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一种人工生物结皮治理荒漠的方法及专用地衣
    【技术领域】
     本发明涉及一种人工生物结皮治理荒漠的方法及专用地衣。背景技术 中国是世界上荒漠化范围最广、 危害程度最深的地区之一。截止 2009 年底， 我国 荒漠化土地面积为 262.37 万平方公里， 沙化土地面积为 173.11 万平方公里， 分别占国土总 面积的 27.33％和 18.03％。并且还在继续扩大蔓延， 危害着农田、 牧场、 交通及人民生活， 给国家和社会经济带来了巨大的损失。以我国现有沙化土地为例， 可治理面积有 53 万平方 公里， 按每年所见 1717 平方公里 ( 国家林业局 2011) 的速度计算， 将可治理沙地变成非沙 化土地大约需要 300 年的时间。因此荒漠治理是国家在生态建设和环境保护方面的迫切需 求。
     机械方法、 化学方法及生物方法等多种方法均已被陆续采用， 但机械固沙工程量 繁重， 效果不佳， 化学方法则存在固定剂老化， 土地无法再利用等问题。生物方法成为荒漠 治理的首选方法， 而人工植树， 建造防风林耗时长， 需要数年至十几年， 流沙在相当一段时 间内仍是流动的， 利用微型生物结皮固沙耗时相对较短， 可同时固沙并改善荒漠生态环境。
     微型生物结皮是由蓝藻、 地衣、 苔藓、 细菌、 真菌等微型生物及其缠绕附着的地表 沙土形成的一层特殊结构， 是荒漠地区所特有的景观。 微型生物结皮的形成历经蓝藻结皮、 地衣结皮及苔藓结皮等阶段， 最终各种高等植物入驻， 整个荒漠生态系统得以恢复。杨军 ( 中国北方荒漠地衣及其生态学意义 . 中国科学院博士论文， 2009， p53) 通过对宁夏沙坡头 地区不同恢复时间的微型生物结皮组成成分研究发现， 随着恢复时间的延长， 最先出现的 蓝细菌 ( 蓝藻 ) 结皮的盖度呈现逐年减少的趋势， 而地衣的盖度逐年稳步增加， 成熟的结皮 以地衣和苔藓为主。
     地衣被称为 “拓荒者” ， 是由真菌与藻类或者蓝细菌形成的， 具有独特形态结构的 互惠共生生物体。真菌为藻类积蓄水分， 提供无机盐， 并保护藻类免受过强的阳光辐射 ； 藻 类或者蓝细菌通过光合作用为真菌提供营养物质， 二者互惠， 因此地衣具有更强的生命力。 地衣能够吸收水分而迅速膨胀， 此后水分缓慢的释放而被利用， 对于保持土壤水分具有重 要的意义 ； 其所进行的光合与固氮作用会增加裸露荒漠地表的有机物含量， 是荒漠生态系 统中碳、 氮元素的重要来源， 改善了荒漠生态的微环境 ； 其具有的根状结构 ( 假根 ) 可穿透 土壤， 提高了沙表的稳定性， 起到了显著地防止风蚀、 雨蚀的固沙作用 ； 其自身分泌的地衣 酸类可以侵蚀岩石表面， 同时和其他有机化合物一起粘结土壤颗粒促进土壤的形成， 为苔 藓植物及高等植物的入驻、 生长提供良好的 条件， 提高生态环境的多样性和稳定性。因此 荒漠地衣及地衣结皮在荒漠治理， 流沙固定过程中具有重要的应用价值。
     发明内容
     本发明的目的是提供一种人工生物结皮治理荒漠的方法及专用地衣。
     本发明提供一种用于制备地衣的成套产品， 由独立包装的菌和藻组成， 所述菌为Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893， 所述藻为 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892。
     本 发 明 所 提 供 的 地 衣 是 由 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 和 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 形成的。
     本发明还提供一种制备所述地衣的方法， 包括将 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 和 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 均接入固体基质进行共 培养得到地衣的步骤。
     所述固体基质为沙土、 PDA 固体培养基或其它固体基质 ；
     所述 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 的接种量以菌丝球的湿重计 为 0.03-0.07 克 / 平方厘米， 如 0.05 克 / 平方厘米 ；
     所述 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 的接种量为 0.18×106 个 细胞 /ml-0.24×106 个细胞 /ml， 如 0.21×106 个细胞 /ml。
     所述共培养的温度、 光照条件如下 ： 室温、 每天 24 小时中 12 小时光照 12 小时黑 暗、 光照强度 2000lux ； 所述室温为 18-25℃。
     本 发 明 所 提 供 的 地 衣 以 及 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 和 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 可应用于人工防沙固沙、 治理荒漠和 / 或 改善生态环境。 本发明还提供一种固沙的方法， 包括将 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 和 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 混匀后撒播于沙土表面形成结 皮的步骤 ；
     所述 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 的撒播量以菌丝球的湿重计 为 0.03-0.07 克 / 平方厘米， 如 0.05 克 / 平方厘米 ；
