一种调控白念珠菌毒性的因子及其应用 技术领域 本发明属于生物技术领域 ； 更具体地， 本发明涉及一种调控白念珠菌毒性的因子 及其应用。
背景技术 白念珠菌 (Candida albicans) 是一种临床上分离到的一种机会性人体致病真菌， 在免疫下调的病人中， 如器官移植病人、 艾滋病毒感染者等， 可以引起广泛的浅部和深部系 统感染， 感染部位包括口腔、 女性阴道等， 引起鹅口疮、 阴道炎等疾病， 也可以侵入表皮和 内皮细胞进入血液到达内脏器官， 如肾脏、 脑部等， 导致败血症， 严重可以导致死亡 (Odds， F.C.1994.J Am Acad Dermatol.31 ： S2-S5)。 白念珠菌在不同的生长条件下， 呈现不同的生 长形态， 包括菌体 (yeast form)， 假菌丝 (pseudohyphae) 和菌丝 (hyphae)。各种形态之间 的相互转化能力直接影响白念珠菌的致病能力 (Odds， F.C.1985.Grit Rev Microbiol.12 ： 45-93 ； Brown， A.J.P.et al.1999.Trends Microbiol.7 ： 334-338)， 而形态转换缺陷的菌 株其系统感染能力下降或消失 (Lo， H.J.et al， 1997.Cell.90 ： 939-949 ； Braun， B.R.et al.2001.EMBO J.20 ： 4753-61 ； Hwang， C.S.et al.2003.Mol Microbiol.47 ： 1029-43)。
最近有些实验室利用减毒菌株作为疫苗来免疫小鼠， 取得了比较好的效果， 并对其进行了深入的生物化学分析， 为疫苗的研制提供了理论基础 (Elena FA et al， Proteomics 2004， 4， 3007-3020 ； Elena FA et al， Proteomics2004， 4， 1204-1215)。 许多培 养条件可以引起白念珠菌的形态转换， 包括血清、 温度、 pH 值、 氮源利用以及氧压等等。所 有的细胞都必需具有检测细胞外环境改变和外界因子刺激的能力， 从而对各种信号做出正 确应答的能力。各种外界因子的刺激包括光、 激素、 神经递质、 生长因子及气味因子等。真 核细胞通过不同的信号传导途径改变蛋白质合成从而应对各种外界因子刺激。一般来说， 信号途径被认为是通过调控转录从而改变胞内蛋白质的表达水平。 而最近的研究显示对翻 译的调控也是信号转导的一个重要方面。两条重要的信号通路 Ras 和 Akt 主要介导了特定 的 mRNA 和核糖体的结合。这种调控使核糖体对于正处于翻译状态的 mRNAs 的识别发生了 变化， 从而导致蛋白合成水平的快速改变。
目前对于白念珠菌真正的致病因子和致病机理没有完全研究清楚， 因此本领域还 有必要研究白念珠菌的致病因子。
发明内容 本发明的目的在于提供白念珠菌减毒株 ( 无毒株 )。
本发明的另一目的在于提供一种筛选抑制白念珠菌的毒性的潜在物质的方法。
在本发明的第一方面， 提供一种白念珠菌减毒株 ( 无毒株 )， 所述的减毒株中 CaASC1 基因基本上不表达。
在一个优选例中， 所述的减毒株 (caasc1/caasc1) 中 CaASC1 基因或基因片段缺 失。
在另一优选例中， 所述的减毒株通过同源重组的方法从野生型白念珠菌染色体中 敲除 CaASC1 基因或基因片段获得。
在另一优选例中， 所述的 CaASC1 的基因 ：
(1) 具有 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 2 所示的核苷酸序列 ； 或
(2) 截短的 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 2 所示的核苷酸序列， 且该基因不编码 CaAsc1 蛋白或编码降低活性 ( 优选活性降低 50 ％， 更优选降低 80 ％， 更优选无活性 ) 的 CaAsc1 蛋白或蛋白片段。
在另一优选例中， 相对于野生型白念珠菌， 所述的减毒株的菌丝形成能力下降。
在本发明的另一方面， 提供所述的白念珠菌减毒株的用途， 用于制备防治 ( 特别 是预防 ) 白念珠菌过度生长相关疾病的组合物。
在另一优选例中， 所述的白念珠菌过度生长相关疾病选自 ( 但不限于 ) ： 鹅口疮、 阴道炎。
在本发明的另一方面， 提供一种组合物， 所述的组合物含有有效量的所述的白念 珠菌减毒株和药学上可接受的载体。
在另一优选例中， 所述的组合物是疫苗。 在本发明的另一方面， 提供一种抑制白念珠菌 ( 抑制毒性或菌丝生长 ) 的方法， 所 述方法包括 ： 抑制白念珠菌中 CaAsc1 蛋白的表达或活性。
在本发明的另一方面， 提供一种筛选抑制白念珠菌 ( 抑制毒性或菌丝生长 ) 的潜 在物质的方法， 所述方法包括 ：
(a) 在 测 试 组 中， 向 表 达 CaAsc1 蛋 白 的 体 系 中 添 加 待 筛 选 的 候 选 物， 并检测 CaAsc1 蛋白的表达或活性 ； 并且， 在对照组中， 在不添加所述候选物的、 表达 CaAsc1 蛋白的 体系中， 检测 CaAsc1 蛋白的表达或活性 ；
(b) 将步骤 (a) 测试组中 CaAsc1 蛋白的表达或活性与对照组中 CaAsc1 蛋白的表 达或活性进行比较，
如果测试组中 CaAsc1 蛋白的表达或活性在统计学上低于 ( 优选显著低于， 较佳的 低 20％或更低 ； 更佳的低 40％或更低 ； 进一步更佳的低 60％或更低 ) 对照组， 就表明该候 选物是抑制白念珠菌的毒性的潜在物质。
在另一优选例中， 所述的体系选自 ： 细胞体系、 溶液体系。
在本发明的另一方面， 提供一种 CaASC1 基因的用途， 用于鉴定待测白念珠菌的毒 性。
在本发明的另一方面， 提供一种鉴定待测白念珠菌毒性的方法， 包括 ： 检测待测白 念珠菌中 CaASC1 基因的表达或活性，
若相对于野生型白念珠菌， 待测白念珠菌 CaASC1 基因表达或活性提高， 则该白念 珠菌具有一般毒性或高的毒性 ；
若相对于野生型白念珠菌， 待测白念珠菌 CaASC1 基因表达或活性降低， 则该白念 珠菌具有低的毒性或无毒性。
在本发明的另一方面， 提供一种白念珠菌 CaASC1 基因或 CaAsc1 蛋白的抑制剂的 用途， 用于制备抑制白念珠菌 ( 抑制毒性或菌丝生长 ) 的组合物。
在一个优选例中， 所述的 CaAsc1 蛋白的抑制剂是特异性抗 CaAsc1 蛋白的抗体。
在另一优选例中， 所述的抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
在本发明的另一方面， 提供一种抗体， 所述的抗体特异性地抗 CaAsc1 蛋白 ( 与 CaAsc1 蛋白特异性结合 )。
在一个优选例中， 所述的抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明的其它方面由于本文的公开内容， 对本领域的技术人员而言是显而易见 的。 附图说明
图 1A 显示了在白念珠菌中敲除 CaASC1 基因的策略。
图 1B 显示了在白念珠菌 CaASC1 基因的敲除过程中各个菌株的 PCR 鉴定图谱。
图 1C 显示了在白念珠菌 CaASC1 基因的敲除过程中各个菌株的 Southern 杂交图 谱。
图 2 显示了白念珠菌 caasc1/caasc1 缺失株在菌丝诱导条件下， 在液体和固体血 清和李氏 (Lee’ s) 培养基中的形态 ( 图 2A)， 在 SCLD 和 SLAD 液体培养基中的形态 ( 图 2B)。
图 3 显示了在小鼠系统感染试验中， CaASC1 基因的敲除使白念珠菌毒性降低。注 7 射液浓度为 5×10 细胞 / 毫升 ( 图 3A) 或 5×106 细胞 / 毫升 ( 图 3B)， 每只小鼠尾静脉注 射 100μl 菌液， 共注射 8 只小鼠。 具体实施方式
本发明人经过广泛的研究， 首次在白念珠菌中分离出一种白念珠菌毒性相关的基 因， 本发明人将之命名为 CaASC1 基因。利用同源重组原理， 本发明人在白念珠菌中构建了 caasc1/caasc1 缺失株， 并证明 CaASC1 基因的表达与白念珠菌的菌丝发育和毒性表现密切 相关。
除非另外说明， 所述的 “白念珠菌 ASC1 基因” ， “CaASC1 基因” ， “CaASC1” ， “ASC1” 可 互换使用， 都是指白念珠菌的 ASC1 基因。 “白念珠菌 Asc1 蛋白” “CaAsc1 蛋白” ， “CaAsc1” ， ， “Asc1” 蛋白可互换使用， 都是指白念珠菌的 Asc1 蛋白。
除非另外说明， 白念珠菌的减毒株 ( 无毒株 ) 用 “caasc1/caasc1”表示， 或用 “caasc1/caasc1 缺失株” 表示， 或用 “asc1/asc1” 表示， 或用 “-/-” 表示。
白念珠菌的单拷贝缺失株用 “ASC1/asc1” 表示， 或用 “CaASC1/caasc1” 表示， 或用 “+/-” 表示。
白念珠菌的回复菌株用 “caasc1/caasc1(CaASC1)” 表 示，或 用 “caasc1/ caasc1+CaASC1” 表示， 或用 -/-(+) 表示。白念珠菌的野生型菌株用 WT 表示， 或用 +/+ 表 示。
如本文所用， “分离的” 是指物质从其原始环境中分离出来 ( 如果是天然的物质， 原 始环境即是天然环境 )。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化 的， 但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开， 则为分离纯化 的。
