包含外消旋氨基蝶呤的药物组合物 技术领域 本发明提供包含外消旋氨基蝶呤或其药学上可接受的盐的药物组合物。 本发明还 提供治疗患者疾病的方法， 包括以治疗有效量的外消旋氨基蝶呤或其药学上可接受的盐进 行给药。 更具体地， 本发明提供治疗至少由二氢叶酸还原酶的活性调节的疾病的方法， 例如 癌症和炎症性疾病， 其中该方法包括以治疗有效量的外消旋氨基蝶呤或其药学上可接受盐 对有需要的患者进行给药。
本 发 明 受 政 府 资 助，从 国 家 卫 生 研 究 院 获 补 助 金 1R43AI068282， 3R43AI068282-01S1， 3R43AI068282-S2， 5R43AR056547。政府对本发明享有某些权利。
背景技术 对映体 ( 对映异构体 ) 是彼此互为镜像、 不能重叠的两个立体异构体之一， 如一个 人的左手和右手互为镜像而不能重叠一样。对映体具有基本相同的物理 ( 除它们对平面偏 振光的旋转能力， 等量但方向相反 ) 和化学 ( 除手性环境 ) 性能。等量光学活性异构体与 其对映体的混合物是外消旋体， 对平面偏振光的净旋转为零。
很多药物分子都是手性的， 其生产涉及的合成化学反应常生成外消旋体。 然而， 由 于许多生物分子都是手性的， 两种对映体对生物体 ( 包括人类 ) 上的外消旋体产生显著不 同的效果。 对外消旋体的对映体之间或单独的对映体与其外消旋组合之间在生物效应上的 差异 ( 如有的话 ) 进行预测是极其困难的， 可能包括无差异、 不同的药代动力学、 定量或定 性不同药理学或毒理学效应。
例如， 外消旋体的两种对映体具有相似的生物活性， 包括 ： 多巴酚丁胺的两种对映 体都是正性肌力药 ； 布洛芬的两种对映体都是消炎药 ； 华法令阻凝剂和苯丙香豆醇的两种 对映体都是抗凝血剂 ； 布比卡因的对映体均可产生局部麻醉。
或者， 外消旋体的一种对映体具有生物活性而另一种对映体不具有的生物活性， 包括 ： 喹诺酮类 ( 例如， l- 普萘洛尔是一种 β- 阻断剂， 而 d- 普萘洛尔却不是 ) 和 β- 内 酰胺类抗生素的对映体。
在其它一些例子中， 外消旋体中每个对映体具有完全不同的活性， 包括 ： 外消旋索 他诺尔， 其中 d- 索他诺尔是一种 III 型抗心律失常药， l- 索他诺尔是一种 β- 阻断剂。这 些例子中， 还有对映体有毒， 对外消旋体的理想活性不起作用的情况。例如， 粒细胞减少症 与左旋多巴的右旋体有关 ； 呕吐由左旋咪唑的右旋体引起的 ； 当去除外消旋肉碱中的右旋 体后， 将观察不到重症肌无力症状。
由于外消旋体中对映体对生物具有不同药理学效应， 人们希望开发基本只生产单 一对映体的药物制备方法。 该方法的一个缺点是 ： 与生产相同的外消旋体的方法相比， 生产 基本单一对映体的方法成本更高。
但是选择开发一种外消旋体药物， 相对于生产外消旋体药物的基本以纯态存在的 一种对映体， 可减少批准后的制备成本， 在前置审批阶段， 该说法被与开发外消旋体药物增 加的监管负担相关的更高的成本所反驳。外消旋体增加的监管负担来自额外的测试， 制备
控制中的开发要求， 药理学和毒理学的评估， 代谢与分布特征和临床的评估。
公开了 “氨基蝶呤 [54-62-6] 氮 -[4-[[(2， 4- 二氨基 -6- 蝶啶 ) 甲基 ] 氨基 ] 苯 th 甲酰 ]- 左旋 - 谷氨酸” (The Merck Index， 13 Edition， Merck & Co.， Inc.， Whitehouse Station， NJ 2001， 83 页 )， 并且在本领域中作为 L 对映体使用。根据默克索引 (The Merck Index)， 氨基蝶呤是 “由 2， 4， 5， 6- 四氨基嘧啶硫酸盐， 2， 3- 二溴丙醛和对氨基苯甲酰谷氨 酸 (Seeger et al.， J.Am.Chem.Soc.69， 2567(1947) 制备 ； 由 6- 溴甲基 -2， 4- 二氨基蝶啶 溴化氢 (Piper， Montgomery， J.Heterocycl.Chem.11， 279(1974)) 制备” 。因此， 本领域使用 的术语 “氨基蝶呤” 指的是 L 对映体。
因此如果将药物作为外消旋体开发， 同时避免许多额外的测试和与开发单一对映 体有关的开发成本， 将具有显著的优点。如果与对理想的生物效应起主要作用的对映体相 比， 外消旋体 ( 即对映体的组合 ) 具有额外有利的生物性能， 这将是外消旋体的另一个优 点。氨基蝶呤或氮 -[4-[[(2， 4- 二氨基 -6- 蝶啶 ) 甲基 ] 氨基 ] 苯甲酰 ]- 左旋 - 谷氨酸， 是一种对治疗人类和动物的各种疾病很有用的有效抗叶酸剂。它具有光学活性， 具有单一 的手性中心。 发明内容 本发明提供一种包含外消旋氨基蝶呤或其药学上可接受的盐的药物组合物。 优选 地， 外消旋氨基蝶呤或其药学上可接受的盐含有 D- 氨基蝶呤和 L- 氨基蝶呤， 其中外消旋氨 基蝶呤中 D- 氨基蝶呤的含量为 15％ -85％。更优选地， 外消旋氨基蝶呤或其药学上可接受 的盐中 D- 氨基蝶呤的含量为 25％ -75％。更优选地， 外消旋氨基蝶呤中 D- 氨基蝶呤的含 量为 35-65％。最优选地， 外消旋氨基蝶呤或其药学上可接受的盐中 D- 氨基蝶呤的含量为 45-55％。优选地， 药物组合物适合口服。更优选地， 药物组合物为片剂或胶囊剂型， 还包括 药物辅料。优选地， 外消旋氨基蝶呤药学上可接受的盐为二钠盐。优选地， 药物组合物中外 消旋氨基蝶呤的含量为 0.01-4mg。优选地， 药物组合物还包含 L- 氨基蝶呤。
