用可见光调节低氧和疾病中线粒体的功能.pdf

本发明提供使用可见光谱部分的电磁辐射调节线粒体功能，以治疗各种病症，包括阿耳茨海默病、其它痴呆症、低氧和糖尿病性周围神经病以及四肢感觉障碍的方法。

1.  一种治疗哺乳动物对象组织的低氧的方法，所述方法包括使所述哺乳动物的低氧组织暴露于可见光谱部分的电磁辐射。

2.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过测定所述患病组织的血流评估对所述治疗的反应。

3.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，监测NO或NO诱生血管扩张剂或VEGF的血液或组织水平以评估对所述治疗的反应。

4.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光增加了所述暴光组织线粒体的NO产生。

5.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述暴光组织中血流增加。

6.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过暴光提高所述暴光组织中的线粒体氧效率。

7.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述低氧是由于四肢循环不良所致。

8.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对象患有糖尿病。

9.  一种治疗哺乳动物对象的糖尿病性周围神经病的方法，所述方法包括使患病组织暴露于可见光谱部分的电磁辐射。

10.  一种提高低氧组织中能量代谢的方法，所述方法包括使所述组织暴露于可见光谱部分的电磁辐射。

11.  一种降低哺乳动物组织中氧化应激的方法，所述方法包括使所述组织暴露于可见光谱部分的电磁辐射。

12.  如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述组织中诱导的氧化应激基因、脂质过氧化物水平、氧化的核苷和氧化的氨基酸或多肽中的一种或多种出现降低。

13.  一种调节组织细胞中细胞色素c氧化酶介导的呼吸作用或调节组织细胞中细胞色素c氧化酶磷酸化的方法，所述方法包括使所述组织暴露于可见光谱部分的电磁辐射。

14.  一种调节组织中线粒体功能的方法，所述方法包括使所述组织暴露于可见光谱部分的电磁辐射。

15.  如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述调节能增加所述暴光组织中的线粒体亚硝酸还原酶活性或NO产生。

16.  如权利要求14所述的方法，其特征在于，调节线粒体生物发生。

17.  如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述调节能增加线粒体的NO产生。

18.  如权利要求14所述的方法，其特征在于，线粒体蛋白质的含量或表达增加。

19.  如权利要求18所述的方法，其特征在于，选自下组的一个或多个亚基的含量或表达增加：细胞色素c氧化酶、细胞色素c、细胞色素c还原酶或ATP合成酶的亚基。

20.  一种监测用可见光谱部分电磁辐射治疗哺乳动物对象的效果的方法，所述方法包括使所述对象的组织暴露于所述辐射，并测定所述辐射对组织中NO产生以及NO诱生血管扩张剂的影响。

21.  一种通过细胞色素c亚硝酸还原酶活性调节哺乳动物组织中能够在低氧条件和/或高浓度葡萄糖条件下产生NO的神经元或内皮细胞的NO产生的体内或体外方法，所述方法包括使所述神经元或内皮细胞暴露于可见光谱部分的电磁辐射。

22.  如前述任何一项权利要求所述的方法，其特征在于，用所述可见光谱部分的电磁辐射照射四肢。

23.  如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述四肢是脚或手。

24.  如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述四肢是下肢。

25.  如前述任何一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述辐射包括约500至625nm的波长。

26.  如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述辐射包括约550至625nm的波长。

27.  如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述辐射包括约575至600nm的波长。

28.  如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述辐射主要包括小于625nm的波长。

29.  如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述电磁辐射基本不含波长在625至750nm范围的辐射。

30.  如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述电磁辐射基本不含波长大于625nm的辐射。

31.  如权利要求25所述的方法，其特征在于，施加1-20焦耳/厘米²的辐射。

32.  如权利要求25所述的方法，其特征在于，以4-10,000Hz的频率调制或脉冲调制所述辐射。

33.  如前述任何一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述组织是中枢神经系统组织。

34.  如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述组织是脑组织或脊髓组织。

35.  如权利要求25所述的方法，其特征在于，照射所述组织的治疗时间为10秒至1小时。

36.  如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述治疗的频率选自每天一次或两次；每周1、2、3、4或5次，或者每月一次或两次。

37.  如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述暴露于可见光谱部分的电磁辐射是短期或长期的。

38.  如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述辐射的波长为550至625nm。

39.  如前述任何一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述辐射暴露的作用是细胞色素c氧化酶对该辐射的吸收介导的。

40.  如前述任何一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述辐射从内部或外部施用于所述组织或对象。

41.  一种预测和诊断组织或器官中血液循环不良或DPN的方法，所述方法包括测定所述血液或组织中的组织或血液NO、VEGF或蛋白质羰基化水平。

42.  如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述NO和VEGF水平表明在丧失感觉和疼痛之前的早期DPN。

43.  一种监测组织暴露于可见光谱部分的电磁辐射的反应的方法，所述方法包括测定所述组织中的血流，或测定所述血液或组织中的组织或血液NO、VEGF、蛋白质羰基化水平。

44.  如权利要求42所述的方法，还包括按照短期或长期监测调节对所述辐射的暴露。

45.  如前述任何一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述辐射的能量发射峰值出现在波长约500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610或620nm处或上述任一数值的10nm范围内。

46.  如前述任何一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述施加辐射的能量分布为波长500至625nm范围内的能量占80％。

47.  如前述任何一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述施加辐射的能量分布为波长500至625nm范围内的能量占90％。

48.  如权利要求34所述的方法，其特征在于，治疗患有神经变性的对象。

49.  如权利要求34所述的方法，其特征在于，治疗患有中风，脑缺血，多发性硬化，肌萎缩性侧索硬化，癫痫症，阿耳茨海默病，痴呆，CNS物理创伤，包括脑、脊髓、神经或视网膜的挤伤或压伤的对象。

