由高乌头和独一味组成的药物组合物及其制备方法和用途.pdf

本发明公开了一种具有镇痛抗炎作用的药物组合物及其制备方法。该药物组合物包括高乌头和独一味两味原料药，将原料药经过水或乙醇提取、浓缩、干燥等工艺制成提取物，合并提取物，加入常规辅料制成常规各种剂型。实验证明高乌头与独一味联合使用，可减少高乌头的剂量，而镇痛效果不降低，在抗炎试验中，独一味与高乌头连用，可增强单独用药效果，也有增效作用。因此，本发明药物组合物具有镇痛抗炎的作用，尤其适用于类风湿关节炎、恶性肿瘤引起的疼痛，具有较好的临床和市场前景。

1、  一种具有镇痛抗炎作用的药物组合物，其特征在于该药物组合物的原料药组成为：
高乌头1-10重量份    独一味1-10重量份。

2、  如权利要求1所述的一种具有镇痛抗炎作用的药物组合物，其特征在于该药物组合物的原料药组成为：
高乌头4重量份    独一味6重量份。

3、  如权利要求1所述的一种具有镇痛抗炎作用的药物组合物，其特征在于该药物组合物的原料药组成为：
高乌头6重量份    独一味4重量份。

4、  如权利要求1所述的一种具有镇痛抗炎作用的药物组合物，其特征在于该药物组合物的原料药组成为：
高乌头2重量份    独一味9重量份。

5、  如权利要求1所述的一种具有镇痛抗炎作用的药物组合物，其特征在于该药物组合物的原料药组成为：
高乌头9重量份    独一味2重量份。

6、  如权利要求1-5任一所述的药物组合物，其特征在于取原料药加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床或药学上接受的片剂、胶囊剂、散剂、软胶囊剂、滴丸、蜜丸、丸剂、颗粒剂、蜜炼膏剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂、注射制剂或外用制剂。

7、  如权利要求1-5任一所述的药物组合物的制备方法，其特征在于该方法为以下方法任意一种：
将独一味药材用水提取一至三次，合并提取液，得独一味提取物；或将独一味药材用20％-70％乙醇提取一至三次，合并提取液，回收乙醇至无醇味，继续加水至提取液体积的1-10倍，离心，取上清液浓缩至干，得独一味提取物；另取高乌头用30％-无水乙醇浸泡，放出浸泡液，并继续用乙醇渗漉，收集乙醇溶液，并回收乙醇，用盐酸溶解残留物，离心，取上清液，加入氨水溶液，调节pH值7-14后，用三氯甲烷萃取，合并三氯甲烷溶液，回收至干，得高乌头提取物；将以上独一味提取物及高乌头的提取物混合，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床或药学上可接受的片剂、胶囊剂、散剂、软胶囊剂、滴丸、蜜丸、丸剂、颗粒剂、蜜炼膏剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂、注射制剂或外用制剂；
或将独一味药材用水提取一至三次，合并提取液，得独一味提取物；或将独一味药材用20％-70％乙醇提取一至三次，合并提取液，回收乙醇至无醇味，继续加水至提取液体积的1-10倍，离心，取上清液通过大孔吸附树脂柱，先用水洗脱至流出液无色，再用乙醇解吸附，收集乙醇溶液，减压回收乙醇，并浓缩至干，得独一味提取物；另取高乌头用30％-无水乙醇浸泡，放出浸泡液，并继续用乙醇渗漉，收集乙醇溶液，并回收乙醇，用盐酸溶解残留物，离心，取上清液，加入氨水溶液，调节pH值7-14后，用三氯甲烷萃取，合并三氯甲烷溶液，回收至干，得高乌头提取物；将以上独一味提取物及高乌头的提取物混合，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床或药学上可接受的片剂、胶囊剂、散剂、软胶囊剂、滴丸、蜜丸、丸剂、颗粒剂、蜜炼膏剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂或外用制剂。

