叶酸偶联聚乙二醇聚烷基氰基丙烯酸酯及制法和应用.pdf

本发明公开了一类叶酸(FA)偶联的聚乙二醇聚氰基丙烯酸酯(PEG-PHDCA)(简称FA-PEG-PHDCA)的合成及其应用。这类聚合物是以叶酸-聚乙二醇氰基乙酸酯和烷基氰乙酸酯在甲醛及二甲胺存在下，通过Michael加成反应得到的两亲性嵌段共聚物。这类聚合物在水中能自组装成纳米粒或胶束，其中疏水性的烷基段聚集成核，亲水性的聚乙二醇段形成亲水壳；同时，该聚合物由于其优良的表面活性和叶酸的肿瘤靶向性还可以应用于修饰固体脂质纳米粒、脂质体、亚微乳等纳米微粒制剂。本聚合物可用于血管内给药、肌肉注射

1、  一种叶酸偶联聚乙二醇聚烷基氰基丙烯酸酯，其特征在于：这类聚合物具有式(I)所示的结构：

其分子量为1.0×10³-1.0×10⁶；PEG含量为1-98％，式中Q和K是O或N原子，x，m，n均为正整数，x范围为1-1000，m范围为1-1000000000，n范围为1-1000000000。

2、  根据权利要求1所述的叶酸偶联聚乙二醇聚烷基氰基丙烯酸酯，其特征在于：所述的聚乙二醇具有式(II)、(III)、(IV)所示结构：

其分子量为1.0×10²-1.0×10⁶，式中n均为正整数。

3、  一种制备权利要求1所述的叶酸偶联聚乙二醇聚烷基氰基丙烯酸酯的方法，其特征在于：以PEG、十六醇、氰基乙酸、叶酸为合成材料，通过如下方法制备：
(1)叶酸-聚乙二醇氰基乙酸酯和十六烷基氰基乙酸酯由PEG和十六醇分别与氰基乙酸脱水缩合而成；
(2)将得到的摩尔比为1∶1-1∶100的聚乙二醇氰基乙酸酯和十六烷基氰基乙酸酯在甲醛及二甲胺存在下，通过Michael加成反应；
(3)将步骤(2)得到的粗品用二氯甲烷反复萃取，有机相用无水硫酸镁或无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至粘稠状，室温减压放置固化，得到淡黄色叶酸-聚乙二醇-聚烷基氰基丙烯酸酯纯品。

4、  根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的甲醛及二甲胺为偶联剂。

5、  根据权利要求1所述的叶酸偶联聚乙二醇聚烷基氰基丙烯酸酯，其特征在于：该聚合物能够在水中自组装形成纳米粒或胶束；将叶酸偶联聚乙二醇聚烷基氰基丙烯酸酯溶于一定体积的有机溶剂中，在搅拌下滴加入含有0.01-50％乳化剂，搅拌挥发除去有机溶剂，得到纳米粒或胶束水分散体，粒径5-1000nm。

6、  根据权利要求5所述的叶酸偶联聚乙二醇聚烷基氰基丙烯酸酯，其特征在于：所述的有机溶剂为氯仿、二氯甲烷、丙酮、四氢呋喃中的一种或任意组合物；所述的乳化剂为磷脂类、脂肪酸山梨坦类、聚山梨酯类、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物类、聚氧乙烯脂肪酸酯类、聚氧乙烯脂肪醇醚类及其任意组合。