如本文所用， 所述的 “含有” ， “具有” 或 “包括” 包括了 “包含” 、 “主要由 ...... 构 成” 、 “基 本 上 由 ...... 构 成” 、 和 “由 ....... 构 成” “主 要 由 ...... 构 成” ； 、 “基 本 上由 ...... 构成” 和 “由 ...... 构成” 属于 “含有” 、 “具有” 或 “包括” 的下位概念。
白念珠菌 (Candida albicans) 是一种人体机会性致病真菌， 能引起广泛的深部 和浅部感染， 但是其真正的致病因子和致病机理以往没有完全研究清楚。根据白念珠菌基 因组序列 (http://www.candidagenome.org/)， 利用生物信息学比较分析， 本发明人在白 念珠菌的基因组序列中找到一个功能未知的新基因， 该基因命名为白念珠菌 CaASC1 基因 (orf19.6906)。利用同源重组原理， 本发明人在白念珠菌中构建了 CaASC1 基因双拷贝敲除 株 caasc1/caasc1。CaASC1 基因的敲除阻断白念珠菌的菌丝生长。在小鼠系统感染试验 中， caasc1/caasc1 缺失株的毒性明显下降。这些结果表明 CaAsc1 正向调控白念珠菌的菌 丝发育同时也影响该致病菌的毒性表现。
作为本发明的优选方式， 所述的 CaASC1 的基因具有 SEQ ID NO ： 1 所示的核苷酸序 列； CaASC1 基因编码区中有一个 259bp 的内含子 (SEQ ID NO ： 3)， 本发明人通过逆转录合成 了其 cDNA 序列。利用所述的 cDNA 序列， 本发明人构建了一个能表达不含内含子的 CaASC1 的表达载体， 用于 CaASC1 基因功能互补试验。
所述的 CaASC1 基因编码 CaAsc1 蛋白。CaAsc1 蛋白具有 SEQ ID NO ： 4 所示的氨 基酸序列。 所述的 CaASC1 的基因也包括截短形式的 CaASC1 的基因 ( 或称为 CaASC1 基因 片段 )， 只要该基因片段在被敲除后可导致 CaAsc1 蛋白不表达或表达异常， 或其表达的 CaAsc1 蛋白片段活性降低或没有活性。根据本发明的揭示， 本领域人员非常容易获得所述 的 CaASC1 的基因片段。
所述的 CaASC1 的基因可以作为一种白念珠菌毒性鉴定的标志物。例如可通过检 测待测白念珠菌中 CaASC1 基因的表达情况来确定白念珠菌的毒性 ； 若相对于野生型白念 珠菌， 待测白念珠菌 CaASC1 基因正常表达或过表达 ( 即相对于野生型白念珠菌， 待测白念 珠菌中 CaASC1 基因的表达高 20％或更高， 更佳的高 50％或更高 )， 则该白念珠菌具有一般 毒性或高的毒性 ； 若相对于野生型白念珠菌， 待测白念珠菌 CaASC1 基因低表达 ( 如低 20％ 或更低 ； 更佳地低 50％或更低 ) 或不表达， 则该白念珠菌具有低的毒性或无毒性。或例如 可通过检测待测白念珠菌中 CaAsc1 蛋白的活性来确定白念珠菌的毒性 ； 若相对于野生型 白念珠菌， 待测白念珠菌 CaAsc1 蛋白活性正常或过于激活 ( 即相对于野生型白念珠菌， 待 测白念珠菌中 CaAsc1 蛋白的活性高 20％或更高， 更佳的高 50％或更高 )， 则该白念珠菌具 有一般毒性或高的毒性 ； 若相对于野生型白念珠菌， 待测白念珠菌 CaAsc1 蛋白的活性降低 ( 即相对于野生型白念珠菌， 待测白念珠菌中 CaAsc1 蛋白的活性低 20％或更低， 更佳的低 50％或更低 )， 则该白念珠菌具有低的毒性或无毒性。
本发明还提供一种白念珠菌减毒株， 该减毒株中 CaASC1 基因基本上不表达。所述 的 “基本上不表达” 是指白念珠菌减毒株中 CaASC1 基因不表达或低表达。其中， CaASC1 基 因低表达是指该减毒株中 CaASC1 基因的表达量低于于野生型白念珠菌的 20％ ； 较佳地低 于野生型白念珠菌的 10％； 更佳地于野生型白念珠菌的 5％或更低， 最佳地低于野生型白念 珠菌的 2％或更低。CaASC1 基因基本上不表达的菌株可以通过各种基因抑制、 基因沉默、 基 因敲除等技术来构建。例如， 可以通过基于同源重组的基因敲除技术来将 CaASC1 基因从染 色体上敲除， 从而使得 CaASC1 基因缺失 ； 可以针对 CaASC1 基因设计干扰性 RNA 或反义核苷 酸来使 CaASC1 基因表达抑制或沉默。
一种使得 CaASC1 基因缺失的方法是基因敲除技术， 在本发明的优选实施方式中， 体外构建 CaASC1 基因敲除质粒， 通过同源重组的方法， 把白念珠菌染色体中 CaASC1 基因敲 除掉。
所述的白念珠菌减毒株可以用于研究 CaASC1 基因基本上不表达后对于白念珠菌 中其它基因表达情况的影响， 以及研究 CaASC1 基因基本上不表达后白念珠菌的菌丝生长 情况以及毒性情况。
所述的白念珠菌减毒株可以用于制备疫苗， 来免疫动物， 从而在不对动物造成危 害的情况下使得动物对白念珠菌感染产生免疫力。
本发明还提供了一种筛选抑制白念珠菌的毒性的潜在物质的方法， 所述方法包 括： 向表达 CaAsc1 蛋白的体系中添加待筛选的候选物， 并检测 CaAsc1 蛋白的表达情况 ； 如 果 CaAsc1 蛋白的表达情况在统计学上减弱， 就表明该候选物是抑制白念珠菌的毒性的潜 在物质。
作为本发明的优选方式， 所述的方法还包括 ： 对获得的潜在物质进行进一步的白 念珠菌毒性抑制或菌丝生长抑制试验， 以进一步选择和确定对于抑制白念珠菌毒性有用的 物质。 本发明还提供一种白念珠菌 CaASC1 基因或蛋白的抑制剂或拮抗剂的用途， 用于 抑制白念珠菌的毒性。所述的白念珠菌 CaASC1 的抑制剂或拮抗剂例如是针对于 CaASC1 基 因的干扰性 RNA 或反义核苷酸， 其能够特异性感染 CaASC1 的表达 ； 或是特异性抗 CaAsc1 蛋 白的抗体 ； 或是特异性结合 CaAsc1 蛋白的配体等。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如， 纯化 CaAsc1 蛋白或其活性片段， 可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。
单克隆抗体可利用杂交瘤技术制备获得 ( 见 Kohler 等， Nature 256 ； 495， 1975 ； Kohler 等 人， Eur.J.Immunol.6 ： 511， 1976 ； Kohler 等， Eur.J.Immunol.6 ： 292， 1976 ； Hammerling 等， In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas， Elsevier， N.Y.， 1981)。 在获得了杂交瘤细胞以后， 可采用本技术领域人员熟知的单克隆抗体制备技术来大 量生产本发明的单克隆抗体。作为本发明的一种实施方式， 所述的单克隆抗体可以由下列 制备方法所制备， 所述方法包括步骤 ： (1) 提供佐剂预处理的小鼠 ； (2) 在小鼠腹腔内接种 所述的杂交瘤细胞并分泌单克隆抗体 ； (3) 抽取腹水， 分离获得所述的单克隆抗体。
作为本发明的一种方式， 提供一种组合物， 其含有有效量 ( 如 0.0001-10wt％ ； 较 佳的 0.001-5wt％ ) 的所述的白念珠菌减毒株以及药学上可接受的载体。 优选的， 所述的组 合物是疫苗， 其可用于免疫动物， 使动物体内产生抗体， 从而抵御白念珠菌的感染。所述的 组合物对于动物没有可见的毒性和副作用。
所述 “有效量” 是指可对人和 / 或动物产生功能或活性的且可被人和 / 或动物所 接受的量。所述 “药学上可接受的载体” 指用于治疗剂给药的载体， 包括各种赋形剂和稀释 剂。该术语指这样一些药剂载体 ： 它们本身并不是必要的活性成分， 且施用后没有过分的 毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可 含有液体， 如水、 盐水、 缓冲液。 另外， 这些载体中还可能存在辅助性的物质， 如填充剂、 润滑 剂、 助流剂、 润湿剂或乳化剂、 pH 缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。对 于疫苗， 所述的药学上可接受的载体例如包括一种佐剂。所述组合物在用于给药时， 通常
1×103-1×109 个细胞 /kg 体重， 较佳的 1×104-1×108 个细胞 /kg 体重是适合的 ； 优选的可 进行多次给药， 以产生良好的免疫效果， 例如可间隔 1-3 周进行重复给药。
下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条 件如 Sambrook 等人， 分子克隆 ： 实验室指南 (New York ： Cold Spring Harbor Laboratory Press， 2002) 中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明， 否则百分比和 份数按重量计算。
除非另行定义， 文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外， 任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所 述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
I. 材料和方法
白念珠菌基因组 DNA 抽提
