突变植物及其生产方法.pdf

根据本发明，基于通过分析具有CPC样Myb序列的功能未知基因的功能获得的发现提供新的突变植物；以下蛋白的任一种的功能被抑制：(a)含有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白；和(b)含有的氨基酸序列具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的取代、缺失、添加或插入的蛋白，并且所述蛋白能够用作控制表皮细胞分化的转录因子；通过抑制以上蛋白的功能可以获得具有特征表型的植物，例如所述植物生长尺寸可大于野生型植物。

1.  一种突变植物，其中以下蛋白(1)-(3)中任一种的功能被抑制：
(1)含有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白；
(2)含有具有一个或多个氨基酸的取代、缺失、添加或插入的SEQID NO：2所示氨基酸序列的蛋白，并且所述蛋白能够用作控制表皮细胞分化的转录因子；和
(3)由多核苷酸编码的蛋白，所述多核苷酸具有一个或多个核苷酸的取代、缺失、添加或插入的SEQ ID NO：1所示核苷酸序列，并且所述蛋白能够用作控制表皮细胞分化的转录因子。

2.  权利要求1的突变植物，其中所述突变植物没有编码蛋白(1)-(3)中任一种的基因。

3.  权利要求1的突变植物，其中所述突变植物为双子叶植物。

4.  权利要求1的突变植物，其中所述突变植物为十字花科(Brassicaceae)植物。

5.  一种生产突变植物的方法，所述方法包括抑制目标植物中以下蛋白(1)-(3)中任一种的功能：
(1)含有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白；
(2)含有具有一个或多个氨基酸的取代、缺失、添加或插入的SEQID NO：2所示氨基酸序列的蛋白，并且所述蛋白能够用作控制表皮细胞分化的转录因子；和
(3)由多核苷酸编码的蛋白，所述多核苷酸具有一个或多个核苷酸的取代、缺失、添加或插入的SEQ ID NO：1所示核苷酸序列，并且所述蛋白能够用作控制表皮细胞分化的转录因子。

6.  权利要求5的生产突变植物的方法，包括缺失编码蛋白(1)-(3)中任一种的基因。

7.  权利要求5的生产突变植物的方法，其中所述目标植物为双子叶植物。

8.  权利要求5的生产突变植物的方法，其中所述目标植物为十字花科植物。

9.  一种生产突变植物的方法，所述突变植物生长至比野生型植物大的尺寸，或早于野生型植物开花，所述方法包括抑制目标植物中以下蛋白(1)-(3)中任一种的功能：
(1)含有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白；
(2)含有具有一个或多个氨基酸的取代、缺失、添加或插入的SEQID NO：2所示氨基酸序列的蛋白，并且所述蛋白能够用作控制表皮细胞分化的转录因子；和
(3)由多核苷酸编码的蛋白，所述多核苷酸具有一个或多个核苷酸的取代、缺失、添加或插入的SEQ ID NO：1所示核苷酸序列，并且所述蛋白能够用作控制表皮细胞分化的转录因子。