7、  根据权利要求1所述的酸偶联聚乙二醇聚烷基氰基丙烯酸酯，其特征在于：该聚合物可用于血管内给药、肌肉注射给药和口服给药，适用于水溶性和水不溶性的药物。

8、  根据权利要求1所述的酸偶联聚乙二醇聚烷基氰基丙烯酸酯，其特征在于：该聚合物用于修饰固体脂质纳米粒、脂质体、亚微乳等纳米微粒制剂。

叶酸偶联聚乙二醇聚烷基氰基丙烯酸酯及制法和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及药用高分子叶酸偶联聚乙二醇聚烷基氰基丙烯酸酯(FA-PEG-PHDCA)的制法及其应用，属嵌段共聚物。
背景技术
纳米粒为固态胶体颗粒，粒径为1～1000nm，其具有小尺寸效应、量子尺寸效应、表面效应以及宏观量子隧道效应等特性，可以被组织及细胞吸收，从而使其可能成为优良的药物传递系统。目前广泛使用的低分子和大分子药物存在各自缺点：(1)低分子药物通过口服或注射给药，短时间内体内药物浓度远超过实际需求量，且缺乏进入人体的选择性；新陈代谢快、半衰期短、体内浓度很快降低而影响疗效，故需要大剂量给药，而过高的药物浓度又会增强药物的副作用；(2)生物大分子药物在体内易被酶降解或失活，生物半衰期短，需重复给药；还收到如免疫系统、组织、细胞膜等的限制，多数不易通过这些生物屏障，因而大分子药物的生物利用度较低。近年来，载药纳米粒作为新型的药物传递和控制释放系统，受到国内外学者的广泛关注，它既能保护药物免遭破坏，又与某些细胞组织有特殊亲和性，能被器官组织的网状内皮系统所内吞(吞噬、胞饮)或被细胞融合，集中于靶区并逐步释放药物。纳米粒在药学方面的研究应用具有非常突出的意义。
制备纳米粒的材料较多，大致可分为聚合物和脂质材料，前者制成的纳米粒称为聚合物纳米粒(polymeric nanoparticles)，后者称为固体脂质纳米粒(solid lipid nanoparticles，SLN)。由于水溶性药物的SLN包封率低，且生物大分子药物SLN面临胃肠环境因素的灭活，使得SLN的应用受到限制，而可降解的生物型材料为载体的聚合物纳米粒受到越来越多的关注。
在过去的几年里，将生物可降解的聚合物纳米粒发展成为高效的药物释放体系引起了人们的广泛兴趣，其中以PLGA、PLA、PCL聚合物最为常用，其制备的载药纳米粒不仅保持了药物活性，提高药物稳定性，降低毒性，还体现了显著的缓释效果，但事实上，血管内注射纳米粒一般难以主动作用于靶位，仍会从血管中迅速清除并被网状内皮系统(RES)摄取，对于与RES有关的疾病是有利的，但多数疾病并不在此系统中。因此研究如何减少RES摄入是研究者的关注的问题。最近研究趋势是对纳米粒载体修饰，聚乙二醇(PEG)有许多优势而且得到FDA批准可用于人体内。有鉴于此，近年来，有大量关于将PEG作为亲水组分引入纳米粒载体的研究报道表明，亲水性PEG修饰的纳米粒，用于静脉给药时，血液清除和RES摄取显著减小。并且PEG引入会影响纳米粒的生物降解行为，调节释药方式。从药物活性角度出发分析，这种由PEG形成微环境，也将有利于药物在储存和给药过程中保持其活性。
PEG修饰的聚合物是其有目标的合成水溶性嵌段共聚物或接枝共聚物，使之同时具有亲水性基团和疏水性基团，在水中溶解后自发形成高分子胶束(polymeric micelles)，完成对药物的增溶和包裹，因为具有亲水性外壳及疏水性内核，适合于携带不同性质的药物，使其与周围介质相隔离以免过快降解，并能在需要时释放活性物质，且其亲水性的外壳还具备“隐形”的特点。另外，聚合物纳米粒具有良好的贮藏稳定性和生物相容性。近年来，将可生物降解的聚合物制成纳米粒，这种聚合物的纳米粒可控释药物，避免药物降解或泄漏，提高药物稳定性和疗效，降低不良反应。药物包入纳米粒中能降低毒性的原因有两点：(1)药物位于纳米粒内核，减少药物与细胞的直接接触，并且亲水PEG外壳能减小纳米粒之间及纳米粒与细胞之间作用。(2)药物从PEG修饰的共聚物纳米粒中持续释放的特性有利于细胞的存活。Peracchia等发现PHDCA经PEG修饰后毒性降低。经过纳米粒培养，50％巨噬单核细胞存活，而没有经过PEG修饰的PHDCA纳米粒培养，只有20％巨噬单核细胞存活。这说明经PEG修饰的共聚物纳米粒更有利于降低细胞毒性。
大量文献表明叶酸受体(FR)是一种通过聚糖磷脂酰肌醇(GPI)锚着于膜上的糖蛋白，对叶酸(folic acid，FA)具有高度亲和力，在正常组织分布较少，而在90％以上的卵巢癌和许多上皮细胞及髓细胞来源的恶性肿瘤有过度表达。FR对叶酸偶联的药物同样具有高度亲和力，这为FR介导药物靶向于肿瘤细胞的研究奠定了基础。氰基丙烯酸酯类聚合物是国内外广泛应用的生物粘附剂，该类载体具有良好的生物相容性、可生物降解性等特点，该类载体纳米粒的主要优点有缓释、降低药物毒性、防止药物降解、增加药物对生物膜的通透性、延长药物半衰期等。PEG-PHDCA本身为一长循环辅料，通过调整FA的比例可以得到不同外表面FA覆盖率的聚合物，而使得最终产物即具有主动靶向性又具有长循环被动靶向性。
发明内容
本发明的目的在于提供一类叶酸(FA)偶联的聚乙二醇聚烷基氰基丙烯酸酯(PEG-PHDCA)(简称FA-PEG-PHDCA)的合成及其应用。这类聚合物在水中能自组装成纳米粒或胶束，其中疏水性的烷基段聚集成核，亲水性的聚乙二醇段形成亲水壳；同时，该聚合物由于其优良的表面活性和叶酸的肿瘤靶向性还可以应用于修饰固体脂质纳米粒、脂质体、亚微乳等纳米微粒制剂。
本发明的FA-PEG-PHDCA共聚物具有式(1)所示结构，其分子量为1.0×10³-1.0×10⁶；PEG含量为1-98％)式中Q和K是O或N原子，x，m，n均为正整数。x范围为1-1000，m范围为1-1000000000，n范围为1-1000000000。

