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1、10申请公布号CN102335459A43申请公布日20120201CN102335459ACN102335459A21申请号201010235072622申请日20100721A61L27/38200601A61L27/6020060171申请人中国科学院动物研究所地址100101北京市朝阳区北辰西路1号院5号72发明人段恩奎张守兵胡慧敏张会闪刘爽74专利代理机构北京泛华伟业知识产权代理有限公司11280代理人曹津燕54发明名称一种以毛囊干细胞和成纤维细胞为基础的毛囊重建方法57摘要本发明提供一种以毛囊干细胞和成纤维细胞为基础的毛囊重建方法。本发明提供的方法包括1培养扩增毛囊干细胞；2培养扩。
2、增成纤维细胞；3将步毛囊干细胞与成纤维细胞混合，接种至需要毛囊重建的部位。由于毛囊干细胞能长期大量传代，真皮成纤维细胞取材方便，故本发明有很强的实际应用前景和科研潜力，是大面积皮肤损伤如烧伤和烫伤等治疗中重建皮肤和毛囊的重要方法，也是科学研究中证明毛囊干细胞的首选方法。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页附图2页CN102335468A1/1页21一种毛囊重建方法，其以毛囊干细胞和成纤维细胞为基础进行毛囊重建，包括以下步骤1培养扩增毛囊干细胞；2培养扩增成纤维细胞；3将步骤1培养扩增的毛囊干细胞与步骤2培养扩增的成纤维细胞混合，接种至需要毛囊重。
3、建的部位。2根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述步骤1中的毛囊干细胞来源于成年大鼠毛囊隆突部；优选地，所述毛囊干细胞是利用器官培养的方法，采用WILLIAMSE完全培养基对毛囊进行培养并分离纯化而制备的。3根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，其中所述步骤2中的成纤维细胞来源于新生大鼠真皮成纤维细胞；优选地，所述成纤维细胞是通过37孵育表皮2小时后，加入含10胎牛血清的DMEM培养基进行培养而制备的。4根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，其中所述步骤3中毛囊干细胞与成纤维细胞按照21的细胞数量比混合，并用WILLIAMSE完全培养基重悬细胞，制备成单细胞悬液；优选地。
4、，其中所述的WILLIAMSE完全培养基不含胎牛血清，含200单位/毫升的青霉素钠，200单位/毫升的硫酸链霉素。5根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，其中所述步骤3中毛囊干细胞与成纤维细胞混合后用硅室接种至需要毛囊重建的部位；优选地，所述细胞的接种量为11107个毛囊干细胞和6106个成纤维细胞。6根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括用绿色荧光蛋白标记毛囊干细胞的步骤；优选地，所述绿色荧光蛋白标记毛囊干细胞是通过慢病毒感染法。7权利要求1至6中任一项所述的方法在皮肤损伤治疗中用于重建皮肤和毛囊的用途；优选地，所述皮肤损伤包括烧伤或烫伤。8权利要求1至。
5、6中任一项所述的方法重建的表皮和毛囊。权利要求书CN102335459ACN102335468A1/6页3一种以毛囊干细胞和成纤维细胞为基础的毛囊重建方法技术领域0001本发明属于生物技术领域，具体涉及一种以毛囊干细胞和成纤维细胞为基础的毛囊重建方法。背景技术0002毛囊是哺乳动物皮肤的附属物，具有调节体温、感觉、分泌与排泄等生理功能。此外，通过伪装，它能够帮助哺乳动物逃避天敌；通过对体表装饰，它能传递社会信息并在生殖行为中起作用；人类具有审美能力，毛囊的缺失如脱发等，会给患者带来很大的精神痛苦。已有的知识表明，毛囊不仅对美容，而且在皮肤损伤如烧伤或烫伤等的伤口愈合和皮肤肿瘤发生中起重要作用。。