8、  如权利要求7所述的制备方法，其特征在于该方法为以下方法任意一种：
将独一味药材用水提取三次，合并提取液，得独一味提取物；或将独一味药材用50％乙醇提取三次，合并提取液，回收乙醇至无醇味，继续加水至提取液体积的5倍，离心，取上清液浓缩至干，得独一味提取物；另取高乌头用70％乙醇浸泡，放出浸泡液，并继续用乙醇渗漉，收集乙醇溶液，并回收乙醇，用盐酸溶解残留物，离心，取上清液，加入氨水溶液，调节pH值8-13后，用三氯甲烷萃取，合并三氯甲烷溶液，回收至干，得高乌头提取物；将以上独一味提取物及高乌头的提取物混合，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床或药学上可接受的片剂、胶囊剂、散剂、软胶囊剂、滴丸、蜜丸、丸剂、颗粒剂、蜜炼膏剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂、注射制剂或外用制剂；
或将独一味药材用水提取三次，合并提取液，得独一味提取物；或将独一味药材用50％乙醇提取三次，合并提取液，回收乙醇至无醇味，继续加水至提取液体积的4倍，离心，取上清液通过大孔吸附树脂柱，先用水洗脱至流出液无色，再用乙醇解吸附，收集乙醇溶液，减压回收乙醇，并浓缩至干，得独一味提取物；另取高乌头用70％乙醇浸泡，放出浸泡液，并继续用乙醇渗漉，收集乙醇溶液，并回收乙醇，用盐酸溶解残留物，离心，取上清液，加入氨水溶液，调节pH值8-13后，用三氯甲烷萃取，合并三氯甲烷溶液，回收至干，得高乌头提取物；将以上独一味提取物及高乌头的提取物混合，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床或药学上可接受的片剂、胶囊剂、散剂、软胶囊剂、滴丸、蜜丸、丸剂、颗粒剂、蜜炼膏剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂、注射制剂或外用制剂。

