
LT1009LC核苷酸序列[SEQ ID NO：36]：
1   aagcttgccg ccaccatgtc tgtgcctacc caggtgctgg gactgctgct
51  gctgtggctg acagacgccc gctgtgaaac gacagtgacg cagtctccat
101 ccttcctgtc tgcatctgta ggagacagag tcaccatcac ttgcataacc
151 accactgata ttgatgatga tatgaactgg ttccagcagg aaccagggaa
201 agcccctaag ctcctgatct ccgaaggcaa tattcttcgt cctggggtcc
251 catcaagatt cagcagcagt ggatatggca cagatttcac tctcaccatc
301 agcaaattgc agcctgaaga ttttgcaact tattactgtt tgcagagtga
351 taacttacca ttcactttcg gccaagggac caagctggag atcaaacgta
401 cggtggctgc accatctgtc ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg
451 aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg ctgaataact tctatcccag
501 agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa tcgggtaact
551 cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc
601 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta
651 cgcctgcgaa gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct
701 tcaacagggg agagtgttag
LT1009LC氨基酸序列[SEQ ID NO：37]：
1   msvptqvlgl lllwltdarc ettvtqspsf lsasvgdrvt itcitttdid
51  ddmnwfqqep gkapkllise gnilrpgvps rfsssgygtd ftltisklqp
101 edfatyyclq sdnlpftfgq gtkleikrtv aapsvfifpp sdeqlksgta
151 svvcllnnfy preakvqwkv dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt
201 lskadyekhk vyacevthqg lsspvtksfn rgec
实施例13：人源化S1P mAb的生产和纯化
该实施例描述了以高亲和力结合至生物活性脂质鞘氨醇-1-磷酸(S1P)的重组人源化单克隆抗体(LT1009；Sonepcizumab^TM)。LT1009是由两个相同轻链和两个相同重链(总分子量为150kDa)构成的全长IgG1k同种型抗体。重链包含N-连接的糖基化部位。寡糖结构的性质还没有确定，但预期是具有核心海藻糖的双触角(biantennary)结构。起重要作用的糖形式的性质在这个阶段还不知道。预测了一些C-末端异质性，因为在重链的恒定结构域中存在赖氨酸残基。两个重链彼此通过两链间二硫键共价偶联，其与人类IgG1的结构一致。
LT1009最初来源于利用从用S1P免疫小鼠产生的杂交瘤产生的鼠类单克隆抗体(LT1002；Sphingomab^TM)。鼠类抗体的人源化涉及六个鼠类CDR插入到由于与鼠类亲代抗体的结构类似而选择的人类抗体框架的那些位置中。在框架中形成一系列替代以改造该人源化抗体。这些替代称为回复突变，并用在抗体与抗原的相互作用中起重要作用的鼠类残基替代人类。最终的人源化形式包含在重链可变结构域的人类框架中的一个鼠类回复突变和在轻链可变结构域的人类框架中的5个鼠类回复突变。另外，在重链CDR#2中存在的一个残基被替代成一个丙氨酸残基。这种替代证实增加抗体分子的稳定性和效力。
将人源化可变结构域克隆入Lonza GS基因表达系统中以产生质粒pATH1009。这种表达系统由带有抗体基因的恒定结构域以及可选择的标记物谷酰胺合成酶(GS)的表达载体。GS是负责从谷氨酸和氨合成谷酰胺的酶。带有抗体基因和可选择标记物的载体转染到适于在无血清介质中生长的专有(proprietary)中华仓鼠卵巢(CHOK1SV)宿主细胞系中，并为细胞提供足够的谷酰胺以在没有外源性谷酰胺的情况下下存活。另外，将特定GS抑制剂-甲硫氨酸砜亚胺(MSX)填加到血清中以抑制内源性GS活性，以使仅由载体提供具有GS活性的细胞系可以存活。在MSX存在下，转染的细胞针对它们在MSX存在下在无谷酰胺培养基中生长的能力进行选择，并且在分离物中选择活性LT1009的高水平分泌。然后生产用于毒性研究和临床开发的材料以用于毒性和临床开发。
ATCC保藏：包含aATH1009质粒的大肠杆菌StB12在美国典型培养物收藏中心保藏(ATCC)(保藏号PTA-8421)。用DNA质粒pATH1009转染的CHO细胞系LH1 275已在美国典型培养物收藏中心保藏(保藏号PTA-8422)。
实施例14：人源化mAb的生产
通常，生产过程涉及三个阶段：种繁殖(seed train)、接种繁殖(inoculum train)和生产培养。所有阶段使用无血清试剂和低蛋白细胞培养生长培养基。为了开始种繁殖，使用来自工作细胞库的细胞；细胞每3至4天进行再次培养，在规定的种繁殖培养时间之后，开始接种繁殖。优选使用非选择性培养基(无MTX培养基)来扩增细胞以引入到生产阶段。细胞通过连续亚培养到增大体积的容器中进行扩增。在接种繁殖的某些天，开始生产阶段。生产培养在体积为200L、400L、2000L、或20000L的生物反应器中进行。生物反应器的实例在以下进行描述。
生物反应器的实例：从2L生物反应器的规模首先在Applikon15L搅拌罐中继续，然后依次至50L生物反应器、200L生物反应器以及最后的2000L生物反应器(所有都设到相同规模)。这些罐的特性如下：
生产商：ABEC，Inc.