本发明还提供治疗至少由二氢叶酸还原酶的活性调节的疾病的方法， 该方法包括 以外消旋氨基蝶呤或其药学上可接受的盐的治疗上有效的量对有需要的患者进行给药。 外 消旋氨基蝶呤优选是口服。
优选地， 至少由二氢叶酸还原酶活性调节的疾病选自癌症和炎症性疾病。更优选 地， 癌症选自白血病、 淋巴瘤、 乳腺癌、 头部和颈部鳞状细胞瘤、 绒毛膜癌和子宫内膜癌。更 优选地， 炎症性疾病选自哮喘、 多发性硬化症、 类风湿关节炎、 幼年类风湿关节炎、 再狭窄、 牛皮癣、 牛皮癣关节炎、 关节炎、 异位性皮炎、 慢性阻塞性肺疾病、 炎症性肠道疾病、 肺纤维 化、 多囊肾病、 支气管肺发育不良、 尘肺病、 系统性红斑狼疮、 多肌炎、 移植物抗宿主病、 移植 排异、 牛急性肺炎巴氏杆菌病和犬异位性皮炎。
优选地， 外消旋氨基蝶呤或其药学上可接受的盐包含 D- 氨基蝶呤和 L- 氨基蝶呤， 其中外消旋氨基蝶呤中 D- 氨基蝶呤的含量为 15％ -85％。更优选地， 外消旋氨基蝶呤或其 药学上可接受的盐中 D- 氨基蝶呤的含量为 25％ -75％。 更优选地， 外消旋氨基蝶呤中 D- 氨 基蝶呤的含量为 35％ -65％。最优选地， 外消旋氨基蝶呤或其药学上可接受的盐中 D- 氨基 蝶呤的含量为 45％ -55％。
本发明的外消旋氨基蝶呤药物组合物提供了其商业和生物优点， 包括 ： (i) 与对
映体药物相比， 具有较低的生产成本 ； (ii) 与其它外消旋体药物相比， 减少了监管负担 ； (iii) 与仅含有左旋体的药物组合物相比， 增加了活性左旋体的系统暴露量。 附图说明
图 1 为实施例 4 所述的 10 只比格犬口服 L- 氨基蝶呤后， 左旋体的平均血浆浓度 的图形描述。
图 2 为实施例 4 所述的 10 只比格犬口服 D- 氨基蝶呤后， 右旋体的平均血浆浓度 的图形描述。
图 3 为实施例 4 所述的 10 只比格犬口服外消旋氨基蝶呤后， 左旋体和右旋体的平 均血浆浓度的图形描述。
图 4 为实施例 4 所述的每组 10 只比格犬分别口服 L- 氨基蝶呤和外消旋氨基蝶呤 后， Cmax， AUC(0-12hrs) 和 AUC ∞值的图形描述。
图 5 为实施例 5 描述的每组 6 个人类受试者分别口服 L- 氨基蝶呤和外消旋氨基 蝶呤后， Cmax， AUC(0-12hrs) 和 AUC ∞值的图形描述。 具体实施方式
本发明提供包含外消旋氨基蝶呤及其药学上可接受的盐的药物组合物。 人们意外 的发现 ： 口服外消旋氨基蝶呤的吸收， 对左旋体具有选择性， 在循环过程中基本未检测到右 旋体。 新发现的对左旋体的选择性避免了外消旋体很多额外的测试、 开发成本和监管负担， 因为不需要考虑右旋体的药理学和毒理学的评估、 代谢与分布特征和临床评价。这代表显 著的商业优点。 人们还发现， 相对于口服纯的左旋体， 口服外消旋氨基蝶呤增加了左旋体的 系统暴露量。
这里使用的 ‘L- 氨基蝶呤’ 或 ‘左旋体’ 指的是氮 -[4-[[(2， 4- 二氨基 -6- 蝶啶 ) 甲基 ] 氨基 ] 苯甲酰 ]-L- 谷氨酸的游离酸形式。左旋体引起平面偏振光的正旋转 ； [α]D25 ＝ +18° ±2° ( 二钠盐水溶液中 c ＝ 0.1)。这里使用的 ‘D- 氨基蝶呤’ 或 ‘右旋体’ 指的 是氮 -[4-[[(2， 4- 二氨基 -6- 蝶啶 ) 甲基 ] 氨基 ] 苯甲酰 ]-D- 谷氨酸的游离酸形式。右 旋体引起平面偏振光的负旋转 ； [α]D25 ＝ -18° ±2° ( 二钠盐水溶液中 c ＝ 0.1)。这里 使用的 ‘外消旋氨基蝶呤’ 、 ‘氨基蝶呤外消旋体’ 、 ‘外消旋 - 氨基蝶呤’ 或 ‘L/D- 氨基蝶呤’ 指的是 L- 氨基蝶呤和 D- 氨基蝶呤的量基本相等的混合物。外消旋氨基蝶呤不会引起平面 偏振光的可测定的旋转。外消旋氨基蝶呤可与各种无机和有机酸以及碱形成盐， 可用传统 方法制备这种盐， 优选地， 盐为二钠盐。
外消旋 - 氨基蝶呤抑制酶参与嘌呤和嘧啶的代谢， 外消旋 - 氨基蝶呤抑制酶含 有二氢叶酸还原酶， 可间接导致腺苷的细胞外释放。腺苷是一种强大的抗炎内分泌物， 调 节先天免疫 (reviewed by Hasko and Cronstein， (2004)“Adenosine ： an endogenous regulator of innate immunity” Trends Immunol.， 25/1 ： 33-39)， 还可减少抗原刺激细胞 的活化、 降低粘附分子的表达以及可能诱导 T 细胞的凋亡 (Cronstein et al.， Proc.Natl. Acad.Sci.USA(1991)， 88 ： 2441 ； Cronstein et al.， J.Clin.Invest.(1993)， 92/6 ： 2675 ； Genesteir et al.， J.Clin.Invest.(1998)， 102 ： 322-328 ； Morabito et al.， J.Clin. Invest.(1998)， 101 ： 295-300 ； Paillot et al.， Transplant Proc.(1998)， 30/5 ： 2348-50 ；and Johnston et al.， Clin.Immunol.(2005)， 114/2 ： 154-63)。