9、  如权利要求1-5任一药物组合物在制备具有镇痛抗炎作用的药物中的应用。

10、  如权利要求9所述的应用，其特征在于其中所述的镇痛抗炎是指类风湿关节炎、恶性肿瘤引起的疼痛。

由高乌头和独一味组成的药物组合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种药物组合物及其制备方法，特别涉及一种用于镇痛抗炎的由高乌头和独一味组成的药物组合物及其制备方法。
背景技术
高乌头分布于河北蔚县小五台山、山西、青海日月山以东各县、陕西、甘肃、湖北遣、四川及贵州等省。其根有毒，入药，能消肿止痛、活血散瘀、祛风，主治骨折、风湿性腰腿痛、疮疖、梅毒、心悸、胃痛、跌打损伤等症。该化合物安全性高，具有强力镇痛作用及解热、抗炎症作用。独一味，性苦，微寒。有小毒。该物种为中国植物图谱数据库收录的有毒植物，其毒性为全草有小毒。生于高山强度风化的碎石滩中或高山草地，分布西藏、四川、甘肃等高原地区。具有活血祛瘀，消肿止痛作用。目前尚未有将两味药物合用于镇痛和抗炎的药物，二者的合用，提高了药效，得到了前所未有的效果。
发明内容
本发明目的在于提供一种用于镇痛抗炎的药物组合物；本发明另一个目的在于提供该组合物的制备方法。
本发明目的是通过如下技术方案实现：
本发明药物组合物的原料药组成为：高乌头1-10重量份  独一味1-10重量份。
本发明药物组合物的原料药优选组成为：高乌头5重量份  独一味5重量份。
本发明药物组合物的原料药优选组成为：高乌头4重量份  独一味6重量份。
本发明药物组合物的原料药优选组成为：高乌头6重量份  独一味4重量份。
本发明药物组合物的原料药优选组成为：高乌头2重量份  独一味9重量份。
本发明药物组合物的原料药优选组成为：高乌头9重量份  独一味2重量份。
本发明药物组合物加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床或药学上可接受的片剂、胶囊剂、散剂、软胶囊剂、滴丸、蜜丸、丸剂、颗粒剂、蜜炼膏剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂、注射制剂或外用制剂。
本发明药物组合物的制备方法为以下方法任意一种：
将独一味药材用水提取一至三次，合并提取液，得独一味提取物；或将独一味药材用20％-70％乙醇提取一至三次，合并提取液，回收乙醇至无醇味，继续加水至提取液体积的1-10倍，离心，取上清液浓缩至干，得独一味提取物；另取高乌头用30％-无水乙醇浸泡，放出浸泡液，并继续用乙醇渗漉，收集乙醇溶液，并回收乙醇，用盐酸溶解残留物，离心，取上清液，加入氨水溶液，调节pH值7-14后，用三氯甲烷萃取，合并三氯甲烷溶液，回收至干，得高乌头提取物；将以上独一味提取物及高乌头的提取物混合，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床或药学上可接受的片剂、胶囊剂、散剂、软胶囊剂、滴丸、蜜丸、丸剂、颗粒剂、蜜炼膏剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂、注射制剂或外用制剂。
或者将独一味药材用水提取一至三次，合并提取液，得独一味提取物；或将独一味药材用20％-70％乙醇提取一至三次，合并提取液，回收乙醇至无醇味，继续加水至提取液体积的1-10倍，离心，取上清液通过大孔吸附树脂柱，先用水洗脱至流出液无色，再用乙醇解吸附，收集乙醇溶液，减压回收乙醇，并浓缩至干，得独一味提取物；另取高乌头用30％-无水乙醇浸泡，放出浸泡液，并继续用乙醇渗漉，收集乙醇溶液，并回收乙醇，用盐酸溶解残留物，离心，取上清液，加入氨水溶液，调节pH值7-14后，用三氯甲烷萃取，合并三氯甲烷溶液，回收至干，得高乌头提取物；将以上独一味提取物及高乌头的提取物混合，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床或药学上可接受的片剂、胶囊剂、散剂、软胶囊剂、滴丸、蜜丸、丸剂、颗粒剂、蜜炼膏剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂、注射制剂或外用制剂。