白念珠菌培养过夜， 用 ddH2O 洗 1 次， 悬浮在 500μl 溶液 A(1M 山梨醇， 100mM EDTA， pH8.0) 中， 加入 5μl 20mg/ml 的 Zymolyase， 37℃放置 1 小时后， 高速离心去上清， 细胞用 500μl 的 TE 缓冲液 (20mM Tris· HCl pH7.5， 1mM EDTA) 洗一次， 悬浮在 350μl 的 TE 缓冲 液中， 并加入 90μl 的溶液 B(250mM EDTApH8.0， 400mM Tris·HCl pH8.0， 2％ (v/v)SDS)， 65℃放置 30 分钟， 加入 80μl 的 5M KAc， 冰上放置 1 小时， 高速离心 5 分钟， 吸取上清并加 入 1ml 的无水乙醇， -20℃放置 20 分钟， 高速离心 5 分钟， 沉淀用 70％ (v/v) 乙醇洗一次， 离心后烘干。 Southern 杂交分析
白念珠菌基因组 DNA 抽提后， 基因组 DNA 用 BglII/EcoRV 完全酶切， 电泳完成后 的琼脂糖胶分别用变性液和中和液浸泡 45min， 尼龙膜用双蒸水或 10×SSC 浸透， 搭好转膜 平台， 胶与膜间用 Parafilm 封闭， 加一个 500g 砝码。以 10×SSC 为转膜液转移过夜， 第二 天漂洗晾干交联。交联后的膜装入杂交管， 加入 10ml 预杂交液 (6×SSC， 5×denhardt’ s Reagent， 0.5％ (v/v)SDS， 100μg/ml 鱼精 DNA 于 42℃预杂交 12h， 探针在 100℃变性 5min， 加入 150μl 探针 ( 约 1/3 所标记的探针 )42℃杂交 10-16h。0.1×SSC， 0.1％ (v/v)SDS 洗 两到三次， 每次 40min， 取出膜， 晾干， 室温或 -70℃压片。探针标记用 Invitrogene 的随机 引物标记试剂盒， 照其说明操作。将含 25ng DNA 的溶液于 100℃加热变性 5-10min， 置于 冰浴中， 再依次加入 Random Primers Buffer Mixture， 2μl dCTP， 2μl dGTP， 2μl dTTP， 32 3μl[α- P]-dATP(10μCi/μl)， 混匀后加入 1μlKlenow 酶， 于 25℃保温 1h， 以 Sephadex G-25 柱以 3000rpm 离心 4min， 收集离心液， 即为纯化后的探针溶液。 探针于 100℃变性 5min 冰上冷却后加入杂交体系中。
白念珠菌的转化
准备 PEG/LiAc 溶液 (pH 7.5)10ml ； 在 1.5mI Eppendof 管中依次加入质粒 5μg， 10μl10mg/ml 鱼 精 DNA， 混匀 ； 加 入 0.1ml 感 受 态 细 胞 和 0.6ml PEG/LiAc， 震荡混匀 ； 30℃ 200rpm 培养 30min ； 加入 70μl DMSO， 轻轻混匀 ； 42℃热冲击 15min， 期间不时轻轻摇 匀； 冰浴 2min ： 高速离心 15s， 吸掉上清， 用 0.2mlTE 重悬细胞 ； 涂布于适当的营养筛选 SD 平 板上。
pBA1-ASC1 表达质粒的构建以及回复菌株的制备
构建 pBA1-ASC1 表达质粒用于制备回复菌株， 抽提野生型菌株 SC5314(WT)( 参 见 Fonzi， W.A.and M.Y.Irwin， Isogenic strain construction and gene mapping in Candida albicans.Genetics， 1993.134(3) ： p.717-28.) 的 mRNA， 反转录成 cDNA， 然后利用 引物 CaASC1F(5’ GCTATCGATATGGCTGATCAAGAAGTTTTAG) 和 CaASC1R(5’ GTCGGTACCTTAAGCAG ATGGAGTCATAACT)PCR 扩增不含内含子的 CaASC1 全长编码区 DNA 片段， 插入到 pBA1( 参见 Cao， F.， et al.， The Flo8Transcription Factor Is Essential for Hyphal Development and Virulence in Candida albicans.Mol Biol Cell， 2006.17(1) ： p.295-307.) 的多克 隆位点， 得到 pBA1-ASC1 表达质粒。
pBA1-ASC1 用限制性内切酶线性化， 转化 caasc1/caasc1 双拷贝缺失株， 得到回复 菌株。
Northern 杂交分析
各菌株在 YPD， 30 ℃中培养至对数生长期后期， 转接至 YPD 起始 OD ＝ 0.05， 并 在相应温度下培养指定时间， 用热酚法抽提白念珠菌总 RNA。20μl 上样量包括 RNA 样 品 12μl(25μg)， 4μl 甲醛， 2μl 10×MOPS， 2μl 上样缓冲液、 65 ℃加热 10min， 0 ℃冷却 2min， 离心 5s， 上样。 电泳在含甲醛的变性胶上进行 (1g 琼脂糖， 10ml 10×MOPS， 87ml DEPC 处理水， 加热融化稍冷后加入 2.7ml 37％ (v/v) 甲醛 )。电泳条件为 100mA， 50-70V， 5-7h 电泳完成后同样用毛细法转膜， 转膜液用 5×SSC。转膜过夜后， 取出膜， 不能使膜干透， 用 Bio-Ra GS Gene Linker C3protocol 紫外交联， 加入 10ml 预杂交液， 65℃， 2h 后更换为 10ml 杂交液， 加入探针 65℃杂交过夜， 用 2×SSC， 0.1％ (v/v)SDS， 65℃洗膜两次， 每次 30min。 杂 交好的膜不要晾干， 用保鲜膜包好后 -70℃压片。重杂交洗膜用 0.5％ (v/v)SDS， 90-100℃ 加热 5-10min， 或按照 Clontech 推荐用 0.5％ (v/v)SDS， 90-100℃加热 10min 后让其自然冷 却 10min 后取出备用， 若不立即位用， 用保鲜膜包好后置于 -20℃保存。
引物核苷酸序列
本发明的方法所用的引物的核苷酸序列如表 1。
表1
小鼠系统感染实验
以体重在 18-21g ICR 雄性小鼠为实验对象， 通过尾静脉注射 100μl 白念珠菌各 种菌株， 并培养观测 25 天。各个菌株注射浓度为 5×106 或 5×107 细胞 / 毫升。
II. 实施例
实施例 1、 白念珠菌中 CaASC1 基因的敲除
为了研究 CaAsc1 在白念珠菌形态发生和毒性表现中的功能， 本发明人构建了 caasc1/caasc1 缺失株。利用 PCR 同源重组策略， 在野生型菌株 BWP17(ura-his-arg-)( 参 见 Wilson， R.B.， D.Davis， and A.P.Mitchell， Rapid hypothesis testing with Candida albicans through gene disruption with short homology regions.J Bacteriol， 1999.181(6) ： p.1868-74.) 中敲除了 CaASC1 基因， 敲除策略如图 1A 所示。
敲除所用的 PCR 引物如下 ：
CaASC1-5DR ：
5’ -GTTAATTTCATTTCCCTTCAATTTCTTTTCTTTTCTTCTTTTTTAAAAAACAAACAATCAATTATC TACGTTTTCCCAGTCACGACGTT ；
CaASC1-3DR ：
5’ -TTTCCCACAAAAAAACAAAATCTATACAAAAAAAAACTTCTTGTTGTATGTTAAATTTAGAATTAA ATTTGTGGAATTGTGAGCGGATA ；
引物 CaASC1-5DR 和 CaASC1-3DR 中有 69 个碱基与目标基因 CaASC1 同源， 而另外 20 个碱基与用于与 PCR 扩增模板质粒中的 DNA 序列配对。 以质粒 pGEM-HIS1( 参见 Wilson， R.B.， D.Davis， and A.P.Mitchell， Rapid hypothesis testing with Candida albicans through gene disruption with short homology regions.J Bacteriol， 1999.181(6) ： p.1868-74.) 为模板， 以 CaASC1-5DR 和 CaASC1-3DR 为引物， 通过 PCR 扩增得到片段用于转 化白念珠菌受体菌 BWP17。转化后在 His 营养缺陷的 SD 平板上筛选得到上百个克隆， 挑取 数 10 个克隆， 用 PCR 进行鉴定。
将正确插入 HIS1 片段的菌株作为受体菌进行第二拷贝 CaASC1 的敲除。以质 粒 pRS-ARG4ΔSpeI( 参见 Wilson， R.B.， D.Davis， and A.P.Mitchell， Rapid hypothesis testing with Candida albicans through gene disruption with short homology regions.J Bacteriol， 1999.181(6) ： p.1868-74.) 为 模 板， 以 CaASC1-5DR 和 CaASC1-3DR 为引物， 通过 PCR 扩增得到的片段用于转化所述正确插入 HIS1 片段的菌株。经过营养筛选 和 PCR 鉴定得到 HIS1+、 ARG4+ 的双拷贝缺失株。最后用 PCR 和 Southern 杂交对以上菌株 进行再次鉴定。 图 1B 显示了 CaASC1 基因敲除过程中各个菌株 PCR 鉴定的图谱， 图 1C 显示了敲除 过程中各个菌株 Southern 杂交分析的图谱。
实施例 2、 CaASC1 基因的敲除对白念珠菌的影响