根据ASME第VIII部分压力容器规范制造。接触表面为316LSS。
底部偏置驱动，ABEC设计
低剪切涡轮316LSS，抛光至15-20微英寸并钝化。直径～1/2的容器直径。
控制：Allen Bradley Control Logic PLC，具有Versa操作界面。
搅拌：Allen Bradley传感器，用于RPM控制的VFI的输出A-BPLC控制
温度：双重控制100欧姆铂RTD传感器，A-B PLC控制热、冷和蒸汽阀w/再循环泵。在生物反应器是空时的自动消毒循环。
pH：Ingold传感器，凝胶填充，CO2的可加压A-B PLC控制以喷射。
溶解的氧：Ingold极谱电极传感器(polarographic electrodesensor)，O2喷射的A-B PLC控制。
空气和气体流：传感器是用于空气、O2、N2和CO2喷射的4种Brooks热质量流量计(thermal mass flowmeter)，还供应Brooks热质用于空气覆盖，对于所有气流的pH自动、DO自动或手动气流控制通过A-B PLC的A-B PLC控制。
容器压力：传感器是Rosemount清洁隔膜式转换器，控制是具有背压式控制阀的转换器的A-B PLC控制。
可编程逻辑控制器(PLC)：用于所指定的过程的连续环控制的Allen Bradley Control Logix系统。软件：PLC编程利用Rockwell软件(Allen Bradley)RS Logix 5000。
人机界面(HMI)：局部操作界面在具有集成FPD/具有以太网触屏进入访问PLC的Allen Bradley HMI Verso View工业计算机上。软件是Rockwell Software RS View 32。
生产过程的实例。
在温度、溶解氧和pH控制下搅拌不锈钢生物反应器。
为了最佳产率而确定接种密度。
通常利用无血清的培养基。
典型地一个分批进料过程。
典型地具有温度变化。
生物反应器中的培养持续时间预期为8至14天。
收获时的存活性待定。
收获物通过过滤净化。
收获物在净化后且纯化前储存在2-8℃。
实施例15：人源化mAb的大规模纯化
药物纯化过程通常由4个步骤构成：蛋白A层析、阴离子交换层析(Q琼脂糖)、阳离子交换层析(CM琼脂糖)以及超滤/渗滤(UF/DF)。亲和性柱通常是在收获和净化之后的第一步。该柱通常利用固定化蛋白A树脂。这个亲和性步骤针对宿主细胞蛋白和DNA提纯抗体。为了灭活潜在的病毒，洗脱液通常经历一个病毒灭活过程，接着是阴离子交换层析步骤以减少宿主细胞蛋白、DNA、蛋白A和潜在的病毒。接着，通常使用阳离子交换层析步骤以进一步减少宿主细胞蛋白和抗体聚集物的残留量。最后，池液(pool)然后渗析并进一步浓缩。
代表性纯化过程：
收获物可以在蛋白A柱之前进行浓缩和缓冲液交换。该过程的下一步是蛋白A柱亲和性层析。结合的抗体利用低pH缓冲液洗脱。蛋白A洗脱液保持一定时间以便灭活病毒。
该过程的下一步可以是在Q(+)柱上的离子交换层析，其中抗体产物流过并且污染物如DNA和宿主细胞蛋白结合至柱树脂。
该过程的下一步可以是在S(-)柱上的第二次离子交换层析，其中污染物流过该柱。可以使用疏水性相互作用柱步骤代替S(-)柱步骤。该过程的下一步可能是纳米过滤病毒移除步骤，使用DV20或Planva过滤器。产物流过该过滤器。该过程的最后步骤是渗析到最终药物制剂缓冲液中以及超滤以实现靶蛋白浓缩。
实施例16：鼠类抗-S1P抗体的人源化变体的生物学活性
体外细胞测定
测试人源化抗体在如图12所示的化疗剂存在下改变肿瘤细胞存活的能力。SKOV3肿瘤细胞暴露于紫杉醇(泰素)，其为一种通过活化细胞凋亡执行者-半胱天冬酶(caspase)-3而诱导肿瘤细胞死亡的化疗剂。相比于对照未处理细胞，S1P能够降低紫杉醇诱导的半胱天冬酶-3的活化和/或细胞死亡。细胞凋亡测定如生产商(Promega，Cat.No G7792)所推荐的实施。简而言之，将A549细胞(每孔2500个细胞)接种到96-孔板中并在处理之前允许生长至80％铺满。细胞然后在有和没有0.1-1μM紫杉醇(Sigma，Cat.No T7409)、0.1-1μM S1P和1μg/mL的抗-S1P mAb下，在McCOy培养基中处理48h。在48h之后，将半胱天冬酶-3测定缓冲液加入到该细胞。上清液中的半胱天冬酶-3活性根据制造商的实验方案通过Apo-One Homogeneous Caspase-3/7Assay kit(Promega，Cat.NoG7792)进行测量。半胱天冬酶-3/7活性按照相对于载体处理细胞的荧光信号增加的倍数表示。
半胱天冬酶-3(caspase-3)活化通过在S1P存在下加入抗-S1PmAb而增加，表明S1P的保护性抗-细胞凋亡作用通过抗体对S1P的选择性吸附而消除。相比于LT1002，人源化抗体变体huMAbHCLC₃(LT1004)和huMAbHCLC₅(LT1006)表现出优异的活性。平行地，测试所有变体对S1P诱导的细胞因子从癌细胞释放的作用。已经知道S1P引发IL-8从癌细胞显著释放到细胞条件培养基中。小鼠对照抗-S1P mAb的加入以浓度依赖性方式减少了IL-8从卵巢癌细胞的释放。相比于HuMAbHCLC₃(LT1004)和huMAbHCLC₅(LT1006)，两种人源化变体huMAbHCcysalaLC₃(LT1007)和huMAbHCcysalaLC₅(LT1009)表现出IL-8释放的更大程度的减少。
实施例17：鼠类mAb(Sphingomab)相对人源化mAb(Sonepcizumab)在新血管形成动物模型中的体内效力
脉络膜新血管形成(CNV)是指起源于脉络膜通过Bruch膜破裂进入眼中的视网膜下色素上皮(sub-RPE)或视网膜下间隙中的新血管生长。CNV是黄斑退化症和其他眼病症中视力丧失的一个主要病因。CNV的小鼠模型在这个实施例中用来评价针对S 1P的mAb。
比较人源化抗体变体和鼠类抗体抑制AMD的CNV动物模型中的新血管形成的能力，如图13所示。通过玻璃体内给药，向小鼠两次(第0天和第6天)给予0.5μg的鼠类_mAb(Mu：LT1002)、人源化变体[LC3(LT 1004)，LC5(LT 1006)，HCcysLC3(LT 1007)和HCcysLC5(LT1009)]或非特异性mAb(NS)，然后经历Bruch膜的激光破裂。小鼠在激光手术后14天杀死。对照小鼠用含水缓冲液(PBS)或同种型匹配的非特异性抗体处理。人源化变体中的三个基本上等同于鼠类抗体在抑制血管发生上的作用，如通过CNV面积测量所评估的。CNV病变体积表示为平均值±SEM。包含在轻链中的5个回复突变并具有在重链CDR2中的半胱氨酸突变的人源化变体(huMAbHCcysLC₅；LT1009)显著地抑制新血管形成。这种差别是高度统计学显著的。
对于CNV的诱导，小鼠以5μL/20g体重的剂量腹膜内给予在无菌盐水中的氯胺酮(14mg/kg)和赛拉嗪(30mg/kg)的混合物进行麻醉。它们的瞳孔然后每个用一滴眼用托吡卡胺(0.5％)和去氧肾上腺素(2.5％)进行扩散。然后，连接到狭缝灯(slit lamp)以递送在150mW具有50μm斑尺寸的100msec脉冲的氩气绿色眼用激光器(Oculight GL 532nm，Iridex Corporation，Mountain View，CA)用来破坏位于在相对9、12和3点处距视盘大约50μm的右眼的三个象限中的Bruch膜。左眼在所有情况下用作未受损对照。