本发明药物组合物的制备方法优选为以下方法任意一种：
将独一味药材用水提取三次，合并提取液，得独一味提取物；将独一味药材用50％乙醇提取三次，合并提取液，回收乙醇至无醇味，继续加水至提取液体积的5倍，离心，取上清液浓缩至干，得独一味提取物；另取高乌头用70％乙醇浸泡，放出浸泡液，并继续用乙醇渗漉，收集乙醇溶液，并回收乙醇，用盐酸溶解残留物，离心，取上清液，加入氨水溶液，调节pH值8-13后，用三氯甲烷萃取，合并三氯甲烷溶液，回收至干，得高乌头提取物；将以上独一味提取物及高乌头的提取物混合，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床或药学上可接受的片剂、胶囊剂、散剂、软胶囊剂、滴丸、蜜丸、丸剂、颗粒剂、蜜炼膏剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂、注射制剂或外用制剂。
或者将独一味药材用水提取三次，合并提取液，得独一味提取物；或将独一味药材用50％乙醇提取三次，合并提取液，回收乙醇至无醇味，继续加水至提取液体积的4倍，离心，取上清液通过大孔吸附树脂柱，先用水洗脱至流出液无色，再用乙醇解吸附，收集乙醇溶液，减压回收乙醇，并浓缩至干，得独一味提取物；另取高乌头用70％乙醇浸泡，放出浸泡液，并继续用乙醇渗漉，收集乙醇溶液，并回收乙醇，用盐酸溶解残留物，离心，取上清液，加入氨水溶液，调节pH值8-13后，用三氯甲烷萃取，合并三氯甲烷溶液，回收至干，得高乌头提取物；将以上独一味提取物及高乌头的提取物混合，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床或药学上可接受的片剂、胶囊剂、散剂、软胶囊剂、滴丸、蜜丸、丸剂、颗粒剂、蜜炼膏剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂、注射制剂或外用制剂。
其中，上述重量份与体积份的关系是g/ml的关系。
药效学进行了有效部位组方配比试验，结果证明，高乌头与独一味联合使用，可减少高乌头的剂量，而镇痛效果不降低，在抗炎试验中，独一味与高乌头连用，可增强单独用药效果，也有增效作用。同时独一味不增加高乌头的毒性。在此基础上进行了镇痛试验，对化学性刺激、炎性刺激、光热刺激、电刺激等模型动物均有非常显著的镇痛作用，尤其对类风湿关节炎、恶性肿瘤引起的疼痛具有显著疗效。
附图说明
图1：第14天各组小鼠缩足反应百分率对照图。
下面实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。
实验例1对小鼠醋酸扭体的影响
1.药物与试剂：药物：高乌头；独一味；本发明高中低剂量样品；曲马多(阳性对照)；醋酸，分析纯，北京化工厂。
2.动物：昆明种小鼠，雄性，体重18～22g，由军事医学科学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK(军)2002-001。
3方法
取小鼠70只，雌雄各半，按性别、体重随机分为7组，每组10只，I组为阴性对照组，II组为高乌头组，III组为独一味组，IV组为本发明药物低剂量组(高乌头40mg+独一味40mg/kg)，V组为本发明药物中剂量组(高乌头50mg+独一味50mg/kg)，VI为本发明药物高剂量组(高乌头60mg+独一味60mg/kg)，VII为阳性对照组(曲马多)。口服给药30分钟后，分别向腹腔注射0.6％的醋酸溶液0.2ml/只，记录15min内小鼠扭体次数。
表1对醋酸致小鼠扭体次数的影响