10.  权利要求9的生产突变植物的方法，包括缺失编码蛋白(1)-(3)中任一种的基因。

11.  权利要求9的生产突变植物的方法，其中所述目标植物为双子叶植物。

12.  权利要求9的生产突变植物的方法，其中所述目标植物为十字花科植物。

突变植物及其生产方法
技术领域
本发明涉及具有特征形态学的突变植物及其生产方法。
背景技术
非特许文件1公开了CAPRICE(后文称为CPC蛋白)，其为具有R3 MYB基序的蛋白，通常涉及拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的根毛细胞分化。非特许文件2记载因发生此CPC蛋白的细胞间移动(由非根毛细胞至根毛细胞)，使得CPC蛋白抑制同源域-亮氨酸拉链基因(GLABRA2)的表达。
已在拟南芥基因组中发现了4类CPC样Myb序列，例如TRIPTYCHON基因(TRY基因)。因为在没有TRY基因的品系中观测到毛状体丛，所以TRY蛋白控制毛状体形成。Kirik等已鉴别出以上4类CPC样Myb序列中的2类(称为ETC1和ETC2)，并遗传分析了这些序列和CPC或TRY之间的关系(非特许文件3和4)。David Marks团队分析了TRY和At1g01380(ETC1)之间的关系，他们证实GL3控制TRY基因表达，但不控制ETC1表达(非特许文件5)。
然而，迄今为止还没有分析各自均含有CPC样Myb序列的其它基因。因此，这些基因的功能仍是未知的。
非特许文件1：Wada，T.，Tachibana，T.，Shimura，Y.，和Okada，K.(1997).Epidermal cell differentiation in Arabidopsis determined by a Mybhomolog，CPC.Science 277，1113-1116。
非特许文件2：Wada，T.，Kurata，T.，Tominaga，R.，Koshino-Kimura，Y.，Tachibana，T.，Goto，K.，Marks，M.D.，Shimura，Y.，和Okada，K.(2002).Role of a positive regulator of root hair development，CAPRICE，in Arabidopsis root epidermal cell differentiation.Development 129，5409-5419。
非特许文件3：Kirik，V.，Simon，M.，Huelskamp，M.，和Schiefelbein，J.(2004b).The ENHANCER OF TRY AND CPC1 geneacts redundantly with TRIPTYCHON and CAPRICE in trichome and roothair cell patterning in Arabidopsis.Dev Biol 268，506-513。
非特许文件4：Kirik，V.，Simon，M.，Wester，K.，Schiefelbein，J.，和Hulskamp，M.(2004a).ENHANCER of TRY and CPC2(ETC2)revealsredundancy in the region-specific control of trichome development ofArabidopsis.Plant Mol Biol 55，389-398。
非特许文件5：Esch，J.J.，Chen，M.A.，Hillestad，M.，和Marks，M.D.(2004).Comparison of TRY and the closely related At1g01380 genein controlling Arabidopsis trichome patterning.Plant J 40，860-869。
本发明的公开内容
本发明的一个目标是提供一种新的突变植物和提供生产所述突变植物的方法，其发现现基础是分析具有CPC样Myb序列的功能未知基因的功能获得的发现，。
对具有CPC样Myb序列的功能未知的基因的功能分析后，本发明人已发现，没有该基因的品系与野生型植物相比具有特征形态学。该发现使得完成了本发明。
具体地说，本发明包括以下内容。
(1)一种突变植物，其中以下蛋白(a)-(c)中任一种的功能被抑制：
(a)含有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白；
(b)含有的氨基酸序列具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的取代、缺失、添加或插入的蛋白，并且其能够用作控制表皮细胞分化的转录因子；和
(c)由多核苷酸编码的蛋白，所述多核苷酸含有的核苷酸序列具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中的一个或多个核苷酸的取代、缺失、添加或插入，并且所述蛋白能够用作控制表皮细胞分化的转录因子。
(2)根据(1)的突变植物，其中所述突变植物没有编码以上蛋白(a)-(c)中任一种的基因。
(3)根据(1)的突变植物，其中所述突变植物为双子叶植物。
(4)根据(1)的突变植物，其中所述突变植物为十字花科(Brassicaceae)植物。
(5)一种生产突变植物的方法，其包括抑制目标植物中以下蛋白(a)-(c)中任一种的功能：
(a)含有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白；
(b)含有的氨基酸序列具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的取代、缺失、添加或插入的蛋白，并且其能够用作控制表皮细胞分化的转录因子；和
(c)由多核苷酸编码的蛋白，所述多核苷酸含有的核苷酸序列具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中的一个或多个核苷酸的取代、缺失、添加或插入，并且所述蛋白能够用作控制表皮细胞分化的转录因子。
(6)根据(5)生产突变植物的方法，包括缺失编码以上蛋白(a)-(c)中任一种的基因。
(7)根据(5)生产突变植物的方法，其中所述目标植物为双子叶植物。
(8)根据(5)生产突变植物的方法，其中所述目标植物为十字花科植物。
(9)一种生产突变植物的方法，所述突变植物生长至比野生型植物大的尺寸，或早于野生型植物开花，所述方法包括抑制目标植物中以下蛋白(a)-(c)中任一种的功能：
(1)含有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白；
(2)含有的氨基酸序列具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的取代、缺失、添加或插入的蛋白，并且其能够用作控制表皮细胞分化的转录因子；和
(3)由多核苷酸编码的蛋白，所述多核苷酸含有的核苷酸序列具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中的一个或多个核苷酸的取代、缺失、添加或插入，并且所述蛋白能够用作控制表皮细胞分化的转录因子。
(10)根据(9)生产突变植物的方法，包括缺失编码以上蛋白(a)-(c)中任一种的基因。
(11)根据(9)生产突变植物的方法，其中所述目标植物为双子叶植物。
(12)根据(9)生产突变植物的方法，其中所述目标植物为十字花科植物。
本说明书包括在日本特许申请号2006-278988的说明书中公开的部分或全部内容，该特许申请是本申请的优先权文件。