6、0003毛囊是哺乳动物体内少数在成年后仍维持周期性形态变化的微型器官，近年来受到科学家们广泛的关注和研究，但仍有很多问题需要阐明，如毛囊干细胞的来源、影响毛囊周期的因素等，而毛囊重建是其中的一个重点，也是一个难点。在哺乳动物的绝大多数毛囊中，存在着生长期、退行期和静止期三个阶段的周期性循环，毛囊重建模型对于阐明毛囊生物学的很多生理特征具有重要价值。由于毛囊是由多种细胞组成的微型器官，也使它成为研究药物的药理作用的理想模型。因此，综合来看，建立一个稳定的毛囊重建模型，具有重要的实际应用价值和科研价值。0004实际生活中，大面积皮肤损伤和脱发等疾病，对科研工作者们提出了皮肤和毛囊重建这一亟待解决的。
7、难题。较早用于皮肤重建的是表皮干细胞，GREEN1991从病人未被烧伤的皮肤培养出角质细胞，然后移植到烧伤部位，形成了能够自我更新的皮肤。然而，移植后生成的皮肤不能形成毛囊，所以不是真正意义上具有完整功能的皮肤。0005自从1990年COTSARELIS等证明毛囊干细胞位于隆突部以后，毛囊干细胞的研究获得了长足的进步。研究表明，毛囊干细胞在体内能够分化为表皮、皮脂腺和毛囊，所以毛囊干细胞是治疗大面积皮肤损伤的重要种子细胞。我国对于毛囊干细胞的研究还处于起步阶段，毛囊干细胞方面的研究人员很少，虽然有人做过毛囊重建的尝试，如将毛囊隆突部细胞和真皮乳头细胞注射到裸鼠皮下，或将角质细胞和真皮乳头细胞用。
8、支架材料培养后移植到裸鼠皮肤等，都有可能获得类似毛囊的结构，但都存在这样那样的缺点，例如，将毛囊隆突部细胞和真皮乳头细胞注射到皮下，虽然能够形成毛囊类似物，但毛干不能长出皮肤表面，也不能形成表皮；而真皮乳头细胞在体外生长非常缓慢，不易获得足量细胞用于移植；另外，真皮乳头细胞在体外长时间培养易失去诱导毛囊形成的能力。这些都限制了表皮干细胞在皮肤和毛囊重建中的应用。可见，还没有建立可靠的毛囊重建方法，这一技术上的空白大大制约了毛囊干细胞研究的发展和应用。发明内容0006因此，本发明的目的是提供一种毛囊重建的方法。0007本发明的目的是采用以下技术方案来实现的。本发明提供了一种毛囊重建的方说明书CN。
9、102335459ACN102335468A2/6页4法，其以毛囊干细胞和成纤维细胞为基础进行毛囊重建，具体包括以下步骤1培养扩增毛囊干细胞；2培养扩增成纤维细胞；3将步骤1培养扩增的毛囊干细胞与步骤2培养扩增的成纤维细胞混合，接种至需要毛囊重建的部位。0008优选地，其中所述步骤1中的毛囊干细胞来源于哺乳动物毛囊隆突部或背部毛囊，优选为大鼠触须。0009优选地，所述毛囊干细胞是利用器官培养的方法，采用WILLIAMSE完全培养基对毛囊进行培养并分离纯化而制备的。所述WILLIAMSE完全培养基为在WILLIAMSE基本培养基中添加以下成分10纳克/毫升的表皮生长因子，5微克/毫升的胰岛素，1。
10、微克/毫升的氢化可的松，58毫摩尔/升的L谷氨酰胺，0115微克/毫升的维生素A，1微克/毫升的维生素D2，1微克/毫升的转铁蛋白，100纳克/毫升的亚油酸，20微克/毫升的牛血清白蛋白，200单位/毫升的青霉素钠，200单位/毫升的硫酸链霉素，体积百分含量为15的胎牛血清。0010优选地，其中所述步骤2中的成纤维细胞来源于新生大鼠真皮成纤维细胞，其他来源的成纤维细胞只要状态好，都可以使用。0011优选地，所述成纤维细胞是通过37孵育皮肤组织块2小时使之贴附到胎牛血清孵育过的培养皿后，加入含10胎牛血清的DMEM培养基进行培养而制备的。0012优选地，其中所述步骤3中毛囊干细胞与成纤维细胞按照。
11、21的细胞数量比混合，并用WILLIAMSE完全培养基重悬细胞，制备成单细胞悬液；更优选地，其中所述的WILLIAMSE完全培养基不含胎牛血清。0013优选地，其中所述步骤3中毛囊干细胞与成纤维细胞混合后用硅室接种至需要毛囊重建的部位；优选地，所述细胞的接种量为11107个毛囊干细胞和6106个成纤维细胞。0014优选地，所述方法还包括用绿色荧光蛋白标记毛囊干细胞的步骤；优选地，所述绿色荧光蛋白标记毛囊干细胞是通过慢病毒感染法。0015此外，本发明提供了上述方法在皮肤损伤治疗中用于重建皮肤和毛囊的用途；优选地，所述皮肤损伤包括烧伤或烫伤。0016本发明还提供了上述方法重建的表皮和毛囊。0017。