现在人们已经意识到腺苷在人体炎症性疾病中具有举足轻重的作用， 如类风湿关 节炎和牛皮癣。腺苷可通过收集类风湿关节炎患者的滑液直接测定 (Ottonello et al.， Rheumatology(2002)41 ： 1249-1260)。
这里使用的术语 “通过调节二氢叶酸还原酶活性治疗的疾病” 是指一种疾病、 病害 或病情， 调节二氢叶酸还原酶活性是减轻疾病或减轻疾病的一个或多个生物表现的有效方 式； 或干扰导致疾病或对潜在的疾病起作用的生物级联中一点或多点 ； 或缓解疾病的一个 或多个症状。因此， 受二氢叶酸还原酶活性调节的疾病， 包括以下方面 ：
(a) 二氢叶酸还原酶活性的不足是疾病或一个或多个生物表现的起因， 而无论其 活性改变因遗传、 感染、 刺激、 内部刺激或其它原因引起的。
(b) 通过降低二氢叶酸还原酶活性来减轻病害或疾病， 或可观察到的表现， 或病害 或疾病的表现。 二氢叶酸还原酶活性的存在与病害或疾病或其可观察到的表现没有因果关 系。
(c) 二氢叶酸还原酶的活性干扰导致病害或疾病或与病害或疾病有关的生化部分 或细胞级联。在这方面， 二氢叶酸还原酶的活性改变级联， 从而控制病害、 病情或疾病。 用外消旋 - 氨基蝶呤调节二氢叶酸还原酶活性来治疗的疾病包括癌症 ： 例如， 白 血病、 淋巴瘤、 乳腺癌、 头部和颈部鳞状细胞瘤、 绒毛膜癌和子宫内膜癌 ； 还包括炎症性疾 病： 例如， 哮喘、 多发性硬化症、 类风湿关节炎、 幼年类风湿关节炎、 再狭窄， 牛皮癣、 牛皮癣 关节炎、 关节炎、 异位性皮炎、 慢性阻塞性肺疾病、 炎症性肠道疾病、 肺纤维化、 多囊肾病、 支 气管肺发育不良， 尘肺病、 系统性红斑狼疮、 多肌炎、 移植物抗宿主病、 移植排异、 牛急性肺 巴氏杆菌病和犬异位性皮炎。
在一个优选实施例中， 本发明提供了一种通过至少调节二氢叶酸还原酶活性来治 疗疾病的方法， 该方法包括以外消旋氨基蝶呤或其药学上可接受盐的治疗上有效的量对有 需要的患者进行给药。据说如果抑制剂的百分含量在 5％ -100％， 患者体内的二氢叶酸还 原酶会受到抑制。
术语 “患者” 指动物或人。术语 “治疗上有效的量” 指外消旋 - 氨基蝶呤的剂量 ( 剂量或数量， 次数 )， 直接或间接地杀死炎症性细胞、 阻止炎症性细胞的累积， 或减少炎症 性细胞在患有炎症性疾病 ( 如， 不确定病因的关节炎、 类风湿关节炎、 幼年类风湿关节炎、 异位性皮炎、 支气管肺发育不良、 炎症性肠道疾病、 牛皮癣关节炎和牛皮癣或动物得的病， 如犬异位性皮炎或牛急性肺炎巴氏杆菌病 ) 的人或其它哺乳动物体内的累积。术语 “治疗 上有效的量” 还指外消旋 - 氨基蝶呤的剂量， 该剂量可直接或间接降低或增加由参与人或 哺乳动物的炎症性疾病的炎症细胞或非炎症细胞分泌的分子的活性， 从而抗叶酸剂的量阻 止、 减少或消除与炎症性疾病相关的病理炎症。通常， 治疗上有效的量也将消除、 减少或阻 止一个或多个疾病表现的发展。有经验的临床医师会意识到， 大多数情况下， 外消旋 - 氨基 蝶呤可能无法提供治疗， 而仅能提供部分益处。此外， 有经验的临床医师还意识到， 因个别 患者或疾病状态会有所不同， 有的患者可得到一点益处， 或根本得不到益处。 上述外消旋氨 基蝶呤 “杀死” 、 “阻止” 、 “减少” 或 “消除” 的剂量， 在至少一部分患者中， 被认为是治疗上有 效的。 在急性或慢性炎症性疾病给药中， 外消旋氨基蝶呤治疗上有效的量的剂量大小， 会因 治疗的炎症性疾病的严重性与给药途径而不同。
外消旋 - 氨基蝶呤的剂量和剂量率取决于多种因素， 如患者体重和计算的表面 积， 使用的具体药物组合物， 治疗目的， 即治疗或预防， 治疗的疾病的性质， 主治医师的判断 和单个患者的反应。当有亚叶酸时， 可能需要大剂量外消旋 - 氨基蝶呤。
通常， 不存在亚叶酸时， 外消旋 - 氨基蝶呤治疗上有效的量， 即外消旋 - 氨基蝶呤 剂量是 0.001-0.5mg/kg、 0.001-0.27mg/kg 和 0.005-0.06mg/kg， 最优选地， 用于炎症症状 的剂量 0.010-0.06mg/kg， 用于肿瘤症状的剂量 0.13-0.27mg/kg， 作为单剂量或分剂量。
可对患者从低向高滴定至上面剂量范围， 从而满意地控制疾病表现。一旦患者的 病情有所改善， 必要时， 对患者以维持剂量的本发明组合物进行给药。随后， 通过降低作为 症状的函数的给药剂量和 / 或给药频率， 来将剂量率降低至能够维持改善的病情的水平。 当症状缓解至理想水平， 医师可选择停止治疗。 但是， 一旦疾病症状复发或需要预防治疗计 划， 患者需要进行间歇性治疗。 可在至少一种治疗上有效量的亚叶酸或叶酸给药之前、 或同 时、 或之后， 以治疗上有效的量进行的外消旋 - 氨基蝶呤的给药。
本发明还提供一种用外消旋氨基蝶呤剂量不间断的周期， 治疗患者炎症性疾病的 方法， 其中剂量包括外消旋氨基蝶呤的治疗上的有效量。不间断意味着将外消旋氨基蝶呤 剂量对患者进行至少 4 个周期、 12 个周期、 24 个周期的重复给药， 优选大于 52 个周期， 其中 周期的周期数是不变的， 一个周期的最后剂量和下个周期的第一剂量之间的最大持续时间 不超过 21 天、 14 天， 优选不超过 7 天。在这个定义中， “周期的周期数是不变的” 指连续周 期的相应剂量之间的持续时间是在 12 小时范围内的恒定值。例如， 如果周期数是 7 天 ( 即 168 小时 )， 那么 “周期的周期数是不变的” 将意味着连续周期相应剂量之间的持续时间在 162-174 小时之间变化。此外， 在这个定义中， 每个周期中外消旋氨基蝶呤剂量的数量范围 为 1-5， 每个单个剂量可能会包括一个或多个剂型。