附图简述
图1-1是系统进化树，显示了CPL3基因和水稻来源的直系同源物之间的关系。
图1-2显示了LOC_Os01g43180、LOC_Os01g43230、CPC、TRY、ETC1、ETC2和CPL3的氨基酸序列比对。
图2显示了CPC蛋白、ETC1蛋白、ETC2蛋白、TRY蛋白和CPL3蛋白的氨基酸序列比对，并图示了每个均缺失相关基因的突变体的T-DNA插入位点。
图3是特征图，显示了在针对CPC基因、TYR基因、ETC1基因、ETC2基因和CPL3基因的双突变体和三突变体中确定根毛数的结果。
图4是特征图，显示了在针对CPC基因、TYR基因、ETC1基因、ETC2基因和CPL3基因的双突变体和三突变体中确定毛状体数的结果。
图5是特征图，显示了检测相同生长期的cpl3-1突变体、35S::CPL3转化体、CPL3::CPL3转化体和野生型植物的毛重的结果。
图6显示了相同生长期的cpl3-1突变体、35S::CPL3转化体、CPL3::CPL3转化体和野生型植物的图片。
图7是特征图，显示了检测cpl3-1突变体、CPL3::CPL3转化体和野生型植物中的核内再复制水平的结果。
图8是特征图，显示了测定每个突变体和转化体中的真叶数的结果。
图9是特征图，显示了测定单个突变体和转化体直至抽苔时的天数的结果。
图10显示的图片指示使用光学显微镜观察cpl3-1突变体、CPL3::CPL3转化体和野生型植物的叶和胚轴中的细胞表型的结果。
图11是特征图，显示了比较转化体中的根毛数的结果，每个转化体均在35S启动子或其自身启动子控制下过表达CPC基因、ETC1基因、ETC2基因、TRY基因或CPL3基因。
图12是特征图，显示了比较转化体中的毛状体数的结果，每个转化体均在35S启动子或其自身启动子控制下过表达CPC基因、ETC1基因、ETC2基因、TRY基因或CPL3基因。
图13显示的图片指示用转化体检查基因表达模式的结果，所述转化体在CPC基因、ETC1基因、ETC2基因、TRY基因或CPL3基因的启动子控制下表达GUS蛋白。
图14显示了使用高度表达GFP融合蛋白的转化体检查CPC基因、ETC1基因、ETC2基因、TRY基因和CPL3基因中的每一个的表达模式的检查结果，以及经由RT-PCR和原位杂交检查各个基因的表达模式的结果。
图15显示了实时PCR结果，指示在cpc、try、etc1、etc2和cpl3突变植物中的CO、FT、SOC1和CPL3表达水平。
实施本发明的最佳方式
在后文将更详细地描述本发明。
通过缺失存在于野生型植物中的特定蛋白的功能获得本发明的突变植物。本发明的突变植物的特征在于，其生长尺寸大于野生型植物。具体地说，本发明的突变植物的特征在于，其重量(在相同条件下栽培而获得与野生型植物相当的尺寸时检测)显著高于野生型植物的重量。另外，本发明的突变植物的特征在于，其早于野生型植物开花。
本文使用的表述“缺失蛋白的功能”指包括缺失基因组中编码蛋白的基因、抑制编码蛋白的基因的表达以及降低蛋白的活性。
更具体地说，缺失编码特定蛋白的基因的可用方法的实例包括但不限于涉及同源重组的方法和使用转座子的方法。另外，在缺失所述基因时，可缺失该基因的全长序列或部分序列。
此外，抑制编码特定蛋白的基因表达的可用方法的实例包括但不限于：缺失控制基因表达的启动子的方法、用诱导表达的启动子取代控制基因表达的启动子的方法、突变控制基因表达的启动子的方法、经RNA干扰降解基因转录产物的方法以及使用反义RNA抑制基因翻译的方法。
而且，降低特定蛋白活性的可用方法的实例包括制备能够特异性结合蛋白并抑制其作用于蛋白的活性的物质。可以使用的这类物质的实例包括能够抑制蛋白功能的抗体和阻遏物。
在本发明的突变植物中，缺失由拟南芥(Arabidopsis thaliana)中登记为At4g01060的基因编码的蛋白的功能。具体地说，登记为At4g01060的基因在本文被称为CPL3基因，其编码含CPC-样Myb序列的蛋白。CPL3基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO：1。由CPL3基因编码的CPL3蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO：2。
因此，本发明的突变植物没有以下蛋白(1)、(2)或(3)的功能：
(1)含有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白；
(2)含有的氨基酸序列具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的取代、缺失、添加或插入的蛋白，并且其能够用作控制表皮细胞分化的转录因子；或
(3)由多核苷酸编码的蛋白，所述多核苷酸含有的核苷酸序列具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中的一个或多个核苷酸的取代、缺失、添加或插入，并且所述蛋白能够用作控制表皮细胞分化的转录因子。
本文使用的表述“多个氨基酸”指例如2-33个氨基酸残基，优选2-15个氨基酸残基，更优选2-5个氨基酸残基。另外，引入一个或多个氨基酸的取代、缺失、添加或插入的位置的实例包括在SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列中的3-5位和21-32位以及77位的区域，以及之后的区域。因为这些区域是非CPC样Myb序列区域，所以在所述区域中引入一个或多个氨基酸的取代、缺失、添加或插入不会显著改变CPL3蛋白的功能。
另外，由上述“多个氨基酸”引出的表述“多个核苷酸”指例如6-99个核苷酸，优选6-45个核苷酸，更优选6-15个核苷酸。另外，由以上“多个氨基酸”引出，引入一个或多个核苷酸的取代、缺失、添加或插入的位置的实例包括在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中的9-15位和63-96位以及231位的区域，以及之后的区域。
此外，本发明可应用于任何植物。因此，本发明可应用于任何植物，只要野生型植物包含如上定义的蛋白。例如，本发明特别优选地适用于双子叶植物，最优选地适用于以拟南芥为代表的十字花科植物。