50.  如前述任何一项权利要求所述的方法，其特征在于，也将NO调节剂给予所述对象。

用可见光调节低氧和疾病中线粒体的功能
相关申请
本申请要求2007年5月11日提交的美国临时专利申请序列号60/917,385和2007年12月7日提交的美国临时专利申请序列号61/012,300的优先权，通过引用将其全部内容纳入本文。
发明背景
据报道，使用发光二极管(LED)阵列或低能激光器进行光生物调节有各种治疗益处(Conlan等，1996；Sommer等，2001；Whelan等，2001；Yu等，1997；Delellis等，2005；Powell等，2004；Harkless等，2006；Powell等，2006)。这种非侵入性治疗已经用于加速伤口愈合、提高缺血的恢复速度、减缓受伤视神经的退化以及在各种类型的周围神经病，包括与糖尿病有关的神经病中提高敏感性和减少疼痛。
糖尿病是常见的代谢病，它正迅速成为世界流行的疾病(Lowell和Schulman，2005)。在美国，II型糖尿病是导致失明的主要原因。糖尿病性周围神经病是糖尿病最常见的长期存在的并发症之一(Pop-Busui等，2006)。它们是与糖尿病有关的疼痛的主要原因，常常导致下肢截肢。虽然有研究表明许多糖尿病性周围神经病患者对近红外辐射(NIR)治疗有反应(Delellis等，2004；Powell等，2004；Harkless等，2006；Powell等，2006)，但尚不明了光生物调节在治疗这些神经病中的治疗作用方式。
NIR对这些治疗有效。与可见光或紫外光相比，NIR光具有显著优势，因为它穿透组织的深度大于可见光，同时没有紫外光的致癌和诱变特性(Whelan等，2001，2002)。但我们对NIR治疗益处的细胞和分子机制知之甚少。然而，已经有几项研究揭示出，治疗性光生物调节的最有效波长是600至830nm(Karu，1999；Karu，2005)。
直到最近，才认为线粒体细胞色素c氧化酶只有一种酶活性：即将氧气还原成水。这一反应在常氧条件下进行，包括将4个电子和4个质子加入双原子氧分子。在这一过程中，通过一系列单个电子传递还原氧分子。加入氧分子的第一个电子产生超氧根(O₂^-)，第二个电子产生过氧化物(H₂O₂)，加入第三个电子产生氢氧根离子(OH^-)，第四个电子产生水。超氧根、过氧化氢和氢氧根离子是氧分子的不完全还原形式，总称为活性氧物质(ROS)。ROS通常螯合于全细胞色素c氧化酶分子的双核反应中心，并且不释放。然而，在一些病理条件下(Poyton，1999)，它们被释放并发挥破坏性作用(诱导氧化应激，一种在许多疾病以及衰老过程中起主要作用的事件)，或建设性作用(在胞内信号传导途径中(Poyton和McEwen，1996))。因为光可影响细胞色素c氧化酶的氧化状态(Winterrle和Einarsdottir，2006，Tachtsidis等，2007)，所以它也可能改变双核反应中心的构象并引起活性氧物质的释放。
现已明确，细胞处于低氧水平时，线粒体呼吸链和线粒体细胞色素c氧化酶可能对细胞生长、衰老和大量核基因的诱导有深远影响(Poyton和McEwen，1996；Castello等，2006；Ryan和Hoogenraad，2007)。这些影响是由线粒体和细胞核之间的信号传导途径导致的。虽然还不完全理解这些途径，但目前有越来越多的证据表明它们涉及到超氧根(O₂^-)、一氧化氮(NO)和过氧亚硝酸根(ONOO^-)(NO与O₂^-反应形成)的作用。NO和超氧根产生的过氧亚硝酸根能够影响蛋白质酪氨酸硝化，进而可改变参与线粒体-细胞核信号传导途径的具体蛋白质。
为了更好地理解通过光生物调节治疗疾病，需要鉴定疾病所影响的、随后经光治疗而改变的重要的可定量生物学标记物。本发明通过披露这类预测性生物学标记物，以及使用它们测定最适合光治疗的辐射波长从而满足了这些和其它需要。
发明概述
在各个方面，本发明涉及可见光电磁辐射在调节NO产生和降低低氧中活性氧物质的水平或产生中的应用。在其它方面，本发明涉及细胞色素c对可见光的吸收介导电磁辐射对线粒体的作用，用于调节线粒体功能的电磁辐射波长是被细胞色素c氧化酶优先吸收的波长。因此，在优选实施方式中，辐射的这种影响是由细胞色素c氧化酶的可见光吸收介导的。在其它实施方式中，电磁辐射(如可见光和近红外辐射)的这种影响是由辐射促进细胞色素c氧化酶磷酸化或转化成更容易产生NO的形式的能力介导的。
因此，在第一个方面，本发明提供一种治疗哺乳动物对象的组织低氧的方法，包括使所述哺乳动物的低氧组织暴露于电磁辐射。暴露于辐射能通过提高NO产生降低组织中的血管阻力，从而改善低氧状态组织的血流。因此，在一个实施方式中，本发明提供一种预防或修复低氧组织中的组织损伤的方法，包括使所述组织暴露于电磁辐射。在相关实施方式中，本发明提供提高暴光组织线粒体亚硝酸还原酶活性或NO产生的方法，包括使所述组织暴露于电磁辐射。在一些实施方式中，本发明提供通过细胞色素c亚硝酸还原酶活性调节哺乳动物组织中能够在低氧条件和/或高浓度葡萄糖条件下产生NO的神经元或内皮细胞的NO产生的体内或体外方法，所述方法包括使所述神经元或内皮细胞暴露于辐射。在另一实施方式中，本发明涉及电磁辐射与能够提高NO活性降低血管阻力的第二种药剂(如，亚硝酸盐、NO供体、硝基甘油、有机亚硝酸酯、精氨酸)的联合治疗。在上述优选实施方式中，辐射是在电磁辐射谱的可见光部分。
在第二个方面，本发明提供一种提高低氧组织中能量代谢的方法，包括使所述组织暴露于电磁辐射。暴露于电磁辐射改变了细胞色素C氧化酶或细胞色素c氧化酶的磷酸化，从而调节其亚硝酸还原酶活性。此外，暴露于电磁辐射导致线粒体蛋白质表达增加，引起组织中的线粒体生物发生增加。在一些相关实施方式中，本发明提供一种调节组织细胞中细胞色素c氧化酶介导的呼吸作用或调节组织细胞中细胞色素c氧化酶的磷酸化的方法，包括使所述组织暴露于电磁辐射。在一些实施方式中，组织中选自下组的一个或多个亚基的含量或表达增加：细胞色素c氧化酶、细胞色素c、细胞色素c还原酶或ATP合成酶的亚基。
在第三个方面，本发明提供一种降低哺乳动物组织中氧化应激或毒性应激的方法，包括使所述组织暴露于电磁辐射。在一些实施方式中，所述组织中诱导的氧化应激基因、脂质过氧化物水平、氧化的核苷和氧化的氨基酸或多肽中的一种或多种出现降低。在一些实施方式中，所述毒性应激是由于接触了代谢成活性氧物质或产生氧自由基的化学物质而造成的。
在第四个方面，本发明提供一种监测电磁辐射治疗对哺乳动物对象的影响的方法，所述方法包括使所述对象的组织暴露于电磁辐射，并测定该辐射对组织NO产生和NO诱生血管扩张剂的影响。
在第五个方面，本发明提供一种预测和/或诊断组织或器官中血液循环不良或糖尿病性周围神经病(DPN)的方法，所述方法包括测定组织或血液的NO、VEGF或蛋白质羰基化水平。在一些实施方式中，NO和VEGF水平表明在丧失感觉和疼痛之前的早期DPN。
在第六个方面，本发明提供一种治疗哺乳动物对象的糖尿病性周围神经病的方法，所述方法包括使患病组织暴露于电磁辐射。
在第七个方面，本发明提供一种监测组织暴露于电磁辐射的反应的方法，包括测定组织中的血流，或测定组织或血液的NO、VEGF或蛋白质羰基化水平。在一些实施方式中，该反应是按照上述第一至第六方面中任一方面所述方法的反应。
在一些方面，本发明提供降低组织中ROS的方法，包括使所述组织暴露于电磁辐射。
在一些方面，本发明提供改善对糖尿病患者的高血糖症或血糖水平的控制的方法，包括使所述对象暴露于电磁辐射。在一些方面，本发明提供治疗神经变性疾病或周围神经病的方法，包括使所述对象暴露于可见光辐射范围的电磁辐射。
在一些实施方式中，本发明提供治疗可能由低氧或氧化应激加重或引起的疾病或病症的方法。这类疾病或病症包括神经变性疾病如阿耳茨海默病，中风、非糖尿病性周围神经病和痴呆；黄斑变性；缺血/再灌注疾病；组织损伤；心血管病，包括动脉粥样硬化和高血压、糖尿病以及眼(如黄斑变性)、肾和神经(如糖尿病性周围神经病)的糖尿病并发症；炎症，关节炎，辐射损伤，衰老，烧伤/伤口愈合；脊椎/背部疾病如椎间盘突出；外周血管病和血管痉挛。在一些实施方式中，本发明也提供治疗肥胖的方法。