因此， 如将外消旋氨基蝶呤每 7 天一剂对患者给药， 至少 4 个周期， 优选至少 52 个 周期 ( 即一年 )。这种情况下， 每周期的剂量数仅是单剂量， 周期数为 7 天， 一个周期的最 后剂量与下个周期的第一剂量之间的最大持续时间为 6 天。在另一个实施例中， 将外消旋 氨基蝶呤在周一和周二各给药一剂， 至少持续 52 个周期。这种情况下， 每个周期的剂量数 是 2， 周期数是 7 天， 一个周期的最后剂量和下个周期的第一剂量之间的最大持续时间为 5 天 ( 即周三到周日 )。在另一个实施例中， 将外消旋氨基蝶呤在早上给药一剂， 另一剂在同 一周的另某个晚上给药， 每个剂量均为两个片剂， 至少重复 52 个周期。在该实施例中， 每个 周期的剂量数是 2， 其中每个剂量包括 2 种剂型， 周期数是 7 天， 一个周期的最后剂量和下 个周期的第一剂量之间的最大持续时间为 6 天 ( 即一周内给药日之间 )。可以理解其它治 疗计划和实施例也在本发明的范围内。 例如， 在一个实施例中， 分别在周一和周三将外消旋 氨基蝶呤给药一剂， 至少持续 52 个周期。这种情况下， 每个周期的剂量数是 2， 周期数是 7 天， 一个周期的最后剂量和下个周期的第一剂量之间的最大持续时间为 4 天 ( 即周四至周 日 )。优选地， 周期数为每周 ( 即 7 天 )。
在 另 一 个 实 施 例 中， 每 周 剂 量 包 括 外 消 旋 氨 基 蝶 呤 的 累 积 剂 量， 范围为 0.001-0.14mg/kg， 0.010-0.06mg/kg， 最优选 0.020-0.06mg/kg。 例如， 对 0.25kg 的患者 ( 如 老鼠 ) 进行外消旋氨基蝶呤的给药的剂量范围为 0.00025-0.035mg， 为 0.0025-0.015mg， 为 0.005-0.015mg ； 而 对 1.0kg 的 患 者 进 行 外 消 旋 氨 基 蝶 呤 的 给 药 的 剂 量 范 围 为 0.001-0.14mg， 为 0.010-0.06mg， 为 0.02-0.06mg ； 而对 100kg 的患者进行外消旋氨基蝶呤的给药的剂量范围为 0.1-14.0mg， 为 1.0-6.0mg， 为 2.0-6.0mg。对于典型的 60kg 的成 年人， 每周剂量包括外消旋氨基蝶呤的累积剂量， 范围为 0.06-8.4mg， 0.6-3.6mg， 最优选 1.2-3.6mg。
本发明还提供一种采用综合疗法治疗患者疾病的方法， 其中包括以外消旋氨基蝶 呤或其药学上可接受的盐的治疗上有效的量对患者给药， 并且根据解决方法， 还包含至少 一种其他治疗剂的给药。 至少一种其他的治疗剂可在外消旋氨基蝶呤或其药学上可接受的 盐给药前、 给药同时或给药后给药。至少一种其他治疗剂还包括含有外消旋氨基蝶呤和至 少一种其他的治疗剂的单一剂型， 和多剂型， 其中外消旋氨基蝶呤和至少一种其他的治疗 剂分开、 但同时给药， 或者对多剂型其中两种成分分开但顺序给药。
所述至少一种其他治疗药物可以是， 如叶酸、 L- 氨基蝶呤、 亚叶酸、 右美沙芬、 盐 酸美金刚、 强的松、 cox-2 抑制剂、 非甾体抗炎药、 长春新碱、 地塞米松、 天门冬酰胺酶、 道诺 霉素、 疏基嘌呤、 依托泊苷、 阿糖胞苷、 阿霉素、 顺铂、 异环磷酰胺、 紫杉醇、 5- 氟尿嘧啶、 卫 康醇、 他莫昔芬、 哌嗪二酮、 米托蒽醌、 地吖醌、 胺噻唑、 甲胺蝶呤、 替尼泊苷、 长春新碱、 棘霉 素、 6- 疏基嘌呤、 地塞米松、 环磷酰胺、 可溶性 TNF 受体、 抗 -TNF 抗体和抗 -TNF 人源化抗体。 在一个实施例中， 外消旋氨基蝶呤与 L- 氨基蝶呤或其药学上可接受的盐同时给药， 其中总 氨基蝶呤中 L- 氨基蝶呤的质量含量约为 10％ -90％， 20％ -80％， 更优选 30％ -70％。 在优选实施例中， 外消旋氨基蝶呤的剂量是 0.001-0.3mg/kg， 0.010-0.06mg/kg， 最优选 0.020-0.06mg/kg， 适用于综合疗法的治疗方案。优选地， 通过以治疗方案中甲氨蝶 呤剂量的约 8-16％进行外消旋氨基蝶呤的给药， 直接用外消旋氨基蝶呤代替使用甲胺蝶呤 的治疗方案中的甲氨蝶呤。
在另一个优选实施例中， 在使用另一种非甾体抗炎药的治疗方案中， 通过以每周 口服 1-4mg 剂量的外消旋氨基蝶呤代替每周给药 7-25mg 剂量的甲氨蝶呤， 从而用外消旋氨 基蝶呤代替甲氨蝶呤治疗成人类风湿关节炎。
在另一个实施例中， 在使用另一种非甾体抗炎药的治疗方案中， 通过以每周口服 2 2 0.5-2.2mg/m 剂量的外消旋氨基蝶呤代替每周给药 4-13mg/m 剂量的甲氨蝶呤， 从而用外 消旋氨基蝶呤代替甲氨蝶呤治疗幼年类风湿关节炎。 在另一个实施例中， 在治疗方案中， 通 过以每周口服 1-4mg 剂量的外消旋氨基蝶呤代替每周给药 15-25mg 剂量的甲氨蝶呤来治疗 成人牛皮癣。