可用的十字花科植物的实例包括属于芸苔(Brassica)属的植物，例如大白菜(Hakusai)(B.campestris)、小松菜(Komatsuna)(B.campestrisvar.peruviridis)、芥菜(B.juncea)、高菜(Takana)(B.juncea var.integlifolia)、羽衣甘蓝(kale)(B.oleracea var.acephala)、叶牡丹(Habotan)(B.oleracea var.acephala)、花椰菜(B.oleracea var.botrytis)、甘蓝(B.oleracea var.capitata)、球芽甘蓝(B.oleracea var.gemmifera)、撇蓝(B.oleracea var.gongylodes)、椰菜(B.oleracea var.italica)、芜菁(B.rapa)、小白菜(B.rapa var.chinensis)、青萝卜(B.rapa var.hakabura)、水菜(B.rapa var.lancinifolia)和油菜(B.rapa var.nippo-oleifera)。另外，可用的十字花科植物的实例包括属于旱金莲属(Nasturtium)的植物，例如豆瓣菜(N.officinale)；属于独行菜属(Lepidium)的植物，例如独行菜(L.sativum)；属于萝卜属(Raphanus)的植物，例如萝卜苗(seeding radish)(R.sativus)和萝卜(R.sativus var.radicula)；属于芝麻莱属(Eruca)的植物，例如芝麻菜(Rucola)(E.vesicaria)；属于山萮菜属(Wasabia/Eutrema)的植物，例如山萮菜(W.japonica)；属于辣根属(Armoracia)的植物，例如辣根(A.rusticana)；属于紫罗兰属(Matthiola)的植物，例如紫罗兰(stock)(M.incana)；属于荠属(Capsella)的植物，例如荠菜(C.bursa-pastoris)；属于拟南芥属(Arabidopsis)的植物，例如拟南芥(Thale Cress or Mouse-ear Cress)；属于诸葛菜属(Orychophragmus)的植物，例如诸葛菜(Shokatsusai或Murasakihanana)；和属于焊菜属(Rorippa)的植物。
与此同时，本发明的突变植物不限于以上双子叶植物，其可以为以水稻为代表的单子叶植物。例如，使用示于SEQ ID NO：2的氨基酸序列作为检索关键字，通过在含有水稻基因组序列数据的数据库中检索该基因，有可能在水稻基因组中鉴定对应于CPL3基因的基因。具体地说，有可能在水稻基因组数据库中鉴定CPL3基因的两个直系同源物。各自均存在于染色体1上的这两个直系同源基因已登记为LOC_Os01g43180和LOC_Os01g43230。CPL3基因在氨基酸水平上与LOC_Os01g43180具有63％同源性，在氨基酸水平上与LOC_Os01g43230具有59％同源性。由LOC_Os01g43180编码的蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO：3。由LOC_Os01g43230编码的蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO：4。
另外，对于LOC_Os01g43180和LOC_Os01g43230，已经计算出了它们与TRY基因、CPC基因、ETC1基因和ETC2基因的同源性。LOC_Os01g43180在氨基酸水平上与CPC具有61％的同源性，在氨基酸水平上与ETC2具有54％的同源性，在氨基酸水平上与ETC1具有53％的同源性，在氨基酸水平上与TRY具有51％的同源性。LOC_Os01g43230在氨基酸水平上与ETC2具有56％的同源性，在氨基酸水平上与CPC具有54％的同源性，在氨基酸水平上与ETC1具有49％的同源性，在氨基酸水平上与TRY具有44％的同源性。图1-1是显示以上结果的系统发生树。此外，图1-2显示了LOC_Os01g43180、LOC_Os01g43230、CPC、TRY、ETC1、ETC2和CPL3的氨基酸序列的比对结果。
如上所述，存在于水稻基因组中的LOC_Os01g43180和LOC_Os01g43230与各自均含有CPC-样Myb序列的蛋白中的CPL3具有最高同源性。因此，可以断定，LOC_Os01g43180和LOC_Os01g43230与拟南芥的CPL3基因具有等同功能的概率较高。
如上定义的本发明的突变植物的特征在于，其生长尺寸大于野生型植物。因此，就其中用于突变的目标植物为可食用植物的情况而言，依据本发明，因尺寸增大，可预期提高产量。另外，就其中在用于突变的目标植物中生产物质的情况而言，有可能依据本发明提高这类有用物质的产量。在此，这类物质最初可以是由野生型植物产生的物质，或者可以是经野生型植物转化产生的物质。
此外，本发明突变植物的特征在于其早于野生型植物开花。因此，可促进果实或种子形成，因此，本发明的突变植物的优势在于有可能1年收获多次，其为通常1年仅收获1次的作物。而且，本发明的突变植物的这些特征能够节约作物收获的时间和成本。
以下实施例更详细地描述了本发明，但本发明的范围不限于所述实施例。
(实验实施例1)筛选没有CPL3基因的突变植物
在本实施例中，将拟南芥生态型Col-0(后文称为“野生型拟南芥”)用作野生型植物。在本实施例中，由Wisconsin T-DNA组筛选出其中含有示于SEQ ID NO：1的核苷酸序列的基因已被突变的cpl3-1突变体。
此外，在本实施例中，其中TRY基因已被突变的try-29760突变体、其中ETC1基因已被突变的etc1-1突变体和其中ETC2基因已被突变的etc2-40390突变体分离自SALK T-DNA组。另外，制备其中CPC基因已被突变的cpc-2突变体(公开于Kurata，T等，Cell-to-cellmovement of the CAPRICE protein in Arabidopsis root epidermal celldifferentiation.Development 132，5387-5398(2005))。图2显示了在所获突变体中的T-DNA插入位点。
(实验实施例2)转化植物制备
在本实施例中，制备以下的转化体：在35S启动子控制下组成型表达CPC基因、ETC1基因、ETC2基因、TRY基因和CPL3基因的转化体；高表达GFP融合蛋白的转化体，其每个均含有与GFP基因连接的对应基因；和表达GUS蛋白的转化体，其每个均含有与对应基因的启动子序列连接的GUS基因。
在表1中列出了在本实施例中使用的启动子的名称、核苷酸序列和SEQ ID NO。
表1

