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1、10申请公布号CN102351631A43申请公布日20120215CN102351631ACN102351631A21申请号201110239772722申请日20110819C07C13/42200601C07C7/04200601A61K31/015200601A61P35/0020060171申请人广东药学院地址510006广东省广州市大学城外环东路280号72发明人陈伟强毛建文李明徐彬魏凤香张丽蓉74专利代理机构广州粤高专利商标代理有限公司44102代理人陈卫54发明名称一种从松针中提取的蒎烯及其提取方法和在抗肿瘤中的应用57摘要本发明公开了一种从松针中提取的蒎烯及其提取方法和在抗肿。
2、瘤中的应用。本发明所述蒎烯是从松针中提取得到的，实验证明，蒎烯对肝癌细胞增殖具有明显的抑制作用，因此可知，本发明所述蒎烯可以用于制备治疗肿瘤相关疾病的药物，具有重大意义。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书3页附图4页CN102351638A1/1页21一种从松针中提取的化合物，其特征在于所述化合物为蒎烯，其结构式为。2权利要求1所述蒎烯的提取方法，其特征在于包括如下步骤（1）从松针嫩茎叶，阴干粉碎，水蒸气蒸馏提取松针油，取上层精油以无水乙醚溶解后，干燥得到松针油；（2）用蒸汽分馏法对松针油进行分离，将松针油的主要成分蒎烯和蒎烯分别提取出来。3根据。
3、权利要求2所述蒎烯的提取方法，其特征在于步骤（1）中所述将松针嫩茎叶粉碎至4060目。4根据权利要求2所述蒎烯的提取方法，其特征在于步骤（1）中所述水蒸气蒸馏时，固液比为18，提取时间为3H。5根据权利要求2所述蒎烯的提取方法，其特征在于步骤（1）所述干燥是使用无水硫酸钠进行的。6权利要求1所述蒎烯在制备治疗抗肿瘤疾病药物中的应用。7根据权利要求6所述蒎烯的应用，其特征在于所述肿瘤疾病为肝癌。权利要求书CN102351631ACN102351638A1/3页3一种从松针中提取的蒎烯及其提取方法和在抗肿瘤中的应用技术领域0001本发明涉及抗癌药物的提取制备领域，具体涉及一种从松针中提取的蒎烯及其。
4、提取方法和在抗肿瘤中的应用。背景技术0002肝癌是影响人类健康的重大疾病，全世界每年患病人数超过100万，其死亡人数在肿瘤死亡人数中安排第三位。在我国，每年肝癌发病人数约35万,死亡人数约32万,发病率和死亡率均占肿瘤中的第二位。目前，有可能治愈肝癌的治疗措施主要有两种手术切除或肝移植，但由于发病隐匿、无明显症状、发现时已是肝癌中晚期，手术效果不佳；或由于缺少肝源而失去手术清除和肝移植机会。即使有机会实行“根治性”手术，肝癌的高复发、高转移特性仍然是医疗界的难题。经皮治疗、射频消融、动脉栓塞、化疗等姑息性治疗措施复发率高、长期生存率极低、治疗后5年生存率仅7。因此，为中晚期肝癌患者创造二期手术。
5、机会，防止肝癌术后复发和转移，已经成为目前肝癌治疗的关键。中药在抑制肿瘤细胞增殖、稳定瘤体生长、改善症状体征、减毒增效、预防复发、提高生存质量、延长生存期等方面具有独特的优势。从传统中药中寻找高效低毒的有效部位或成份治疗肝癌已成为研究热点,具有重要的研究价值和应用前景。发明内容0003本发明的目的在于提供一种从松针叶中提取得到的抗癌组分。0004本发明另一目的在于提供上述抗癌组分的制备方法。0005本发明还有一个目的在于提供上述抗癌组分的应用。0006本发明上述目的通过以下技术方案予以实现一种从松针中提取的化合物蒎烯，其结构式为。0007本发明所述蒎烯的提取方法包括如下步骤（1）从松针嫩茎叶，。
6、阴干粉碎，水蒸气蒸馏提取松针油，取上层精油以无水乙醚溶解后，干燥得到松针油（松针（PINENEEDLE）为松科（PINACEASE）松属（PINUS），药用植物的叶）；（2）用蒸汽分馏法对松针油进行分离，将松针油的主要成分蒎烯和蒎烯分别提取出来。说明书CN102351631ACN102351638A2/3页40008作为一种优选方案，上述提取方法中，步骤（1）中所述将松针嫩茎叶粉碎至4060目；所述水蒸气蒸馏时，固液比为18，提取时间为3H；所述干燥是使用无水硫酸钠进行的。0009本发明所述蒎烯可以用于制备治疗肿瘤相关疾病的药物，尤其是治疗肝癌的药物。0010与现有技术相比，本发明具有如下有益。
7、效果申请人的前期研究发现松针油能诱导宫颈癌和肝癌细胞凋亡，其作用机制与抑制端粒酶活性和诱导凋亡相关基因表达有关,提示松针油可能是一种新的抗肿瘤中药。松针油作为一种粗提物，含有多种成份。我们采用蒸气分馏方法对松针提取液（松针油）进行分离，得到了松针油的主要成份为蒎烯和蒎烯。据目前研究认为多种中药来源的烯类具有抗肿瘤作用，我们在体外针对松针油的两种组分的抗肿瘤作用进行了预实验。预实验结果显示，蒎烯能显著抑制肝癌BEL7402细胞的增殖，且其作用可能与阻滞细胞周期有关，流式细胞分析显示蒎烯作用后肝癌细胞被阻滞在G2/M期，但没有明显的细胞凋亡。而蒎烯没有明显抑制增殖和细胞周期阻滞作用。这些结果提示蒎。