CNV病变的形态测定和体积测定检测如下。在激光诱导CNV之后两周，动物通过过剂量的氯胺酮-赛拉嗪混合物麻醉，然后用在PBS pH7.5中的6ml 4％多聚甲醛经过心脏刺穿进行全身灌注，如之前描述(Sengupta et al.，2003)。然后剜出眼，用27g针头1mm缘后部刺穿，并在室温下在固定剂中浸泡1h，然后通过在PBS中浸泡30min进行清洗2X。然后解剖眼睛以分离有视网膜色素上皮、脉络膜内层和巩膜构成的后段。该组织然后罗丹明结合的蓖麻凝集素I(Vector Laboratories，Burlingame，CA)渗透并反应，如前所述检测CNV病变(Sengupta et al.，2003；Sengupta et al.，2005)。后部杯然后被切成4-7放射状切片，并平铺到具有一滴Vectashield抗-褪色介质(Vector Laboratories，Burlingame，VT)的显微镜载玻片上，用于通过具有RGB斑点高分辨率数字照相机的Zeiss Axioplan 2和激光扫描共焦显微镜(BioRad MRC 1024，BioRad Corporation，Temecula，CA)拍摄数字照片。
捕获的数字照片利用ImageJ软件(Research Services Branch，National Institutes of Health，Bethesda，MD)通过形态测定进行评价。照片分成用于如下红和绿通道分析的单个RGB通道：1)通过对特定物体和显微镜的校准以设置像素-长度比；2)利用Otsu算法使用阈值；3)照片制成二元的；4)概括感兴趣的区域(ROI)以包括整个病变区；5)实施颗粒分析以定量ROI内在阈值水平上方的像素区。对于体积测定分析，过程类似于上述的，只是使用z-轴捕获。整个z-系列的病变区总和然后乘以z厚度(通常4μm)以获得病变体积。
在该模型中测试的药物产品是LT1002(S1P的鼠类mAb；Sphingomab^TM)、LT1004(人源化mAb)、LT1006(人源化mAb)，LT1007(人源化mAb)和LT1009(人源化mAb；Sonepcizumab^TM)。还包括盐水介质和非特异性抗体(NSA)对照。如图13所示的，鼠类mAb LT1002(Sphingomab^TM)和人源化mAb LT1009(Sonepcizumab^TM)在这个CNV小鼠模型中显著减少病变。所有测试的mAb表现出病变尺寸大约80-98％减少，其在所有情况下都是显著性的(相对盐水，p＜0.001)。另外，相比于非特异性抗体对照，LT1007和LT1009还表现出显著抑制(p＜0.05)。病变尺寸的抑制百分比在LT1002(鼠类)为约80％，在LT1004(人源化)为约82％，在LT1006为约81％以及在LT1009为约99％。因此，LT1009是这个新血管形成的体内模型中最具活性的人源化mAb变体。
实施例18：Sonepcizumab剂量反应的确定
在激光诱导破裂Bruch膜的前一天，小鼠(n＝10)接受单个、双侧玻璃体内注射逐渐增高剂量的sonepcizumab(0.05，0.5，1.0或3.0μg/眼)或高剂量非特异性(NS)抗体(3.0μg/眼)。在激光破裂后14天，小鼠麻醉并用荧光素标记的葡聚糖灌注，并制备脉络膜展开固定片以用于CNV病变尺寸分析。
在该研究中，sonepcizumab给药量和给药时间间隔对CNV抑制的作用利用另一种量化CNV区的有效方法进行考察，其中动物在杀死之前用荧光素标记的葡聚糖刚刚灌注。Sonepcizumab在CNV区诱导了剂量依赖性减少，导致在3.0μg/眼剂量下大约50％的最大抑制。这种减少是显著性的(使用未配对t检验，相比于非特异性抗体对照，p＜0.0001)。在给药频率研究中，在超过14-天的研究中，在单个时间点(第0天)或多个时间点(第0天和第7天)用Sonepcizumab处理的组之间观察到类似效力。
将利用Sonepcizumab处理(3.0μg/眼)观察到的大约50％的最大抑制有利地与之前在相同模型中并由相同研究者实施的试验中公开的数据进行比较，证实通过VEGF-Trap)(4.92μg/眼减小CNV区。Saishin，et al.J Cell Physiol，2003.195(2)：p.241-8。“Trap”(Regeneron Pharmaceuticals，Inc)是两个不同受体成分和称为Fc区的抗体分子的Fc区之间的融合体，并且VEGF-Trap是通过Regeneron跟踪眼病和癌症。这些两个独立研究之间的比较表明，通过Sonepcizumab减小CNV病变尺寸比利用VEGF-Trap观察到的20个更大的百分点。因此，这些数据不仅证实我们关于抗-S1P治疗减少CNV鼠类模型中病变形成的能力的初步发现，而且它们还证实该人源化抗体Sonepcizumab在抑制CNV病变形成以及抑制针对抗渗入性提供渗入的的能力方面增加的效果。
实施例19：Sonepcizumab在早产儿视网膜病变的鼠类模型中减少视网膜新血管形成中的作用
C57BL/6小鼠(n＝7)在生命的第7天置于75％氧中并在生命的第12天回到环境空气中，并在一只眼中给予3μg Sonepcizumab的眼内注射，而在对侧眼中给予介质(vehicle)。在第17天，小鼠接受用FITC标记的抗-PECAM抗体的眼内注射并在8小时后，对小鼠进行麻醉并取出眼睛，并在PBS缓冲的福尔马林室温下固定5小时。视网膜切除并用包含0.25％Triton X-100的磷酸缓冲盐水清洗，整体固定。载玻片用Nikon荧光显微镜进行观察并且每个视网膜的视网膜NV的面积通过照片分析进行检测。
与在鼠类激光破裂模型中观察到的CNV减少一致，我们也观察到早产儿视网膜病变(ROP)的鼠类模型中CNV的显著减少。相比于盐水对照，Sonepcizumab(3.0μg/眼)的玻璃体内给药导致视网膜新血管形成的几乎4倍的减少。这些数据证实了Sonepcizumab在视网膜和脉络膜血管床中抑制病态眼部血管发生，无论是局部缺血导致的或Bruch膜破裂导致的。
实施例20：Sonepcizumab在基底膜栓子测定中对VEGF诱导的血管发生的作用
体内新血管形成利用GFR基底膜栓子测定实施，如在Staton，et al.，Int J Exp Pathol，2004.85(5)：p.233-48中描述的。将4-6周龄nu/nu小鼠在左侧面注射500μl的冰冷GFR基底膜。GFR基底膜单独注射(对照)或在加入补充了100μg/ml肝素的10μg/mL VEGF之后注射。由3只用于对照和sonepcizumab处理的动物组成组。在GFR基底膜植入之前1天，动物用盐水和sonepcizumab(10mg/kg)处理，并且在实验持续期间每72h腹膜内给予各个剂量。在12天后，杀死动物；切除栓子并立即在锌和无福尔马林固定剂中固定过夜，埋入石蜡中并切片(5um)。石蜡埋入切片然后对CD31(Pharmingen)染色。通过数字照相机以20x放大获取照片(每个切片9张照片，每个栓子3个切片)，并且CD31阳性染色然后通过PhotoShop 6.0程序量化并通过ImageJ表示为血管发生计分(像素2).