为了获得在35S启动子控制下组成型表达对应基因的转化体，制备以下构建体。具体地说，首先使用TW1169和TW1170扩增含有ETC1基因的0.7-kb PCR片段。另外，使用TW1165和TW1166扩增含有ETC2基因的1.4-kb PCR片段。此外，使用TW1167和TW1168扩增含有CPL3基因的0.8-kb PCR片段。而且，使用RT91和RT92扩增含有TRY基因的1.4-kb PCR片段。接着，使用Pyrobest DNA聚合酶(Takara，Japan)将所获PCR片段各自亚克隆入pBluescript SK+(Stratagene)中。制备的质粒被称为pBS-ETC1、pBS-ETC2、pBS-CPL3和pBS-TRY。
接着，将通过用Acc65I和SalI处理pBS-ETC1、pBS-ETC2和pBS-CPL3获得的片段分别插入pCHF3二元载体(Jarvis，P.等，AnArabidopsis mutant defective in the plastid general protein importapparatus.Science 282，100-103(1998))的Acc65I和SalI位点，以便制备35S::ETC1、35S::ETC2和35S::CPL3构建体。另外，以上述方式制备35S::TRY构建体，只是用BamHI和SalI处理pBS-TRY。
制备以下构建体，以便获得高度表达GFP融合蛋白的转化体，每个GFP融合蛋白均含有连接GFP基因的对应基因。具体地说，使用RT67和RT68扩增含有ETC1基因的2.3-kb PCR片段。使用SalI和SmaI对所获物质进行限制酶处理。另外，使用RT69和RT70扩增含有ETC2基因的4.0-kb PCR片段。用SalI和EcoRV消化所获物质。此外，使用RT71和RT72扩增3.0-kb PCR片段。用SalI和EcoRV对所获物质进行限制酶处理。而且，使用RT89和RT90扩增4.0-kb PCR片段。用SalI和SmaI对所获物质进行限制酶处理。将所获片段单独插入pBS-2xGFP(Kurata，T.等，Cell-to-cell movement of the CAPRICEprotein in Arabidopsis root epidermal cell differentiation.Development132，5387-5398(2005))的SalI和EcoRV位点。因此，制备pBS-ETC1:2xGFP、pBS-ETC2:2xGFP、pBS-CPL3:2xGFP和pBS-TRY:2xGFP。
接着，将通过用SalI和XbaI处理pBS-ETC1:2xGFP获得的片段插入pJHA212K二元载体(Yoo，S.Y.等，The 35S promoter used in aselectable marker gene of a plant transformation vector affects theexpression of the transgene.Planta 221，523-530(2005))的SalI和XbaI位点。另外，将通过用SalI和SacII处理pBS-ETC2:2xGFP获得的片段插入pJHA212K二元载体的SalI和SmaI位点。此外，将通过用SalI和SacI处理pBS-CPL3:2xGFP和pBS-TRY:2xGFP获得的片段分别插入pJHA212K二元载体的SalI和SacI位点。
为了获得表达GUS蛋白的转化体，制备以下构建体，GUS蛋白每个均含有连接对应基因的启动子序列的GUS基因。具体地说，使用RT46和RT47扩增含有ETC1基因启动子区的1.9-kb PCR片段。另外，使用RT48和RT49扩增含有ETC2基因启动子区的3.0-kb PCR片段。此外，使用RT50和RT5 1扩增含有CPL3基因启动子区的2.4-kbPCR片段。而且，使用RT88和RT89扩增含有TRY基因启动子区的3.0-kb PCR片段。每个所获扩增片段均用NotI和AccI处理，然后亚克隆入pBS中。制备的质粒分别称为pBS-ETC1、pBS-ETC2、pBS-CPL3和pBS-TRY。