12、由此可见，本发明涉及一种新的毛囊重建技术。本发明克服了表皮干细胞移植不易形成毛囊的缺点，以毛囊干细胞在体内具有分化为皮肤和毛囊的能力为依据，用经过培养鉴定的毛囊隆突部干细胞为种子细胞，添加适量的真皮成纤维细胞由于毛囊干细胞属于表皮的细胞，能重新形成表皮、毛囊和皮脂腺，但不能形成真皮，所以需要添加成纤维细胞以形成真皮一起移植，两者混合后，用无血清的WILLIAMSE完全培养基重悬细胞，用硅室移植到裸小鼠背部。裸鼠无免疫能力，接种的细胞能继续增殖和分化，7周后形成皮肤和毛囊。由于毛囊干细胞能长期大量传代，真皮成纤维细胞取材和培养方便，细胞移植方法简单并且易于操作，故本发明有很强的实际应用前景和科研。
13、潜力，是大面积皮肤损伤如烧伤和烫伤等治疗中重建皮肤和毛囊的重要方法，也是科学研究中证明是否为毛囊干细胞的首选方法。0018在本发明的一个优选实施方案中，涉及的主要技术路线包括00191培养扩增毛囊隆突部干细胞；说明书CN102335459ACN102335468A3/6页500202培养扩增真皮成纤维细胞；00213用慢病毒感染法将毛囊干细胞标记为表达绿色荧光蛋白的细胞；00224将裸鼠背部皮肤剪掉合适大小；00235将毛囊干细胞和真皮成纤维细胞混合，用硅室接种到裸鼠背部；00246适时冰冻切片，激光共聚焦显微镜下观察和照相。0025本发明所具有的主要特点及所能达到的有益效果为将裸鼠原来皮肤剪。
14、掉，用单细胞悬液重建皮肤和毛囊，是真正意义上的皮肤和毛囊重建；毛囊干细胞用绿色荧光蛋白标记，便于追踪干细胞的去向；真皮成纤维细胞取材方便；用硅室接种细胞，避免细菌污染，重建效率高。0026综上所述，本发明以毛囊隆突部干细胞为种子细胞，添加适量的真皮成纤维细胞，两者混合后，用硅室SILICONCHAMBER移植到裸鼠背部，形成了皮肤和毛囊。由于毛囊干细胞能长期大量传代，真皮成纤维细胞取材方便，细胞移植方法简单并且易于操作，故本发明有很强的实际应用前景和科研潜力。附图说明0027以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中0028图1绿色荧光蛋白标记的成年大鼠触须毛囊干细胞的照片；其中A是绿色荧。
15、光蛋白标记成年大鼠触须毛囊干细胞的一个克隆在明视场下的照片；B是该克隆表达的绿色荧光蛋白在激发光下显示出绿色。0029图2是将毛囊干细胞和真皮成纤维细胞混合，用硅室接种到裸鼠背部。0030图3是手术7周后形成的毛囊之一在高倍镜下的照片；其中A为明视场下的照片，毛囊形态清晰可见，已经形成明显的毛干；B为激光共聚焦显微镜照片，显示该毛囊中的细胞高表达绿色荧光蛋白，证明该毛囊是由接种的成年大鼠触须毛囊干细胞分化形成。0031图4是手术10周后伤口愈合处皮肤冰冻切片在低倍镜下的照片，表示新形成的表皮和毛囊；A为激光共聚焦显微镜照片，显示用绿色荧光蛋白标记的成年大鼠触须毛囊干细胞分化为表皮和毛囊，而伤口。
16、愈合处的裸鼠皮肤不表达绿色荧光蛋白，为阴性对照；B是该组织切片的明视场照片，可以看到毛干已经伸长到表皮外侧；C是前两者的叠加照片。0032图5是手术10周后伤口愈合处皮肤冰冻切片在低倍镜下的照片，表示新形成的皮肤中皮脂腺的位置；A为激光共聚焦显微镜照片，显示用绿色荧光蛋白标记的成年大鼠触须毛囊干细胞分化为皮脂腺，而伤口愈合处的裸鼠皮肤不表达绿色荧光蛋白，为阴性对照；B是明视场照片，可以看到新形成的皮肤长出很多毛囊，毛干已经伸长到表皮外侧；C是前两者的叠加照片。具体实施方式0033以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
