两株裂解性哈维弧菌噬菌体制剂的制备及其应用 【技术领域】
本发明涉及两株噬菌体及其应用， 减少水产养殖系统及产品加工过程中细菌方 法。具体而言， 本发明提供用于控制刺参、 刺参养殖系统 ( 如养殖池、 饲料等 ) 及刺参食品 加工中的病原菌， 尤其可以显著的杀灭哈维弧菌 (Vibrio harveyi)， 属于生物工程领域。背景技术
但随着消毒剂和抗生素长期不当使用， 许多弊端突显出来 ： (1) 使病原菌产生耐 药性， 以致抗生素作用效果下降， 甚至无效 ； (2) 造成水体严重污染， 并引发水环境微生态 失衡 ； (3) 在刺参体内产生药物残留， 影响产品的质量安全， 并危害人体健康。由此可见， 传 统的抗生素药物不但疗效甚微， 而且会产生药物残留， 污染水体环境， 并引起严重的食品安 全问题。因此， 积极寻求一种安全有效的新型抗菌制剂用于刺参病害防治乃当务之急。
噬 菌 体 (Bacteriophage) 作 为 一 类 细 菌 性 病 毒， 是能侵染且最终杀死细菌 的 病 毒， 可 分 为 裂 解 性 噬 菌 体 (Lytic Bacteriophage) 和 溶 原 性 噬 菌 体 (Lysogenic Bacteriophage)。裂解性噬菌体又叫毒性噬菌体， 感染细菌后可在菌体内快速增殖最终致 使细菌裂解。
自 20 世纪初噬菌体治疗就已应用于临床， 治疗的疾病包括化脓性伤口感染、 胃 肠炎、 骨髓炎、 皮炎及肺炎等， 能够裂解的病原菌涉及到金黄色葡萄球菌 (Staphylococus aureus)、 链 球 菌 (Streptococcus)、 克 雷 伯 氏 菌 (Klebsiella)、 弧 菌 (Vibrio)、 变形杆 菌 (Proteusbacillus vulgaris)、 铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)、 沙门氏菌 (Salmonella) 等。 噬菌体治疗的给药方式有皮下注射、 口服、 局部及全身用药。 噬菌体抗菌 技术和产品应用的巨大突破， 开启了应用绿色、 安全、 无公害生物防治手段有效保障食品安 全的先河。 发明内容
本发明针对目前人们在刺参养殖中大量使用抗生素加速耐药性菌株的产生， 同时 促进了耐药性菌株的进化， 提供一种新的能够特异性杀灭刺参体内的主要病原菌哈维弧菌 (Vibrio harveyi)， 从而起到对养殖环境及产品加工过程的保护， 确保食品的安全健康。
本发明的技术方案如下 ：
从废水中分离得到对哈维弧菌 (Vibrio harveyi) 有裂解作用的两株噬菌体 vp-1 和 vp-2， 制剂制备方法如下 ：
(1) 宿主菌的准备 ： 从刺参分离出致病性哈维弧菌。
(2) 水样及其处理 ： 将废水加入 CaCl2、 MgCl2 对水样做预处理。
(3) 噬菌体分离 ： 将上述经过预处理的水样， 用离心， 收集上清 ； 将上清过滤除去 菌体、 杂质等其他成分， 得噬菌体原液。
(4) 采用双层平板法进行噬菌体的鉴定 ： 在平板上形成空斑， 则说明在滤液内有 针对该宿主菌有裂解性的噬菌体存在。(5) 噬菌斑的纯化 ： 当噬菌斑的形态、 大小、 完全一致时， 即得到纯化了的噬菌体， 将该噬菌体保存， 即为哈维弧菌噬菌体 vp-1 和 vp-2。
(6) 噬菌体的液体增殖 ： 离心过膜获得高效价的噬菌体上清液。
(7) 通过聚乙二醇 8000 沉淀噬菌体颗粒， 溶解于 SM 缓冲液中， 即获得噬菌体 vp-1 和 vp-2 的混合制剂。
在本发明中两株哈维弧菌噬菌体 vp-1 和 vp-2， 是能特异性裂解从患病刺参体表 分离得到的哈维弧菌 (Vibrio harveyi)， vp-1 和 vp-2 具有呈正多面体头部结构和不可收 缩的尾部， 头部直径约为 50nm， vp-1 尾部长约 150nm， vp-2 尾部长约为 200nm。两株噬菌体 均属于长尾噬菌体。为一种用于减少动物体内、 水产养殖环境中以及动物加工食品靶病原 菌数量的方法。