接着，将通过用SalI和BamHI处理pBS-ETC1和pBS-CPL3获得的片段单独插入pBI101二元载体(Clontech Laboratories，Inc.，CA，USA)的SalI和BamHI位点。所获质粒被称为ETC1启动子::GUS和CPL3启动子::GUS。另外，将通过用SalI和XbaI处理pBS-ETC2和pBS-TRY获得的片段单独插入pBI101二元载体的SalI和XbaI位点。获得的质粒被称为ETC2启动子::GUS和TRY启动子::GUS。
使用所获的35S::ETC1、35S::ETC2、35S::CPL3、ETC1::ETC1:2xGFP、ETC2::ETC2:2xGFP、CPL3::CPL3:2xGFP、TRY::TRY:2xGFP、ETC1启动子::GUS、CPL3启动子::GUS、ETC2启动子::GUS和TRY启动子::GUS进行转化，其方法按照在Kurata，T.等，The YORE-YORE gene regulates multiple aspects of epidemal celldifferentiation in Arabidopsis.Plant J 36，55-66(2003)中公开的方法。
[实施例1]没有CPL3基因的突变体的表型
通过PCR鉴定在实验实施例1中分离的F2代的etc1-1突变体、etc2-40390突变体和cpl3-1突变体的纯合子，由此鉴定针对CPC基因、TRY基因、ETC1基因、ETC2基因和CPL3基因的双突变体和三突变体。图3显示了测定突变体(所获的针对各个基因的双突变体和三突变体)中的根毛数的结果。
由图3可见，根毛数在cpl3-1突变体中稍微降低。另外，在针对CPC基因和TRY基因的双突变体、针对CPC基因和ETC1基因的双突变体以及针对TRY基因、CPL3基因和CPC基因的三突变体中观察到根毛数显著下降或基本上没有根毛。
图4显示了在突变体(所获的针对对应基因的双突变体和三突变体)中测定毛状体数的结果。由图4可见，cpl3-1突变体中的毛状体数相比于野生型植物增加，cpc-2突变体也是这样。另外，在针对TRY基因、CPC基因和CPL3基因的三突变体中，毛状体数进一步增加。此外，在针对TRY基因、CPC基因、ETC1基因和CPL3基因的四突变体中，形成了数量进一步增加的毛状体，叶的整个主表面都被毛状体覆盖。
另外，观测在实验实施例1中分离的cpl3-1突变体和在实验实施例2中制备的转化体的生长情况。
图5显示了检测相同生长期的各个植物毛重的结果。图6显示了在该阶段的各个植物的图片。由图5和6可见，没有CPL3基因的突变体生长尺寸大于野生型植物。另一方面，过表达CPL3基因的转化体的生长相当于野生型植物生长的30％。另外，每一个没有CPC基因、ETC1基因、ETC2基因或TRY基因的突变体的生长都仅仅与野生型植物的生长相当(未显示结果)。
此外，图7显示了各个植物的多倍性确认结果。顺便提一句，用Ploidy Analtzer PA流式细胞仪(Partec)按照生产商的说明对播种后2周的各个植物进行多倍性检测。由图7可见，16C峰在没有CPL3基因的突变体中显著增加。结果表明，没有CPL3基因的突变体由于核内再复制提升而表现出与细胞尺寸改善相关的表型。
此外，图8显示了测定各个植物中的真叶数的结果。图9显示了测定各个植物直至抽苔时的天数的结果。由图8和9可见，没有CPL3基因的突变体早于野生型植物和其它突变体及转化体开花。
另外，用光学显微镜观察各个植物的叶和胚轴细胞表型。图10显示了结果。由图10可见，没有CPL3基因的突变体与野生型植物和过表达CPL3基因的转化体相比表现出以下特征：叶表皮细胞增大和胚轴延长。另外，表2列出了检测各个植物的叶大小和测定各个植物的上皮细胞数的结果。
表2