通过同源重组的方法在白念珠菌中敲除 CaASC1 基因， PCR 和 Southern 杂交分析 证明敲除是成功的。
为了检测 CaASC1 基因的缺失是否会影响白念珠菌的菌丝发育， 本发明人在菌 丝诱导条件下， 检测以下各个菌株的形态。血清是一种很强的菌丝诱导因子。丰富液体 培养基 YPD 中加入 10 ％ (v/v) 血清在 37 ℃培养是标准的菌丝诱导条件。在此条件下 培 养 3.5 个 小 时， 野 生 型 菌 株 SC5314(WT)( 参 见 Fonzi， W.A.and M.Y.Irwin， Isogenic strain construction and gene mapping in Candida albicans.Genetics， 1993.134(3) ： p.717-28.) 以及 CaASC1 的回复菌株 (caasc1/caasc1+CaASC1) 均能形成真菌丝， CaASC1/ caasc1 单拷贝缺失株则形成较短的真菌丝。caasc1/caasc1 双拷贝缺失株只有部分细胞能 够形成粗短弯曲的菌丝 ( 约 40％ )， 而约 60％细胞仍旧维持在酵母态 ( 图 2A)。
另一种诱导菌丝的培养基是 Lee’ s 培养基。在 pH6.8 的 Lee’ s 液体培养基 ( 参见 Lee， K.L.， H.R.Buckley， and C.C.Campbell， An amino acid liquid synthetic medium for the development of mycelial and yeast forms of Candida Albicans.Sabouraudia， 1975.13(2) ： p.148-53.) 中 37 ℃培养 6 个小时， 缺失株的情况与在 YPD+10 ％ (v/v) 血清 下类似 ( 图 2A)。碳源缺乏的液体培养基 SCLD( 参见 Li， Y.， et al.， Roles of Candida albicans Sfl1 in hyphal development.Eukaryot Cell， 2007.6(11) ： p.2112-21.) 和氮 源缺乏的液体培养基 SLAD( 参见 Gimeno， C.J.， et al.， Unipolar cell divisions in the yeast S.cerevisiae lead to filamentous growth ： regulation by starvation and RAS. Cell， 1992.68(6) ： p.1077-90) 是诱导菌丝生长能力相对比较弱的培养基， 37 ℃条件下培
养 6 个小时， 野生型菌株 SC5314 及回复菌株均能形成较长的真菌丝， 而 CaASC/caasc1 单拷 贝缺失株则形成较短的真菌丝。caasc1/caasc1 双拷贝缺失株没有菌丝生成 ( 图 2A)。本 发明人也观察了这些缺失株在固体培养基中菌丝形成的情况。 在含血清的琼脂固体平板上 诱导 3 天后， 野生型菌株 SC5314 形成丝状菌落， CaASC1/caasc1 单拷贝缺失株形成较短的 丝状菌落， 而 caasc1/caasc1 只能形成边缘不甚光滑的菌落 ( 图 2B)。
以上结果表明， CaAsc1 在白念珠菌菌丝形成中起激活作用， 正向调控酵母态细胞 向菌丝的转变， 而且 CaAsc1 在白念珠菌的菌丝形成中呈剂量依赖型， 拷贝数的降低就能影 响其激活功能。
实施例 3、 CaASC1 基因的敲除对白念珠菌毒性的影响
酵母 - 菌丝形态之间的转换能力与白念珠菌的致病能力密切相关， 不能形成菌丝 的菌株会丧失毒性， 而组成型形成菌丝的菌株也是或丧失或大幅下降其毒性。
本发明人构建的 caasc1/caasc1 缺失株菌丝发育有缺陷， 于是本发明人通过小鼠 系统感染试验来检测缺失株的感染能力或者毒性。以野生型菌株 CAI4+pBA1(WT)( 参见 Cao， F.， et al.， The Flo8 Transcription Factor Is Essential for Hyphal Development and Virulence in Candida albicans.Mol Biol Cell， 2006.17(1) ： p.295-307.) 为阳性 对照， 本发明人检测了 caasc1/caasc1 缺失株的毒性。将 18-21 克的 ICR 雄性小鼠作为实 验对象， 通过小鼠的存活率曲线来分析这些缺失株的毒性变化。各菌株在 YPD 培养基中培 养过夜， 转接到新鲜的 YPD 培养基中再培养 4 小时， 取适量菌液离心后重悬于生理盐水中， 在显微镜下计数后稀释成所需浓度。每只小鼠通过尾静脉注射 0.1ml 白念珠菌悬液， 每个 5 6 菌种注射两个不同浓度， 分别为 5×10 细胞 / 只 ( 低浓度 ) 和 5×10 细胞 / 只 ( 高浓度 )， 每种浓度注射 8 只小鼠。观察小鼠在注射后 25 天中的死亡情况。
与野生型菌株相比， caasc1/caasc1 缺失株的毒性明显下降。 野生型菌株的毒性非 常强， 高浓度下在约 8 天左右实验小鼠就全部死掉， 低浓度下小鼠也在 12 天左右全部死掉。 CaASC1/caasc1 单拷贝缺失株在第 11 天上， 注射高浓度菌液的实验小鼠全部死亡， 第 18 天 上注射低浓度菌液的实验小鼠全部死亡。而 caasc1/caasc1 缺失株在第 25 天上， 注射高浓 度菌液的实验小鼠存活率约为 50％ ( 图 3A)， 注射低浓度菌液的实验小鼠存活率约 100％， 都明显低于野生型菌株的毒性 ( 图 3B)。
因此， 根据 CaASC1 调控白念珠菌的毒性表现， 其是一个重要的毒性因子。
实施例 4、 筛选方法
如前述方法获得白念珠菌的回复菌株 caasc1/caasc1+CaASC1， 作为表达 CaAsc1 蛋白的系统， 并将所述系统分为 ：
对照组 ： 不给予候选物质 ； 和
测试组 ： 给予候选物质。
检测对照组和测试组细胞中情况， 若相对于对照组， 测试组中 CaAsc1 蛋白的表达 在统计学上减弱 30％以上， 则说明候选物质是抑制白念珠菌的毒性的潜在物质。
实施例 5、 抗 CaAsc1 蛋白抗体的制备
本实施例制备抗 CaAsc1 蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体。
1. 多克隆抗体的制备
从 pBA1-ASC1 表达质粒 DNA 中扩增不含内含子的 CaASC1 全长片段， 插入 pET28(a)( 购自 MERCK) 载体的多克隆位点内。导入大肠杆菌表达菌株 BL21， 1.0mM IPTG 诱导 3h 之后， 镍柱纯化 His-CaAsc1 蛋白， 然后常规方法免疫兔子， 获得 CaAsc1 蛋白的抗体， 作为 CaAsc1 蛋白的一种抑制剂。
验证发现， 该抗体结合 CaAsc1 的特异性良好， 抑制 CaAsc1 活性显著。
2. 单克隆抗体的制备
前述 “1” 制备和纯化的 His-CaAsc1 蛋白免疫小鼠。Balb/c 小鼠免疫剂量 ： 0.1mg 每只每次。肌肉多点注射。免疫程序 ： 0， 3， 6 周三次免疫。融合前三天取 0.1mg 蛋白腹腔 注射， 做回忆刺激。
回忆刺激后 3 天做融合。取免疫后小鼠的脾脏细胞和鼠骨髓瘤细胞 SP2/0 采用聚 乙二醇 (PEG) 常规融合法做融合。
融合后加 HAT 选择性培养基， 筛选采用 ELISA 法， 所用筛选用抗原为前述纯化的 His-CaAsc1 蛋白。
经过三次有限稀释法克隆化筛选得到若干株分泌抗 CaAsc1 的单克隆抗体的杂交 瘤细胞株， 其中有一株分泌的抗体结合 CaAsc1 的特异性非常好。
实施例 6、 利用减毒菌株制备疫苗
本实施例中， 本发明人检测 caasc1/caasc1 缺失株作为减毒菌株能否可以使小鼠 产生免疫力。
本 发 明 人 采 用 注 射 过 caasc1/caasc1 缺 失 株 ( 将 1×105 个 白 念 珠 菌 caasc1/ caasc1 缺失株溶解于 0.1ml 的生理盐水溶液中， 用于注射 )15 天后的存活小鼠， 向其体内注 6 射 5×10 野生型的白念珠菌， 再过 25 天后， 发现 10 只小鼠有 8 只依然存活。事先未注射过 caasc1/caasc1 缺失株而仅注射过生理盐水的小鼠， 15 天后注射 5×106 野生型的白念珠菌 后， 7 天之后 10 只小鼠全部死亡。
上述结果说明， caasc1/caasc1 缺失株能使小鼠对野生型的白念珠菌产生免疫力， 因此本发明的减毒菌株可以作为一种有效的免疫疫苗。
背景技术 白念珠菌 (Candida albicans) 是一种临床上分离到的一种机会性人体致病真菌， 在免疫下调的病人中， 如器官移植病人、 艾滋病毒感染者等， 可以引起广泛的浅部和深部系 统感染， 感染部位包括口腔、 女性阴道等， 引起鹅口疮、 阴道炎等疾病， 也可以侵入表皮和 内皮细胞进入血液到达内脏器官， 如肾脏、 脑部等， 导致败血症， 严重可以导致死亡 (Odds， F.C.1994.J Am Acad Dermatol.31 ： S2-S5)。 白念珠菌在不同的生长条件下， 呈现不同的生 长形态， 包括菌体 (yeast form)， 假菌丝 (pseudohyphae) 和菌丝 (hyphae)。各种形态之间 的相互转化能力直接影响白念珠菌的致病能力 (Odds， F.C.1985.Grit Rev Microbiol.12 ： 45-93 ； Brown， A.J.P.et al.1999.Trends Microbiol.7 ： 334-338)， 而形态转换缺陷的菌 株其系统感染能力下降或消失 (Lo， H.J.et al， 1997.Cell.90 ： 939-949 ； Braun， B.R.et al.2001.EMBO J.20 ： 4753-61 ； Hwang， C.S.et al.2003.Mol Microbiol.47 ： 1029-43)。