Sonepcizumab的抗形成血管作用在该基底膜栓子测定中明显。如预期的，在填加了10μg/ml VEGF的基底膜栓子中诱导了广泛新血管形成(在缺少VEGF或sonepcizumab的未处理对照中的大约5.75x)。重要的是，在基底膜注射之前，利用sonepcizumab的系统性腹膜内治疗防止了几乎80％的这种VEGF刺激的细胞构成和微血管密度增加。这种减少是显著性的(p＜0.05，相比于单独的VEGF)，并且证实了当系统地给予动物时sonepcizumab的潜在抗-形成血管活性，并且有力地表明了sonepcizumab能够显著抑制VEGF诱导的血管发生。这个发现与来自Lpath的肿瘤学规划的数据一致，因而S1P抗体在鼠类原位乳腺癌模型中减少多种血管形成因子包括VEGF的血清水平。
与AMD相关的血管生长的主要组成是周细胞的聚集，其包围并支持生长的内皮血管。Jo，et al.，Am J Pathol，2006.168(6)：p.2036-53。转基因小鼠研究表明，VEGF和PDGF-B是刺激周细胞渗入和分化的主要因子，导致血管成熟和稳定化。Guo，et al.，Am JPathol，2003.162(4)：p.1083-93；Benjamin，L.E.，I.Hemo，and E.Keshet，Development，1998.125(9)：p.1591-8。重要地，S1P促进VEGF和PDGF的反式激活。因此，sonepcizumab间接中和这些生长因子的能力表明，sonepcizumab可以防止AMD期间的异常血管生长。
实施例21：Sonepcizumab显著减少在Bruch膜激光破裂之后的血管渗漏
在Bruch膜激光破裂的鼠类模型中，给予Sonepcizumab评价抑制血管渗漏(除了抑制如上所示的新血管形成外)的效力。
C57BL/6小鼠(n＝10)在每一只眼的3个位置经历Bruch膜的激光破裂并在一只眼中眼内注射3μg的Sonepcizumab，对侧眼中注射介质。在激光破裂后一周，小鼠腹膜内注射给予12μl/g体重的1％荧光素钠，之后麻醉5分钟。取出眼睛并在室温下在PBS缓冲的福尔马林中固定5小时。然后切除视网膜，清洗，并用一级(primary)抗-PECAM-1孵育。然后清洗视网膜，用二级(secondary)抗体(结合有罗丹明的羊抗-大鼠IgG)孵育，然后展开固定。
CNV病变面积的定量通过PECAM-1染色进行检测。血管渗漏的定量通过荧光素钠染色进行检测。总渗漏面积来自CNV＝CNV+渗漏(绿色)-CNV面积(红色)。数值表示对于n＝10只小鼠/组的平均值±SEM。脉络膜新血管形成面积(通过PECAM-1染色)用LT1009处理的动物为约0.015mm²，而盐水处理的对照动物为约0.03mm²。这是新血管形成的50％减少(p-0.018)。来自脉络膜新血管形成的渗漏面积(通过荧光素染色)对于用LT1009处理的动物为约0.125mm²，而盐水处理的对照动物为约0.2mm²。这是血管渗漏中大约38％的减少(p-0.017)。
在用3.0μg/眼的Sonepcizumab或PBS对照处理的小鼠中脉络膜新血管形成和血管渗漏减少的代表性免疫组织化学照片与这些结果一致。因此，除了减少CNV外，Sonepcizumab在激光破裂Bruch膜的视网膜水肿之后显著减少血管渗漏，其在视敏度丧失中起主要作用，血管渗漏与以下有关：(i)AMD中的脉络膜新血管渗漏；和(ii)糖尿病中血-视网膜屏障的破坏。Gerhardt，H.and C.Betsholtz，Cell Tissue Res，2003.314(1)：p.15-23。Sonepcizumab减少眼中的病态血管形成以及导致视网膜水肿的血管渗漏。这些发现与小鼠用荧光素标记的葡聚糖灌注的CNV面积定量实验产生的数据一致。经由这种方法的CNV定量确定地受血管渗透影响。高度有利的结果说明了在脉络膜血管床中的抗-渗透作用。给定这些数据，我们认为Sonepcizumab具有成为单一疗法的潜力。与目前pan-VEGF-A封闭剂的协同效应的可能性也存在。
实施例22：在用针对S1P的抗体处理之后视网膜中巨噬细胞渗入减少
老年性黄斑退化症(AMD)是一种与逐渐破坏锐利中心视觉的与老化相关的疾病。有两种主要的黄斑退化症类型。占到85-90％AMD病例的干性或萎缩形式AMD病例以及湿性形式的AMD的特征在于异常血管生长。当称为玻璃疣的黄色斑点开始从主要在黄斑区域中破坏组织的沉淀或碎片聚集时，诊断为干性黄斑退化症。可能发生逐渐的中心视觉丧失。对于最流行的AMD萎缩(干性)形式没有有效的治疗。萎缩性AMD由位于光感受器细胞下方并通常对这些感光细胞提供关键代谢支持的视网膜色素上皮(RPE)中的异常所引起。次于RPE功能障碍，黄斑棒和椎体变性，导致视力不可逆丧失。氧化作用应激、缺血、玻璃疣形成、脂褐素聚集、局部炎症和反应性神经胶质增生代表萎缩性AMD发病机制表现的病理过程。在这些过程之中，炎症作为对组织损害的关键促进因素出现。巨噬细胞渗入到患有干性AMD的患者的黄斑中已被证实是损害性的炎性反应的一个重要部分。因此，可以减轻巨噬细胞渗入的试剂将是有价值的治疗剂，因为巨噬细胞渗入的抑制将可能消除黄斑组织损害。这样的试剂也可以降低干性AMD转化成湿性AMD的速率。
在缺血和炎性视网膜病变的模型中，现在已被证实在用抗S 1P抗体的治疗之后巨噬细胞渗入抑制55％。这些数据利用良好建立的鼠类氧诱导视网膜病变模型(也称为早产儿视网膜病变(ROP)模型)产生。特别地，将C57BL/6小鼠在生命的第7天放入75％氧中并在生命的第12天回到环境空气，并在一只眼中给予眼内注射的3μg人源化抗S1P抗体(LT1009，Sonepcizumab^TM)，而在另一只眼中注射介质。在生命的第17天，小鼠接受眼内注射的针对F4/80(一种pan-巨噬细胞标记物)的FITC标记抗体，并且在8小时后，小鼠麻醉。取出眼球并在室温下在PBS缓冲的福尔马林中固定5小时。切除视网膜并用包含0.25％Triton X-100的磷酸缓冲盐水清洗，并整体固定。载玻片利用Nikon荧光显微镜观察并将视网膜巨噬细胞定量。结果示于下表8中。
表8：通过用针对S1P的人源化单克隆抗体处理，视网膜中巨噬细胞渗入的减少

基于这些数据和已知的巨噬细胞在干性AMD发病机制中的作用，认为抗-S1P抗体代表一种有效的治疗干性AMD的治疗剂。
实施例23：裸NCr小鼠中SC COLO205结肠直肠肿瘤异种移植对单独使用25-75mg/kg LT 1009和联合阿瓦斯丁(Avastin)或紫杉醇使用25-75mg/kgLT1009治疗的反应
这个研究的目的是确定单独LT1009和LT1009联合另一抗癌剂在延迟雌性Ncr(nu/nu)小鼠中皮下移植和建立的人类结肠直肠(COLO205)癌肿瘤的进展的效力。
裸小鼠在右侧面附近皮下植入来自体内途径的COLO205肿瘤的一个片段/小鼠。在每个实验中的60只小鼠建立范围在大约100至200mm³大小的肿瘤时，所有治疗开始。然后小鼠(n＝10/组)用25mg/kg的LT1009、50mg/kg LT1009、40mg/kg阿瓦斯丁、50mg/kgLT1009+40mg/kg阿瓦斯丁、15mg/kg紫杉醇或介质(盐水)进行处理。25或50mg/kg LT1009和盐水然后在实验期间以0.1mL/20g体重的体积腹膜内给予一次q3d。阿瓦斯丁在q7d时间表上以40mg/kg/每次的剂量静脉内给药，以0.1mL/20g体重的体积注射。紫杉醇(阳性对照)在q1d x 5时间表上以15mg/kg/每次的剂量静脉内给药，以0.1mL/10g体重的体积注射。在第21天，将25mg/kgLT1009的剂量在研究持续时间内增加至75mg/kg LT1009。
每天观察动物的死亡率。肿瘤尺寸和体重每周收集两次，从治疗的第一天开始并且包括研究终止的那天。当每个研究中的介质(vehicle)处理的对照组中的中间肿瘤达到约4,000mg时，终止该研究。收获来自每个动物的肿瘤，记录湿重，处理肿瘤以通过CD-31染色确定微血管密度(MVD)。肿瘤重量(mg)利用用于椭球体(lxw²)/2＝mm³的方程技术，其中l和w是指在每次测量收集的较大和较小尺寸，并假定单位密度(1mm³＝1mg)。
表9：发现物-Colo205的数值概括
                                      相比于介质处理小鼠
处理              最终肿瘤重量(mg)    的减少％
介质              3047.25             -
50mg/kg LT1009    2071.17             32％
25/75mg/kg LT1009 2465.60             20％
阿瓦斯丁          1967.90             35％
阿瓦斯丁+50mg/kg
LT1009            1614.40             48％
紫杉醇            0                   100％
50mg/kg LT1009实质性地抑制肿瘤进展(p＜0.018)，如通过最终肿瘤重量测得的，当相比于盐水处理动物时减少32％。25/75mg/kg LT1009在减少20％最终肿瘤重量中也是有效的；然而，这种减少不是统计学显著的。50mg/kg LT1009与阿瓦斯丁在减少最终肿瘤重量中一样有效(分别为32％和35％减少)。LT1009与阿瓦斯丁的组合比每个单独试剂都更有效，当相比于盐水处理动物时，显示出肿瘤重量48％的减少。因此，LT1009和阿瓦斯丁的作用看起来是可累加的。阳性对照紫杉醇完全消除预先建立的肿瘤。
实施例24：裸NCr小鼠中SC HT29结肠直肠肿瘤异种移植对单独用50mg/kg LT1009和用50mg/kg LT1009与阿瓦斯丁和5-FU组合的治疗的反应
这个研究的目的是评价LT1009单独和组合另一抗癌剂在针对雌性无胸腺NCr-nu/nu小鼠中皮下植入人类HT29结肠肿瘤异种移植的抗肿瘤效力。
裸小鼠在右侧面附近皮下植入来自体内途径的HT29肿瘤的一个片段/小鼠。当每个实验中60只小鼠建立范围在约100至200mm³的尺寸范围的肿瘤时，所有治疗开始。每个治疗组有10只小鼠。在实验期间以0.1mL/20g体重的体积腹膜内q2d给予50mg/kgLT1009和盐水。75mg/kg 5-FU和20mg/kg阿瓦斯丁分别以75mg/kg/每次和20mg/kg/每次的剂量腹膜内和静脉内给药，q4d，以0.1mL/10g体重的体积注射。第一次给予LT1009由静脉内给予100mg/kg构成。
每天观察动物的死亡率。肿瘤尺寸和体重每周收集两次，从治疗的第一天开始并且包括研究终止的那天。当每个研究中介质处理的对照组中的中间肿瘤达到大约4,000mg时，终止研究。收获来自每个动物的肿瘤，记录湿重，并且处理肿瘤以通过CD-31染色确定MVD。肿瘤重量(mg)利用用于椭球体(lx w²)/2＝mm³的方程技算，其中l和w是指在每次测量收集的较大和较小尺寸，并假定单位密度(1mm³＝1mg)。
表10：最终肿瘤重量-HT29
                  最终肿瘤重量    显著性(p-       相比于介质处理小
治疗              (mg)            值)             鼠的减少％
介质              2723.67         -               -
LT1009            2390.63         1.00            13％
阿瓦斯丁          1927.44         0.39            30％
LT1009+阿瓦斯丁   1624.90         0.001           41％
5-FU              1963.71         0.099           28％
LT1009+5-FU       1948.00         0.049           29％
50mg/kg LT1009减少肿瘤进展，如通过肿瘤重量测得的，当相比于来自盐水处理动物的肿瘤时，减少13％，而阿瓦斯丁减少30％的肿瘤重量。LT1009与阿瓦斯丁的组合比任何单独试剂更有效，当相比于盐水处理动物时显示出肿瘤重量的统计学显著性地41％的减少。用5-Fu处理减少28％的肿瘤重量。5-FU表现出与LT1009最小的累加效应，显示出最终肿瘤重量的29％抑制。
实施例25：裸NCr小鼠中SC DU145前列腺肿瘤异种移植对单独使用50mg/kg LT1009或用50mg/kg LT1009组合阿瓦斯丁或紫杉醇的治疗反应
这个研究的目的是确定LT1009单独和组合其他抗癌剂在延迟雌性Ncr(nu/nu)小鼠中皮下抑制(sc)和建立的人类前列腺(DU1145)癌性肿瘤进展的效力。
裸小鼠在右侧齿面附近皮下植入来自体内途径的DU145肿瘤的一个片段/小鼠。当每个实验中60只小鼠建立范围在约100至200mm³的尺寸范围的肿瘤时，所有治疗开始。小鼠(n＝10/组)然后用50mg/kg的LT1009、20mg/kg阿瓦斯丁、7.5mg/kg紫杉醇、50mg/kg LT1009+20mg/kg阿瓦斯丁、50mg/kg LT1009+7.5mg/kg紫杉醇或介质(盐水)进行处理。50mg/kg LT1009和盐水在实验期间以0.1mL/20g体重的体积腹膜内q2d给予。紫杉醇和阿瓦斯丁分别以75mg/kg/每次和20mg/kg/每次的剂量腹膜内和静脉内q1dx5和q4d给药，以0.1mL/10g体重的体积注射。第一个LT1009剂量由静脉内给予100mg/kg构成。
在研究的过程中，肿瘤生长通过检测皮下肿瘤在三个轴上的值并计算体积而进行监测。在研究结束时，确定最终肿瘤重量和体积，然后杀死小鼠，收获肿瘤。肿瘤的微血管密度(MVD)然后通过CD-31染色确定。