在测定上皮细胞数时，在播种后2周收集第三叶，并用含有下述比率的以下组分的洗涤液洗涤：水合氯醛(重量)∶甘油(体积)∶水(体积)＝8∶2∶1。然后，用Zeiss Axioplan 2(Carl Zwiss，Germany)进行目测检查。在表2中，每个值均代表5个叶的检测结果的平均值。
基于图10和表2所示结果，没有CPL3基因的突变体生长尺寸大于野生型植物，尽管突变体的细胞数没有增加至超过野生型植物的细胞数。因此，业已揭示，在没有CPL3基因的突变体中，个体的细胞生长水平比野生型植物有大幅度的提升。
[实施例2]
在本实施例中，使用在实验实施例2中制备的转化体，相互比较在35S启动子或其自身启动子控制下过表达CPC基因、ETC1基因、ETC2基因、TRY基因或CPL3基因的转化体的根毛数。图11显示了结果。如图11所示，在35S启动子下组成型表达相关基因的每个转化体都表现出比野生型植物高的根毛数。然而，在35S启动子控制下表达CPL3基因的转化体表现出略高于其它转化体的根毛数。此外，在ETC1启动子控制下过表达ETC1基因的转化体表现出比其它在其自身启动子控制下过表达相关基因的转化体和野生型植物较高的根毛数。
另外，图12显示了以上述方式测定各个转化体中的毛状体数的结果。如图12所示，除了在ETC2启动子控制下过表达ETC2基因的转化体之外，所有转化体都完全没有毛状体。另外，在ETC2启动子控制下过表达ETC2基因的转化体具有的毛状体数比野生型植物大幅减少。
[实施例3]
在本实施例中，用在以上基因的任何启动子控制下表达GUS蛋白的转化体检测基因表达模式，所述转化体已在实验实施例2中制备。图13显示了结果。另外，用高度表达GFP融合蛋白(其每个均含有对应基因)的转化体检查单个基因的基因产物的表达模式，所述转化体已在实验实施例2中制备。图14还显示了通过RT-PCR和原位杂交检查各个基因的表达模式的结果。
如图13和14所示，CPC基因、TRY基因和ETC1基因的基因产物特别地在嫩叶毛状体和根表皮的非根毛细胞(无毛细胞)中累积。另外，ETC2基因和CPL3基因的基因产物特别地在含有近轴侧气孔保卫细胞的叶表皮细胞中累积，但在根和毛状体中不累积。尤其是，相比于ETC3基因，CPL3基因以受限的方式在叶、子叶、胚轴和叶柄的气孔保卫细胞中表达。
[实施例4]
在本实施例中，如在实施例1中一样鉴定cpc、try、etc1、etc2和cpl3敲除突变体，如在实验实施例2中一样制备过表达CPL3的植物，检查它们的开花时间和叶数。
表3显示了检查以上突变植物的开花时间和开花时的叶数的结果。顺便提一句，数据表示为单个实验的至少10株植物的平均值±SD。
表3