最近有些实验室利用减毒菌株作为疫苗来免疫小鼠， 取得了比较好的效果， 并对其进行了深入的生物化学分析， 为疫苗的研制提供了理论基础 (Elena FA et al， Proteomics 2004， 4， 3007-3020 ； Elena FA et al， Proteomics2004， 4， 1204-1215)。 许多培 养条件可以引起白念珠菌的形态转换， 包括血清、 温度、 pH 值、 氮源利用以及氧压等等。所 有的细胞都必需具有检测细胞外环境改变和外界因子刺激的能力， 从而对各种信号做出正 确应答的能力。各种外界因子的刺激包括光、 激素、 神经递质、 生长因子及气味因子等。真 核细胞通过不同的信号传导途径改变蛋白质合成从而应对各种外界因子刺激。一般来说， 信号途径被认为是通过调控转录从而改变胞内蛋白质的表达水平。 而最近的研究显示对翻 译的调控也是信号转导的一个重要方面。两条重要的信号通路 Ras 和 Akt 主要介导了特定 的 mRNA 和核糖体的结合。这种调控使核糖体对于正处于翻译状态的 mRNAs 的识别发生了 变化， 从而导致蛋白合成水平的快速改变。
目前对于白念珠菌真正的致病因子和致病机理没有完全研究清楚， 因此本领域还 有必要研究白念珠菌的致病因子。
最近有些实验室利用减毒菌株作为疫苗来免疫小鼠， 取得了比较好的效果， 并对其进行了深入的生物化学分析， 为疫苗的研制提供了理论基础 (Elena FA et al， Proteomics 2004， 4， 3007-3020 ； Elena FA et al， Proteomics2004， 4， 1204-1215)。 许多培 养条件可以引起白念珠菌的形态转换， 包括血清、 温度、 pH 值、 氮源利用以及氧压等等。所 有的细胞都必需具有检测细胞外环境改变和外界因子刺激的能力， 从而对各种信号做出正 确应答的能力。各种外界因子的刺激包括光、 激素、 神经递质、 生长因子及气味因子等。真 核细胞通过不同的信号传导途径改变蛋白质合成从而应对各种外界因子刺激。一般来说， 信号途径被认为是通过调控转录从而改变胞内蛋白质的表达水平。 而最近的研究显示对翻 译的调控也是信号转导的一个重要方面。两条重要的信号通路 Ras 和 Akt 主要介导了特定 的 mRNA 和核糖体的结合。这种调控使核糖体对于正处于翻译状态的 mRNAs 的识别发生了 变化， 从而导致蛋白合成水平的快速改变。
目前对于白念珠菌真正的致病因子和致病机理没有完全研究清楚， 因此本领域还 有必要研究白念珠菌的致病因子。
发明内容 本发明的目的在于提供白念珠菌减毒株 ( 无毒株 )。
本发明的另一目的在于提供一种筛选抑制白念珠菌的毒性的潜在物质的方法。
在本发明的第一方面， 提供一种白念珠菌减毒株 ( 无毒株 )， 所述的减毒株中 CaASC1 基因基本上不表达。
在一个优选例中， 所述的减毒株 (caasc1/caasc1) 中 CaASC1 基因或基因片段缺 失。
本发明的另一目的在于提供一种筛选抑制白念珠菌的毒性的潜在物质的方法。
在本发明的第一方面， 提供一种白念珠菌减毒株 ( 无毒株 )， 所述的减毒株中 CaASC1 基因基本上不表达。
在一个优选例中， 所述的减毒株 (caasc1/caasc1) 中 CaASC1 基因或基因片段缺 失。
在另一优选例中， 所述的减毒株通过同源重组的方法从野生型白念珠菌染色体中 敲除 CaASC1 基因或基因片段获得。
在另一优选例中， 所述的 CaASC1 的基因 ：
(1) 具有 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 2 所示的核苷酸序列 ； 或
(2) 截短的 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 2 所示的核苷酸序列， 且该基因不编码 CaAsc1 蛋白或编码降低活性 ( 优选活性降低 50 ％， 更优选降低 80 ％， 更优选无活性 ) 的 CaAsc1 蛋白或蛋白片段。
在另一优选例中， 相对于野生型白念珠菌， 所述的减毒株的菌丝形成能力下降。
在本发明的另一方面， 提供所述的白念珠菌减毒株的用途， 用于制备防治 ( 特别 是预防 ) 白念珠菌过度生长相关疾病的组合物。
在另一优选例中， 所述的白念珠菌过度生长相关疾病选自 ( 但不限于 ) ： 鹅口疮、 阴道炎。
在本发明的另一方面， 提供一种组合物， 所述的组合物含有有效量的所述的白念 珠菌减毒株和药学上可接受的载体。
在另一优选例中， 所述的组合物是疫苗。 在本发明的另一方面， 提供一种抑制白念珠菌 ( 抑制毒性或菌丝生长 ) 的方法， 所 述方法包括 ： 抑制白念珠菌中 CaAsc1 蛋白的表达或活性。
在本发明的另一方面， 提供一种筛选抑制白念珠菌 ( 抑制毒性或菌丝生长 ) 的潜 在物质的方法， 所述方法包括 ：
(a) 在 测 试 组 中， 向 表 达 CaAsc1 蛋 白 的 体 系 中 添 加 待 筛 选 的 候 选 物， 并检测 CaAsc1 蛋白的表达或活性 ； 并且， 在对照组中， 在不添加所述候选物的、 表达 CaAsc1 蛋白的 体系中， 检测 CaAsc1 蛋白的表达或活性 ；
(b) 将步骤 (a) 测试组中 CaAsc1 蛋白的表达或活性与对照组中 CaAsc1 蛋白的表 达或活性进行比较，
如果测试组中 CaAsc1 蛋白的表达或活性在统计学上低于 ( 优选显著低于， 较佳的 低 20％或更低 ； 更佳的低 40％或更低 ； 进一步更佳的低 60％或更低 ) 对照组， 就表明该候 选物是抑制白念珠菌的毒性的潜在物质。
在另一优选例中， 所述的体系选自 ： 细胞体系、 溶液体系。
在本发明的另一方面， 提供一种 CaASC1 基因的用途， 用于鉴定待测白念珠菌的毒 性。
在本发明的另一方面， 提供一种鉴定待测白念珠菌毒性的方法， 包括 ： 检测待测白 念珠菌中 CaASC1 基因的表达或活性，
若相对于野生型白念珠菌， 待测白念珠菌 CaASC1 基因表达或活性提高， 则该白念 珠菌具有一般毒性或高的毒性 ；
若相对于野生型白念珠菌， 待测白念珠菌 CaASC1 基因表达或活性降低， 则该白念 珠菌具有低的毒性或无毒性。
在本发明的另一方面， 提供一种白念珠菌 CaASC1 基因或 CaAsc1 蛋白的抑制剂的 用途， 用于制备抑制白念珠菌 ( 抑制毒性或菌丝生长 ) 的组合物。
在一个优选例中， 所述的 CaAsc1 蛋白的抑制剂是特异性抗 CaAsc1 蛋白的抗体。
在另一优选例中， 所述的抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
在本发明的另一方面， 提供一种抗体， 所述的抗体特异性地抗 CaAsc1 蛋白 ( 与 CaAsc1 蛋白特异性结合 )。
在一个优选例中， 所述的抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明的其它方面由于本文的公开内容， 对本领域的技术人员而言是显而易见 的。 附图说明
图 1A 显示了在白念珠菌中敲除 CaASC1 基因的策略。
图 1B 显示了在白念珠菌 CaASC1 基因的敲除过程中各个菌株的 PCR 鉴定图谱。
图 1C 显示了在白念珠菌 CaASC1 基因的敲除过程中各个菌株的 Southern 杂交图 谱。
图 2 显示了白念珠菌 caasc1/caasc1 缺失株在菌丝诱导条件下， 在液体和固体血 清和李氏 (Lee’ s) 培养基中的形态 ( 图 2A)， 在 SCLD 和 SLAD 液体培养基中的形态 ( 图 2B)。
图 3 显示了在小鼠系统感染试验中， CaASC1 基因的敲除使白念珠菌毒性降低。注 7 射液浓度为 5×10 细胞 / 毫升 ( 图 3A) 或 5×106 细胞 / 毫升 ( 图 3B)， 每只小鼠尾静脉注 射 100μl 菌液， 共注射 8 只小鼠。 具体实施方式
本发明人经过广泛的研究， 首次在白念珠菌中分离出一种白念珠菌毒性相关的基 因， 本发明人将之命名为 CaASC1 基因。利用同源重组原理， 本发明人在白念珠菌中构建了 caasc1/caasc1 缺失株， 并证明 CaASC1 基因的表达与白念珠菌的菌丝发育和毒性表现密切 相关。
除非另外说明， 所述的 “白念珠菌 ASC1 基因” ， “CaASC1 基因” ， “CaASC1” ， “ASC1” 可 互换使用， 都是指白念珠菌的 ASC1 基因。 “白念珠菌 Asc1 蛋白” “CaAsc1 蛋白” ， “CaAsc1” ， ， “Asc1” 蛋白可互换使用， 都是指白念珠菌的 Asc1 蛋白。
除非另外说明， 白念珠菌的减毒株 ( 无毒株 ) 用 “caasc1/caasc1”表示， 或用 “caasc1/caasc1 缺失株” 表示， 或用 “asc1/asc1” 表示， 或用 “-/-” 表示。
白念珠菌的单拷贝缺失株用 “ASC1/asc1” 表示， 或用 “CaASC1/caasc1” 表示， 或用 “+/-” 表示。
白念珠菌的回复菌株用 “caasc1/caasc1(CaASC1)” 表 示，或 用 “caasc1/ caasc1+CaASC1” 表示， 或用 -/-(+) 表示。白念珠菌的野生型菌株用 WT 表示， 或用 +/+ 表 示。