表11：对发现物-DU145的数值概括
 治疗  最终肿瘤重量  (mg)  显著性(p-  值)  相比于介质处理小  鼠的减少％ 介质  2703 LT1009  2242  0.00  28％ 阿瓦斯丁  578  0.00  79％ LT1009+阿瓦斯丁  676  0.00  75％ 紫杉醇  539  0.00  80％ LT1009+紫杉醇  373  0.00  84％
50mg/kg LT1009显著地(p＜0.00)减少肿瘤进展，如通过最终肿瘤重量测定的，减少28％。当与盐水处理的动物的肿瘤时相比时，阿瓦斯丁和紫杉醇也显著(P＜0.00)减少肿瘤重量的80％。LT1009没有显著增大阿瓦斯丁或紫杉醇的抗肿瘤活性，如通过最终肿瘤重量测定的。
实施例26：CB17SCID小鼠中RPMI 8226人类骨髓瘤异种移植对单独使用25mg/kg或50mg/kg LT1009和用25mg/kg或50mg/kgLT1009组合硼替佐米(Bortezomib)的治疗反应
这个研究的目的是评价LT1009单独和组合抗癌剂硼替佐米(Bortezomib)在对雌性CB17SCID小鼠皮下植入的人类RPMI人骨髓瘤异种移植的抗肿瘤效力。
裸小鼠(CB 17SCID，4-5周龄，重18-22mg，获自Harlan的雌性小鼠)皮下注射从组织培养物收获的RPMI 8226细胞(～1x10⁷个细胞/小鼠)。当肿瘤生长至大约100mm³大小时，动物通过肿瘤尺寸配对到治疗和对照组(10只小鼠/组)中。初始给药在配对后第1天开始。所有组中的动物按重量给药(0.01ml/g；10ml/kg)。介质中的LT1009通过每3天腹膜内(IP)注射一次进行给药，直到研究完成(Q3D至结束)。硼替佐米经由尾静脉每3天一次通过静脉内注射给药，达到6个治疗(Q3Dx6)。为了用作阴性对照，LT1009介质(0.9％盐水)在Q3D直至结束时间表上给药。
每周记录两次单个和组平均肿瘤体积±SEM，直至研究完成，从第1天开始。对于每一个组，最终平均肿瘤体积±SEM在研究完成时报告；经历部分或完全肿瘤消退的动物或经历技术或药物相关死亡的动物从这些计算中排除。
表12：最终肿瘤体积-RPMI
                   最终肿瘤重量       相比于介质处理小
治疗               (mg)               鼠的减少％
介质               2083               0
硼替佐米           1664               20％
25mg/kg LT1009     1860               11％
50mg/kg LT1009     1978               5％
50mg/kg LT1009
+硼替佐米          1832               12％
本文中描述的和要求保护的所有组合物和方法根据本披露内容可以在无需过度实验的情况下制得和实施。虽然本发明的组合物和方法依据优选实施方式进行了描述，但是对于本领域技术人员明显的是，可以对所述组合物和方法施加变化。对于本领域技术人员来说明显的所有这样的类似替换和更改认为在如由所附权利要求限定的本发明的精神和范围内。
在本说明书中提及的所有专利、专利申请、以及出版物是本发明所属技术领域的技术人员的水平的指示。所有专利、专利申请和出版物，包括要求的优先权或其他权益的那些文献，通过引用并入本文中，如同每一个单个出版物具体和单独地指明通过引用并入的程度一样。
本文举例说明性地描述的发明可以在缺少本文没有特定披露的任何元件或要素的情况下实施。因此，例如，在本文中的每一种情况下，术语“包含”、“基本上由...构成”、以及“由...构成”中的任一个可以用另外两个中的任一个替代。所采用的术语和表达用于描述而不是限定，并且在使用这样的术语和表达中不排除所示出和所描述的特征、或其部分的任何等同替换，但是应当理解，各种修饰在要求保护的本发明范围内是可能的。因此，应当理解，尽管本发明已经通过优选实施方式和最佳特征具体地进行了披露，但是本文披露的概念的更改和变化可以由本领域技术人员做到，并且这样的更改和变化认为属于由所附权利要求限定的本发明的范围。
序列表
<110>勒帕斯公司(Lpath，Inc.)
<120>用于治疗眼疾和眼病的组合物及方法
<130>P25745BTLG
<140>PCT/US2007/082675
<150>60/855,003
<151>2006-10-27
<150>60/956,890
<151>2007-08-20
<160>37
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1
atggratgga gckggrtctt tmtctt    26
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
cagtggatag acagatgggg g    21
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
cagtggatag accgatgggg c    21
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>4
cagtggatag actgatgggg g    21
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>5
caagggatag acagatgggg c    21
<210>6
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>6
gtctctgatt ctagggca    18
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>7
actggatggt gggaagatgg    20
<210>8
<211>120
<212>PRT
<213>小鼠属
<400>8
Gln Ala His Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Phe Ile Phe Ile Asp His
             20                 25                  30
Thr Ile His Trp Met Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Cys Ile Ser Pro Arg His Asp Ile Thr Lys Tyr Asn Glu Met Phe
    50                  55                  60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Ile Gln Val Asn Ser Leu Thr Phe Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Gly Phe Tyr Gly Ser Thr Ile Trp Phe Asp Phe Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser
        115                 120
<210>9
<211>107
<212>PRT
<213>小鼠属
<400>9
Glu Thr Thr Val Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Met Ala Ile Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Ile Thr Thr Thr Asp Ile Asp Asp Asp
            20                  25                  30
Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro Pro Asn Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Ser Glu Gly Asn Ile Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser
    50                  55                  60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Leu Phe Thr Ile Glu Asn Met Leu Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Asn Leu Pro Phe
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>10
<211>11
<212>PRT
<213>小鼠属
<400>10
Ile Thr Thr Thr Asp Ile Asp Asp Asp Met Asn
1               5                   10
<210>11
<211>7
<212>PRT
<213>小鼠属
<400>11
Glu Gly Asn Ile Leu Arg Pro
1               5
<210>12
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠属
<400>12
Leu Gln Ser Asp Asn Leu Pro Phe Thr
1               5
<210>13
<211>5
<212>PRT
<213>小鼠属
<400>13
Asp His Thr Ile His
1               5
<210>14
<211>17
<212>PRT
<213>小鼠属
<400>14
Cys Ile Ser Pro Arg His Asp Ile Thr Lys Tyr Asn Glu Met Phe Arg
1               5                   10                  15
Gly
<210>15
<211>12
<212>PRT
<213>小鼠属
<400>15
Gly Gly Phe Tyr Gly Ser Thr Ile Trp Phe Asp Phe
1               5                   10
<210>16
<211>147
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Humanized murine antibody variable domains
<400>16
Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu Ala Leu Leu Leu Ala Val Leu Gln Gly
1               5                   10                  15
Val Cys Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Gln Ser Phe Gly Tyr Ile Phe
        35                  40                  45
Ile Asp His Thr Ile His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Gln Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Met Gly Cys Ile Ser Pro Arg His Asp Ile Thr Lys Tyr Asn
65                  70                  75                  80
Glu Met Phe Arg Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ser Ser
                85                  90                  95
Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met
            100                 105                 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Phe Tyr Gly Ser ThrIle Trp Phe Asp
        115                 120                 125
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
    130                 135                 140
Gly Pro Ser
145
<210>17
<211>134
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Humanized murine antibody variable domains
<400>17