4结果
实验结果显示：
本实验设对照组、阳性药组曲马多，独一味、高乌头单一味药及本发明低、中、高剂量7组。由实验结果可知，独一味及高乌头的高剂量均有镇痛作用(结果见表1)。其中，独一味与高乌头二者的合用，显著提高了药效。
实验例2小鼠水浴甩尾试验
1.药物与试剂：药物：I组为阴性对照组，II组为高乌头组，III组为独一味组，IV组为本发明药物低剂量组(高乌头40mg+独一味40mg/kg)，V组为本发明药物中剂量组(高乌头50mg+独一味50mg/kg)，VI为本发明药物高剂量组(高乌头60mg+独一味60mg/kg)，VII组为阳性对照组(曲马多，7mg/kg)；
2.动物：昆明种小鼠，雄性，体重18～22g，由军事医学科学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK(军)2002-001。
3、方法
先取小鼠70只，雄性，分层随机分为对照组、样品组，阳性组。给药前先用秒表测定各小鼠的痛阈(小鼠自尾尖浸入50℃温水中至尾部甩起的时间，以下称甩尾潜伏期)，单次给药后0.5h，1h，2h，4h，6h分别测定甩尾潜伏期，计算镇痛率，进行组间t检验。
镇痛率＝(甩尾潜伏期-痛阈)/痛阈×100％
根据筛选结果比较二者之间的镇痛作用。
4、结果
由实验结果可知，独一味及高乌头的高剂量均有显著的镇痛协同作用(结果见表2)。
表2对小鼠热刺激甩尾镇痛率的影响(x±s)

实验例3抗炎作用试验
抗炎作用试验——对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的作用
(一)试验材料
1.药物：高乌头；独一味；本发明药物低、中、高剂量组；曲马多(阳性对照)；二甲苯；醋酸；角叉菜胶，Sigma产品。
2.动物：昆明种小鼠，体重18-22g，雌雄各半。
3.仪器：剃毛器、电子天平，秒表，鼠足容积测定器。
(二)试验方法和结果
取小鼠70只，雌雄各半，按性别、体重随机分为7组，每组10只，I组为阴性对照组，II组为高乌头组，III组为独一味组，IV组为本发明药物低剂量组(高乌头40mg+独一味40mg/kg)，V组为本发明药物中剂量组(高乌头50mg+独一味50mg/kg)，VI组为本发明药物高剂量组(高乌头60mg+独一味60mg/kg)，VII为阳性对照组(曲马多，7mg/kg)。口服给药30分钟后，用温水将右耳擦拭干净，滴二甲苯0.03ml致炎，40分钟后，颈椎脱臼处死动物，剪下左右耳廓，在双耳同一相应部位用直径6mm的打孔器冲下耳片，用分析天平称重。以两耳片重量差为肿胀程度指标，比较给药组与对照组间的差异，并求出抑肿率，结果见表3。
肿胀度＝右耳重量-左耳重量

试验结果：相对于阴性对照组，高乌头组、独一味组、本发明组均能抑制小鼠右耳肿胀。本发明抑制肿胀率明显高于高乌头组与独一味组，表明本发明具有良好的抗炎作用，独一味与高乌头有协同作用。
表3对二甲苯引起小鼠耳肿胀的作用(X±s，n＝10)

实验例4对佐剂关节炎大鼠抗炎作用的试验
(一)试验材料
1、主要药物：高乌头；独一味；本发明药物低(高乌头80mg+独一味80mg/kg)、中(高乌头100mg+独一味100mg/kg)、高剂量组(高乌头120mg+独一味120mg/kg)；醋酸可的松(阳性对照)。
2、动物：健康成年雄性SD大鼠50只，体重190～210g(兰州生物制品研究所实验动物中心提供，合格证号：医动字第14-001)。
(二)方法
1、佐剂性关节炎(Adjuvant Arthritis，AA)大鼠模型的建立
弗氏完全佐剂(Freund’s Complete Adjuvan，FCA)的制备：无水羊毛脂加热溶化后取1份置于研钵中，稍冷却，边研磨边加入液体石腊2份。研磨0.5小时后，加热至70℃10分钟，然后高压灭菌1小时，取出后按每毫升加入卡介苗7.5mg，研磨均匀，置4℃冰箱保存备用，使用前需混匀。
动物造模前在相同光照条件下适应性喂养1周，于需造模大鼠右后足跖皮下进针至踝关节，注射上述佐剂0.1mL致炎，诱导关节炎发生。各组大鼠相同条件下喂养，自由摄食，饮水。室温控制在15～18℃，湿度70％左右。
2、分组、给药方法及相关指标测定
随机分为5组，分别为模型组、本发明药物组合物低剂量组(高乌头80mg+独一味80mg/kg)、中剂量组(高乌头100mg+独一味100mg/kg)、高剂量组(高乌头120mg+独一味120mg/kg)、阳性药醋酸可的松组(100mg/kg)，每组10只。
造模后第3天开始给药，连续给药至致炎后第24天。阳性对照组为腹腔注射给药，其余组均为经皮给药(每天1次)，模型组给等量生理盐水。分别于给药后测定各大鼠双后肢足跖部周长，不同天数称量大鼠体重，测量双侧足跖部周长，同时观察大鼠全身炎症反应及血管周围炎症程度，计算关节炎指数，由上述指标综合判断药物作用。
关节炎指数评分标准为：0分，为无红肿；1分，小趾关节稍肿；2分，趾关节和足趾肿胀；3分，踝关节以下足爪肿胀；4分，踝关节在内全部足爪肿胀；耳朵，一个红斑计0.5分；尾巴，一个结节计0.5分；前肢，一个前肢肿胀计0.5分。给药第24天测定完大鼠体重、关节周长和关节炎指数后，处死大鼠，取胸腺、脾和肾上腺称重，计算脏器系数。
3、统计学分析
所有数据用均数±标准差(x+s)表示，采用SPSS11.5统计软件进行数据处理。进行单因素方差分析，方差具有齐性时用LSD检验，方差不齐用Dunnett’s T3检验进行各组间比较。P＜0.05表示差异有显著性。
(三)结果
本发明药物组合物高、中剂量可抑制大鼠致敏后第3-24天内注射足的肿胀，并且可抑制大鼠致敏后第16-24天内非注射足的肿胀；高、中剂量组的胸腺、肾上腺、脾指数均低于模型组，本发明药物组合物高、中剂量组在致敏后第19-24天的体重均高于模型组(P＜0.01，P＜0.05)。见表4～表8。表4对佐剂性关节炎大鼠致敏后注射足足跖部周长的影响(mm，x±s)(n＝10)

