一种降解蓖麻基润滑油及矿物油的耐盐菌株 L-3 技术领域 本发明属于微生物育种及生态领域， 尤其是一种降解蓖麻基润滑油及矿物油的耐 盐菌株 L-3。
背景技术 随着全球经济的快速发展， 每年都要消耗大量的石油产品， 除汽、 柴油等成品油 外， 很大一部分就是用于各种不同领域的润滑油， 随着润滑油的广泛使用， 人们越来越关注 它对环境产生的影响。 在使用过程中， 润滑油不可避免地会通过泄漏、 溢出或不恰当的排放 等途径进入环境， 而在这些油品中， 大部分不能被生物降解， 并具有一定的生态毒性， 严重 污染大气、 土壤和水资源， 破坏生态环境和生态平衡。据统计， 全世界每年约有 500 ～ 1000 万吨石油基化学品进入生物圈， 仅欧共体每年就有 60 万吨润滑油进入环境。在我国， 废油 的回收率不足 10％， 以此估算， 每年至少有 28 ～ 32 万吨流入环境， 造成极大的资源浪费和 环境污染。据报道， 矿物润滑油污染地下水的影响可达 100 年， 微量的矿物油会阻碍植物的 生长和毒害水生生物， 约 0.1μg/g 的矿物油即可使水生壳类生物减寿 20％。目前， 润滑油 污染土壤的治理方法主要有物理方法、 化学方法和生物方法 3 种。物理方法包括挖掘填埋 法、 气提吹脱法、 电解法、 洗涤法和隔离控制法等， 主要采用热处理法， 即通过焚烧或锻烧， 净化土壤中大部分有机污染物， 但同时亦破坏土壤结构和组分， 且所用的燃料和设备价格 昂贵因此很难实施 ； 化学方法包括氧化剂氧化法、 光化学氧化法、 热分解法、 萃取法和化学 棚法等， 采用化学浸出和水洗也可以获得较好的除油效果， 但所用的化学试剂的二次污染 问题限制了其应用。
为彻底解决废润滑油对环境造成的污染， 许多国家都以极大热情相继进行环境兼 容润滑油即可生物降解润滑油的研究。所谓可生物降解润滑油， 又称绿色润滑油或环境友 好润滑油， 是指润滑油必须满足机器工况的要求， 即使用性能 ； 润滑油及其损耗产物对生态 不造成危害， 或在一定程度上为环境所容许， 即生态效应， 主要包括 ： 可生物降解性、 生物积 聚性、 毒性和生态毒性、 损耗和可再生资源， 其中， 生物降解性是反映其生态效应最主要的 指标， 建立废润滑油生物降解性评定方法对研究可降解性废润滑油具有重要意义。
生物修复是指利用微生物及其它生物， 将存在于土壤中的有毒有害的油品污染物 现场降解成二氧化碳和水或转化成为无害物质的工程技术系统， 它是传统的生物处理方法 的延伸。生物修复由于能够治理大面积污染而成为一种新型可靠的环保技术， 已得到世界 环保部门的认可， 并引起了工业界的关注， 生物修复在治理土壤污染方面的作用己越来越 突出。生物修复的类型主要包括微生物对污染土壤的修复、 植物对污染土壤的修复及微生 物一植物的联合修复， 其中微生物对润滑油污染土壤的生物修复是近年来科学家研究的重 点。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处， 提供一种耐盐性好的降解蓖麻基润滑油的菌株 L-3， 是一种生长速度快， 能以蓖麻基润滑油为唯一碳源的菌种。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的 ：
一种降解蓖麻基润滑油的菌株 L-3， 菌株 L-3 的分类名称 ： 克雷伯氏菌 klebsiella sp.， 保藏编号为 ： CGMCC No.4925， 保藏日期 ： 2011 年 06 年 10 日， 保藏单位为 ： 中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏地址为 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号。
而且， 菌株 L-3 对蓖麻基润滑油的降解率为 80％ -90％。
而且， 菌株 L-3 使用的培养基配方 ： KH2PO43.4g/L， Na2HPO41.5g/L， (NH4)2SO44.0g/ L， MgSO40.7g/L， NaCl 1.6g/L， 酵母粉 0.01g/L， Tween-800.6mL， 蓖麻基润滑油 5.0mL， 蒸馏 水 1L， pH 7.0 ～ 7.2。