如表3所示，cpl3敲除的突变植物早于野生型植物开花(28.9±0.5天对37.6±0.5天)。另外，其叶数低于野生型植物的叶数(8.2±0.3对17.4±0.6)。另一方面，在野生型植物和cpc、try、etc1或etc2突变植物之间没有显著差异(表3)。35S:CPL3转基因植物稍晚于野生型植物开花(41.1±1.1对37.6±0.5)。另外，其叶数高于野生型植物的叶数(28.5±1.7对17.4±0.6)。
此外，为了阐明CPL3基因在开花后的作用，依据已知在花转变(开花)控制中起核心作用的以下基因的表达，通过实时PCR检测CPL3表达改变的植物谱系：开花基因座T(FT)、CO1过表达阻抑子(SOC1)和CONSTANS(CO)(Bagnall，Annals of Botany 71，75，1993；Lee等，Gene & development 14，2366-2376，2000；Koornneef等，Mol Gen Genet229，57-66，1991)。
如下进行实时PCR。使用RNeasy植物小型试剂盒(Qiagen)提取总RNA。在RNA纯化过程中按照在RNeasy迷你手册中描述的方案进行柱上DNA酶I消化。用Prime Script RT试剂盒(Takara)在反应液混合物(20μL)中由总RNA(1μg)合成首链cDNA。用SYBR Premix ExTaq(Takara)经由Chromo4实时PCR检测系统(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)进行实时PCR。PCR扩增包括于95℃达30秒的变性步骤，接着于95℃反应5秒和于60℃反应30秒(对于CPL3为45个循环，对于CO、FT、SOC1和ACT2为40个循环)。相对mRNA水平用iQ5软件(Bio-Rad)计算，并对ACT2 mRNA浓度标准化。
在叶生长过程中于长日照(LD)条件下cpl3敲除突变体的FT和SOC1表达水平高于野生型植物的水平。cpl3敲除突变体的21日龄叶的FT表达水平约为野生型植物水平的7.5倍高。其SOC1表达水平为野生型植物的水平的3.2倍高(图15A和15B)。就CO表达而言，在cpl3敲除突变体和野生型植物之间没有显著差异(图15C)。这些结果表明，CPL3通过抑制FT和SOC1表达参与开花调节。
工业适用性
按照本发明，有可能提供比野生型植物生长尺寸更大或早于野生型植物开花的新的突变植物及其生产方法。本发明的突变植物的尺寸大于野生型植物。因此，可提高例如由植物提取的物质的产量。另外，本发明的突变植物早于野生型植物开花，因此果实或种子形成可得以改善。例如，有可能在1年多次收获，而所述作物通常1年仅可收获1次。此外，本发明的突变植物的这些特征使得节约了作物收获的时间和成本。
本文提及的所有出版物、专利和专利申请都整体在此引入作为参考。
序列表
<110>RIKEN
<120>突变植物及其生产方法
<130>PH-3281-PCT
<150>JP 2006-278988
<151>2006-10-12
<160>36
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>234
<212>DNA
<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(234)
<400>1
atg gat aac cat cgc agg act aag caa ccc aag acc aac tcc atc gtt      48
Met Asp Asn His Arg Arg Thr Lys Gln Pro Lys Thr Asn Ser Ile Val
1               5               10               15
act tct tct tct gaa gga aca gaa gtg agt agt ctt gag tgg gaa gtt      96
Thr Ser Ser Ser Glu Gly Thr Glu Val Ser Ser Leu Glu Trp Glu Val
20               25               30
gtg aac atg agt caa gaa gaa gaa gat ttg gtc tct cga atg cat aag     144
Val Asn Met Ser Gin Glu Glu Glu Asp Leu Val Ser Arg Met His Lys
35               40               45
ctt gtc ggt gac agg tgg gaa ctg ata gct ggg agg atc cca gga aga    192
Leu Val Gly Asp Arg Trp Glu Leu Ile Ala Gly Arg Ile Pro Gly Arg
50               55               60
acc gct gga gaa att gag agg ttt tgg gtc atg aaa aat tga             234
Thr Ala Gly Glu Ile Glu Arg Phe Trp Val Met Lys Asn
65                  70                  75
<210>2
<211>77
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>2
Met Asp Asn His Arg Arg Thr Lys Gln Pro Lys Thr Asn Ser Ile Val
1               5                   10                  15
Thr Ser Ser Ser Glu Gly Thr Glu Val Ser Ser Leu Glu Trp Glu Val
            20                  25                  30
Val Asn Met Ser Gln Glu Glu Glu Asp Leu Val Ser Arg Met His Lys
        35                  40                  45
Leu Val Gly Asp Arg Trp Glu Leu Ile Ala Gly Arg Ile Pro Gly Arg
    50                  55                  60
Thr Ala Gly Glu Ile Glu Arg Phe Trp Val Met Lys Asn
65                  70                  75
<210>3
<211>107
<212>PRT
<213>水稻(Oryza sativa)
<400>3
Met Glu Ser Ser Gly Gly Ser Gln Leu Gly Lys Asn Ser Lys Thr Ser
1               5                   10                  15
Asp Gly Arg Glu Thr Lys Ala Thr Ser Ser Leu Leu Leu Leu Ile Thr
            20                  25                  30
Ala Ile His Phe Val Ala Leu Cys Pro Lys Gly Glu Asn Glu Asp Ala
        35                  40                  45
Arg Lys Glu Val Asn Ser Thr Ala Gln Asn Phe Val His Phe Thr Glu
    50                  55                  60
Glu Glu Glu Asp Ile Val Phe Arg Met His Arg Leu Val Gly Asn Arg
65                  70                  75                  80
Trp Glu Leu Ile Ala Gly Arg Ile Pro Gly Arg Thr Ala Glu Glu Val
                85                  90                  95
Glu Lys Phe Trp Ala Ile Lys His Gln Ala Thr
            100                 105
<210>4
<211>83
<212>PRT
<213>水稻
<400>4
Met Asp Ser Ser Ser Gly Ser Gln Gly Lys Asn Ser Lys Thr Ser Asp
1               5                   10                  15
Gly Cys Glu Thr Lys Glu Val Asn Asn Thr Ala Gln Asn Phe Val His
            20                  25                  30
Phe Thr Glu Glu Glu Glu Asp Leu Val Phe Arg Met His Arg Leu Val
        35                  40                  45
Gly Asn Arg Trp Glu Leu Ile Ala Gly Arg Ile Pro Gly Arg Thr Ala
    50                  55                  60
Lys Glu Gln Tyr Thr Glu Gly Glu Ile Trp Cys Leu Glu Thr Phe Pro
65                  70                  75                  80
Arg Arg Met
<210>5
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