用叶酸开始制备外消旋氨基蝶呤及其二钠盐， 最优选外消旋叶酸， 如美国专 利 7,235,660 描述的方法中使用的原料， 该专利的公开通过参考纳入此处。或者， 使用 Piper 和 Montgomery 的方法制备外消旋氨基蝶呤及其二钠盐， 使用外消旋的 N-( 对氨 基 苯 甲 酰 )- 谷 氨 酸 (Piper and Montgomery， J.Org.Chem.42 ： 208， 1977 ； U.S.Patents 4,077,957 ； 4,079,056 ； and 4,224,446， 这些公开通过参考纳入此处 )。例如， 由容易得到 的原料， 根据反应方程式 1 制备外消旋氨基蝶呤。
反应方程式 1
如上所述， 市售的 2， 4， 5， 6- 四氨基嘧啶， 化合物 1， 与 β- 溴代丙酮醛肟浓缩提 供 2， 4- 二氨基 -6-( 溴甲基 ) 蝶啶， 化合物 2(Taghavi-Moghadam and Pfleiderer， Tet. Lett.38 ： 6835， 1997and Taylor and Portnoy， J.Org.Chem.38 ： 806， 1973)。 或者， 可通过化 合物 1 与 1， 3- 二羟基丙酮反应提供 2， 4- 二氨基 -6- 蝶啶甲醇， 化合物 5(Baugh and Shaw， J.Org.Chem.29 ： 3610， 1964)。 化合物 5 经纯化， 并与溴化氢和二溴三苯基磷 (Ph3PBr2) 在二 甲基乙酰胺中反应得到化合物 2(Piper and Montgomery， J.Org.Chem.42 ： 208， 1977 ； Piper and Montgomery， J.Heterocycl.Chem.11 ： 279， 1974 ； Piper and Montgomery， U.S.Patent
4,077,957 ； and Piper and Montgomery， U.S.Patent 4,079,056)。在其他实施例中， 可通 过化合物 1 与 1， 1- 二氯丙酮反应生成 2， 4- 二氨基 -6-( 溴甲基 ) 蝶啶， 然后再与溴化物反 应生成化合物 2(Catalucci， U.S.Patent4,224,446)。
无 论 其 合 成 路 线， 化 合 物 2 与 N-( 对 氨 基 苯 甲 酰 )-L/D- 谷 氨 酸 ( 即 外 消 旋 N-( 对氨基苯甲酰 )- 谷氨酸 )， 化合物 3 浓缩， 在二甲基乙酰胺中提供外消旋氨基蝶呤， 化 合 物 4(Piper and Montgomery， J.Org.Chem.42 ： 208， 1977 ； Piper and Montgomery， U.S.Patent4,077,957 ； Piper and Montgomery， U.S.Patent 4,079,056 ； and Catalucci， U.S.Patent4,224,446)。 可 用 Hutchings 等 的 方 法 合 成 化 合 物 3(J.Biol.Chem.1947， pg.343)。简单地说， 将对硝基苯甲酰氯在 NaOH 水溶液中与外消旋谷氨酸进行浓缩。产物 对硝基苯甲酰 - 外消旋 - 谷氨酸经催化加氢 (H2， 钯活性炭 ) 还原成化合物 3。本领域的技 术人员熟知很多将芳香硝基还原成胺的方法。
除了外消旋氨基蝶呤， 本发明药物组合物可包含一种或多种药学上可接受的载体 及其他可选治疗成分。根据传统的药物复合技术， 通过将外消旋氨基蝶呤与一种或多种药 物载体紧密混合， 来制备药物组合物。外消旋氨基蝶呤通常只占药物组合物总量很小的比 例。
药物载体可采取各种各样的形式， 取决于用于如口服或肠外 ( 包括静脉注射或注 入 ) 给药的所需药物组合物的形式 ( 如 “制剂” 或 “形式” )。在制备口服剂型药物组合物 时， 常用的任何药物载体均可使用。常用的药物载体包括 ： 如在口服液体制剂 ( 如悬浮液、 溶液和酏剂 ) 中包括 ： 水、 二醇类、 油、 酒精、 调味剂、 防腐剂、 着色剂及其类似物 ； 气溶胶 ； 或 在口服固体制剂 ( 如粉剂、 胶囊和片剂 ) 中， 载体包括如淀粉、 糖 ( 如乳糖 )、 微晶纤维素、 稀 释剂、 造粒剂、 润滑剂、 粘合剂、 崩解剂及其类似物， 相对口服液体制剂， 通常优选口服固体 制剂。然而， 对儿科患者， 首选口感宜人的口服液体制剂。由于片剂和胶囊易于给药， 在成人中是最有优势的口服剂型， 这种情况下， 使用固 体药物载体。如有需要， 可用标准水性或非水性技术对片剂包衣。肠外剂型可包含活性成 分的无菌溶液， 在生理缓冲液或无菌水中以其自由基或盐的形式存在。 此外， 肠外溶液中还 可包含防腐剂如苯扎氯铵、 对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯和氯丁醇。本领域标准 参考文献， 雷明顿药物科学 (Remington′ s Pharmaceutical Sciences) 中描述了合适的药 物载体。
除了上述所列一般剂型， 本发明药物组合物可通过控释手段和 / 或输送装置给 药， 如 美 国 专 利 3,845,770 ； 3,916,899 ； 3,536,809 ； 3,598,123 ； 3,630,200 ； 4,008,719 ； 4,687,660 和 4,769,207 中的描述， 这些专利的公开通过参考纳入此处。