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1               5                    10                 15
Leu Pro Gly Ala Arg Cys Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe
            20                  25                  30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ile Thr Thr
        35                  40                  45
Thr Asp Ile Asp Asp Asp Met Asn Trp Tyr Gln Gln Glu Pro Gly Lys
    50                  55                  60
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Gly Asn Ile Leu Arg Pro Gly Val
65                  70                  75                  80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
                85                  90                  95
Ile Ser Lys Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln
            100                 105                 110
Ser Asp Asn Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
        115                 120                 125
Lys Arg Glu Trp Ile Pro
130
<210>18
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Humanized murine mAb CDR nucleotide sequence
<400>18
ataaccacca ctgatattga tgatgatatg aac    33
<210>19
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Humanized murine mAb CDR nucleotide sequence
<400>19
gaaggcaata ttcttcgtcc t    21
<210>20
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Humanized murine mAb CDR nucleotide sequence
<400>20
ttgcagagtg ataacttacc attcacg    27
<210>21
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Humanized murine mAb CDR nucleotide sequence
<400>21
gaccatactt cac    13
<210>22
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Humanized murine mAb CDR nucleotide sequence
<400>22
tgtatttctc ccagacatga tattactaaa tacaatgaga tgttcagggg c    51
<210>23
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Humanized murine mAb CDR nucleotide sequence
<400>23
ggggggttct acggtagtac tatctggttt gacttt    36
<210>24
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Humanized murine mAb CDR nucleotide sequence
<400>24
ggggggttct acggtagtac tatctggttt gacttt    36
<210>25
<211>455
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Humanized murine mAb nucleotide sequence
<400>25
cgccaagctt gccgccacca tggggtcaac cgccatcctc gccctcctcc tggctgttct   60
ccaaggagtc tgttccgagg tgcagctggt gcagtctgga gcagaggtga aaaagcccgg  120
ggagtctctg aagatctcct gtcagagttt tggatacatc tttatcgacc atacttcact  180
gggtgcgcca gatgcccggg caaggcctgg agtggatgtg tatttctccc agacatgata  240
ttactaaata caatgagatg ttcaggggcc aggtcaccat ctcagccgac aagtccagca  300
gcaccgccta cttgcagtgg agcagcctga aggcctcgga caccgccatg tatttctgtg  360
cgagaggggg gttctacggt agtactatct ggtttgactt ttggggccaa gggacaatgg  420
tcaccgtctc ttcagcctcc accaagggcc catcg                             455
<210>26
<211>452
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Humanized murine mAb nucleotide sequence
<400>26
cgccaagctt gccgccacca tggggtcaac cgccatcctc gccctcctcc tggctgttct     60
ccaaggagtc tgttccgagg tgcagctggt gcagtctgga gcagaggtga aaaagcccgg    120
ggagtctctg aagatctcct gtcagagttt tggatacatc gaccatactt cactggatgc    180
gccagatgcc cgggcaaggc ctggagtgga tgggggctat ttctcccaga catgatatta    240
ctaaatacaa tgagatgttc aggggccagg tcaccatctc agccgacaag tccagcagca    300
ccgcctactt gcagtggagc agcctgaagg cctcggacac cgccatgtat ttctgtgcga    360
gaggggggtt ctacggtagt actatctggt ttgacttttg gggccaaggg acaatggtca    420
ccgtctcttc agcctccacc aagggcccat cg                                  452
<210>27
<211>147
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Humanized murine mAb sequence
<400>27
Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu Ala Leu Leu Leu Ala Val Leu Gln Gly
1               5                   10                  15
Val Cys Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Gln Ser Phe Gly Tyr Ile Phe
        35                  40                  45
Ile Asp His Thr Ile His Trp Met Arg Gln Met Pro Gly Gln Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Met Gly Ala Ile Ser Pro Arg His Asp Ile Thr Lys Tyr Asn
65                  70                  75                  80
Glu Met Phe Arg Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ser Ser
                85                  90                  95
Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met
            100                 105                 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Phe Tyr Gly Ser Thr Ile Trp Phe Asp
        115                 120                 125
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
    130                 135                 140
Gly Pro Ser
145
<210>28
<211>419
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Humanized murine mAb sequence
<400>28
cgccaagctt gccgccacca tggacatgag ggtccccgct cagctcctgg ggctcctgct     60
gctctggctc ccaggtgcca gatgtgaaac gacactcacg cagtctccat ccttcctgtc    120
tgcatctgta ggagacagag tcaccatcac ataaccacca ctgatattga tgatgatatg    180
aactggtatc agcaggaacc agggaaagcc cctaagctcc tgatctatga aggcaatatt    240
cttcgtcctg gggtcccatc aaggttcagc ggcagtggat ctggcacaga tttcactctc    300
accatcagca aattgcagcc tgaagatttt gcaacttatt actgtttgca gagtgataac    360
ttaccattca cgttcggcca agggaccaag ctggagatca aacgtgagtg gatcccgcg     419
<210>29
<211>407
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Humanized murine mAb sequence
<400>29
cgccaagctt gccgccacca tggacatgag ggtccccgct cagctcctgg ggctcctgct     60
gctctggctc ccaggggcca gatgtgaaac gacagtgacg cagtctccat ccttcctgtc    120
tgcatctgta ggagacagag tcaccatcac ttgcataacc accactgata ttgatgatga    180
tatgaactgg ttccagcagg aaccagggaa agcccctaag ctcctgatct ccgaaggcaa    240
tattcttcgt cctggggtcc catcaagatt cagcagcagt ggatatggca cagatttcac    300
tctcaccatc agcaaattgc agcctgaaga ttttgcaact tattactgtt tgcagagtga    360
taacttacca ttcactttcg gccaagggac caagctggag atcaaac                  407
<210>30
<211>126
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Humanized murine mAb sequence
<400>30
Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1               5                   10                  15
Gly Ala Arg Cys Glu Thr Thr Val Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser
            20                  25                  30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ile Thr Thr Thr Asp
        35                  40                  45
Ile Asp Asp Asp Met Asn Trp Phe Gln Glu Pro Gly Lys Ala Pro Lys
    50                  55                  60
Leu Leu Ile Ser Glu Gly Asn Ile Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg
65                  70                  75                  80
Phe Ser Ser Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Lys
                85                  90                  95
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Asn
            100                 105                 110
Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
        115                 120                 125
<210>31
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Humanized murine mAb sequence
<400>31
Ala Ile Ser Pro Arg His Asp Ile Thr Lys Tyr Asn Glu Met Phe Arg
1               5                   10                  15
Gly
<210>32
<211>140
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Humanized murine mAb sequence
<400>32
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1               5                   10                  15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Gln Ser Phe Gly Tyr Ile Phe
        35                  40                  45
Ile Asp His Thr Ile His Trp Met Arg Gln Met Pro Gly Gln Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Met Gly Ala Ile Ser Pro Arg His Asp Ile Thr Lys Tyr Asn
65                  70                  75                  80
Glu Met Phe Arg Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ser Ser
                85                  90                  95
Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met
            100                 105                 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Phe Tyr Gly Ser Thr Ile Trp Phe Asp
        115                 120                 125
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
    130                 135                 140
<210>33
<211>127
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Humanized murine mAb sequence
<400>33
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1               5                   10                  15
Asp Ala Arg Cys Glu Thr Thr Val Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser
            20                  25                  30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ile Thr Thr Thr Asp
        35                  40                  45
Ile Asp Asp Asp Met Asn Trp Phe Gln Gln Glu Pro Gly Lys Ala Pro
    50                  55                  60
Lys Leu Leu Ile Ser Glu Gly Asn Ile Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser
65                  70                  75                  80
Arg Phe Ser Ser Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
                85                  90                  95
Lys Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp
            100                 105                 110
Asn Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
        115                 120                 125
<210>34
<211>2034
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Humanized murine mAb sequence
<400>34
aagcttgccg ccaccatgga atggagctgg gtgttcctgt tctttctgtc cgtgaccaca     60
ggcgtgcatt ctgaggtgca gctggtgcag tctggagcag aggtgaaaaa gcccggggag    120
tctctgaaga tctcctgtca gagttttgga tacatcttta tcgaccatac tattcactgg    180
atgcgccaga tgcccgggca aggcctggag tggatggggg ctatttctcc cagacatgat    240
attactaaat acaatgagat gttcaggggc caggtcacca tctcagccga caagtccagc    300
agcaccgcct acttgcagtg gagcagcctg aaggcctcgg acaccgccat gtatttctgt    360
gcgagagggg ggttctacgg tagtactatc tggtttgact tttggggcca agggacaatg    420
gtcaccgtct cttcagcctc caccaagggc ccatcggtct tccccctggc accctcctcc    480
aagagcacct ctgggggcac agcggccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa    540
ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct     600
gtcctacagt cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc     660
ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac     720
aagagagttg gtgagaggcc agcacaggga gggagggtgt ctgctggaag ccaggctcag     780
cgctcctgcc tggacgcatc ccggctatgc agtcccagtc cagggcagca aggcaggccc     840
cgtctgcctc ttcacccgga ggcctctgcc cgccccactc atgctcaggg agagggtctt     900
ctggcttttt ccccaggctc tgggcaggca caggctaggt gcccctaacc caggccctgc     960
acacaaaggg gcaggtgctg ggctcagacc tgccaagagc catatccggg aggaccctgc    1020
ccctgaccta agcccacccc aaaggccaaa ctctccactc cctcagctcg gacaccttct    1080
ctcctcccag attccagtaa ctcccaatct tctctctgca gagcccaaat cttgtgacaa    1140
aactcacaca tgcccaccgt gcccaggtaa gccagcccag gcctcgccct ccagctcaag    1200
gcgggacagg tgccctagag tagcctgcat ccagggacag gccccagccg ggtgctgaca    1260
cgtccacctc catctcttcc tcagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct    1320
tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg    1380
tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg    1440
aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg    1500
tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg    1560
tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaaggtggga    1620
cccgtggggt gcgagggcca catggacaga ggccggctcg gcccaccctc tgccctgaga    1680
gtgaccgctg taccaacctc tgtccctaca gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc  1740
ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa  1800
ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac  1860
tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc  1920
accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag  1980
gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa atag        2034