在上述各个方面和实施方式的一些实施方式中，所用的电磁辐射或光的波长是可见光辐射。因此，在这类实施方式中，所用的电磁辐射光的波长包括以下波长：约500-650nm、550-625nm、575nm-625nm、或500-600nm、550-600nm、575-600nm。在上述其它一些实施方式中，所用的电磁辐射的波长基本不含以下波长，大于595nm、600nm、610nm、615nm、625nm、630nm、650nm或675nm的波长。在另外一些实施方式中，施加的电磁辐射基本不含615-750nm范围、620-700nm范围、630-700nm范围、630-750nm范围、630-675nm范围、650和700nm范围或625-800nm范围的辐射。
在一些实施方式中，所用光的波长落入或主要由落入线粒体细胞色素C氧化酶的主要条带的波长构成。在一些实施方式中，所用光的波长落入能刺激细胞色素C氧化物产生NO的波长的条带内。在一些实施方式中，所述光或辐射特异性地靶向细胞色素c氧化酶的血红素吸收条带。在上述其它实施方式中，光波长不含或基本不含能抑制细胞色素c氧化酶产生NO的波长。可调整该光的时间和/或强度和/或强度，以适合个体对象或如本文所述的治疗目的。
在上述一些实施方式中，前提是哺乳动物对象未患糖尿病。在上述一些实施方式中，前提是该组织不是糖尿病组织或未受DPN影响。
上述方法可刺激治疗的组织中产生NO。因此，在上述内容的另一个方面，本发明还提供包括使用任何一种上述方法与某疗法的联合治疗，以调节对象的NO活性。该治疗可包括给予NO供体和能调节对象的NO水平的其他化合物(NO合成酶底物、NO降解途径抑制剂)。
附图简要说明
图1.高血糖症、低氧、血管收缩和光生物调节之间关系的模型。该模型的元素如下：(1)糖尿病患者的血糖水平升高促进内皮细胞的需氧发酵反应，进而促进低氧。(2)在低氧条件下，活性氧物质，特别是超氧根水平提高。(3)此种超氧根与血液中的NO发生反应，产生过氧亚硝酸根。(4)由血液NO产生过氧亚硝酸根能有效降低血液中NO的浓度，并导致蛋白质硝化(5)由于NO是血管扩张药，所以血液中NO水平降低导致血管(特别是微血管)收缩。
图2.50瓦氙/卤素泛光灯(FE公司(Feit Electric Co.))的发射光谱。
图3.在酵母细胞中测试亚硝酸盐依赖性一氧化氮产生的两种实验条件。
图4.光刺激导致的亚硝酸盐依赖性NO产生。
图5.在酵母细胞中比较光强和呼吸链对光刺激的一氧化氮产生的影响。
图6.在酵母细胞中晚期光刺激的一氧化氮产生的功率依赖性。
图7.在晚期一氧化氮产生的总体速率与波长的关系。
发明详述
本发明涉及可见光谱部分的电磁辐射在调节暴露于该电磁辐射的组织中细胞色素c氧化酶、细胞色素c氧化酶磷酸化，更具体地调节线粒体产生NO的能力，以及此种NO调节组织循环的能力中的应用。线粒体，更具体说，细胞色素c氧化酶是细胞能量产生的主要控制点(Poyton，1988)。因此，TER调节细胞色素c氧化酶和线粒体功能也可产生信号分子，为低氧组织中的细胞和组织功能提供立竿见影的益处。此外，可见光谱部分的电磁辐射可用于调节低氧组织中的细胞活力或增殖能力，并保护细胞和组织免受低氧伤害。前面的作用应该对细胞和组织生理产生立竿见影的短期影响，而预计后面的作用是更长期的影响。
术语“调节”指降低或提高。调节性刺激在应用过程中可以有动态变化(随时间变化)或保持恒定。线粒体功能的可见光调节见图1。调节可以是治疗性的，导致治疗(如，改善、减轻(降低发病频率或严重性)或预防(如，延迟发病或不发生)所述的不良病症或所述不良病症的征候、症状或不利后果。就特定病症而言，调节可以是改善组织或对象的健康。
许多前述研究集中于正常氧压条件下光对线粒体的作用。这些研究的结果表明，近红外辐射特别适合保护线粒体功能。本发明涉及以下令人惊讶的发现：1)缺氧线粒体也能以亚硝酸作为电子受体产生ATP，；2)可见光谱部分的光促进线粒体在这些条件下产生NO；和3)促进正常氧压下线粒体中ATP功能的NIR光实际上抑制了线粒体产生NO的能力。由于NO是一种强效的血管扩张剂，所以NO产生的开关有利于帮助恢复低氧或缺氧组织的血流和正常氧压。因此，申请人的发现提供治疗因NO产生增加或血流增强而获益的许多病症的新方法。
更具体说，本发明涉及申请人的以下发现，波长范围在550至625nm的可见光对缺氧条件下的线粒体功能有益，波长范围约625nm至750nm的光抑制此种疗效。因此，本发明提供改善氧气减少的条件下线粒体功能的方法，包括向靶组织施加波长约为550nm至625nm的单色或多色光，该光基本不含较长波长的电磁辐射或不含波长约为630nm至700nm的辐射。
因此，在一个方面，本发明提供治疗哺乳动物对象组织中低氧的方法，所述方法包括使所述哺乳动物的低氧组织暴露于可见光形式的电磁辐射。在一些实施方式中，通过测定患病组织的血流评估对该治疗的反应。在其它方面，监测NO或NO诱生血管扩张剂或VEGF的血液或组织水平以评估对该治疗的反应。在优选实施方式中，辐射增加了暴光组织的线粒体的NO产生，暴光组织中的血流也增加。在其它实施方式中，通过暴光提高暴光组织中的线粒体氧效率。在一些实施方式中，低氧是由四肢循环不足造成的。在示范性实施方式中，组织是糖尿病患病对象的组织。在其它实施方式中，相对于正常血糖对照患者，该治疗缓解了糖尿病或非糖尿病患者的周围神经病的征候或症状。在上述一些实施方式中，该治疗缓解四肢(如脚或手)的感觉障碍(如针刺感、麻木、灼热或其它不良感觉)。
在另一方面，本发明提供一种治疗哺乳动物对象的糖尿病性周围神经病的方法，包括使所述对象的患病组织暴露于可见光谱部分的电磁辐射。在又一方面，本发明提供一种改善低氧组织中能量代谢的方法，包括使所述组织暴露于此种辐射。在又一方面，本发明提供一种降低哺乳动物组织中的氧化应激的方法，包括使所述组织暴露于可见光谱部分的电磁辐射。在上述一些实施方式中，所述组织中诱导的氧化应激基因、脂质过氧化物水平、氧化的核苷和氧化的氨基酸或多肽中的一种或多种出现降低。
在另一方面，本发明提供一种调节组织细胞中细胞色素c氧化酶介导的呼吸作用或调节组织细胞中细胞色素c氧化酶的磷酸化的方法，包括使所述组织暴露于可见光谱部分的电磁辐射。在另一方面，本发明提供一种调节组织中的线粒体功能的方法，所述方法包括使所述组织暴露于可见光谱部分的电磁辐射。
在上述一些实施方式中，还有一些实施方式是调节提高了线粒体亚硝酸还原酶活性、暴光组织中的NO产生或线粒体生物发生，包括例如线粒体蛋白质的含量或表达。在另外一些实施方式中，选自下组的一个或多个亚基的含量或表达增加：细胞色素c氧化酶、细胞色素c、细胞色素c还原酶或ATP合成酶的亚基。在上述一些实施方式中，所述辐射是可见光或近红外辐射。
在其它方面，本发明提供一种监测可见光谱部分电磁辐射的治疗对哺乳动物对象的影响的方法，包括使所述对象的组织暴露于所述辐射，并测定所述辐射对组织中NO产生以及NO诱生血管扩张剂的影响。在另一方面，本发明提供通过细胞色素c亚硝酸还原酶活性，调节能够在低氧条件和/或高浓度葡萄糖条件下产生NO的哺乳动物组织细胞(如神经元或内皮细胞)的NO产生的体内或体外方法，所述方法包括使所述神经元或内皮细胞暴露于可见光辐射。在这些实施方式中，可治疗神经变性病症。在一些实施方式中，本发明提供提高患阿耳茨海默病或处于患阿耳茨海默病风险中的人的脑组织中NO产生和血流的方法。因此，在一些实施方式中，本发明提供一种降低斑块形成的方法，包括降低这些患者中的APP加工。在其它实施方式中，本发明提供提高或改善对象的认知功能的方法。
在任何上述方面和实施方式中，其它实施方式是用可见光谱的电磁辐射照射四肢。例如，在一些实施方式中，四肢是脚或手，或下肢。另外，在上述任何实施方式中，存在所述组织可以是中枢神经系统的组织的实施方式。在一些实施方式中，所述组织是脑组织或脊髓组织。