可选地， 药物组合物还包括其它治疗成分。 加入这些治疗成分可减轻某些副作用， 特别是外消旋氨基蝶呤的副作用， 或者可减少患者必须服用的剂型数从而方便患者。用于 与药物组合物结合的合适的治疗成分包括， 如叶酸、 亚叶酸、 强的松、 cox-2 抑制剂、 非甾体 抗炎药、 长春新碱、 地塞米松、 天门冬酰胺酶、 道诺霉素、 疏基嘌呤、 依托泊苷、 阿糖胞苷、 阿 霉素、 顺铂、 异环磷酰胺、 紫杉醇、 5- 氟尿嘧啶、 卫康醇、 他莫昔芬、 哌嗪二酮、 米托蒽醌、 地吖 醌、 胺噻唑、 甲胺蝶呤、 替尼泊苷、 长春新碱、 棘霉素、 6- 疏基嘌呤、 地塞米松、 环磷酰胺、 可溶 性 TNF 受体、 抗体和人源化抗体。
本发明方法和组合物使用的术语 “药学上可接受的盐” 指由药学上可接受的无毒 酸或碱 ( 包括无机酸和碱、 有机酸和碱 ) 制备的盐。氨基蝶呤的钠盐或二钠盐是外消旋氨 基蝶呤药学上可接受的盐。
由于外消旋氨基蝶呤既有碱性又有酸性， 可通过药学上可接受的无毒酸或碱 ( 包 括无机酸和有机酸或无机碱和有机碱 ) 来制备其盐。这种盐可包含以下任何阴离子 ： 醋酸 根、 苯磺酸根、 苯甲酸根、 樟脑磺酸根、 柠檬酸根、 富马酸根、 葡萄糖酸根、 氢溴酸根、 盐酸根、 乳酸根、 马来酸根、 扁桃酸根、 粘酸根、 硝酸根、 扑酸根、 磷酸根、 琥珀酸根、 硫酸根和酒石酸 根等。这些盐也可包含以下阳离子 ： 铝、 钙、 锂、 镁、 钾、 钠、 锌、 苄星青霉素、 氯普鲁卡因、 胆 碱、 二乙醇胺、 乙二胺、 甲葡胺和普鲁卡因。
可使用任何合适的给药途径为患者提供治疗上有效的量的外消旋氨基蝶呤或其 药学上可接受的盐， 例如， 口腔、 直肠、 肠外、 经过皮肤、 皮下、 肌肉及其它合适的途径。剂型 包括片剂、 包衣片剂、 含片、 分散液、 悬浮液、 溶液、 囊片、 胶囊和贴剂等。药物组合物包括这 些适合口服、 直肠给药和肠外 ( 包括皮下、 肌肉和静脉 ) 给药的药物组合物， 尽管在任何情 况下， 给药的最合适的途径取决于治疗的疾病的性质和严重程度。最优选的途径是口腔给 药。药物组合物可以方便的以单位剂型存在， 并按照制药领域任何已知的方法制备。
本发明适合口服的药物组合物可作为离散单元， 如胶囊、 扁囊剂、 或片剂、 或气溶 胶喷雾剂， 每种均包含预定量的药物活性成分， 药物活性成分为粉末或颗粒， 或溶液或水溶 液中的悬浮液， 非水液体， 水包油型乳液， 或油包水型乳液的形式。这些药物组合物可用任 何制药方法制备， 但所有方法均包含与活性药物成分一起引入至少一种药物载体的步骤。 通常， 可将活性药物成分与液态药物载体或细磨的固体药物载体， 或两种药物载体一起均 匀、 密切的混合来制备药物组合物， 必要时， 可将产物塑性为想要的外观。
例如， 片剂可选择一种或多种辅助成分， 通过压缩或模压来制备。在合适的机器 中， 通过压缩自由流动形式 ( 如粉末或颗粒 )、 可选择地与粘合剂、 润滑剂、 惰性稀释剂、 表面活性剂和分散剂混合的活性药物成分， 来制备压缩片剂。 在合适的机器中， 通过对用惰性 稀释剂润湿的粉状化合物的混合物压膜来制备模压片剂。
理想上， 每片片剂中含有约 0.25-4mg 的外消旋氨基蝶呤或其治疗上可接受的盐， 每个扁囊剂或胶囊中含有约 0.25-4mg 外消旋氨基蝶呤或其治疗上可接受的盐。最优选地， 片剂、 扁囊剂或胶囊含有两种剂量中的一个， 约 0.25mg 或约 1mg 的外消旋氨基蝶呤或其治 疗上可接受的盐。
在其他优选实施例中， 其他的剂型含有 0.05mg、 0.75mg、 0.1mg、 0.15mg、 0.2mg、 0.25mg 、 0.3mg 、 0.35mg 、 0.4mg 、 0.45mg 、 0.5mg 、 0.55mg 、 0.6mg 、 0.65mg 、 0.7mg 、 0.75mg 、 0.8mg、 0.85mg、 0.9mg、 0.95mg 或 1.0mg 的外消旋氨基蝶呤或其治疗上可接受盐。在其他实 施例中剂型是片剂。在另一个实施例中， 每周剂量包括口服 1 至 3 个任何剂量组合的剂型。 上述外消旋氨基蝶呤累积的周剂量可通过特定时间一次给药或一天中多次给药， 或多天给 药。使用本发明方法， 已经发现可向有炎症性疾病却无毒性表现的患者进行外消旋氨基蝶 呤的给药， 且在最优选实施例中进行不间断给药。 在另一个优选实施例中， 一种剂型中外消 旋氨基蝶呤或其药学上可接受的盐的含量为 0.00025-7.0mg， 更优选 0.00025-0.5mg， 更优 选 0.00025-0.4mg， 更优选 0.00025-0.3mg， 更优选 0.00025-0.2mg， 更优选 0.00025-0.1mg。 在优选实施例中， 所述剂型为片剂。 实施例 1
药物组合物
剂量强度为 0.25mg( 批号 157I0907) 和 1.0mg( 批号 387I1100 和 116I0604) 的光 学纯、 外消旋的、 刻痕的、 立即释放 (IR) 的片剂制剂， 见表 1。
表1
在任何情况下， 片剂中的药物均为二钠盐， 所要求的片剂的剂量强度为左旋体或 右旋体加左旋体的游离酸 ( 即二酸 ) 当量。
实施例 2
片剂制剂中左旋体和右旋体的分析
利用带有手性流动相的等度反相高效液相色谱法确定左旋体片剂制剂 ( 批号 387I1100 和 116I0604) 中对映体的纯度， 并测定外消旋片剂制剂 ( 批号 157I0907) 中左旋 体与右旋体的相对含量。该方法包括以下步骤 ：