     所述 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 的撒播量为 0.18×106 个 细胞 /ml-0.24×106 个细胞 /ml， 如 0.21×106 个细胞 /ml。
     所述固沙的方法中， 所述形成结皮的步骤中还包括辅以保水剂的步骤。
     所述固沙的方法中还可以同时撒播荒漠蓝藻、 真菌、 细菌、 苔藓等微型生物。
     本发明所提供的将所述地衣和 / 或所述 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 和 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 撒播于沙土表面形成人工结 皮治理荒漠的方法， 一年即可形成结皮， 每平方米的结皮覆盖率可达 80％， 该方法可直接促 进地衣结皮的形成， 缩短了微型生物结皮成熟的时间， 操作简便， 可以有效持久固沙， 提高 荒漠生态系统的营养元素及生物多样性， 同时其形成的生态景观不仅可以为荒漠地区旅游 业带来经济价值， 而且可以为干旱半干旱地区城镇绿化提供材料， 在人工防沙固沙、 治理荒 漠和 / 或改善生态环境中具有广阔的应用前景。
     附图说明 图 1 为实验室条件下石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 和共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 形成的结皮。
     图 2 为石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 与共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 在室内共培养形成结皮的纵剖面电镜扫描
     图。 图 3 为喷洒样方的制作。其中， 左图为示意图， 右图为实际的草障方格。
     图 4 为野外固沙实验形成人工地衣结皮。其中， 左上图结皮已初具规模， 右上图结 皮厚度已达到 0.4-0.6cm， 左下图对照未形成结皮， 右下图已出现 Endocarpon sp.。
     图 5 为石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 的生长曲线。
     图 6 为石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 的耐旱性实 验。其中， a 为对照， 未进行干燥胁迫 ； h 为干燥胁迫 210 天后， 转接于 PDA 培养基。
     图 7 为石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 形成的结皮。
     图 8 为石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 形成结皮的 微观照。
     图 9 为石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 的生长曲 线。
     图 10 为石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 的耐旱性 验证。其中， a 为对照， 未进行干燥胁迫 ； b 为干燥胁迫 30 天后， 转接于 PDA 培养基。
     图 11 为石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 形成的结 皮。
     图 12 为石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 形成结皮 的微观照。
     具体实施方式
     下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。
     下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。
     下述实施例中所用培养基的配方如下 ：
     琼脂 (1.5％ WA) 培养基 ： 琼脂粉 15g， 蒸馏水 1L。
     大豆蛋白胨 (DBD) 液体培养基 ： 蛋白胨 10g， 酵母膏 5g， 葡萄糖 1g， 蒸馏水 1L。
     土豆浸汁 (PDA) 斜面培养基 ： 葡萄糖 20g， 琼脂粉 15g， 土豆浸汁 1L。
     实施例 1、 石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 与共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 室内共培养制备地衣与固沙实验
     将 石 果 衣 共 生 菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 与 共 生 藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 分别接种于 PDA 斜面培养基上， 活化 15 天 后， 当观察到培养基上有上述地衣共生菌和共生藻生长后， 将地衣共生菌和共生藻分别转 接入 PDA 液体培养基中 150rpm 大量培养， 培养周期分别为 30 天和 20 天， 培养条件分别为 ： 共生菌 22℃暗培养 ； 共生藻 22℃、 12h 光照 ( 光照强度 2000lux)/12h 暗培养。
     将 培 养 至 对 数 生 长 期 的 石 果 衣 共 生 菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 与共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 混匀， 使共生菌与共 6 生藻的浓度分别为 0.785g/ml( 以菌丝球湿重计 ) 和 3.25×10 个细胞 /ml。将得到的 混合液均匀喷洒于无菌沙土表面， 沙土颗粒大小均一， 盛于直径 10cm 的无菌平皿中， 厚约 0.5cm。每皿喷施 5mL 混合液， 做 3 皿重复， 平皿密封后置于光照培养箱中， 22℃、 12h 光照 (2000lux)/12h 黑暗条件下培养， 定期观察。培养 12 个月后， 三个重复均观察到地衣共生菌与共生藻形成结皮， 并且固着在沙 土颗粒之上， 覆盖了平皿的 80％ ( 图 1)。