术语“可见光谱部分的电磁辐射”包括波长约为500-650nm、550-625nm、575nm-625nm、或500-600nm、550-600nm和575-600nm的光。在一些实施方式中，所用电磁辐射的波长基本不含以下波长：大于600nm、610nm、615nm 625nm、630nm、650nm或675nm的波长。在另外一些实施方式中，电磁辐射基本不含抑制性光波长的辐射，或者基本不含615-750nm范围、620-700nm范围、630-700nm范围、630-750nm范围、630-675nm范围、650和700nm范围或625-800nm范围的辐射。“基本不含”某些波长的光是其总能量的一小部分(如少于25％、20％、15％、10％、5％或1％)在特定波长或按照刺激缺氧条件下NO产生测定，在治疗范围(如550nm至625nm)内的光能比例是抑制治疗性光对线粒体作用的波长(如抑制性波长)的至少3倍、4倍、5倍或10倍的光。在一些实施方式中，所述辐射特异性靶向细胞色素c氧化酶的血红素吸收条带。
在一些实施方式中，所用波长的电磁辐射主要由落入上述波长范围的多色光组成。“主要由...组成”指施加光能的至少70％、80％、90％或95％落入上述波长范围。在一些实施方式中，所述单色或多色电磁辐射基本不含波长在615-750nm范围、620-700nm范围、630-700nm范围、630-750nm范围、630-675nm范围、650和700nm范围、或625-800nm范围的辐射。在其它实施方式中，所述方法采用滤光片从多色光源中去除波长625至700nm的一种或多种光波长，然后将来自该光源的辐射施用于皮肤。在上述其它实施方式中，每次治疗施加的可见光谱部分电磁辐射的水平约为0.5-40、1-20或2-10焦耳/厘米²。在一些实施方式中，调节该辐射以提供脉冲频率为4至10,000Hz的光脉冲。
在上述各个方面和实施方式的一些实施方式中，可见光波长的透射光谱峰值在约500至650nm、550至625nm、575nm至约625nm、或500至600nm、550至600nm、575至600nm、590至610nm、或595至605nm处。在一些其它实施方式中，该光的带宽为约10、20、30、40或50nm。在其它实施方式中，所用波长的电磁辐射主要由上述波长范围内的一种或多种单色光源组成。在其它实施方式中，施加的光的透射光谱峰值可以在约590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610nm处，带宽约为5、10或20nm或者小于5、10或20nm。
任何上述实施方式中的光源可以是氙-卤素灯泡、LED或激光二极管。
如本领域普通技术人员所了解，可调节可见光谱部分的电磁辐射的剂量方案以适合个体对象。应为每个对象和/或组织单独确定治疗的时间和强度。例如，可按照病症的严重程度、患者的反应性和/或暴光点皮肤的厚度和颜色确定辐射的频率、时间和强度。在上述方面的一些实施方式中，照射组织的治疗时间为10秒至1小时。在一些实施方式中，所述治疗每天给予一次或两次；每周给予1、2、3、4或5次，或者每月一次或两次。在一些实施方式中，给予一次或数次治疗，以治疗急性病症。在其它实施方式中，长期给予治疗(持续数月至数年)。在其它实施方式中，所述治疗可以是间歇性和/或按需给予的治疗，以缓解所治病症的征候和症状。因此，治疗时间可以是短期或长期。此外，辐射可以从内部(如通过玻璃光纤)或外部施用于组织或对象。可见光谱部分的电磁辐射优选不伴有辐射能量所引起的显著组织发热。在一些实施方式中，该辐射局部施用或施用于患病组织附近，或施用于距患病组织一定距离处，以促进释放NO作用于未接触施加光部位的靶组织。
另一方面，本发明提供一种预测和诊断组织或器官中血液循环不良或DPN的方法，包括测定组织或血液NO、VEGF或蛋白质羰基化水平。在一些实施方式中，NO和VEGF水平可表明在丧失感觉和疼痛之前的早期DPN。
在另一方面，本发明提供一种监测组织暴露于可见光谱部分的电磁辐射的反应的方法，包括测定组织中的血流，或测定组织或血液中的组织或血液NO、VEGF、蛋白质羰基化、硝化或亚硝化(nitroslylation)水平。在一些实施方式中，可利用这个方面评估按照本发明任何其它方面和实施方式暴露于所述辐射后组织或对象的反应。因此，在一些实施方式中，利用监测来调整组织或对象的短期或长期辐射治疗方案。
一方面，本发明提供可见光谱部分的电磁辐射在糖尿病性周围神经病的治疗性光调节中的应用。认为高血糖症和内皮炎症会促进一系列事件，这一系列事件影响可能诱导DPN的血管结构。几项近期的研究提出，活性氧物质可能在许多这些过程中起到关键作用，血管收缩、四肢血流减少、高血糖症、神经内缺氧、硝化应激(nitrosative stress)和氧化应激可能都对糖尿病相关性周围神经病起到一定作用(Pop-Busai等，2006)。提供本发明所用的可见光谱部分的电磁辐射的方法和设备(参见美国专利申请序列号11/331490，与本申请转让给同一受让人，通过引用将其全文，特别是这种方法和设备纳入本文)以及鉴定组织低氧、血液循环不良、高血糖症、周围神经病和II型糖尿病的方法是本领域普通技术人员众所周知的。在一些实施方式中，考虑将发光二极管(LED)阵列或低能激光器用作辐射源。因此，所施加的辐射可以是相干的或非相干的。
定义
应注意到，本说明书和所附权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”和“这种”包括复数含义，除非另有明确说明。例如，术语“一个”(或“一种”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可以互换使用。
术语“调节”指降低或提高。这种调节性刺激在应用过程中可以有动态变化(随时间变化)或保持恒定。线粒体功能的可见光调节见图1。这种调节可以是治疗性的，导致治疗(如，改善、减轻(降低发病频率或严重性)或预防(如，延迟发病或不发生)所述的不良病症或所述不良病症的征候、症状或不利后果。就特定病症而言，调节可以是改善组织或对象的健康。
术语“可见光谱部分的电磁辐射”包括波长约为500-650nm、550-625nm、575nm-625nm、或500-600nm、550-600nm和575-600nm的光。在一些实施方式中，所用电磁辐射的波长基本不含以下波长：大于600nm、610nm、615nm 625nm、630nm、650nm或675nm的波长。在另外一些实施方式中，电磁辐射基本不含抑制性光波长的辐射，或者基本不含615-750nm范围、620-700nm范围、630-700nm范围、630-750nm范围、630-675nm范围、650和700nm范围或625-800nm范围的辐射。“基本不含”某些波长的光是其总能量的一小部分(如少于25％、20％、15％、10％、5％或1％)在特定或按照刺激缺氧条件下NO产生测定，在治疗范围(如550nm至625nm)内的光能比例是抑制治疗性光对线粒体作用的波长(如抑制性波长)的至少3倍、4倍、5倍或10倍的光。
此外，每次治疗施加的治疗性辐射水平可以是约0.5-40、1-20或2-10焦耳/厘米²。可调节辐射以提供脉冲频率为4至10,000Hz的辐射脉冲。例如，在一些实施方式中，每次治疗期间施加的可见光辐射强度为0.5至40焦耳，频率调整范围是4至10,000Hz。该治疗可以持续不同时间(例如，1-5分钟，至1小时或更长时间)。例如，治疗可持续5-10分钟、5-20分钟或20-40分钟。
因此，用于施加光的光源优选产生可见光范围的光。在上述各个方面和实施方式的一些实施方式中，所用电磁辐射光的波长包括约500至650nm、550至625nm、575nm至约625nm、或500至600nm、550至600nm、575至600nm的波长。在一些实施方式中，所用电磁辐射的波长基本不含以下波长：大于600nm、610nm、615nm 625nm、630nm、650nm或675nm的波长。在一些实施方式中，电磁辐射基本不含615-750nm范围、620-700nm范围、630-700nm范围、630-750nm范围、630-675nm范围、650和700nm范围或625-800nm范围的辐射。
在某些实施方式中，光源包括各自提供相干光的一个或多个激光二极管。在光源光是相干光的实施方式中，由于光的相干干涉，发出的光可能产生“散斑”。这种散斑包括相长干涉产生的强尖峰，并且可能在所治疗靶组织的附近出现。例如，虽然平均功率密度可能约为10mW/cm²，但所治疗脑组织附近的一个这类强尖峰的功率密度可能约为300mW/cm²。在某些实施方式中，在照射较深组织时，与使用非相干光相比，这种散斑造成的功率密度提高可提高使用相干光进行治疗的疗效。