与模型组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01
表5对佐剂性关节炎大鼠致敏后非注射足足跖部周长的影响(mm，x±s)(n＝10)

与模型组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01
表6对佐剂性关节炎大鼠致敏后关节炎指数的影响(x±s)(n＝10)

与模型组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01.
表7对佐剂性关节炎大鼠致敏后体重的影响(g，x±s)(n＝10)

与模型组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01
表8对佐剂性关节炎大鼠致敏后重要脏器系数的影响(x±s)

与模型组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01
实验例5本发明药物组合物外用缓解癌性疼痛的作用研究
一、实验材料与方法
1.实验动物、瘤株、药物及仪器
C57BL/6L近交系小鼠，体重：18±2克，四周龄，雌性；由中国医学科学院实验动物中心繁育场提供，合格证：京动许字017。实验动物使用许可证号：syxk(京)2002-0016。小鼠肺癌(Lewis)瘤株由中国医学科学院肿瘤研究所中心实验室常规保存。硫酸四氢帕马丁注射液，广西南宁百会药业集团有限公司生产，批号H45021113；高乌头；独一味；本发明药物低剂量(高乌头80mg+独一味80mg/kg)、中剂量(高乌头100mg+独一味100mg/kg)、高剂量(高乌头120mg+独一味120mg/kg)。
58011Touch Test Sensory Evaluator(North Coast Medical，Inc.Morgan Hill，CA95037，USA)；PE34冷热板测痛仪(North Coast Medical，Inc.Morgan Hill，CA95037，USA)；自制铁丝网和铁架。
2.分组
随机分为8组，每组8只。
治疗组：高乌头组，接种Lewis肺癌细胞3.0×10⁵L^-1个；独一味组，接种Lewis肺癌细胞3.0×10⁵L^-1个；本发明药物低剂量组(高乌头80mg+独一味80mg/kg)，接种Lewi s肺癌细胞3.0×10⁵L^-1个；本发明药物中剂量组(高乌头100mg+独一味100mg/kg)，接种Lewis肺癌细胞3.0×10⁵L^-1个；本发明药物高剂量组(高乌头120mg+独一味120mg/kg)，接种Lewis肺癌细胞3.0×10⁵L^-1个；
对照组：硫酸四氢帕马丁组，接种Lewis肺癌细胞3.0×10⁵L^-1个；
模型组：生理盐水组，接种Lewis肺癌细胞3.0×10⁵L^-1个；
空白组：假手术组，接种等体积的生理盐水。
3.造模
按Schwei MJ等报道的方法，建立小鼠骨癌痛模型。动物麻醉(乙醚麻醉)后，仰卧，腹部朝上，左侧后肢剪毛，75％酒精消毒股骨及胫骨处皮肤，膝关节处沿着股直肌肌腱方向切一长约0.5-1cm的皮肤切口，小心暴露髌骨，先用一次性无菌1m注射器针头在髌骨沿股骨长轴方向穿刺打孔，然后换上10ul注射器进入股骨骨髓腔，缓慢注入10ul含Lewis小鼠肺癌细胞(3.0×10⁵L^-1)至股骨。注射完毕后用骨腊封住针孔。无菌棉签蘸生理盐水清洗创口，皮肤缝合，假手术组动物左侧髌骨上段注入等体积的生理盐水，其余操作同模型组。
4.给药：
①高乌头组、独一味组、本发明药物低剂量组(高乌头80mg+独一味80mg/kg)、本发明药物中剂量组(高乌头100mg+独一味100mg/kg)、本发明药物高剂量组(高乌头120mg+独一味120mg/kg)：加入一定量透皮吸收剂，外用敷于小鼠股骨骨转移部位，注意避开皮肤伤口缝合处，24h更换一次。造模第10天开始给药，连用5天。
②硫酸四氢帕马丁组：按6.498mg/kg，皮下注射于骨转移部位。造模第14天给药。
③模型组：涂擦生理盐水，0.5ml/只，每日一次。造模第10天开始，连用5天。
④空白对照组：涂擦生理盐水，0.5ml/只，每日一次。造模第10天开始，连用5天。
5.痛行为测量：
痛行为测量分别在第10天各组用药前及第14天各组用药后进行，高乌头组、独一味组、本发明药物低剂量组、本发明药物中剂量组、本发明药物高剂量组、生理盐水组和假手术组于末次给药后5h，硫酸四氢帕马丁组于给药后30min，测量痛相关行为包括触诱发痛觉超敏和热刺激痛觉过敏。
(1)用小鼠足底对2g Von Frey纤维(North Coast Medical，USA，型号：58011)刺激的缩足反应百分率(缩足反应百分率＝缩足次数÷5×100％)来反应触诱发痛。具体方法：2g Von Frey纤维刺激小鼠左侧足底中部，5～6秒观察小鼠缩足反应。每只动物每种纤维试验5次，两次试验之间至少间隔2分钟。动物对Von Frey纤维刺激的缩足反应百分率为：缩足次数÷5×100％。
(2)用小鼠热板法测量热刺激痛阈，先将热板温度恒定在(50+1)℃，然后将小鼠放置在热板上，待出现添后足时所需要的时间值(s)即为该动物的痛阈值，每只小鼠测3次，间隔5min以上，取3次均值作为该动物的热刺激痛阈值(筛选基础痛阈在10～30s的动物用于实验)。
6.统计学分析
所有数据用均数±标准差(x+s)表示，采用SPSS11.5统计软件进行数据处理。进行单因素方差分析，方差具有齐性时用LSD检验，方差不齐用Dunnett’s T3检验进行各组间比较。P＜0.05表示差异有显著性。
二、结果
1、痛觉超敏
以小鼠对2g von Frey纤维刺激的缩足反应来测量机械性痛觉超敏。造模前各组小鼠缩足反应百分率无明显差别；造模第10天各组用药前，模型组、对照组及治疗组缩足反应百分率较空白组增多(P＜0.01)，提示小鼠产生触诱发痛行为。造模第14天，治疗组缩足反应百分率减少，与模型组比较(P＜0.01)；对照组缩足反应百分率接近治疗组，较模型组减少(P＜0.01)。各组小鼠左侧足底对2g von Frey纤维刺激的缩足反应百分率分别为：高乌头组26.01％±4.39％、独一味组32.94％±2.78％、本发明药物低剂量组31.03％±6.26％、本发明药物中剂量组25.53％±2.31％、本发明药物高剂量组24.69％±4.19％、阳性对照组23.38％±3.09％、模型组63.70％±8.15％、空白组10.38％±2.62％(结果见附图1)。
2、痛觉过敏
造模前各组小鼠热刺激痛阈无明显差异；造模第10天各组用药前，模型组热刺激痛阈较空白组下降(P＜0.05)。造模第14天，治疗组热刺激痛阈明显延长，与对照组比较无明显差异，与模型组比较差异显著(P＜0.01)；见表9。
表9各组小鼠不同时间点热刺激痛阈的变化(秒，x±s，n＝8)