制备FA-PEG-PHDCA共聚物所用的PEG具有式(II)、(III)、(IV)所示结构：

(其分子量为1.0×10²-1.0×10⁶)式中n均为正整数。
以上述PEG、十六醇、氰基乙酸、叶酸为合成材料，叶酸-聚乙二醇氰基乙酸酯和十六烷基氰基乙酸酯由上述PEG和十六醇分别与氰基乙酸脱水缩合而成。将得到的聚乙二醇氰基乙酸酯和十六烷基氰基乙酸酯(摩尔比1∶1-1∶100)在甲醛及二甲胺存在下，通过Michael加成反应后，得到的粗品用二氯甲烷反复萃取，有机相用无水硫酸镁或无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至粘稠状，室温减压放置固化，得到淡黄色叶酸-聚乙二醇-聚烷基氰基丙烯酸酯(FA-PEG-PHDCA)纯品。
将FA-PEG-PHDCA溶于一定体积的有机溶剂(氯仿、二氯甲烷、丙酮、四氢呋喃之一或任意组合物)中，在搅拌下滴加入含有0.01-50％乳化剂(磷脂类、脂肪酸山梨坦类、聚山梨酯类、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物类、聚氧乙烯脂肪酸酯类、聚氧乙烯脂肪醇醚类及其任意组合)，搅拌挥发除去有机溶剂，得到纳米粒或胶束水分散体。粒径5-1000nm。
本发明的聚合物可用于血管内给药、肌肉注射给药和口服给药，适用于水溶性和水不溶性的药物同时可以应用于修饰固体脂质纳米粒、脂质体、亚微乳等纳米微粒制剂。
本发明为叶酸偶联的新型两亲性辅料——叶酸偶联聚乙二醇聚烷基氰基丙烯酸酯(FA-PEG-PHDCA)。该聚合物具有亲油端，因而能够容易的与脂质纳米粒或结构脂质载体等疏水性粒子结合，而其同时具有亲水端，这使得连接在其之上的靶向基团——叶酸能够被暴露在纳米粒的最外层，发挥最大的靶向作用；FA-PEG-PHDCA是一个比较理想的载体材料，其主要特点是聚合度可控，毒性更小，降解速度慢；由于PEG链具有亲水性、柔性的特点赋予了共聚物纳米粒的长循环特点；由于FA基团的肿瘤趋向性使聚合物具有肿瘤靶向性，从而改变了被包载药物的体内药动学行为。本聚合物可用于血管内给药、肌肉注射给药和口服给药，适用于水溶性和水不溶性的药物。本发明制备方法工艺成熟，适于大规模连续生产。
附图说明
图1叶酸-聚乙二醇聚烷基氰基丙烯酸酸酯红外光谱
图2叶酸-聚乙二醇聚烷基氰基丙烯酸酸酯核磁共振¹H谱
图3叶酸-聚乙二醇聚烷基氰基丙烯酸酸酯核磁共振¹³C谱
图4实施例1中以叶酸-聚乙二醇聚烷基氰基丙烯酸酸酯制备的纳米粒粒径
图5实施例2中以叶酸-聚乙二醇聚烷基氰基丙烯酸酸酯制备的纳米粒粒径
具体实施方式
下面再以实施例对本发明加以进一步的说明。
实施例1：
叶酸-聚乙二醇氰乙酸酯的合成：单氨聚乙二醇5000 6mmol和氰乙酸12mmol置250ml三颈瓶中，加入二氯甲烷50ml，超声溶解。搅拌下加入缩合剂DCC 12mmol及少量DMAP，通入氮气条件下室温搅拌12h。加入正己烷30ml，过滤，滤饼用二氯甲烷洗涤(15ml×3)，合并滤液及洗液，减压浓缩至粘稠状，室温下固化得淡黄色蜡状固体，加入叶酸6mmol，加入二氯甲烷50ml。搅拌下加入缩合剂DCC 12mmol及少量DMAP，通入氮气条件下室温搅拌12h。加入正己烷30ml，过滤，滤饼用二氯甲烷洗涤(15ml×3)，合并滤液及洗液，减压浓缩至粘稠状，室温下固化得淡黄色蜡状固体。