在其它实施方式中，光源提供非相干光。非相干光光源的例子包括但不限于：白炽灯或发光二极管。可将散热器与光源(相干或非相干光源)一起使用，以去除光源产生的热量和抑制头皮温度升高。在某些实施方式中，光源产生基本为单色的光(即具有单一波长的光或具有狭窄波长带宽的光)。
在上述其它实施方式中，光源产生或提供具有多个波长的光，限制条件是：该光基本不含波长范围是650至750nm的光。在一些实施方式中，使用一个或多个滤光片去除波长落入625和750nm之间的那部分光。
光源发射的光能量能够足以在皮下靶组织(如，深度约为硬脑膜下2厘米)实现预定的功率密度。目前相信，以功率密度至少约0.01mW/cm²、至多约1W/cm²照射靶组织时对组织的光治疗最有效。在各种实施方式中，根据所需的临床性能，表面下功率密度分别为至少约0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80或90mW/cm²。在某些实施方式中，表面下功率密度优选为约0.01mW/cm²至约100mW/cm²，更优选约0.01mW/cm²至约50mW/cm²，最优选约2mW/cm²至约20mW/cm²。据信，这些表面下功率密度能特别有效地对所治疗组织产生所需的生物刺激作用。考虑到随着光从皮肤表面穿过机体组织、骨骼和液体深入皮下靶组织时能量衰减，一般优选使用约为10mW/cm²至10W/cm²，更优选约为100mW/cm²至500mW/cm²的表面功率密度，以便在皮下靶组织获得所选的功率密度。为了达到所述表面功率密度，光源优选能够发出总功率输出为至少约25mW至100W的光能。在各种实施方式中，限制总功率输出分别不超过约30、50、75、100、150、200、250、300、400或500mW。在某些实施方式中，光源包括多个联合使用的光源，以提供这种总功率输出。优选的是，光源的实际功率输出可控且可变。以此方式，可按照所治疗皮下组织处的所选功率密度调节发射光能的功率。
某些实施方式利用只包含一个激光二极管的光源，能够在皮肤表面提供约10、20、25、30、40或50mW至约100W的总功率输出。在某些这类实施方式中，激光二极管可通过光纤以光学方法偶联于头皮，或者可经构造提供足够大小的光斑以避免其功率密度可能灼伤或损伤皮肤。在其它实施方式中，光源利用排列成网格或阵列的多个源(如激光二极管)，能够在皮肤表面上共同提供至少10、20、25、30、40或50mW至约100W总功率输出。其它实施方式的光源也可包括功率容量在这些限度以外的源。
在某些实施方式中，光源产生个体直视时会引起眼损伤的光。在这类实施方式中，可构造能提供眼保护作用从而避免个体直视该光的光源设备。例如，可以适当的安置不透明材料，以防止直视该光。此外，可提供联锁装置，以使光源设备不被激活，除非保护元件就位或者采取了其它合适的安全措施。
在其它实施方式中，递送光能的治疗设备包括手持式探测器。
在某些实施方式中，光的施用可通过可编程控制器控制，该控制器包括逻辑电路、偶联于该逻辑电路的时钟和偶联于该逻辑电路的界面。某些实施方式的时钟向逻辑电路提供时间信号，以便让逻辑电路监测和控制施加光的时间间隔。时间间隔的例子包括但不限于：总治疗时间、施加光脉冲的脉冲宽度时间和施加光脉冲之间的时间间隔。在某些实施方式中，可选择性地打开和关闭光源，以降低皮肤上的热负荷和将所选功率密度递送至脑的特定区域或其它靶组织/器官。
在一些实施方式中，施加光源受偶联于界面的逻辑电路的控制。该界面可包括用户界面或监测至少一种治疗参数的传感器界面。在某些这类实施方式中，可编程控制器对传感器的信号作出反应，优选调节治疗参数来优化所测定的反应。因此，可编程控制器可对各种治疗参数进行闭环监测和调节，以优化光治疗效果。用户界面提供的信号表明的参数包括但不限于：患者特征(如皮肤类型、脂肪百分数)、所选的施加功率密度、目标时间间隔和施加光的功率密度/时间概况。
在某些实施方式中，将逻辑电路偶联于光源驱动器。该光源驱动器偶联于电源，在某些实施方式中包括电池，在其它实施方式中包括交流电源。该光源驱动器也偶联于光源。逻辑电路对时钟的信号和用户界面的用户输入产生反应，以将控制信号传送给光源驱动器。在对逻辑电路的控制信号的反应中，光源驱动器可调节和控制施加于光源的功率。
在某些实施方式中，逻辑电路对监测至少一个治疗参数的传感器信号产生反应，以控制施加的光。例如，某些实施方式包括热偶联于皮肤的温度传感器，以便将有关皮肤温度的信息提供给逻辑电路。在这类实施方式中，逻辑电路对来自温度传感器的信息产生反应，将控制信号传送给光源驱动器，以便调节施加光的参数，从而维持头皮温度低于预定水平。其它实施方式包括示范性生物医学传感器，其包括但不限于：血流传感器、血液气体(如氧合)传感器、NO产生传感器或细胞活性传感器。这类生物医学传感器可将实时反馈信息提供给逻辑电路。在某些这类实施方式中，逻辑电路对传感器信号产生反应，优选调节施加光的参数，以优化所测定的反应。因此，逻辑电路可对各种施加光的参数进行闭环监测和调节，以优化光治疗效果。
用所选波长进行光治疗的优选方法是基于以下认识：递送至组织的光能功率密度(光强或单位面积上的功率，W/cm²)或能量密度(单位面积上的能量，J/cm²，或功率密度乘以暴露时间)是决定光治疗相对功效的重要因素。
在某些实施方式中，可调节光源照射对象皮肤或头皮的不同部分，从而靶向其下方的脑组织，例如发生病变或神经变性的脑组织。
本文所用术语“神经变性”指原发破坏事件如中风或CVA以及由于出现原发破坏事件细胞导致的继发性延迟和进行性破坏机制引起细胞损伤或功能丧失的过程。原发破坏事件包括疾病发展过程或物理损伤或伤害，包括中风，也包括其它疾病和病症如多发性硬化、肌萎缩侧索硬化、癫痫症、阿耳茨海默病、其它原因如AIDS导致的痴呆、脑缺血包括病灶性脑缺血和CNS物理创伤如挤伤或压伤，包括脑、脊髓、神经或视网膜的挤伤或压伤，或者产生神经变性的任何急性损伤或伤害。在一些实施方式中，可利用本发明方法治疗亨廷顿病；帕金森病；家族性帕金森病；阿尔茨海默病；家族性阿尔茨海默病；肌萎缩侧索硬化；偶发性肌萎缩侧索硬化；伴有乳酸酸中毒和中风样发作的线粒体脑肌病；红肌纤维粗糙的肌阵挛性癫痫症；卡恩斯-塞尔综合征；进行性外眼肌麻痹；利伯遗传性视神经病(LHON)；利氏综合征(Leigh syndrome)；弗里德赖希共济失调，和细胞色素c氧化酶(CCO)缺乏状态。
本文所用术语“神经保护”指减缓或防止原发破坏事件后由于神经变性造成神经元或CNS功能的不可逆丧失，无论所述神经变性丧失是由于原发破坏事件相关的发病机理或由于继发性破坏机制所致。
此外，炎症和氧化应激是许多慢性神经变性病症，包括阿耳茨海默病发病中的重要因素。该疾病的特征是神经纤维缠结和老年斑的蓄积，以及脑神经元的广泛进行性变性。老年斑中富含淀粉样前体蛋白(APP)，它由位于21号染色体上的APP基因编码。AD的发病可能由APP的异常蛋白水解切割介导，这种异常蛋白水解切割导致对神经元有毒的β-淀粉样肽在胞外过度蓄积(Selkoe等，(1996)，J.Biol.Chem.271：487-498；Quinn等，(2001)，Exp.Neurol.168：203-212；Mattson等，(1997)，Alzheimer′s Dis.Rev.12：1-14；Fakuyama等，(1994)，Brain Res.269-272)。评估神经保护的方法是本领域众所周知的(参见例如，美国专利公开号20080107603和美国专利号6,803,233，通过引用全文纳入本文)。光依赖性CCO NO产生的有益后果是亚硝化和随后的γ分泌酶活性下调。γ分泌酶活性降低进而降低了有害β淀粉样肽的产生。
因此，在一些实施方式中，本发明的一个目的是提供可改善阿尔茨海默型痴呆、脑血管痴呆和老年性痴呆中的学习和/或记忆力损伤或认知损伤的痴呆症治疗。