与模型组比，^#P＜0.05，^##P＜0.01
综上，我们在小鼠股骨癌痛模型成功复制的基础上，首次应用该模型研究和探讨本发明药物缓解癌性疼痛疗效及机制。结果表明，本发明药物在小鼠股骨癌痛模型上治疗有效，并能减轻骨癌痛小鼠的痛行为，主要对轻、中度骨破坏的癌痛小鼠有效。本研究为本发明药物的临床应用提供了新的实验依据。
实验例6本发明药物组合物对佐剂性关节炎大鼠镇痛作用的影响
本实验采用佐剂性关节炎(Adjuvant Arthritis，AA)大鼠疼痛模型。研究AA大鼠灌服本发明药物后痛阈的变化，现将实验结果报告如下。
1、材料
1.1药物
本发明药物低剂量(高乌头40mg+独一味40mg/kg)、中剂量(高乌头50mg+独一味50mg/kg)、高剂量(高乌头60mg+独一味60mg/kg)、阿司匹林片(阳性对照药)。
1.2实验动物
健康成年雄性SD大鼠70只，体重190～210g(兰州生物制品研究所实验动物中心提供，合格证号：医动字第14-001)。
2、方法
2.1AA大鼠模型的建立
弗氏完全佐剂(Freund’s Complete Adjuvan，FCA)的制备：无水羊毛脂加热溶化后取1份置于研钵中，稍冷却，边研磨边加入液体石腊2份。研磨0.5小时后，加热至70℃10分钟，然后高压灭菌1小时，取出后按每毫升加入卡介苗7.5mg研磨均匀，置4℃冰箱保存备用。使用前需混匀。于需造模大鼠右后足跖皮下进针至踝关节，注射上述佐剂0.1mL致炎，诱导关节炎发生。
2.2分组及给药方法
大鼠随机分为7组，每组10只，高乌头组(A)、独一味组(B)、本发明药物低剂量组(高乌头40mg+独一味40mg/kg)(C)、中剂量组(高乌头50mg+独一味50mg/kg)(D)、高剂量组(高乌头60mg+独一味60mg/kg)(E)、阿司匹林组(阳性对照，100mg/kg)(F)、模型组(生理盐水10mL/kg)(G)。致炎后第17天开始灌胃给药，每天1次，连续10天。各组大鼠相同条件下喂养，自由摄食，饮水。室温控制在15～18℃，湿度70％左右。
2.3AA大鼠的测痛试验
选出模型组、高乌头组、独一味组、阿司匹林组及本发明药物大、中、小剂量组，于致炎前用辐射热照射右侧踝关节内侧，记录缩腿反应潜伏期(秒)作为基础痛阈。测得基础痛阈后，按上述方法造模型给药，并分别于末期给药后30、60、90、120、150分钟各测一次炎症部位的缩腿痛阈。
3、统计学分析
由第三作者，采用SPSS 10.0软件完成统计处理。组间显著性差异进行One-Way ANOVA分析。
4、设计、实施、评估者：实验设计为第一、二作者，干预实施为第一、三作者，评估为第四作者，均受过专业培训，采用盲法评估。
5、结果
关节炎疼痛过敏大鼠灌胃本发明药物后30～150分钟内，关节炎局部的缩腿阈明显提高，表明本发明药物能提高炎性疼痛模型痛阈值，对慢性炎症性疼痛有镇痛作用，峰值在给药后30～90分钟，持续150分钟以上。结果见表10。
表10本发明药物组合物对AA大鼠痛阈的影响(x±s)，(n＝10)