两株噬菌体在 37℃中放置 20min， 其活性稳定 ； 对氯仿不敏感， 在 90℃以上失活， 两株噬菌体在 pH 8.0 左右稳定， 噬菌体通常纯化后保存在含 10％的二甲基亚砜的 SM 溶液 中。
上述两株噬菌体的应用， 将噬菌体纯化和扩增培养后， 用于抑制哈维弧菌的生长， 减少了抗药性菌株的残留， 最终降解产物为细菌碎片， 无任何毒副作用。 烈性噬菌体净化作 用的范围以及技术净化范围包括 ： 水体中病原菌灭活， 水产动物表面病原菌灭活， 运输车辆 表面病原菌灭活， 人体表面病原菌灭活， 食品加工过程中病原菌灭活。 用于抑制哈维弧菌是 指： 将纯化的两株噬菌体用缓冲液稀释后制成喷洒液或淋洗液， 用于对水产养殖环境或刺 参加工食品的喷洒或浸泡， 来防治哈维弧菌的感染。 本发明与传统的抗生素相比， 噬菌体治疗的突出特点是 ：
(1) 专一性裂解目标病原微生物， 不破坏水环境中的正常菌群。 传统的抗生素治疗 在杀灭致病菌的同时， 也破坏了水体中正常的浮游微生物， 引起微生态失衡， 并导致机会性 感染 ；
(2) 噬菌体是宿主依赖性的， 只在细菌感染部位发生作用， 随着宿主菌的清除而消 亡， 不会残留在动物体内 ；
(3) 噬菌体能够自我复制增殖， 且其感染发生在水溶液状态中 ；
(4) 安全无毒副作用， 噬菌体由蛋白质和核酸组成， 降解后的终产物是氨基酸和核 酸片段， 对人和动物安全。
附图说明
图 1 是纯化后噬菌斑图。
图 2 是投射电镜观察的 vp-1 和 vp-2 噬菌体的形态结构图。
图 3 是在平皿上形成的抑菌圈噬图。
图 3 中为滴加 10μl 噬菌体滤液， 菌体效价为 1×109pfu/ml。
图 4 是两株噬菌体混合制剂 vp-1 和 vp-2， 在 MOI 为 10 时噬菌体的抑菌效果图。
阴性对照 噬菌体组 (MOI ＝ 1) 卡那霉素组 空白对照具体实施方式
实施例 1、 噬菌体的分离制备
(1) 宿主菌的准备
将上述经过鉴定并接种于 2216E 固体培养基中的保存于 4℃冰箱中备用的哈维弧 菌取出， 37℃过夜培养， 挑取单个菌落， 接种于 2216E 液体培养基中， 37℃振荡培养 6h 后， 用 来分离噬菌体之用。
(2) 水样及其处理
取废水 50ml， 对水样做预处理 ： 加入 CaCl2、 MgCl2， 使其终浓度为 1mmol/L， 作用大 约 10min， 目的是使噬菌体更易吸附于致病菌表面。
(3) 噬菌体分离
将上述经过预处理的水样， 用离心机离心， 10000rpm， 离心 5min， 收集上清 ； 将上 清过 0.22μm 的一次性滤膜过滤， 除去菌体、 杂质等其他成分， 即得噬菌体原液 ； 取 10ml 滤 6 7 液加入处于对数生长期 ( 接种后 5h 左右， 噬菌体终浓度达到 10 -10 PFU/ml 时即为是对数 生长期 ) 的 50ml 菌液中， 37℃过夜培养 12-18h， 目的是使噬菌体数量扩增， 观察现象并记 录； 收集菌液， 10000rpm， 离心 5min， 再次收集上清， 再过膜 (0.22μm)， 即得增值后的噬菌 体悬浮液。
(4) 噬菌体的鉴定方法 ：
采用双层平板法进行噬菌体的鉴定 ：