在一些实施方式中，本发明提供一种治疗患有与线粒体功能受损有关的疾病的对象的方法。通常，该方法包括在有效改善线粒体功能的条件下将本发明光治疗给予这个对象。本发明的这种方法尤其可用于治疗或预防与线粒体功能受损有关的疾病。可按照本发明方法治疗的疾病通常包括特征是氧化代谢水平降低的病症或疾病。这些疾病可能由遗传因素、环境因素或二者引起。更具体说，这类疾病包括神经系统的病症或疾病(如，神经变性、精神病等)，身体其它部分的病症或疾病，以及机体全身的病症或疾病。这类神经系统的病症或疾病不仅包括阿耳茨海默病、帕金森病、亨廷顿病，而且包括脊髓小脑性共济失调和与氧化代谢异常有关的精神病(包括抑郁症或精神分裂症)。机体其他部分的示范性病症或疾病包括心血管病(如，动脉粥样硬化和心血管病，包括心肌梗塞、心绞痛、心肌病、心脏瓣膜病以及引起心力衰竭的其他病症或失调)，氧化代谢异常的骨骼肌病和氧化代谢异常的非神经组织的病症或失调，如常常与代谢改变有关的老年综合征——虚弱(frailty)。
许多神经系统的病症或疾病(如AD和上述疾病)的特征是脑代谢不足，它表现为脑功能受损如痴呆。因此，本发明另—方面涉及一种改善脑代谢不足的对象的脑功能的方法。通常，在有效改善脑细胞代谢的条件下将本发明药物组合物给予脑代谢受损的对象。通过改善脑细胞代谢，显著改善对象的脑功能。
术语“治疗”指包括施用对特定疾病或病症有利的药剂的治疗方法。例如，本发明光治疗可用于减缓疾病或病症的进展或发病，和/或减轻所述疾病或病症的征候和/或症状或身体表现。药剂的治疗有效量指足以治疗疾病或病症的药剂(如辐射或药物)的用量或剂量。本领域已知许多用于确定神经保护剂的功效的模型系统。这类模型系统可用于评估本发明治疗的功效。例如，可利用本领域普通技术人员已知的行为评估法测试人或动物的认知损伤。在测试动物中，利用Y-迷宫设备进行的空间记忆测试可用于测试动物进入新臂，避免刚刚进入的臂的行为特性(交替行为)。(参见Itoh，J.，等(Eur.J.Pharmacol.，236，341-345(1993))。或者或此外，可利用监测细胞死亡、神经纤维缠结或老年斑蓄积的组织病理方法评估神经变性的程度。
神经保护有效量的光能能实现以下目的：逆转、预防、避免、减轻或消除神经变性。
在某些实施方式中，“神经保护”包括将治疗设备与患者头皮相接触或放置在患者脑的目标区域附近治疗患者(如阿耳茨海默病)。患者脑的目标区域可以是事先用(例如)标准医学成像技术鉴定的。在某些实施方式中，治疗还包括计算头皮上的表面功率密度，其对应于患者脑目标区域的预先选择的功率密度。某些实施方式的计算包括影响光能穿透，从而影响目标区域的功率密度的因素。这些因素包括但不限于：患者头骨的厚度、头发类型和发色、皮肤颜色和色素沉着、患者年龄、患者性别和距脑内目标区域的距离。然后，按照计算结果调整施加光的功率密度和其他参数。
施加于患者脑目标区的功率密度的选择取决于许多因素，包括但不限于：施加光的波长、病变的位置和严重程度以及患者的临床状况，包括患病脑区域的范围。也可调节递送至患者脑的目标区域的光能的功率密度，以便与任何其他一种或多种治疗剂，特别是神经保护药联用，以实现所需的生物学效应。在这类实施方式中，所选的功率密度也可取决于所选的其他一种或多种治疗剂。
在优选实施方式中，该治疗持续进行约10秒至2小时，更优选约1至10分钟，最优选约2至5分钟。在其它实施方式中，优选在至少一个治疗期递送光能至少约5分钟，更优选在至少一个治疗期递送光能至少10分钟。在治疗期内可脉冲递送光能，或者可在治疗期内连续递送光能。
在某些实施方式中，可以在一个治疗期后终止治疗，而在其它实施方式中，可重复治疗至少两个治疗期。后续治疗期之间的间隔时间优选为至少约5分钟，更优选至少约1-2天，最优选至少约1周。治疗时间的长度和治疗期的频率可取决于若干因素，包括治疗中患者的功能恢复或反应。
在需要治疗的患者中进行神经保护治疗的方法包括将神经保护有效量的波长在可见光范围的光能递送至患者脑的目标区域。在某些实施方式中，患者脑的目标区域包括斑块蓄积或缺血的区域，即“危险区”内的神经元。在其它实施方式中，所述目标区域包括不在危险区内的脑的部分。不受理论限制，认为对危险区附近的健康组织进行辐射能增加被辐射组织的NO产生，从而改善邻近低氧组织，包括损伤组织中的血流。
适用于按照本发明将光施加于脑的设备和方法参见美国专利申请公开号2006/0253177，通过引用将其纳入本文。
在某些实施方式中，一种方法在已经发生脑缺血事件的患者中提供神经保护作用。该方法包括鉴定已发生脑缺血事件的患者。该方法还包括估计发生缺血事件的时间。该方法还包括着手将神经保护有效量的光能给予脑或脑的患病区域和/或其相邻区域。在发生缺血后不少于约2小时，开始给予光能。在某些实施方式中，优选在缺血事件发生后24小时内，更优选在缺血事件后不早于约2小时，更优选在缺血事件后不早于约3小时，最优选在缺血事件后不早于约5小时进行有效的光治疗。在某些实施方式中，可根据缺血事件发生后逝去的时间来改变一种或多种治疗参数。
本发明也提供一种治疗阿耳茨海默病的方法(如，减缓病症的进展或发病，或减轻该疾病的征候和/或症状或身体表现)。有很多证据表明，流如脑的血液氧合程度较低可导致与阿耳茨海默病有关的蛋白质斑块的蓄积(build-up)。也报道在阿耳茨海默病患者中，线粒体功能，包括具体的细胞色素c-氧化酶活性有所改变。我们已经证明，在低氧条件下，可见光可激活细胞色素c，以产生强效血管扩张剂一氧化氮。血管舒张可增加细胞可获得的氧气量，并直接改善这些患者的线粒体功能。因此，在一个方面，本发明提供阿耳茨海默病的光治疗。
在治疗脑的上述一些实施方式中，通过从头的侧面施加可见光使颈外动脉和/或椎动脉暴露于光照。从侧面到这些结构的距离最短。将治疗头或光源直接放置在耳下或颚骨后将为这些结构施加辐射能量提供最直接的通道。在其它实施方式中，通过从头骨背后或头骨侧面施加光治疗椎动脉。
在治疗脑的一些实施方式中，可将治疗头施加于耳下或恰好在颚骨后(见图9)。由于穿过的软组织较少，这将使脑供血血管受辐射面积最大(maze)。这表明直径约2”英寸的治疗头即可覆盖这两种结构。可采用其他治疗头，包括直径为0.5-4英寸的治疗头。治疗头不一定是圆形，但可构造成能够较密切地跟踪目标动脉的位置的形状。在一些实施方式中，治疗头的应用表面积可以是约1或2平方英寸至4、8或10平方英寸。在一些实施方式中，该治疗可施加于身体的一侧或两侧。
在一些实施方式中，可通过以下方法评估该治疗对阿耳茨海默病的作用：评估该治疗本身对疾病进展的作用，或间接地监测疾病进展或发病的生物学标记(如APP和APP产物，γ分泌酶(包括但不限于具体的早老蛋白亚基)水平；线粒体CCO亚基IV(哺乳动物，V酵母)同种型))。(参见Schon等，J.Clin.Invest.111(3)：303-312(2003))。
实施例1：低氧条件下呼吸链在内皮细胞NO产生中的作用。
目前，NO合成有两种已知途径。第一种途径涉及一氧化氮合酶(NOS)，这种酶在NADPH和氧存在下将精氨酸转变为瓜氨酸。一氧化氮合酶(NOS)有三种同种型。它们称为NOS I(神经元NOS)、NOS II(诱导性NOS)和NOS III(内皮NOS)。NO产生的第二种途径包括线粒体呼吸链的亚硝酸盐依赖性NO产生。这种途径只在氧浓度降低时有活性。
在可见光治疗之前和之后评估内皮细胞中NOS-依赖性和NOS-非依赖性NO合成的相对重要性。在生理浓度的亚硝酸盐存在下，在接触低氧条件的细胞中评估NO的产生。在以下物质存在下评估呼吸链在这一过程中的作用：a)L-NAME，总NOS抑制剂，b)呼吸链抑制剂，c)线粒体膜电位扰乱剂，d)线粒体复合物IV的抑制剂，e)组成型NOS抑制剂和e)茶碱。
实施例2.内皮或细胞的NO产生
如他处所述分离和培养内皮细胞(Wang等，2007；Wang等，2004)。在INVIVO工作站(拜特斯公司(Biotrace))或Coy实验室手套箱中建立低氧(1.5％O₂，93.5％N₂，5％CO²)或缺氧(5％CO₂，4％H₂，91％N₂)条件，用合适的混合气体预平衡。所有细胞提取物均在工作站或手套箱中制备，以避免再氧合。将细胞维持在缺氧或低氧条件下不同时间(2-8小时)。用荧光一氧化氮指示剂DAF-FM(加州分子探针公司(Molecular Probes，CA))评估一氧化氮的产生。营养培养基补充有20μM N_aNO₂。在以下物质存在下评估呼吸链在亚硝酸盐依赖性NO产生中的作用：a)复合物III的抑制剂抗霉素A(10μM)、粘噻唑(myxothiazol)(10μM)和氰化物(1mM)；b)线粒体膜电位扰乱剂FCCP(10μM)和二硝基酚(100μM)c)线粒体复合物V的抑制剂寡霉素10μM，和d)L-NAME，组成型NOS抑制剂L-NAME(1mM)。