注：与模型组比较，^*P＜0.05
本实验结果表明，灌胃本发明药物后佐剂性关节炎大鼠痛阈明显升高，且呈一定的剂量相关性。证明本发明药物对慢性疼痛具有确切的镇痛作用。
下述实施例均能实现上述实验例的效果。
具体实施方式
实施例1：胶囊的制备
高乌头20g  独一味80g
将独一味药材用30％乙醇提取2次，合并提取液，回收乙醇至无醇味，继续加水至提取液体积的2倍，离心，取上清液浓缩至干，得独一味提取物；另取高乌头用80％乙醇浸泡，放出浸泡液，并继续用乙醇渗漉，收集乙醇溶液，并回收乙醇，用盐酸溶解残留物，离心，取上清液，加入氨水溶液，调节pH值8后，用三氯甲烷萃取，合并三氯甲烷溶液，回收至干，得高乌头提取物；将以上独一味及高乌头的提取物混合，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床或药学上可接受的胶囊剂。
实施例2：片剂的制备
高乌头80g  独一味30g
将独一味药材用水提取3次，合并提取液，得独一味提取物；另取高乌头用40％乙醇浸泡，放出浸泡液，并继续用乙醇渗漉，收集乙醇溶液，并回收乙醇，用盐酸溶解残留物，离心，取上清液，加入氨水溶液，调节pH值12后，用三氯甲烷萃取，合并三氯甲烷溶液，回收至干，得高乌头提取物；将以上独一味及高乌头的提取物混合，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床或药学上可接受的片剂。
实施例3：口服液的制备
高乌头40g  独一味60g
将独一味药材用40％乙醇提取1次，合并提取液，回收乙醇至无醇味，继续加水至提取液体积的5倍，离心，取上清液浓缩至干，得独一味提取物；另取高乌头用30％乙醇浸泡，放出浸泡液，并继续用乙醇渗漉，收集乙醇溶液，并回收乙醇，用盐酸溶解残留物，离心，取上清液，加入氨水溶液，调节pH值10后，用三氯甲烷萃取，合并三氯甲烷溶液，回收至干，得高乌头提取物；将以上独一味及高乌头的提取物混合，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床或药学上可接受的口服液。
实施例4：丸剂的制备
高乌头50g  独一味50g
将独一味药材用50％乙醇提取2次，合并提取液，回收乙醇至无醇味，继续加水至提取液体积的6倍，离心，取上清液浓缩至干，得独一味提取物；另取高乌头用50％乙醇浸泡，放出浸泡液，并继续用乙醇渗漉，收集乙醇溶液，并回收乙醇，用盐酸溶解残留物，离心，取上清液，加入氨水溶液，调节pH值9后，用三氯甲烷萃取，合并三氯甲烷溶液，回收至干，得高乌头提取物；将以上独一味及高乌头的提取物混合，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床或药学上可接受的丸剂。
实施例5：颗粒剂的制备
高乌头20g  独一味90g
取上述原料药加入常规辅料按照常规工艺，制成颗粒剂。
实施例6：注射剂的制备
高乌头90g  独一味20g
取上述原料药加入常规辅料按照常规工艺，制成注射剂。
实施例7：颗粒剂的制备
高乌头60g  独一味40g
将独一味药材用50％乙醇提取三次，合并提取液，回收乙醇至无醇味，继续加水至提取液体积的3倍，离心，取上清液通过大孔吸附树脂柱，先用水洗脱至流出液无色，再用70％乙醇解吸附，收集乙醇溶液，减压回收乙醇，并浓缩至干，得独一味提取物；另取高乌头用70％乙醇浸泡，放出浸泡液，并继续用乙醇渗漉，收集乙醇溶液，并回收乙醇，用盐酸溶解残留物，离心，取上清液，加入氨水溶液，调节pH值13后，用三氯甲烷萃取，合并三氯甲烷溶液，回收至干，得高乌头提取物；将以上独一味提取物及高乌头的提取物混合，加入常规辅料，按照常规工艺，制成颗粒剂。
实施例8：贴剂的制备
高乌头20g  独一味40g
将独一味药材用70％乙醇提取2次，合并提取液，回收乙醇至无醇味，继续加水至提取液体积的5倍，离心，取上清液通过大孔吸附树脂柱，先用水洗脱至流出液无色，再用70％乙醇解吸附，收集乙醇溶液，减压回收乙醇，并浓缩至干，得独一味提取物；另取高乌头用无水乙醇浸泡，放出浸泡液，并继续用无水乙醇渗漉，收集乙醇溶液，并回收乙醇，用盐酸溶解残留物，离心，取上清液，加入氨水溶液，调节pH值10后，用三氯甲烷萃取，合并三氯甲烷溶液，回收至干，得高乌头提取物；将以上独一味提取物及高乌头的提取物混合，加入常规辅料，按照常规工艺，制成贴剂。
实施例9：软膏的制备
高乌头50g  独一味20g
将独一味药材用60％乙醇提取三次，合并提取液，回收乙醇至无醇味，继续加水至提取液体积的4倍，离心，取上清液通过大孔吸附树脂柱，先用水洗脱至流出液无色，再用60％乙醇解吸附，收集乙醇溶液，减压回收乙醇，并浓缩至于，得独一味提取物；另取高乌头用30％乙醇浸泡，放出浸泡液，并继续用30％乙醇渗漉，收集乙醇溶液，并回收乙醇，用盐酸溶解残留物，离心，取上清液，加入氨水溶液，调节pH值12后，用三氯甲烷萃取，合并三氯甲烷溶液，回收至干，得高乌头提取物；将以上独一味提取物及高乌头的提取物混合，加入常规辅料，按照常规工艺，制成软膏。
实施例10：喷雾剂的制备
高乌头100g  独一味10g
将独一味药材用水提取三次，合并提取液，得独一味提取物；另取高乌头用90％乙醇浸泡，放出浸泡液，并继续用90％乙醇渗漉，收集乙醇溶液，并回收乙醇，用盐酸溶解残留物，离心，取上清液，加入氨水溶液，调节pH值10后，用三氯甲烷萃取，合并三氯甲烷溶液，回收至干，得高乌头提取物；将以上独一味提取物及高乌头的提取物混合，加入常规辅料，按照常规工艺，制成喷雾剂。
实施例11：软胶囊的制备
高乌头10g  独一味100g
将独一味药材用70％乙醇提取3次，合并提取液，回收乙醇至无醇味，继续加水至提取液体积的3倍，离心，取上清液浓缩至干，得独一味提取物；另取高乌头用70％乙醇浸泡，放出浸泡液，并继续用乙醇渗漉，收集乙醇溶液，并回收乙醇，用盐酸溶解残留物，离心，取上清液，加入氨水溶液，调节pH值10后，用三氯甲烷萃取，合并三氯甲烷溶液，回收至干，得高乌头提取物；将以上独一味及高乌头的提取物混合，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床或药学上可接受的软胶囊剂。