如本文所用， “分离的” 是指物质从其原始环境中分离出来 ( 如果是天然的物质， 原 始环境即是天然环境 )。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化 的， 但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开， 则为分离纯化 的。
如本文所用， 所述的 “含有” ， “具有” 或 “包括” 包括了 “包含” 、 “主要由 ...... 构 成” 、 “基 本 上 由 ...... 构 成” 、 和 “由 ....... 构 成” “主 要 由 ...... 构 成” ； 、 “基 本 上由 ...... 构成” 和 “由 ...... 构成” 属于 “含有” 、 “具有” 或 “包括” 的下位概念。
白念珠菌 (Candida albicans) 是一种人体机会性致病真菌， 能引起广泛的深部 和浅部感染， 但是其真正的致病因子和致病机理以往没有完全研究清楚。根据白念珠菌基 因组序列 (http://www.candidagenome.org/)， 利用生物信息学比较分析， 本发明人在白 念珠菌的基因组序列中找到一个功能未知的新基因， 该基因命名为白念珠菌 CaASC1 基因 (orf19.6906)。利用同源重组原理， 本发明人在白念珠菌中构建了 CaASC1 基因双拷贝敲除 株 caasc1/caasc1。CaASC1 基因的敲除阻断白念珠菌的菌丝生长。在小鼠系统感染试验 中， caasc1/caasc1 缺失株的毒性明显下降。这些结果表明 CaAsc1 正向调控白念珠菌的菌 丝发育同时也影响该致病菌的毒性表现。
作为本发明的优选方式， 所述的 CaASC1 的基因具有 SEQ ID NO ： 1 所示的核苷酸序 列； CaASC1 基因编码区中有一个 259bp 的内含子 (SEQ ID NO ： 3)， 本发明人通过逆转录合成 了其 cDNA 序列。利用所述的 cDNA 序列， 本发明人构建了一个能表达不含内含子的 CaASC1 的表达载体， 用于 CaASC1 基因功能互补试验。
所述的 CaASC1 基因编码 CaAsc1 蛋白。CaAsc1 蛋白具有 SEQ ID NO ： 4 所示的氨 基酸序列。 所述的 CaASC1 的基因也包括截短形式的 CaASC1 的基因 ( 或称为 CaASC1 基因 片段 )， 只要该基因片段在被敲除后可导致 CaAsc1 蛋白不表达或表达异常， 或其表达的 CaAsc1 蛋白片段活性降低或没有活性。根据本发明的揭示， 本领域人员非常容易获得所述 的 CaASC1 的基因片段。
所述的 CaASC1 的基因可以作为一种白念珠菌毒性鉴定的标志物。例如可通过检 测待测白念珠菌中 CaASC1 基因的表达情况来确定白念珠菌的毒性 ； 若相对于野生型白念 珠菌， 待测白念珠菌 CaASC1 基因正常表达或过表达 ( 即相对于野生型白念珠菌， 待测白念 珠菌中 CaASC1 基因的表达高 20％或更高， 更佳的高 50％或更高 )， 则该白念珠菌具有一般 毒性或高的毒性 ； 若相对于野生型白念珠菌， 待测白念珠菌 CaASC1 基因低表达 ( 如低 20％ 或更低 ； 更佳地低 50％或更低 ) 或不表达， 则该白念珠菌具有低的毒性或无毒性。或例如 可通过检测待测白念珠菌中 CaAsc1 蛋白的活性来确定白念珠菌的毒性 ； 若相对于野生型 白念珠菌， 待测白念珠菌 CaAsc1 蛋白活性正常或过于激活 ( 即相对于野生型白念珠菌， 待 测白念珠菌中 CaAsc1 蛋白的活性高 20％或更高， 更佳的高 50％或更高 )， 则该白念珠菌具 有一般毒性或高的毒性 ； 若相对于野生型白念珠菌， 待测白念珠菌 CaAsc1 蛋白的活性降低 ( 即相对于野生型白念珠菌， 待测白念珠菌中 CaAsc1 蛋白的活性低 20％或更低， 更佳的低 50％或更低 )， 则该白念珠菌具有低的毒性或无毒性。
本发明还提供一种白念珠菌减毒株， 该减毒株中 CaASC1 基因基本上不表达。所述 的 “基本上不表达” 是指白念珠菌减毒株中 CaASC1 基因不表达或低表达。其中， CaASC1 基 因低表达是指该减毒株中 CaASC1 基因的表达量低于于野生型白念珠菌的 20％ ； 较佳地低 于野生型白念珠菌的 10％； 更佳地于野生型白念珠菌的 5％或更低， 最佳地低于野生型白念 珠菌的 2％或更低。CaASC1 基因基本上不表达的菌株可以通过各种基因抑制、 基因沉默、 基 因敲除等技术来构建。例如， 可以通过基于同源重组的基因敲除技术来将 CaASC1 基因从染 色体上敲除， 从而使得 CaASC1 基因缺失 ； 可以针对 CaASC1 基因设计干扰性 RNA 或反义核苷 酸来使 CaASC1 基因表达抑制或沉默。
一种使得 CaASC1 基因缺失的方法是基因敲除技术， 在本发明的优选实施方式中， 体外构建 CaASC1 基因敲除质粒， 通过同源重组的方法， 把白念珠菌染色体中 CaASC1 基因敲 除掉。
所述的白念珠菌减毒株可以用于研究 CaASC1 基因基本上不表达后对于白念珠菌 中其它基因表达情况的影响， 以及研究 CaASC1 基因基本上不表达后白念珠菌的菌丝生长 情况以及毒性情况。
所述的白念珠菌减毒株可以用于制备疫苗， 来免疫动物， 从而在不对动物造成危 害的情况下使得动物对白念珠菌感染产生免疫力。
本发明还提供了一种筛选抑制白念珠菌的毒性的潜在物质的方法， 所述方法包 括： 向表达 CaAsc1 蛋白的体系中添加待筛选的候选物， 并检测 CaAsc1 蛋白的表达情况 ； 如 果 CaAsc1 蛋白的表达情况在统计学上减弱， 就表明该候选物是抑制白念珠菌的毒性的潜 在物质。
作为本发明的优选方式， 所述的方法还包括 ： 对获得的潜在物质进行进一步的白 念珠菌毒性抑制或菌丝生长抑制试验， 以进一步选择和确定对于抑制白念珠菌毒性有用的 物质。 本发明还提供一种白念珠菌 CaASC1 基因或蛋白的抑制剂或拮抗剂的用途， 用于 抑制白念珠菌的毒性。所述的白念珠菌 CaASC1 的抑制剂或拮抗剂例如是针对于 CaASC1 基 因的干扰性 RNA 或反义核苷酸， 其能够特异性感染 CaASC1 的表达 ； 或是特异性抗 CaAsc1 蛋 白的抗体 ； 或是特异性结合 CaAsc1 蛋白的配体等。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如， 纯化 CaAsc1 蛋白或其活性片段， 可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。
单克隆抗体可利用杂交瘤技术制备获得 ( 见 Kohler 等， Nature 256 ； 495， 1975 ； Kohler 等 人， Eur.J.Immunol.6 ： 511， 1976 ； Kohler 等， Eur.J.Immunol.6 ： 292， 1976 ； Hammerling 等， In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas， Elsevier， N.Y.， 1981)。 在获得了杂交瘤细胞以后， 可采用本技术领域人员熟知的单克隆抗体制备技术来大 量生产本发明的单克隆抗体。作为本发明的一种实施方式， 所述的单克隆抗体可以由下列 制备方法所制备， 所述方法包括步骤 ： (1) 提供佐剂预处理的小鼠 ； (2) 在小鼠腹腔内接种 所述的杂交瘤细胞并分泌单克隆抗体 ； (3) 抽取腹水， 分离获得所述的单克隆抗体。
作为本发明的一种方式， 提供一种组合物， 其含有有效量 ( 如 0.0001-10wt％ ； 较 佳的 0.001-5wt％ ) 的所述的白念珠菌减毒株以及药学上可接受的载体。 优选的， 所述的组 合物是疫苗， 其可用于免疫动物， 使动物体内产生抗体， 从而抵御白念珠菌的感染。所述的 组合物对于动物没有可见的毒性和副作用。
所述 “有效量” 是指可对人和 / 或动物产生功能或活性的且可被人和 / 或动物所 接受的量。所述 “药学上可接受的载体” 指用于治疗剂给药的载体， 包括各种赋形剂和稀释 剂。该术语指这样一些药剂载体 ： 它们本身并不是必要的活性成分， 且施用后没有过分的 毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可 含有液体， 如水、 盐水、 缓冲液。 另外， 这些载体中还可能存在辅助性的物质， 如填充剂、 润滑 剂、 助流剂、 润湿剂或乳化剂、 pH 缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。对 于疫苗， 所述的药学上可接受的载体例如包括一种佐剂。所述组合物在用于给药时， 通常
1×103-1×109 个细胞 /kg 体重， 较佳的 1×104-1×108 个细胞 /kg 体重是适合的 ； 优选的可 进行多次给药， 以产生良好的免疫效果， 例如可间隔 1-3 周进行重复给药。
下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条 件如 Sambrook 等人， 分子克隆 ： 实验室指南 (New York ： Cold Spring Harbor Laboratory Press， 2002) 中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明， 否则百分比和 份数按重量计算。
除非另行定义， 文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外， 任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所 述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