17、。0034以下实施例中使用的磷酸盐缓冲液除非特别指出，均为PH值为73的磷酸盐缓冲液，其配方如下1L02GKCL，024GKH2PO4，8GNACL，144G无水NA2HPO4。0035实施例1成年大鼠毛囊干细胞的制备说明书CN102335459ACN102335468A4/6页60036本实施例以成年大鼠触须毛囊干细胞为例，详细说明制备作为本发明毛囊重建的种子细胞的方法，具体如下。实验动物的饲养和使用按照中国科学院动物研究所动物与医学伦理委员会的规定执行。0037一大鼠触须毛囊的显微剥离0038取一小块成年WISTAR大鼠中国科学院动物研究所触须部皮肤，用75酒精消毒35分钟；在体视镜下，用。
18、镊子夹住触须毛囊靠近表皮的峡部，向真皮方向用力撕出毛囊；用29G针头固定住毛囊，用解剖刀小心划破真皮鞘，并将毛囊剥离出来，切断真皮乳头和真皮鞘间的连接。图2示出了毛囊照片，其中A为剥离前带真皮鞘，B为剥离后。0039二用WILLIAMSE完全培养基培养毛囊00401配制WILLIAMSE完全培养基。向WILLIAMSE基本培养基购自GIBCO公司中添加以下因子，各种因子的最终浓度为10纳克/毫升的表皮生长因子，5微克/毫升的胰岛素，1微克/毫升的氢化可的松，58毫摩尔/升的L谷氨酰胺，0115微克/毫升的维生素A，1微克/毫升的维生素D2，1微克/毫升的转铁蛋白，100纳克/毫升的亚油酸，20。
19、微克/毫升的牛血清白蛋白，200单位/毫升的青霉素钠，200单位/毫升的硫酸链霉素。向添加因子后的WILLIAMSE培养基中加体积百分含量为15的胎牛血清，即为WILLIAMSE完全培养基。00412将毛囊转入6孔培养板，加WILLIAMSE完全培养基，37、5CO2、100湿度的培养箱中培养。毛囊一般在第37天贴壁，然后毛囊干细胞会从隆突部爬出，细胞边缘明亮，紧密排列，为典型角质细胞特征。0042三毛囊干细胞的纯化0043毛囊干细胞具有贴壁紧的特点，利用这一特点，在室温25左右，用消化液含有质量百分含量为01的胰蛋白酶和0008的EDTA的磷酸盐缓冲液消化时，成纤维细胞会被消化下来，而干细胞。
20、克隆仍贴在培养板上。用磷酸盐缓冲液小心将消化下来的成纤维细胞收集起来，离心后可以传代或冻存，以备用于与毛囊干细胞的共培养，为干细胞提供与体内相似的模拟环境，有利于干细胞的生长。再向培养板中加消化液，转到37培养箱继续消化35分钟，用磷酸盐缓冲液收集消化下来的毛囊干细胞，离心后可以传代或冻存。0044四毛囊干细胞的传代和增殖0045将单根毛囊生长出的毛囊干细胞和成纤维细胞按照11的比例接种到10CM培养皿中，加WILLIAMSE完全培养基，37、5CO2、100湿度的培养箱中培养，23天更换培养液，大约2周后细胞长满，可继续传代或在液氮中冻存备用。0046实施例2以成年大鼠毛囊干细胞和新生大鼠成。
21、纤维细胞为基础的毛囊重建0047一成纤维细胞的制备0048用胎牛血清将细胞培养皿在37培养箱中预先孵育2小时；将新生大鼠中国科学院动物研究所实验动物中心处死，用75酒精消毒35分钟，然后用生理盐水冲洗3遍以上；在超净工作台中，用消毒过的剪刀将背部皮肤剪下；用解剖刀刮除皮下脂肪；将皮肤剪成05CM05CM的小块；吸干培养皿中的血清，将皮肤小块均匀地铺在皿内，表皮朝上，在37培养箱中孵育2小时后，加入含10胎牛血清的DMEM培养基进行培养；每2天更换一次培养液，培养到需要的细胞量备用。0049二毛囊干细胞的标记说明书CN102335459ACN102335468A5/6页700501毛囊干细胞的准。
22、备复苏实施例1中制备并冻存的成年大鼠触须毛囊干细胞，按照建立的毛囊干细胞培养体系，接种少量成纤维细胞做滋养层细胞，用WILLIAMSE完全培养基在37、5CO2、100湿度的培养箱中培养。00512毛囊干细胞用绿色荧光蛋白标记恢复性生长24小时后，细胞生长状态良好；加入带有绿色荧光蛋白基因的慢病毒储存液购自INVITROGEN公司，感染24小时后，换为新鲜WILLIAMSE完全培养基，48小时可以观察到绿色细胞，如图1所示，其中A是绿色荧光蛋白标记成年大鼠触须毛囊干细胞的一个克隆在明视场下的照片；B是该克隆表达的绿色荧光蛋白在激发光下显示出绿色。00523绿色荧光蛋白标记的毛囊干细胞的纯化和扩。