下层倒入含 1.5％琼脂的 2216E 固体培养基， 置于 4℃备用， 使用前置于 37℃， 约 30min ； 上层培养基含琼脂 0.7％， 将上层培养基加热溶解， 放置于 50℃的水浴锅中待用， 取 -6 8 支 10ml 离心管， 分别加 1ml 宿主菌菌液， 吸取噬菌体悬浮液进行梯度稀释至 10 将 7 不 同浓度梯度的噬菌体稀释液分别取出 10μl， 加到 10ml 离心管中， 设置一个对照组， 仅加入 1ml 宿主菌菌液和 10μl 2216E 培养基， 在 37℃下， 相互作用 10min， 加入 7ml 含 0.7％琼脂 的 2216E 培养基充分混匀后， 立刻加到上层， 待凝固后， 倒置培养 24h 后观察有无噬菌斑形 成。如果在平板上形成空斑则说明在滤液内有针对该宿主菌有裂解性的噬菌体存在， 从稀 -6 释液浓度为 1×10 PFU/ml 的噬菌体悬液中分离出的噬菌斑中发现两种噬菌体 vp-1、 vp-2。 ( 见图 1)。
(5) 噬菌斑的纯化
噬菌体的纯化因为初次分离噬菌斑的大小、 形状不一致， 所以应该对分离的噬菌 体进行进一步的纯化， 以使噬菌体在平板上形成大小及形状一致的噬菌斑。
用灭过菌的 20μl 枪头挑取形态大小有明显差异的噬菌斑各一个， 将其分别加入 到 1ml 无菌 PBS 的离心管中， 涡旋震荡 1min， 放于 4℃， 4h， 使噬菌体充分释放入 PBS( 磷酸 缓冲溶液 ) 中 ； 之后 10000rpm， 离心 5min， 收集上清， 过膜 (0.22μm)， 将过膜后的噬菌体液 进行浓度梯度稀释 ( 方法同上 )， 双层培养， 重复 3 次上述操作， 直至出现的噬菌斑形态、 大 小、 完全一致为止， 即得到纯化了的噬菌体 ( 见图 2)。
(6) 噬菌体的液体增殖
纯化后的噬菌体的效价一般都不高， 需要进行进一步的增殖， 采用液体增殖法进 行增殖。 具体的方法如下 ： 将噬菌体液按一定比例加入到培养 12h 的宿主菌液中， 再于 37℃摇床中培养 12h， 将混合液 10000rpm 离心 5min， 去处细菌碎片， 上清液用 0.22μm 的滤器过 滤， 即可获得效价较高的噬菌体液。
(7) 增殖后效价的测定
将上述双层培养得到的噬菌斑计数， 从而计算噬菌体效价。
噬菌体效价 (PFU/ml) ＝噬菌斑 × 稀释倍数 × 取样量折算数
(8) 氯仿敏感性测试
为了检验纯化得到的噬菌体是否对氯仿敏感 ( 即检测噬菌体衣壳是否含有脂类 的一种方法 )， 取备用的噬菌体悬浮液 1ml( 约 1×108PFU/ml) 与 100μl 氯仿溶液混合后， 剧 烈摇晃 1min， 然后与 4℃下静置约 30min ； 直至出现分层， 其中上层为水相， 下层为氯仿相， 取出 100μl 上层水相部分 ( 即噬菌体悬浮液 )， 梯度稀释后取 20μl 滴定于长有宿主细胞 细菌的平板上， 翌日进行观察， 看是否有噬菌斑出现， 如果有噬菌斑出现， 说明该噬菌体的 活性并不受氯仿影响， 即说明该噬菌体的衣壳内不含脂类物质。同时计算氯仿处理前后的 噬菌体效价， 看效价有无减少。
结果 ： 测定结果显示处理前后噬菌体效价不发生任何变化， 表明噬菌体对氯仿不 敏感， 噬菌体的衣壳不含脂类物质。 实施例 2、 PEG 8000 沉淀噬菌体颗粒
(1) 取过夜培养的宿主菌液 20mL， 接到 1L 液体 2216E 中， 37℃振荡培养至对数生 长初期， 约为 12h ；
(2) 加入噬菌体液， 使感染复数 ( 感染噬菌体的数量与宿主菌数量的比值 ) 约为 0.01， 37℃继续振荡培养 24h， 转数为 150rpm ；
(3) 将上述混合液于 4℃ 10000rpm 离心 10min， 以除去细菌碎片， 然后量取上清液， 在其中加入 DNase I 和 RNaseA 至终浓度为 1μg/mL， 室温温育 30min ；
(4) 按 500ml 培养物加入 29.2g 固体 NaCl， 搅拌使其溶解， 然后将培养物冰浴 1h， 加 NaCl 后可促使细菌碎片和杂蛋白沉降， 也是噬菌体颗粒有效沉淀所必需的 ；
(5)4℃， 10000rpm 离心 10min 以去除细胞碎片， 收集上清 ；
(6) 测定所收集上清液的总体积， 然后按照 500mL 上清加 50g 的比例加入固体 PEG8000， 于室温用玻璃棒慢慢搅拌溶解， 然后冰浴 12hours 以使噬菌体颗粒发生沉淀 ；