十六烷基氰乙酸酯的合成：用十六醇5.5mmol和氰乙酸11mmol投料，操作同上，得到乳白色固体。
FA-PEG-PHDCA聚合物的合成：精密称取十六烷基氰乙酸酯6mmol，加入叶酸-聚乙二醇氰乙酸酯2mmol，加入乙醇-二氯甲烷(1∶1)混合溶液60ml，超声溶解。加入37％甲醛溶液20mmol及33％二甲胺溶液20mmol，氮气保护下室温反应12h。减压浓缩，剩余物倾入水中，用二氯甲烷萃取(15ml×3)，有机相用无水硫钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至粘稠状，室温减压下放置固化，得淡黄色蜡状固体聚合物。
纳米粒的制备：将FA-PEG-PHDCA 200mg溶于2ml二氯甲烷中，在搅拌下滴加入含有1％poloxamer188的水中，搅拌挥发除去有机溶剂，得到纳米粒水分散体。粒径129nm。
实施例2：
叶酸-聚乙二醇氰乙酸酯的合成：聚乙二醇2000 6mmol和氰乙酸12mmol置250ml三颈瓶中，加入二氯甲烷50ml，超声溶解。搅拌下加入缩合剂DCC 12mmol及少量DMAP，通入氮气条件下室温搅拌12h。加入正己烷30ml，过滤，滤饼用二氯甲烷洗涤(15ml×3)，合并滤液及洗液，减压浓缩至粘稠状，室温下固化得淡黄色蜡状固体，加入叶酸6mmol，加入二氯甲烷50ml。搅拌下加入缩合剂DCC 12mmol及少量DMAP，通入氮气条件下室温搅拌12h。加入正己烷30ml，过滤，滤饼用二氯甲烷洗涤(15ml×3)，合并滤液及洗液，减压浓缩至粘稠状，室温下固化得淡黄色蜡状固体。
十六烷基氰乙酸酯的合成：用十六醇5.5mmol和氰乙酸11mmol投料，操作同上，得到乳白色固体。
FA-PEG-PHDCA聚合物的合成：精密称取十六烷基氰乙酸酯3mmol，加入叶酸-聚乙二醇氰乙酸酯3mmol，加入乙醇-二氯甲烷(1∶1)混合溶液60ml，超声溶解。加入37％甲醛溶液20mmol及33％二甲胺溶液20mmol，氮气保护下室温反应12h。减压浓缩，剩余物倾入水中，用二氯甲烷萃取(15ml×3)，有机相用无水硫钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至粘稠状，室温减压下放置固化，得淡黄色蜡状固体聚合物。
修饰固体脂质纳米粒：将单硬脂酸甘油酯300mg、FA-PEG-PHDCA 60mg溶解于2mL乙醇中，微热形成有机相。另取处方量的大豆磷脂50mg和tween-8010mg溶于约8mL水中，构成水相。在高速搅拌(1000r.min^-1)下将有机相用针头注入水相中，整个过程保持温度75±2℃，浓缩体积至原来的约1/2。将所得的半透明体系快速混于另一0-2℃的10mL水相中，继续搅拌2小时，0.8μm微孔滤膜过滤，即得FA-PEG-PHDCA修饰的固体脂质纳米粒。粒径126nm。