I. 材料和方法
白念珠菌基因组 DNA 抽提
白念珠菌培养过夜， 用 ddH2O 洗 1 次， 悬浮在 500μl 溶液 A(1M 山梨醇， 100mM EDTA， pH8.0) 中， 加入 5μl 20mg/ml 的 Zymolyase， 37℃放置 1 小时后， 高速离心去上清， 细胞用 500μl 的 TE 缓冲液 (20mM Tris· HCl pH7.5， 1mM EDTA) 洗一次， 悬浮在 350μl 的 TE 缓冲 液中， 并加入 90μl 的溶液 B(250mM EDTApH8.0， 400mM Tris·HCl pH8.0， 2％ (v/v)SDS)， 65℃放置 30 分钟， 加入 80μl 的 5M KAc， 冰上放置 1 小时， 高速离心 5 分钟， 吸取上清并加 入 1ml 的无水乙醇， -20℃放置 20 分钟， 高速离心 5 分钟， 沉淀用 70％ (v/v) 乙醇洗一次， 离心后烘干。 Southern 杂交分析
白念珠菌基因组 DNA 抽提后， 基因组 DNA 用 BglII/EcoRV 完全酶切， 电泳完成后 的琼脂糖胶分别用变性液和中和液浸泡 45min， 尼龙膜用双蒸水或 10×SSC 浸透， 搭好转膜 平台， 胶与膜间用 Parafilm 封闭， 加一个 500g 砝码。以 10×SSC 为转膜液转移过夜， 第二 天漂洗晾干交联。交联后的膜装入杂交管， 加入 10ml 预杂交液 (6×SSC， 5×denhardt’ s Reagent， 0.5％ (v/v)SDS， 100μg/ml 鱼精 DNA 于 42℃预杂交 12h， 探针在 100℃变性 5min， 加入 150μl 探针 ( 约 1/3 所标记的探针 )42℃杂交 10-16h。0.1×SSC， 0.1％ (v/v)SDS 洗 两到三次， 每次 40min， 取出膜， 晾干， 室温或 -70℃压片。探针标记用 Invitrogene 的随机 引物标记试剂盒， 照其说明操作。将含 25ng DNA 的溶液于 100℃加热变性 5-10min， 置于 冰浴中， 再依次加入 Random Primers Buffer Mixture， 2μl dCTP， 2μl dGTP， 2μl dTTP， 32 3μl[α- P]-dATP(10μCi/μl)， 混匀后加入 1μlKlenow 酶， 于 25℃保温 1h， 以 Sephadex G-25 柱以 3000rpm 离心 4min， 收集离心液， 即为纯化后的探针溶液。 探针于 100℃变性 5min 冰上冷却后加入杂交体系中。
白念珠菌的转化
准备 PEG/LiAc 溶液 (pH 7.5)10ml ； 在 1.5mI Eppendof 管中依次加入质粒 5μg， 10μl10mg/ml 鱼 精 DNA， 混匀 ； 加 入 0.1ml 感 受 态 细 胞 和 0.6ml PEG/LiAc， 震荡混匀 ； 30℃ 200rpm 培养 30min ； 加入 70μl DMSO， 轻轻混匀 ； 42℃热冲击 15min， 期间不时轻轻摇 匀； 冰浴 2min ： 高速离心 15s， 吸掉上清， 用 0.2mlTE 重悬细胞 ； 涂布于适当的营养筛选 SD 平 板上。
pBA1-ASC1 表达质粒的构建以及回复菌株的制备
构建 pBA1-ASC1 表达质粒用于制备回复菌株， 抽提野生型菌株 SC5314(WT)( 参 见 Fonzi， W.A.and M.Y.Irwin， Isogenic strain construction and gene mapping in Candida albicans.Genetics， 1993.134(3) ： p.717-28.) 的 mRNA， 反转录成 cDNA， 然后利用 引物 CaASC1F(5’ GCTATCGATATGGCTGATCAAGAAGTTTTAG) 和 CaASC1R(5’ GTCGGTACCTTAAGCAG ATGGAGTCATAACT)PCR 扩增不含内含子的 CaASC1 全长编码区 DNA 片段， 插入到 pBA1( 参见 Cao， F.， et al.， The Flo8Transcription Factor Is Essential for Hyphal Development and Virulence in Candida albicans.Mol Biol Cell， 2006.17(1) ： p.295-307.) 的多克 隆位点， 得到 pBA1-ASC1 表达质粒。
pBA1-ASC1 用限制性内切酶线性化， 转化 caasc1/caasc1 双拷贝缺失株， 得到回复 菌株。
Northern 杂交分析
各菌株在 YPD， 30 ℃中培养至对数生长期后期， 转接至 YPD 起始 OD ＝ 0.05， 并 在相应温度下培养指定时间， 用热酚法抽提白念珠菌总 RNA。20μl 上样量包括 RNA 样 品 12μl(25μg)， 4μl 甲醛， 2μl 10×MOPS， 2μl 上样缓冲液、 65 ℃加热 10min， 0 ℃冷却 2min， 离心 5s， 上样。 电泳在含甲醛的变性胶上进行 (1g 琼脂糖， 10ml 10×MOPS， 87ml DEPC 处理水， 加热融化稍冷后加入 2.7ml 37％ (v/v) 甲醛 )。电泳条件为 100mA， 50-70V， 5-7h 电泳完成后同样用毛细法转膜， 转膜液用 5×SSC。转膜过夜后， 取出膜， 不能使膜干透， 用 Bio-Ra GS Gene Linker C3protocol 紫外交联， 加入 10ml 预杂交液， 65℃， 2h 后更换为 10ml 杂交液， 加入探针 65℃杂交过夜， 用 2×SSC， 0.1％ (v/v)SDS， 65℃洗膜两次， 每次 30min。 杂 交好的膜不要晾干， 用保鲜膜包好后 -70℃压片。重杂交洗膜用 0.5％ (v/v)SDS， 90-100℃ 加热 5-10min， 或按照 Clontech 推荐用 0.5％ (v/v)SDS， 90-100℃加热 10min 后让其自然冷 却 10min 后取出备用， 若不立即位用， 用保鲜膜包好后置于 -20℃保存。
引物核苷酸序列
本发明的方法所用的引物的核苷酸序列如表 1。
表1
小鼠系统感染实验
以体重在 18-21g ICR 雄性小鼠为实验对象， 通过尾静脉注射 100μl 白念珠菌各 种菌株， 并培养观测 25 天。各个菌株注射浓度为 5×106 或 5×107 细胞 / 毫升。
II. 实施例
实施例 1、 白念珠菌中 CaASC1 基因的敲除
为了研究 CaAsc1 在白念珠菌形态发生和毒性表现中的功能， 本发明人构建了 caasc1/caasc1 缺失株。利用 PCR 同源重组策略， 在野生型菌株 BWP17(ura-his-arg-)( 参 见 Wilson， R.B.， D.Davis， and A.P.Mitchell， Rapid hypothesis testing with Candida albicans through gene disruption with short homology regions.J Bacteriol， 1999.181(6) ： p.1868-74.) 中敲除了 CaASC1 基因， 敲除策略如图 1A 所示。
敲除所用的 PCR 引物如下 ：
CaASC1-5DR ：
5’ -GTTAATTTCATTTCCCTTCAATTTCTTTTCTTTTCTTCTTTTTTAAAAAACAAACAATCAATTATC TACGTTTTCCCAGTCACGACGTT ；
CaASC1-3DR ：
5’ -TTTCCCACAAAAAAACAAAATCTATACAAAAAAAAACTTCTTGTTGTATGTTAAATTTAGAATTAA ATTTGTGGAATTGTGAGCGGATA ；
引物 CaASC1-5DR 和 CaASC1-3DR 中有 69 个碱基与目标基因 CaASC1 同源， 而另外 20 个碱基与用于与 PCR 扩增模板质粒中的 DNA 序列配对。 以质粒 pGEM-HIS1( 参见 Wilson， R.B.， D.Davis， and A.P.Mitchell， Rapid hypothesis testing with Candida albicans through gene disruption with short homology regions.J Bacteriol， 1999.181(6) ： p.1868-74.) 为模板， 以 CaASC1-5DR 和 CaASC1-3DR 为引物， 通过 PCR 扩增得到片段用于转 化白念珠菌受体菌 BWP17。转化后在 His 营养缺陷的 SD 平板上筛选得到上百个克隆， 挑取 数 10 个克隆， 用 PCR 进行鉴定。
将正确插入 HIS1 片段的菌株作为受体菌进行第二拷贝 CaASC1 的敲除。以质 粒 pRS-ARG4ΔSpeI( 参见 Wilson， R.B.， D.Davis， and A.P.Mitchell， Rapid hypothesis testing with Candida albicans through gene disruption with short homology regions.J Bacteriol， 1999.181(6) ： p.1868-74.) 为 模 板， 以 CaASC1-5DR 和 CaASC1-3DR 为引物， 通过 PCR 扩增得到的片段用于转化所述正确插入 HIS1 片段的菌株。经过营养筛选 和 PCR 鉴定得到 HIS1+、 ARG4+ 的双拷贝缺失株。最后用 PCR 和 Southern 杂交对以上菌株 进行再次鉴定。 图 1B 显示了 CaASC1 基因敲除过程中各个菌株 PCR 鉴定的图谱， 图 1C 显示了敲除 过程中各个菌株 Southern 杂交分析的图谱。