(7)4℃， 10000rpm 离心 10min 回收沉淀的噬菌体颗粒， 弃上清， 将离心管倒置 5 分 钟， 使残余液体流干， 用移液器除去残余液体 ；
(8) 用 2mL 的 SM 保存液重悬噬菌体沉淀， 亲和层析法去除内毒素， 放于 4℃保存。
(9) 纯化后的噬菌体颗粒溶解在添加 10％二甲基亚砜的 SM 缓冲液中
结果 ： 除去培养基成分和细菌碎片， 最终收集噬菌体颗粒沉淀， 对噬菌体的进一步 的纯化应用做准备。
实施例 3、 体外抑菌实验
实验设置为 4 个组， 取 4 个 50ml 离心管， 分别标记为 A、 B、 C、 D； 其中 A 为阴性对 照组， B 为抗生素组， C 为噬菌体组。A 中加入 40ml 2216E 液体培养基、 1ml 菌液 ( 浓度为 8 10 PFU/ml)、 1ml PBS ； B 中加入 40ml 2216E 液体培养基、 1ml 菌液 ( 浓度为 108PFU/ml)、 1ml 硫酸卡那霉素 ( 浓度为 4mg/ml) ； C 中同样加入 40ml 2216E 液体培养基、 1ml 菌液、 1ml 噬菌 8 体悬液， 分别是 500μl vp-1 和 500μl vp-2， 效价为 1×10 pfu/ml ； D 为空白对照， 只加入
40ml 2216E 培养基。振荡 10min 后， 放入酶标仪中测 OD600 的值， 记录 ； 放入 37℃摇床中培 养， 每半小时拿出来测一次 OD600 的值， 并做好记录。 以 OD600 的值为纵坐标， 时间为横坐标做 曲线 ( 见图 4)。
实施例 4、 毒力实验
6 周龄雌性 BALB/c 小鼠， 27g 左右， 共 30 只， 购自大连医科大学实验动物中心。随 机分为两组， 各 15 只， 每只每天口服 vp-1 和 vp-2 混合噬菌体制剂 0.1ml( 效价为 109pfu/ ml)， 对照组口服等量的 SM 缓冲液， 连续口服 14d， 脱颈致死， 观察内脏， 消化道及粘膜变化 情况。
结果显示， 此剂量的噬菌体混合制剂对小鼠的日常行为没有影响， 解剖无任何异 常。
实施例 5、 刺参体内保护实验
实验设 4 组， 每组设 3 个平行。每组 10 头养殖仿刺参。分别标记为 1、 2、 3、 4、 5。 试验组采用浸浴法攻毒， 向编号不同的盆中分别注入不同体积的菌悬液， 使其终浓度分别 7 (1 组、 2 组、 3 组和 5 组分别加入菌液， 是最终浓度为 10 CFU/mL， 4 组为对照组， 对照组中加 入与等体积过滤灭菌海水 )， 攻读 3h 后， 1 组加入两株混合噬菌体 vp-1 和 vp-2 是最终 MOI ＝ 0.1， 2 组加入 vp-1 和 vp-2 的混合噬菌体是最终感染复数 MOI ＝ 1， 3 组加入混合 vp-1 和 vp-2 使最终 MOI ＝ 10， 每天观察各盆中仿刺参的发病及死亡状况。
结果见表 1， 随着噬菌体的浓度增加， 保护率逐渐增加。 表 1 噬菌体 vp-1 和 vp-2 治疗的实验结果
实施例 6、 噬菌体在固体刺参食品中的杀菌效果实验
将即食刺参切成 2×2×2cm 小块， 以哈维弧菌配制成效价为 1×108cfu/ml 的宿主 菌， 再将 vp-1 和 vp-2 两株噬菌体配制成混合制剂效价分别为 1×109pfu/ml， 在无菌操作台 中， 将 20ul 的宿主菌滴加于即食刺参上， 10min 后， 分别滴加 20ul 噬菌体混合制剂于实验组 和对照组， 至于 20℃环境中放置 48h， 其中于 1h、 4h、 24h 和 48h 分别检测残留的宿主菌的数 量。
结果， 与对照组相比， 20℃作用 1h 后宿主菌数量减少 10％左右， 4h 后， 几乎可以完 全杀灭哈维弧菌， 且可以对食品长期保护。