23、增首先利用毛囊干细胞贴壁紧的特点，用消化液质量百分含量为01的胰蛋白酶0008的EDTA的磷酸盐缓冲液在室温下消化，显微镜下观察，待成纤维细胞脱落后，用磷酸盐缓冲液PH为73左右将成纤维细胞洗掉，剩余仍然贴壁的都是毛囊干细胞；然后加消化液在37继续消化，收集毛囊干细胞；用适量磷酸盐缓冲液重悬，用流式细胞仪进行分选，只保留绿色荧光较强的细胞；将分选出的高表达绿色荧光蛋白的毛囊干细胞接种到10CM细胞培养皿中扩增，加少量成纤维细胞做共培养，培养条件为WILLIAMSE完全培养基在37、5CO2、100湿度的培养箱中培养，23天更换一次培养液，将绿色荧光蛋白标记的毛囊干细胞增殖到需要的细胞量备用。0。
24、053三准备硅室00541预先从德国购买直径大小合适的硅室SILICONCHAMBER，购自德国RENNERGMBH公司，上盖直径12CM，下盖直径11CM，清洗并且消毒。清洗消毒方法为首先在超声波清洗仪中加双蒸水和少量洗涤灵，洗15分钟；然后用自来水冲洗12小时，双蒸水洗2遍，再用双蒸水泡过夜；双蒸水再洗1遍后，56烤箱内烘干。00552将洗涤干净的硅室用过氧乙酸消毒，密封备用。0056四毛囊重建00571制备毛囊干细胞和成纤维细胞混合悬液将培养的绿色荧光蛋白标记的毛囊干细胞用消化液在室温下消化，显微镜下观察，待成纤维细胞脱落后，用磷酸盐缓冲液将洗掉滋养层成纤维细胞，然后加消化液在37继续消。
25、化至干细胞全部脱落，收集绿色荧光蛋白标记的毛囊干细胞；将制备的新生大鼠成纤维细胞用消化液消化至细胞全部脱落，用磷酸盐缓冲液收集，分别计数，将毛囊干细胞与成纤维细胞以21的比例细胞数量比混合在一起；1000转/分钟离心5分钟，倒掉磷酸盐缓冲液，用不含胎牛血清的WILLIAMSE完全培养基在流式管中重悬细胞，吹匀，即为毛囊干细胞和成纤维细胞的单细胞悬液。00582实验台提前用紫外线消毒，手术器械用75酒精消毒，裸鼠大于7周龄，雌雄不限，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司腹部皮肤消毒，腹腔注射经过过滤除菌的麻醉剂；待裸鼠麻醉后，整个背部皮肤用碘酒和75酒精擦拭消毒，用剪刀剪掉一小块皮肤，直径大约。
26、1CM，与硅室的内径接近，小心用镊子拉住皮肤边缘，将硅室的下盖塞入皮下，加入细胞悬液，每只裸鼠接种11107个毛囊干细胞和6106个真皮成纤维细胞，然后盖上上盖。整个过程要求无菌操作，具体如图2所示。005931周后，将裸鼠麻醉，去掉上盖，使伤口慢慢干燥；2周后，去掉下盖，使伤口愈合；定期观察裸鼠状态和伤口愈合情况。说明书CN102335459ACN102335468A6/6页80060五形态学观察006117周后，用颈椎脱臼法处死裸鼠，取背部疤痕部位皮肤，立即转到80保存；用冰冻切片包埋剂OCT，购自北京中杉金桥生物技术有限公司包埋皮肤组织，冰冻切片，切片厚度60微米。00622用4的中性多。
27、聚甲醛溶液室温固定切片10分钟，磷酸盐缓冲液洗3遍，用防淬灭剂DABCO购自SIGMA公司封片，20保存，直到用激光共聚焦显微镜观察。观察结果如图3所示，其中A为显微镜明视场下的照片，毛囊形态清晰可见，表明已经形成明显的毛干；B为激光共聚焦显微镜照片，显示该毛囊中的细胞高表达绿色荧光蛋白，证明该毛囊是由接种的成年大鼠触须毛囊干细胞分化形成，也即绿色的组织即为绿色荧光蛋白标记的毛囊干细胞分化形成的组织，可以发现毛囊干细胞已经成功分化为表皮和毛囊7周后，具体参见见图4和图5。说明书CN102335459ACN102335468A1/2页9图1图2说明书附图CN102335459ACN102335468A2/2页10图3图4图5说明书附图CN102335459A。