实施例3：线粒体功能和NO产生。
分离来自正常和低氧细胞的线粒体，并用以前所述的方法(Castello等，2006)评估呼吸控制、低氧条件下亚硝酸盐依赖性NO产生以及用ATP和茶碱培育后亚硝酸盐依赖性NO产生。
实施例4：通过可见光刺激细胞色素c氧化酶的亚硝酸还原酶活性和亚基磷酸化
可以用分离得到的线粒体和纯化的细胞色素c氧化酶评价可见光对细胞色素c氧化酶的亚硝酸还原酶活性的影响。
亚硝酸盐依赖性NO产生。最初，用NO计或荧光探针DAF-FM(加州的分子探针公司)检测分离线粒体中的NO水平。如前所述(Castello等，2006)，用特异性呼吸抑制剂处理暴露于可见光的线粒体，以便将NO产生定位于细胞色素c氧化酶。观察到可见光刺激线粒体中NO的产生。
下一步研究可见光对于从哺乳动物和酵母纯化分离的细胞色素c氧化酶的亚硝酸盐依赖性NO产生的影响。
细胞色素c氧化酶亚基的磷酸化.在免疫沉淀、凝胶电泳和免疫印迹后分析COX的Tyr-磷酸化(Lee等，2005)。
实施例5.可见光对内皮和酵母细胞中氧化应激和/或线粒体生物发生的胞内水平的影响
这些研究检测了可见光暴露对培养的内皮和酵母细胞的长期影响。具体说，发现可见光暴露能增加新线粒体的产生并提高细胞呼吸代谢。通过评估可见光对细胞呼吸和线粒体蛋白质，包括细胞色素c氧化酶诸亚基胞内水平的影响证明该结果。细胞呼吸率提高导致线粒体呼吸链产生的ROS减少。评估可见光对细胞呼吸、氧化应激和线粒体生物发生(即新线粒体的合成)的影响。通过改变暴光所用可见光辐射的波长，鉴定对治疗低氧而言最有效的波长。
实施例6.线粒体的过氧化氢产生。
评估可见光对细胞氧化应激影响的一种方式是测定呼吸链产生的ROS。可以用分离的线粒体和连接于W.P.I.放大器的过氧化氢电极进行这种检测。
测定蛋白质羰基化.通常，利用三类实验评估细胞氧化应激。第一类利用荧光染料(例如荧光素或罗丹明的衍生物)来评估胞内ROS水平。第二类通过测定脂类过氧化物(如丙醛和羟基烯醛(hydroxyalkenals))、氧化的核苷(如8-羟基-2’-脱氧鸟苷(8OH2gG)或蛋白质上氧化的氨基酸侧链(如邻-酪氨酸、间-酪氨酸、二酪氨酸和羰基衍生物)的累积评估ROS引起的氧化损伤。第三类测定氧化应激诱导的基因表达。
利用蛋白质羰基化说明细胞氧化应激的总体水平。如下所述(Dirmeier等，2002；2004)，用2，4-二硝基苯基肼(DNPH)衍生各组分中的蛋白质后，测定线粒体和胞浆蛋白质各组分的羰基含量。
线粒体生物发生.为了测定光是否影响新线粒体的合成，进而影响细胞呼吸水平，利用氧电极测定氧气消耗速率。在细胞暴露于光后测定关键线粒体蛋白质(细胞色素c氧化酶诸亚基、细胞色素c、细胞色素c还原酶和ATP合酶)的胞内水平改变。通过对全细胞提取物进行SDS凝胶电泳免疫印迹测定这些蛋白质的水平。
实施例7可见光提高血液中血管扩张剂的水平。
周围神经病患者暴露于可见光后，测定静脉血和暴光组织中的NO和VEGF。通过免疫实验评估VEGF水平，用NO计或荧光NO指示剂DAF-FM测定NO水平。
测定血液中的NO水平。收集患者的静脉血并冻存。由于NO不稳定并且在氧合血红蛋白存在下快速转化为硝酸盐，我们无法直接测定NO。取而代之，我们用镀铜的镉作还原剂(NITRALYZER^TM-II，WPI，FL)，通过化学方法将硝酸盐转化为亚硝酸盐和NO。用连接于NO/自由基分析仪的NO电极测定产生的NO。
VEGF水平.取全血作SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳并且用VEGF的特异性抗体对该凝胶进行免疫印迹后，测定血液VEGF水平。
实施例8
这项研究的总体目的是检测光与细胞内线粒体细胞色素c氧化酶的亚硝酸盐依赖性一氧化氮产生的关系。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)用作这些研究的模型。具体目的是：
1)确定光是否影响酵母细胞的亚硝酸盐依赖性一氧化氮产生，如果是，则评估它是刺激或是抑制作用。
2)确定光强对细胞的亚硝酸盐依赖性一氧化氮产生的影响。
3)鉴定光对细胞的亚硝酸盐依赖性一氧化氮产生的刺激或抑制作用的作用谱。
检测广谱光对低氧酵母细胞的亚硝酸盐依赖性一氧化氮产生的影响。最初，调查几项实验条件，以确定评价光对细胞的亚硝酸盐依赖性一氧化氮产生的影响的最佳方式。这些实验包括：研究不同类型的光源、控制温度、改变加入底物(亚硝酸盐)的时间和检测光照的时机和持续时间。用这些变量进行初步研究后，我们决定使用能够产生广谱可见光和近IR光的50瓦氙/卤素泛光灯(FE公司)。用海洋光学(Ocean Optics)二极管阵列光纤(Diode Array Fiber Optic)分光光度计(型号SD 2000)，由玻尔得市科罗拉多大学(University of Colorado，Boulder)的CIRES实验室的集成设备开发中心工作人员测定这种灯泡的发射光谱(图2)。
在配有水套的小室中将测定细胞保持在28℃恒温，将滤热器安置在光源和细胞之间，以保证观察到的作用是光引起的，而不是光照造成的温度变化引起的。用纽泊仪器公司(Newport Instruments)918D-SL功率计检测试验小室表面的光强。所有研究都在暗室中进行。使细胞暴露于7mW/cm²的光强，其对应于将灯泡设置在距离试验小室20英寸的地方。改变细胞暴露于光照的时间长度，以传递不同水平的总光能。在暴露于光之前，用氮气吹扫细胞悬液以去除氧气。然后，将细胞暴露于光照不同时间，然后加入亚硝酸盐启动该反应。用连接于WPI Apollo 4000一氧化氮计的一氧化氮电极测定一氧化氮水平。
如图3所示，检测两种实验条件。在条件A中，在加入亚硝酸盐之前，使细胞暴露于光照不同时间长度以预先调节细胞。加入亚硝酸盐后，关闭光源。除了在实验期间保持光照外，条件B与条件A相同。在条件A和B下，广谱光对亚硝酸盐依赖性一氧化氮产生的影响见图3。通过比较条件A和B下一氧化氮的产生与不存在光照的条件下一氧化氮的产生，明显看出在条件A和B下广谱光刺激了低氧细胞中亚硝酸盐依赖性一氧化氮的产生，并且存在两个不同时期。第一个时期的特征是快速产生一氧化氮。这一时期之后是较慢时期。为了方便起见，我们将第一个时期称为“早期”，将第二个时期称为“晚期”。尚不了解为什么速率减慢，但很可能所产生的一氧化氮总体水平主要由早期观察到的速率增加决定。虽然这两个时期均可用于这些研究，但我们观察到一氧化氮产生的晚期速率和总体水平比早期速率更具重现性。从图4可以明显看出，与按照条件A进行的方案相比，条件B期间接受到的额外光能对一氧化氮产生速率的增加作用较小。
实际上，在条件A中用光进行预先调节的步骤足矣。
因此，所有后续研究均用条件A进行。
通过改变预先调节期的暴光时间确定光强对酵母细胞的亚硝酸盐依赖性一氧化氮产生的影响。从图5可以明白，光对亚硝酸盐依赖性一氧化氮产生的刺激作用需要呼吸链，因为在呼吸链缺陷的菌株中没有观察到这种作用。也可看出，将光强从0.8增加至1.6J/cm²能提高一氧化氮产生的早期速率。对于晚期光强对亚硝酸盐依赖性一氧化氮产生速率的作用的更全面分析见图6。在光强为0.8J/cm²时观察到对一氧化氮合成速率的最大刺激作用。对于早期一氧化氮合成，观察到光强和一氧化氮产生之间有类似关系。
利用来自埃德蒙得科学公司(Edmund Scientific)的一系列广谱干涉滤光片评估特定波长的光对亚硝酸盐依赖性一氧化氮产生的影响，从而产生我们使用的作用光谱。这些滤光片每50nm有一个透射峰值，半峰值全宽(FWHM)为80nm。晚期一氧化氮产生的总速率见图7。用550±40nm和600±40nm滤光片过滤的光刺激细胞时观察到对一氧化氮产生的最大刺激作用。而透过450和500nm滤光片的波长对一氧化氮产生无影响。令人惊讶的是，与没有光照的对照相比，650和700nm滤光片透过的波长对亚硝酸盐依赖性一氧化氮产生有抑制作用。为了进一步研究光的刺激和抑制作用对亚硝酸盐依赖性一氧化氮产生的波长依赖性，我们尝试使用尺视光学公司(Cheshire optical)的狭窄带宽干涉滤光片。这些滤光片的中心波长间隔为10±2nm，覆盖范围530至850nm。不幸的是，因为这些狭窄带宽滤光片将光透射水平降低到低于光激发一氧化氮合成所需的水平，所以它们不适合建立较高分辨率的作用光谱。