而且， 所述菌株 L-3 以蓖麻基润滑油为唯一碳源进行生长。
而且， 所述菌株 L-3 降解的矿物油包括齿轮油、 液压油。
而且， 所述菌株 L-3 耐 NaCl 浓度为 7％。
本发明的优点和积极效果如下 ：
1. 本发明利用平板梯度涂布法， 从蓖麻榨油车间排污井口采取土样和水样中筛选 出能以废弃蓖麻基润滑油为唯一碳源的菌种， 该方法操作简便快捷， 能显著缩短菌株筛选 时间。 2. 本发明筛选出的降解废弃蓖麻基润滑油的菌株 L-3， 生长速度快， 在最适培养 温度和 pH 条件下， 有利于扩大培养， 制成菌种发酵剂， 投放到污染地进行生态修复。
3. 本发明对筛选的菌株进行了初步鉴定， 通过生理生化及相关菌株鉴定试验， 得 出菌株具有耐盐性， 革兰氏阳性， 链球状， 无鞭毛， 不运动， 葡萄糖氧化发酵实验不产酸、 不 产气， 产过氧化氢酶， 明胶酶等， 初步鉴定为克雷伯菌属。
4. 以本发明筛选出的降解蓖麻基润滑油的 L-3 菌株为出发菌株， 采用改良的 CEC-L-33-A-93 实验方法进行生物降解， 在 30℃， 180r/min， 黑暗遮光条件下培养 7d 后， 用 四氯化碳进行萃取， 采用 IR 在 2930nm 处检测 CH3-CH2- 中 C-H- 键的振动吸收峰， 计算出残 余油量， 得出蓖麻基润滑油的降解率。本方法可缩短降解培养周期， 从 21d 缩短到 7d， 与其 他降解方法相比， 实验效率大大提高。
附图说明 ：
图 1 为本发明 L-3 菌株 CEC 法测试红外光谱图。 具体实施方式
下面结合实施例， 对本发明进一步说明， 下述实施例是说明性的， 不是限定性的， 不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明的技术路线为 ： 将采集的土样和水样用无菌水制成悬浮液， 采用平板梯 度涂布法进行菌株分离， 从中分离出降解效果较好的菌株 L-3， 再对 L-3 菌株进行改良的 CEC-L-33-A-93 实验， 获得较好的降解效果。
一种降解蓖麻基润滑油及矿物油的耐盐菌株 L-3， 其筛选步骤如下 ：
1. 从蓖麻榨油车间排污井口采取土样和水样， 采样所需工具均已灭菌 ；
2. 菌株初筛 ： 将采集的样品经 24h 曝气处理后， 在无菌操作条件下取少量样品，加入 50mL 无菌水， 搅拌， 制成悬浮液， 用移液枪取 0.1mL 悬浮液， 放入以废弃蓖麻基润滑 油为唯一碳源的筛选培养基平板上 ( 培养基 ： KH2PO43.4g ； Na2HPO41.5g ； (NH4)2SO44.0g ； MgSO40.7g ； NaCl 1.6g ； 酵 母 粉 0.01g ； Tween-800.6mL， 蓖 麻 基 润 滑 油 5.0mL， 蒸馏水 1000mL， pH7.0 ～ 7.2)， 用无菌涂布器连续涂布四个平板， 分别放置于 30℃恒温培养箱中， 培养 2-3d， 挑取生长较快和不同菌落形态的菌株， 进一步分离纯化复筛， 从中筛选出能以废 弃蓖麻基润滑油为唯一碳源生长的菌种。
3. 菌株复筛 ； 将第一次挑选出的菌株分别接种在以蓖麻基润滑油为唯一碳源的 平板筛选培养基上进行分离纯化， 将平板分别置于 30℃恒温培养箱中， 培养 2-3d， 观察结 果， 再挑选生长较快的不同单菌落， 接种到斜面中， 培养后， 将菌株 L-3 置于 4℃冰箱保藏， 待用。
4.L-3 菌株的鉴定
(1) 菌株耐盐性实验
在 250mL 三角瓶中装入 100mL 富集培养基 ( 葡萄糖， 3g ； NaCl， 5g ； 酵母膏， 3g ； 蛋白 胨， 3g ； K2HPO4· 3H2O， 2.7g ； 蒸馏水， 1000mL ； pH 为 7.2)， 将 L-3 菌株以相同接种量接入 NaCl 质量分数为 1％、 3％、 5％、 7％、 9％的培养基中， 30℃， 180r/min， 培养 3d， 测定 OD600 值， 其 结果见表 3。
表 3L-3 菌株的耐盐性
由表 3 可以看出， 菌株 L-3 在 NaCl 浓度为 1％时生长良好， 当 NaCl 浓度为 7％时 生长一般， 9％时生长受到抑制。
(2) 不同初始 pH 对 L-3 菌株生长的影响