*步骤 1 ： 用于高效液相色谱的分析的手性流动相。将 L- 脯氨酸 (1.86g， 16mmol， Sigma Aldrich product P-0380) 和 水 合 硝 酸 铜 (II)(1.86g， 8mmol， Sigma Aldrich product 229636) 溶解于 1L 经过滤和脱气的 HPLC 级水 (J.T.Baker product 4218-03) 中。使用 pH 计， 用 5N NaOH( 接近 2.5ml) 将溶液的 pH 值调节至 6.00。
步骤 2 ： L- 氨基蝶呤标准制剂。在二甲基乙酰胺中配制 1.0mg/ml 的 L- 氨基蝶呤 溶液 (Sigma Aldrich product A1784)。 将 100μl 的该溶液加入至 900μl 的流动相 (16mM 的 L- 脯氨酸和 8mM 水合硝酸铜 (II)) 中稀释 10 倍， 得到用于分析的 0.1mg/ml 的 L- 氨基 蝶呤标准制剂的溶液。
步骤 3 ： D- 氨基蝶呤标准制剂。在二甲基乙酰胺中配制 1.0mg/ml 的 D- 氨基蝶呤 ( 实验室合成 ) 溶液。将 100μl 的该溶液加入至 900μl 的流动相 (16mM 的 L- 脯氨酸和 8mM 水合硝酸铜 (II)) 中稀释 10 倍， 得到用于分析的 0.1mg/ml 的 D- 氨基蝶呤标准制剂的 溶液。
步骤 4 ： 系统适应性制剂。将在上述流动相中步骤 2 和步骤 3 得到的 0.1mg/ml 的 标准溶液各 500μl 混合， 得到 L- 氨基蝶呤与 D- 氨基蝶呤 50 ∶ 50 的混合物， 提供 L- 和 D- 氨基蝶呤的混合物， 浓度均为 0.05mg/ml。
步骤 5 ： 色谱系统。 将配备有可变波长检测器 (VWD) 的液相色谱仪的检测波长设定 为 370nm， 色谱柱为 2.0mm x 50mm( 即 a Phenomenex Gemini， 5μm， C18)。 等度流动相 条件是 100％溶剂 A(16mM 的 L- 脯氨酸和 8mM 水合硝酸铜 (II)， pH ＝ 6.0)， 流速为 0.6ml/ min。通过使用柱式加热炉， 在分析过程中， 将柱温保持在 60℃。
步骤 6 ： 程序
6a ： 空白基线。向色谱仪进 5μl 样品稀释液 (10％二甲基乙酰胺水溶液 )， 记录下 色谱图和色谱峰的响应。将得到的峰定义为空白进样的峰， 并记录峰面积。后续的计算中 应扣除这些峰的面积。
6b ： 标准品和适应性制剂。准备 5μl D- 氨基蝶呤标准制剂， D- 氨基蝶呤标准制 剂和系统适应性溶液分别向色谱进样， 记录色谱图和色谱峰的响应。记录下基线空白色谱 图中不存在的色谱峰面积。以下情况能满足系统适应性 ： (1) 彼此分开的 L- 氨基蝶呤和 D- 氨基蝶呤的色谱峰的分辨率 R 不小于 1.5， (2) 在纯的 D- 氨基蝶呤和 L- 氨基蝶呤标准 制剂中没有可辨别的 D- 氨基蝶呤和 L- 氨基蝶呤色谱峰， (3) 对于 D- 氨基蝶呤和 L- 氨基 蝶呤 50 ∶ 50 的混合物， 其 6 次重复进样的色谱峰面积的相对标准偏差不大于 1.0％， 6次 进样 L- 氨基蝶呤与 D- 氨基蝶呤的平均峰面积比为 0.98-1.02。
6c ： 样品。将片剂制剂浸泡在水中提供 1mg/ml 的溶液， 接着用水将上述溶液稀释 10 倍作为试验样品。每次进样 5μl 重复进样 3 次。计算 L- 氨基蝶呤与 D- 氨基蝶呤的平 均峰面积。可通过平均值计算各自的百分比。如果没有可辨别的 L- 氨基蝶呤或 D- 氨基蝶 呤色谱峰， 则报告其含量为 0％。
表2
使用此程序， 确定纯左旋体片剂制剂 ( 批号 387I1100 和 116I0604) 中对映体的纯 度， 并测定外消旋片剂制剂 ( 批号 157I0907) 中左旋体和右旋体的相对含量， 见表 2。实施例 3
片剂制剂中氨基蝶呤异构体总量的定量
采 用 反 相 高 效 液 相 色 谱 梯 度 法 分 析 纯 左 旋 体 片 剂 制 剂 ( 批 号 387I1100 和 116I0604) 中和外消旋片剂制剂 ( 批号 157I0907) 中氨基蝶呤异构体的总量。该方法包括 以下步骤 ：
步骤 1 ： 流动相制剂。 将 100ml 1.0M 的三乙基醋酸铵缓冲溶液 (1.0M TEAAC， Fluka product 90357) 溶解于 900ml HPLC 级水中， 配置成 1L 经过滤和脱气的 0.1M 的三乙基醋酸 铵缓冲溶液， 作为溶剂 A。1L 经过滤和脱气的乙腈用作溶剂 B。
步骤 2 ： L- 氨基蝶呤标准品。称取一定量 (50mg x 565.2/440.4) 的 L- 氨基蝶呤 标准品 ( 二钠盐 )( 即等同于 50mg 游离酸的量 )。将 L- 氨基蝶呤标准品转移至 50ml 容量 瓶中， 用溶剂 A 溶解至 50ml， 以提供 1.0mg/ml 的溶液 ( 游离酸当量 )。接着再将 100μl 该 溶液加到 900μl 溶剂 A 中， 将其稀释 10 倍， 得到 0.1mg/ml 的溶液。
步骤 3 ： 色谱系统。将配备有可变波长检测器 (VWD 的液相色谱的波长设定为 260nm， 色谱柱为 2.0mm x 50mm( 即 Phenomenex Gemini 5μm， C18)。流动相条件为 在超过 30 分钟的时间中从 95 ％的溶剂 A(0.1M TEAAC) ： 5 ％溶剂 B( 乙腈 ) 变至 5 ％溶剂 A(0.1M TEAAC) ： 95％溶剂 B， 在 95％溶剂 B 状态保持 10 分钟， 并在 95％溶剂 A ： 5％溶剂 B 时重新平衡 15 分钟。流速为 0.200ml/min。