<210>35
<211>455
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Humanized murine mAb sequence
<400>35
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1               5                   10                  15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Gln Ser Phe Gly Tyr Ile Phe
        35                  40                  45
Ile Asp His Thr Ile His Trp Met Arg Gln Met Pro Gly Gln Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Met Gly Ala Ile Ser Pro Arg His Asp Ile Thr Lys Tyr Asn
65                  70                  75                  80
Glu Met Phe Arg Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ser Ser
                85                  90                  95
Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met
            100                 105                 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Phe Tyr Gly Ser Thr Ile Trp Phe Asp
        115                 120                 125
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
    130                 135                 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145                 150                 155                 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
                165                 170                 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
            180                 185                 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
        195                 200                 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
    210                 215                 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Ala Pro
225                 230                 235                 240
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
                245                 250                 255
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
            260                 265                 270
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
        275                 280                 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
    290                 295                 300
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
305                 310                 315                 320
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
                325                 330                 335
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
            340                 345                 350
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
        355                 360                 365
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
    370                 375                 380
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
385                 390                 395                 400
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
                405                 410                 415
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
            420                 425                 430
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
        435                 440                 445
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    450                 455
<210>36
<211>720
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Humanized murine mAb sequence
<400>36
aagcttgccg ccaccatgtc tgtgcctacc caggtgctgg gactgctgct gctgtggctg    60
acagacgccc gctgtgaaac gacagtgacg cagtctccat ccttcctgtc tgcatctgta    120
ggagacagag tcaccatcac ttgcataacc accactgata ttgatgatga tatgaactgg    180
ttccagcagg aaccagggaa agcccctaag ctcctgatct ccgaaggcaa tattcttcgt    240
cctggggtcc catcaagatt cagcagcagt ggatatggca cagatttcac tctcaccatc    300
agcaaattgc agcctgaaga ttttgcaact tattactgtt tgcagagtga taacttacca    360
ttcactttcg gccaagggac caagctggag atcaaacgta cggtggctgc accatctgtc    420
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg    480
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa    540
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc    600
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa    660
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag    720
<210>37
<211>234
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Humanized murine mAb sequence
<400>37
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1               5                   10                  15
Asp Ala Arg Cys Glu Thr Thr Val Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser
            20                  25                  30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ile Thr Thr Thr Asp
        35                  40                  45
Ile Asp Asp Asp Met Asn Trp Phe Gln Gln Glu Pro Gly Lys Ala Pro
    50                  55                  60
Lys Leu Leu Ile Ser Glu Gly Asn Ile Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser
65                  70                  75                  80
Arg Phe Ser Ser Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
                85                  90                  95
Lys Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp
            100                 105                 110
Asn Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
        115                 120                 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
    130                 135                 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145                 150                 155                 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
                165                 170                 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
            180                 185                 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
        195                 200                 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
    210                 215                 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230