实施例 2、 CaASC1 基因的敲除对白念珠菌的影响
通过同源重组的方法在白念珠菌中敲除 CaASC1 基因， PCR 和 Southern 杂交分析 证明敲除是成功的。
为了检测 CaASC1 基因的缺失是否会影响白念珠菌的菌丝发育， 本发明人在菌 丝诱导条件下， 检测以下各个菌株的形态。血清是一种很强的菌丝诱导因子。丰富液体 培养基 YPD 中加入 10 ％ (v/v) 血清在 37 ℃培养是标准的菌丝诱导条件。在此条件下 培 养 3.5 个 小 时， 野 生 型 菌 株 SC5314(WT)( 参 见 Fonzi， W.A.and M.Y.Irwin， Isogenic strain construction and gene mapping in Candida albicans.Genetics， 1993.134(3) ： p.717-28.) 以及 CaASC1 的回复菌株 (caasc1/caasc1+CaASC1) 均能形成真菌丝， CaASC1/ caasc1 单拷贝缺失株则形成较短的真菌丝。caasc1/caasc1 双拷贝缺失株只有部分细胞能 够形成粗短弯曲的菌丝 ( 约 40％ )， 而约 60％细胞仍旧维持在酵母态 ( 图 2A)。
另一种诱导菌丝的培养基是 Lee’ s 培养基。在 pH6.8 的 Lee’ s 液体培养基 ( 参见 Lee， K.L.， H.R.Buckley， and C.C.Campbell， An amino acid liquid synthetic medium for the development of mycelial and yeast forms of Candida Albicans.Sabouraudia， 1975.13(2) ： p.148-53.) 中 37 ℃培养 6 个小时， 缺失株的情况与在 YPD+10 ％ (v/v) 血清 下类似 ( 图 2A)。碳源缺乏的液体培养基 SCLD( 参见 Li， Y.， et al.， Roles of Candida albicans Sfl1 in hyphal development.Eukaryot Cell， 2007.6(11) ： p.2112-21.) 和氮 源缺乏的液体培养基 SLAD( 参见 Gimeno， C.J.， et al.， Unipolar cell divisions in the yeast S.cerevisiae lead to filamentous growth ： regulation by starvation and RAS. Cell， 1992.68(6) ： p.1077-90) 是诱导菌丝生长能力相对比较弱的培养基， 37 ℃条件下培
养 6 个小时， 野生型菌株 SC5314 及回复菌株均能形成较长的真菌丝， 而 CaASC/caasc1 单拷 贝缺失株则形成较短的真菌丝。caasc1/caasc1 双拷贝缺失株没有菌丝生成 ( 图 2A)。本 发明人也观察了这些缺失株在固体培养基中菌丝形成的情况。 在含血清的琼脂固体平板上 诱导 3 天后， 野生型菌株 SC5314 形成丝状菌落， CaASC1/caasc1 单拷贝缺失株形成较短的 丝状菌落， 而 caasc1/caasc1 只能形成边缘不甚光滑的菌落 ( 图 2B)。
以上结果表明， CaAsc1 在白念珠菌菌丝形成中起激活作用， 正向调控酵母态细胞 向菌丝的转变， 而且 CaAsc1 在白念珠菌的菌丝形成中呈剂量依赖型， 拷贝数的降低就能影 响其激活功能。
实施例 3、 CaASC1 基因的敲除对白念珠菌毒性的影响
酵母 - 菌丝形态之间的转换能力与白念珠菌的致病能力密切相关， 不能形成菌丝 的菌株会丧失毒性， 而组成型形成菌丝的菌株也是或丧失或大幅下降其毒性。
本发明人构建的 caasc1/caasc1 缺失株菌丝发育有缺陷， 于是本发明人通过小鼠 系统感染试验来检测缺失株的感染能力或者毒性。以野生型菌株 CAI4+pBA1(WT)( 参见 Cao， F.， et al.， The Flo8 Transcription Factor Is Essential for Hyphal Development and Virulence in Candida albicans.Mol Biol Cell， 2006.17(1) ： p.295-307.) 为阳性 对照， 本发明人检测了 caasc1/caasc1 缺失株的毒性。将 18-21 克的 ICR 雄性小鼠作为实 验对象， 通过小鼠的存活率曲线来分析这些缺失株的毒性变化。各菌株在 YPD 培养基中培 养过夜， 转接到新鲜的 YPD 培养基中再培养 4 小时， 取适量菌液离心后重悬于生理盐水中， 在显微镜下计数后稀释成所需浓度。每只小鼠通过尾静脉注射 0.1ml 白念珠菌悬液， 每个 5 6 菌种注射两个不同浓度， 分别为 5×10 细胞 / 只 ( 低浓度 ) 和 5×10 细胞 / 只 ( 高浓度 )， 每种浓度注射 8 只小鼠。观察小鼠在注射后 25 天中的死亡情况。
与野生型菌株相比， caasc1/caasc1 缺失株的毒性明显下降。 野生型菌株的毒性非 常强， 高浓度下在约 8 天左右实验小鼠就全部死掉， 低浓度下小鼠也在 12 天左右全部死掉。 CaASC1/caasc1 单拷贝缺失株在第 11 天上， 注射高浓度菌液的实验小鼠全部死亡， 第 18 天 上注射低浓度菌液的实验小鼠全部死亡。而 caasc1/caasc1 缺失株在第 25 天上， 注射高浓 度菌液的实验小鼠存活率约为 50％ ( 图 3A)， 注射低浓度菌液的实验小鼠存活率约 100％， 都明显低于野生型菌株的毒性 ( 图 3B)。
因此， 根据 CaASC1 调控白念珠菌的毒性表现， 其是一个重要的毒性因子。
实施例 4、 筛选方法
如前述方法获得白念珠菌的回复菌株 caasc1/caasc1+CaASC1， 作为表达 CaAsc1 蛋白的系统， 并将所述系统分为 ：
对照组 ： 不给予候选物质 ； 和
测试组 ： 给予候选物质。
检测对照组和测试组细胞中情况， 若相对于对照组， 测试组中 CaAsc1 蛋白的表达 在统计学上减弱 30％以上， 则说明候选物质是抑制白念珠菌的毒性的潜在物质。
实施例 5、 抗 CaAsc1 蛋白抗体的制备
本实施例制备抗 CaAsc1 蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体。
1. 多克隆抗体的制备
从 pBA1-ASC1 表达质粒 DNA 中扩增不含内含子的 CaASC1 全长片段， 插入 pET28(a)( 购自 MERCK) 载体的多克隆位点内。导入大肠杆菌表达菌株 BL21， 1.0mM IPTG 诱导 3h 之后， 镍柱纯化 His-CaAsc1 蛋白， 然后常规方法免疫兔子， 获得 CaAsc1 蛋白的抗体， 作为 CaAsc1 蛋白的一种抑制剂。
验证发现， 该抗体结合 CaAsc1 的特异性良好， 抑制 CaAsc1 活性显著。
2. 单克隆抗体的制备
前述 “1” 制备和纯化的 His-CaAsc1 蛋白免疫小鼠。Balb/c 小鼠免疫剂量 ： 0.1mg 每只每次。肌肉多点注射。免疫程序 ： 0， 3， 6 周三次免疫。融合前三天取 0.1mg 蛋白腹腔 注射， 做回忆刺激。
回忆刺激后 3 天做融合。取免疫后小鼠的脾脏细胞和鼠骨髓瘤细胞 SP2/0 采用聚 乙二醇 (PEG) 常规融合法做融合。
融合后加 HAT 选择性培养基， 筛选采用 ELISA 法， 所用筛选用抗原为前述纯化的 His-CaAsc1 蛋白。
经过三次有限稀释法克隆化筛选得到若干株分泌抗 CaAsc1 的单克隆抗体的杂交 瘤细胞株， 其中有一株分泌的抗体结合 CaAsc1 的特异性非常好。
实施例 6、 利用减毒菌株制备疫苗
本实施例中， 本发明人检测 caasc1/caasc1 缺失株作为减毒菌株能否可以使小鼠 产生免疫力。
本 发 明 人 采 用 注 射 过 caasc1/caasc1 缺 失 株 ( 将 1×105 个 白 念 珠 菌 caasc1/ caasc1 缺失株溶解于 0.1ml 的生理盐水溶液中， 用于注射 )15 天后的存活小鼠， 向其体内注 6 射 5×10 野生型的白念珠菌， 再过 25 天后， 发现 10 只小鼠有 8 只依然存活。事先未注射过 caasc1/caasc1 缺失株而仅注射过生理盐水的小鼠， 15 天后注射 5×106 野生型的白念珠菌 后， 7 天之后 10 只小鼠全部死亡。
上述结果说明， caasc1/caasc1 缺失株能使小鼠对野生型的白念珠菌产生免疫力， 因此本发明的减毒菌株可以作为一种有效的免疫疫苗。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考， 就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。 此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。13102337218 A CN 102337229
序列表1/6 页
14102337218 A CN 102337229序列表2/6 页
15102337218 A CN 102337229序列表3/6 页
16102337218 A CN 102337229序列表4/6 页
17102337218 A CN 102337229序列表5/6 页
18102337218 A CN 102337229序列表6/6 页