从上述研究获得的结果明确支持以下结论：广谱光能以剂量依赖方式影响酵母细胞的亚硝酸盐依赖性一氧化氮产生。它们也支持以下结论：一些波长的光具有刺激作用，而另一些波长的光具有抑制作用。此外，在过去三个半月进行的实验表明，虽然灯泡可用于这些研究，但它们的缺点是随着老化它们的输出光谱会改变。这不大方便，并表明改用其他光能来源(如LED)将会更适合未来的研究。
参考文献
Baynes，J.W.1991.Diabetes 40，401-412。
Baynes，J.W.和Thorpe，S.R.1999..Diabetes.48，1-9。
Beauvoit，B.，Katai，T.和Chance，B.1994.Biophys J.67，2501-2510。
Capla，J.M.等，2007.Plastic Reconstructive Surgery 119，59-70。
Castello，P.R.，David，P.S.，McClure，T.，Crook，Z.和Poyton，R.O.(2006).Cell Metabolism 3，277-287。
Chandel，N.S.，McClintock，D.S.，Feliciano，C.E.，Wood，T.M.，Melendez，J.A.，Rodriguez，A.M.和Schumacker，P.T.(2000)。
Conlan，M.J.，Rapley，J.W.和Cobb，C.M.1996.J.Clin.Periodont.23，492-496。
DCCT.1993.《糖尿病控制和并发症试验研究组》(The Diabetes Controland Complications Trial Research Group)New.Eng.J.Med.329，977-986。
DCCT.1995.Ann.Neurol.38，869-880。
DCCT/EDIC.2002.JAMA 287，2563-2569。
Delellis，S.，Carnegie，D.E.和Burke，T.J.2005.J.Amer.Podiatric Med.Assoc.95，143-147。
Dirmeier，R.，O′Brien，K.M.，Engle，M.，Dodd，A.，Spears，E.和Poyton，R.O.(2002).J.Biol.Chem.277，34773-34784。
Eells，J.Y.，Henry，M.M.，Summerfelt，P.，Wong-Riley，M.T.，Buchmann，E.V.，Kane，M.，Whelan，N.T.和Whelan，H.T.2004.Proc.Natl.Acad.SciUSA，100，3439-3444。
Harkless，L.B.，Dellellis，S.，Carnegie，D.和Burke，T.J.2006.J.DiabetesComplications.20，81-87。
Karu，T.1999.J.Photochem.Photobiol.49，1-17。
Karu，T.I.，Pyatibrat，L.V.和Kalendo，G.s.2004.Photochem PhotobiolSci 3，211-216。
Karu，T.I.，Pyatibrat，L.V.，Kolyakov，S.F.2005.Photochem Photobiol.81(2)，98-106。
Lee，I.，Salomon，A.R.，Ficarro，S.，Mathes，I.，Lottspeich，F.，Grossman，L.I.和Huttemann，M。(2005).J.Biol.Chem.280，6094-6100。
Lowell，B.B.和Schulman，G.I.2005.Science 307，384-387。
Palm，F.2006.《临床实验药理学和生理学》(Clinical ExperimentalPharmacology and Physiology.)33，997-1001。
Pop-Busui，R.，Sima，A.和Stevens，M.2006.《糖尿病代谢研究综述》(Diabetes Metabolism Research Review.)22，257-273。
Powell，M.，Carnegie，D.and Burke，T.2004.《皮肤和创伤护理进展》(Advances in Skin and Wound Care.)17，295-300。
Powell，M.W.，Carnegie，D.H.和Burke，T.J.2006.Age Ageing 35，454。
Poyton，R.O.，C.E.Trueblood，R.M.Wright and L.E.Farrell(1988)Ann.N.Y.Acad.Sci.550：289-307。
Poyton，R.O.(1998)“组装时间炸弹-细胞色素c氧化酶和疾病”(Assembling a time bomb-cytochrome c oxidase and disease.)NatureGenetics 20：316-317。
Poyton，R.O.and J.E.McEwen(1996)Annu.Rev.Biochem.65：563-607。
Prabu，S.K.，Anandatheerthavarada，H.K.，Raza，H.，Srinivasan，S.，Spear，J.F.和Avadhani，N.G.(2006).J.Biol.Chem.281，2061-2070。
Rolo，A.P.and Palmeira，C.M.2006.Toxicol and Applied Pharmacology212，167-178。
Ryan，M.T.和Hoogenraar，N.J.2007.Annu Rev.Biochem.76，4.1-4.22
Sommer，A.P.，Pinheiro，A.L.，Mester，A.R.，Franke，R.P.和Whelan，H.T.2001.J.Clin.Laser Med.Surg.19，29-33。
Tachtsidis，I.，Tisdall，M.，Leung，T.S.，Cooper，C.E.，Delpy，D.T.，Smith，M.和Elwell，C.E.2007.Physiol.Meas.28，199-211。
Takahashi，H.，Shin，Y.，Cho，S.J.，Zago，W.M.，Nakamura，T.，Gu，Z.，Ma，Y.，Furukawa，H.，Liddington，R.，Zhang，D.，Tong，G.，Chen，H.S.和Lipton，S.A.(2007).Neuron 53，53-64。
Whelan等，2001.J.Clin.Laser Med.Surg.19，305-314。
Whelan等，2002.J.Clin.Laser Med.Surg.20，319-324。
Winterle，J.S.和Einarsdottir，O.2006.Photochem Photobiol.82：711-719。
Wong-Riley，M.T.，Bai，X.，Buchmann，E.和Whelan，H.T.2001.Neuroreport 12，3033-3037。
Wong-Riley，M.T.T.，Liang，H.L.，Eelles，J.T.，Chance，B.，Henry，M.m.，Buchmann，E.，Kane，M.和Whelan，H.T.2005.J.Biol.Chem.280，4761-4771。
Yu，W.，Naim，J.O.和Lanzafame，R.J.1997.Lasers Surg.Med.20，56-63。
本文引用的文献通过引用全文纳入本文。如果本文所引用的参考文献与本说明书的具体教导内容有任何矛盾，则以后者为准。同样，如果本领域理解的术语或短语的定义与本说明书特别教导的该术语或短语的定义有任何矛盾，则以后者为准。