步骤 4 ： 程序
4a ： 基线响应。向色谱仪中进 5μl 的溶剂 A， 记录色谱图和色谱峰的响应。获得 的色谱峰定义为空白进样中的色谱峰， 并记录其峰面积。后续的面积计算中应扣除这些峰 的面积。
4b ： 标准品响应。向色谱仪中进 5μl 的 L- 氨基蝶呤标准品， 重复进样三次， 记录 色谱图和平均峰面积响应。标准品在约 7 分钟的时间流出， 并且在非手性方法中， 左旋体和 右旋体共同流出。
4c ： 样品响应。将片剂制剂按以下操作溶解在溶剂 A 中 ： 批号 157I0907， 每 5ml 水 溶解片剂 10 片 (0.5mg/ml) ； 批号 387I1100 和 116I0604， 每 20ml 水溶解片剂 5 片 (0.25mg/ ml)。经离心后， 取每个制剂的上清液， 重复进样 3 次， 每次 5μl。计算每个片剂中氨基蝶呤 的平均峰面积和标准偏差 (SD)， 再除以标准品的平均峰面积得到每个片剂中氨基蝶呤的含 量。 使用此程序， 对纯左旋体片剂制剂 ( 批号 387I1100 和 116I0604) 和外消旋片剂制 剂 ( 批号 157I0907) 中总的氨基蝶呤进行定量， 见表 3。
表3
实施例 4
药代动力学及在比格犬体内的吸收
对 10 只 (N ＝ 10) 比格犬进行药代动力学研究， 以测试 1 片纯左旋体片剂制剂 ( 批 号 116I0604)， 与 99mg 的微晶纤维素混合的 1mg 的右旋体， 和 4 片外消旋片剂制剂 ( 批号 157I0907) 的口服吸收。 各制剂均装在硬胶囊中， 通过直接的胃部给药。 每个制剂的剂量给 药由 7 天的清洗期隔开。10 只犬的平均体重是 11.3±1.7(SD)kg。
在每次给药前， 以及每次给药后 0.5h、 1h、 1.5h、 2h、 3h、 6h、 9h 和 12h， 采集含有 EDTA 作为抗凝血剂的静脉血液样品， 用作药代动力学分析。对样品进行离心， 收集血浆并 冻结用于分析。本研究中并未对尿液采样。采用非手性液相色谱 / 质谱法 (LC/MS) 分析 (Advion Biosciences， Ithaca， New York) 对血浆样品中的氨基蝶呤进行定量。该分析的 定量低限 (LLOQ) 为 0.5ng/ml 或 1.2nM。用手性 LC/MS 分析可测定动物服用外消旋体后， 血 浆样品中左旋体和右旋体的含量。
给药的每种剂型的每种对映体的平均血浆浓度 ( 每种剂型 N ＝ 10) 列于表 4 中， 并在图 1、 图 2、 图 3 用图形方式展示出。这些数据表明 ： 尽管右旋体的系统暴露量约为左 旋体系统暴露量的 30％ ( 即 AUC 比 )， 当分别给药时， 左旋体和右旋体均能被有效吸收。然 而， 当左旋体和右旋体作为外消旋组合同时给药， 与左旋体吸收的立体选择性一致， 右旋体 并没有系统暴露量。
表4
从该研究中得到的含有左旋体的制剂的药代动力学参数 ( 左旋体的给药量为标 准剂量 ) 列于表 5 中。Cmax、 AUC(0-12hrs) 和 AUC ∞的值绘制在图 4 中。意外地， 数据表明 ： 与仅 含有左旋体的制剂中左旋体的吸收相比， 外消旋制剂中的左旋体 ( 三种药代动力学参数 P ＜ 0.05， 配对 t 检验 ) 的系统暴露量显著增强 ( 如 Cmax、 AUC(0-12hrs) 和 AUC ∞所测定的 )。 表5
实施例 5 药代动力学及在人体内的吸收通过对 21 岁或以上， 患有中度到重度牛皮癣的男性和女性受试者进行随机、 单剂 量和两期交叉研究， 来对 0.25mg 外消旋氨基蝶呤片剂 (D 和 L- 氨基蝶呤， 批号 157I0907) 与 1.0mg 参比 L- 氨基蝶呤片剂 ( 批号 387II100) 的药代动力学和安全性进行比较。将受试者 随机分配到两个平行的组 ( 每组 N ＝ 6) 中， 使其分别摄取 1.0mg 单剂量的外消旋氨基蝶呤 片剂 (4×0.25mg 片剂 ) 或参比 L- 氨基蝶呤片剂 (1×1.0mg 片剂 )， 得到每个受试者 10 小 时的血液样本。7 天后， 将两组受试者相互交换至该测试的另一组， 分别口服 1.0mg 单剂量 的另一种制剂， 再次得到超过 10 小时的血液样本。
最终结果分析包括血浆中氨基蝶呤的 AUC(0-12hrs)、 AUC ∞和 Cmax 分析。对血浆做进一 步的手性分析， 以测定左旋体和右旋体的不同吸收程度。 可通过非手性 LC/MS 分析 (Advion Biosciences， Ithaca， New York) 对血浆样品中的氨基蝶呤定量。 该分析的定量下限 (LLOQ) 为 0.5ng/ml 或 1.2nM。 使用手性 LC/MS 分析可测定服用外消旋体的动物血浆样品中的左旋 体和右旋体的含量。
在犬科动物的例子中， 两种制剂的血浆中仅检测到了左旋体， 这与外消旋体肠道 吸收对左旋体的立体选择性一致。从该研究得到的两种制剂的药代动力学参数列于表 6。
表6
Cmax、 AUC(0-12hrs) 和 AUC ∞的值绘于图 5。意外地， 人体与犬体内一样， 数据表明 ： 与仅 含有左旋体的制剂中左旋体的吸收相比， 外消旋体制剂中左旋体的系统暴露量得到了增强 ( 如 Cmax、 AUC(0-12hrs) 和 AUC ∞所测定的 )。
虽然本发明特别提到了某些实施例， 但是可以理解在以下权利要求的范围和精神 内， 普通技术人员可做出修改和变更。