8、烯可能是松针油中起抗肿瘤作用的活性成份。在此基础上本课题拟采用动物实验和免疫组化等分子生物学方法，通过体内外的研究，证实其抗肿瘤生长的作用和其抑癌的分子机制。我们的研究将为蒎烯在肝癌防治中的临床应用提供重要的参考资料和新的理论依据。附图说明0011图1为松针油总离子流图；图2为蒎烯总离子流图；图3为蒎烯总离子流图；图4为蒎烯抑制肝癌BEL7402细胞细胞的增殖；图5为蒎烯对肝癌BEL7402细胞CDC25CMRNA表达的影响；图6为蒎烯对肝癌BEL7402细胞细胞周期的阻滞作用，其中，A为对照组，B为蒎烯（1800稀释）作用48小时；图7为蒎烯对肝癌BEL7402细胞细胞凋亡的影响；A对照组；。
9、B蒎烯（1800稀释）作用48小时；图8为蒎烯对裸鼠移植性肝癌抑制的影响；空白对照组；对照5氟脲嘧啶对照组；实验蒎烯干扰组。具体实施方式0012以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。0013实施例1蒎烯的提取纯化将本地松针的嫩茎叶，自然阴干，粉碎到4060目，采用水蒸气蒸馏法，取松针粉200G装入纱布袋中，置于自行设计的水蒸气蒸馏装置中进行提取，以固液比18蒸馏3H，取上层精油，以无水乙醚溶解，无水硫酸钠干燥，冷藏备用。提取的松针油为透明微黄色液体，芳香气味的松针油。我们将松针油采用蒸气分馏方法对松针提取液进行分离，得到了松针油的主要成分为蒎烯和蒎烯，通过高效。
10、液相进行检测，得提取纯度达到98（图13）。说明书CN102351631ACN102351638A3/3页50014实施例2蒎烯的抗肝癌作用效果和机制研究蒎烯对肝癌BEL7402细胞增殖具有明显抑制用RPMT1640培养液加10的小牛血清，将肝癌7402细胞接种于上述培养液中放在CO2培养箱中37，5的CO2培养，消化、收集对数生长期的细胞，并调整浓度为5107L的单细胞悬液，接种于96孔板中，每孔02ML，24H后加入以RPMI1640培养液配制的蒎烯，终浓度分别为8、2、05、0125、0MG/L（空白对照），各浓度蒎烯处理的肝癌细胞实验组，每组接种8个复孔，置于培养箱中培养24、48、7。
11、2H，终止培养前每孔加入MTT液20L，继续培养4H，上机前吸弃培养液，每孔加入DMSO150L，在水平摇床摇动5MIN，在酶标仪490NM处测量A值，计算出细胞生长抑制率，确定最佳抑制浓度（图4）（00079MOL/L）。0015实施例3肝癌7402细胞用不同浓度（1400、1600、1800、11000）蒎烯作用不同时间（24H、48H、72H）后，提取细胞总RNA，用SYBRGREEN实时荧光PCR定量技术检查细胞周期调控基因CDC2、CDK1、P53、P21和CYCLINB1的表达变化。荧光定量PCR结果显示蒎烯能显著地下调肝癌BEL7402细胞CDC25CMRNA的表达（图5）。00。
12、16实施例4收集蒎烯不同浓度（1400、1600、1800、11000）处理24、48、72H后的肝癌7402细胞，以PBS缓冲液清洗2次，将细胞沉淀充分混匀，以70的冷乙醇4固定24H以上离心去除乙醇固定液，用PBS清洗1次后，加入200L的RNA酶，流式细胞仪分析含不同量DNA的细胞分布。应用分析系统进行数据处理，结果显示蒎烯能显著抑制肝癌BEL7402细胞的增殖，且其作用可能与阻滞细胞周期有关，流式细胞分析显示蒎烯作用后肝癌细胞被阻滞在G2/M期，但没有明显的细胞凋亡（图67）。0017实施例5动物实验证明（表1），用细胞实验确定蒎烯最佳作用浓度（00079MOL/L）并计算出动物用量，。
13、将肝癌7402细胞接种于上述培养液中放在CO2培养箱中37，5的CO2培养，消化、收集对数生长期的细胞，并用生理盐水调整浓度为1107ML的单细胞悬液，每只裸鼠的右后肢皮下接种肝癌细胞悬液02ML，使每只裸鼠接种的细胞数目达到2106。当肿瘤大小到直径约为34MM时接种20D以后,建模成功。建模成功后皮下注射蒎烯267ML/KG/次，阳性对照组为皮下注射5氟脲嘧啶067ML/KG/次，空白照为每天注射02ML/D的生理盐水（隔天注射药物，共注射药物两周）。结果显示蒎烯能显著抑制肝癌7402细胞的生长，电子显微镜结果显示蒎烯还能使肝癌7402细胞核发生变性、固缩、细胞内的细胞器发生变性等。其抗肝癌活性与5氟脲嘧啶的作用无显著差异（图8）。0018表1蒎烯对裸鼠移植性肝癌的作用（,N6）组别瘤重（G）瘤体积（CM3）空白组098123102125氟脲嘧啶对照组034121067103蒎烯干扰组028105059124与空组比较P005有显著性差异。说明书CN102351631ACN102351638A1/4页6图1图2说明书附图CN102351631ACN102351638A2/4页7图3图4说明书附图CN102351631ACN102351638A3/4页8图5图6说明书附图CN102351631ACN102351638A4/4页9图7图8说明书附图CN102351631A。