在 250mL 三角瓶中装入 100mL 富集培养基 ( 葡萄糖， 3g ； NaCl， 5g ； 酵母膏， 3g ； 蛋 白胨， 3g ； K2HPO4·3H2O， 2.7g ； 蒸馏水， 1000mL ； pH 为 7.2)， 将菌株 L-3 以相同接种量接入初 始 pH 分别为 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 的培养基中， 30℃， 180r/min 培养 11h， 测定 OD600 值， 其结果 见表 4。
表 4L-3 菌株在不同初始 pH 下生长情况
由表 4 可以看出， 菌株 L-3 在 pH ＝ 7 时生长最快， 在一定范围的酸、 碱性条件下也 能较好的生长， 适应环境范围广。
(3) 碳源利用实验
表 5L-3 菌株对不同碳源的利用情况
(4) 氮源利用实验
将亚铁氰化钾、 硝酸钠分别加入到氮源基础培养基中， 浓度为 1％， 不加氮源空白 做对照， 接种后 30℃， 180r/min 培养 3d， 与对照管比较浑浊度， 混浊者为阳性。观察发现 ： L-3 不能利用硝酸钠， 为阴性 ； 在加入亚铁氰化钾的培养基中呈浅绿色混浊液。
(5)L-3 菌株生理生化实验
表 6 L-3 菌株生理生化性状
根据菌株的生理生化特性， 初步鉴定 L-3 菌株为克雷伯菌属 (klebsiella)。
5. 生物降解性的测定
(1) 培养基 ： KH2PO43.4g ； Na2HPO41.5g ； (NH4)2SO44.0g ； MgSO40.7g ； NaCl 1.6g ； 酵母 粉 0.01g ； Tween-800.6mL， 蓖麻基润滑油 5.0mL， 蒸馏水 1000mL， pH 7.0 ～ 7.2。
(2) 锥形瓶的准备
中性瓶 ： 100mL 矿物基营养液 +1mL 种子菌液
测试瓶 ： 100mL 矿物基营养液 +1mL 种子菌液 +1mL 废弃蓖麻基润滑油
毒化瓶 ： 100mL 矿物基营养液 +1mL 废弃蓖麻基润滑油
(3) 测试烧瓶的最小数目列于表 7 中
L-3 菌株活化后进行蓖麻基润滑油的生物降解试验， 从种子培养基中吸取 1mL 种 子液， 接入到步骤 (2) 中需要添加菌液的锥形瓶中， 30℃， 180r/min 振荡器中暗室培养 7d。
表 7 生物降解性试验所需烧瓶数量及分配
注： “0d” 烧瓶应该在试验开始后再准备， 并立即对其进行萃取
(4) 破乳和破细胞壁
培养期结束后， 在各锥形瓶中加入约 1mL HCl 和 20g NaCl， 摇瓶振荡， 待 NaCl 完全 溶解后， 采用超声波细胞破碎仪将培养基中的微生物细胞壁破碎， 使内容物释放及进一步
破乳。 间歇式超声波破碎条件 ： 200W， 2min， 工作 2s， 停止 1s， 破碎后待三角瓶内溶液温度冷 却至室温后再进行分离萃取。
(5) 萃取
培养液 10000r/min 离心 10min 沉淀去细胞， 取上清液， 将各样品倒入 250mL 分液 漏斗中， 分三次加入四氯化碳进行萃取， 每次加入量为 30mL， 剧烈摇动 1 ～ 2min， 并经常开 启活塞排气 ； 静置至分层后， 分液漏斗中的溶液从上口倒出， 将下层有机相溶液倒入装有无 水硫酸钠的小烧杯中除水， 转移至 25mL 容量瓶中， 静置 24h 后， 置入 10mm 光路长的 IR 室， 测量 CH3-CH2- 的 C-H 伸缩振动吸收峰 ( 在 2930±10cm-1) 峰高的红外光谱。
(6)IR 分析及生物降解率计算
用红外光谱分析仪测定萃取液， 波长范围 2500 ～ 3500cm-1， 用装样的石英比色皿 -1 进行扫描， 测定 2930±10cm 处吸收峰的吸光度值， 测定各毒化瓶和测试瓶 (E 烧瓶 ) 萃取液 的 IR 吸收， 以下式计算残余油含量 ：
生物降解率按下式计算 ：注P： 毒化瓶中残余油含量，％ ( 平均值 )
T： 测试瓶中残余油含量，％ ( 平均值 )
采用红外谱图的方法鉴定四氯化碳中的 C-H 含量， 用四氯化碳做空白， 确保萃取 剂中没有干扰， L-3 菌株红外光谱图和降解率计算如图 1， 表 8 所示。
表 8L-3 菌株降解率计算
T： 测试瓶中残余油含量 (％ ) P： 毒化瓶中残余油含量 (％ ) W： 生物降解率 W ＝ (P-T)/P×100％。