     同 时， 对 结 皮 进 行 纵 切， 通 过 扫 描 电 镜 观 察 发 现 石 果 衣 共 生 菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 与 共 生 藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 发生接触， 并且菌丝将藻细胞包裹在内 ( 图 2)， 说明二者已经共生形成地衣的初始 阶段， 并且起到固着沙粒的作用。
     实施例 2、 野外固沙实验
     在平整固定沙丘上清理 3 个约 0.5m2 的沙面， 然后用麦草将每个沙面分成两部分， 形成草障方格， 0.4×0.5m 区作为喷洒清水对照方， 0.6×0.5m 区作为喷洒悬浮液实验方 ( 图 3)。
     将处于对数生长期的石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 和共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 及野外收集的地衣碎片 ( 经 鉴定， 该地衣为石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 和共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 共生形成的石果衣 ) 与水混合， 混合后得 7 -3 到浓度分别为 0.5g/ml( 以菌丝球湿重计 )、 0.21×10 个细胞 /ml、 5×10 g/ml 的悬浮液， 然后按每平方米 1L 悬浮液均匀撒播于实验方沙土表面， 每 3 天用清水浇灌 一次， 观察。对 照样方喷洒清水， 用量与悬浮液体积相同， 其他管理均相同。 以上处理辅以保水剂 (Super Absorbent Polymers， 简称 SAP， 购自北京金元易生 2 态工程技术中心 )， 将保水剂以 250g/m 的用量撒播于草方格之上保持水分。
     上述地衣碎片的制备方法如下 ： 将地衣 ( 经鉴定该地衣为石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 和共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 共生形成的石果衣 ) 及其下 4mm-12mm 的土壤同时取下， 碾碎经直径 0.5cm 的筛网过滤， 获得均一大小的地衣碎片。
     结果 ： 在 12 个月后的地衣结皮在自然条件下均已初具规模 ( 图 4， 左上 )， 结皮厚 度均已达 0.4-0.6cm( 图 4， 右上 )， 与对照方的差异明显 ( 图 4， 左下 )， 且有地衣着生 ( 图 4， 右下 )。
     以上结果表明， 该地衣及其共生藻与共生菌可以直接促进地衣结皮的形成， 缩短 了微型生物结皮成熟的时间， 操作简便， 可以有效持久固沙， 提高荒漠生态系统的营养元素 及生物多样性， 同时其形成的生态景观不仅可以为荒漠地区旅游业带来经济价值， 而且可 以为干旱半干旱地区城镇绿化提供材料。
     上 述 石 果 衣 共 生 菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 与 共 生 藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 的分离培养与鉴定实验如下 ：
     一、 石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 的分离培养与鉴 定
     1、 地衣标本的采集与鉴定
     从腾格里沙漠东南缘的沙坡头地区 ( 干旱多风， 年均降雨量不足 200mm) 采集获得 新鲜地衣标本， 采用形态解剖学方法对该标本进行鉴定。选取成熟、 发育良好的地衣体， 放 于盛有蒸馏水的培养皿中， 使地衣体浸透变软， 随后用干净滤纸吸去地衣体上的多余水分， 冷冻切片， 在解剖镜下选取较薄的切片置于载玻片水滴中， 加盖玻片， 在显微镜下观察， 结
     果如下 ：
     地衣体鳞片叶状， 鳞片叶聚集， 紧密贴生于基物， 宽约 2-5mm， 圆形至不规则形 状， 边缘完整至锯齿状， 上表面深棕色至浅棕色， 平坦至微下凹， 下表面黑色具有菌丝和 假根， 假根黑色， 5-7mm 长， 单一少分枝， 每个鳞片叶单个或多个假根。子囊壳球形， 直径 0.1-0.2mm 每个鳞片叶 1-6 个， 埋生于地衣体中， 孔口周围深棕色。
     地 衣 体 厚 140-200μm， 上 皮 层 厚 25-50μm， 透 明 无 色， 为假薄壁组织 ； 藻层厚 75-100μm， 藻细胞直径 5-10μm ； 髓层厚 10-25μm ； 下皮层厚 30-50μm， 下部浅黑色， 菌丝 细胞壁加厚。
     子囊壳通常圆形， 内腔高 220-400μm， 宽 200-380μm， 果壳棕色， 厚 25-37μm， 侧 丝 25-65μm 长， 子实层藻直径 4-7μm， 子囊棒状， 50-65×15-22μm， 子囊内含 2 个子囊孢 子， 砖壁型， 长椭圆形， 25-50×12-17μm。
     基物为沙土。
     通 过 以 上 观 察 结 果， 鉴 定 该 荒 漠 地 衣 标 本 为 石 果 衣 Endocarpon pusillum Hedwig， Descript.Adumbr.Musc.Frondos. ： 56(1789)。
     2、 地衣共生菌的分离、 培养 利用孢子释放方法从石果衣标本中分离地衣共生菌， 具体方法为 ： 将新鲜地衣标 本的成熟子囊器， 用水浸湿后吸去表面多余水分， 用凡士林将子囊器倒置在培养皿盖内侧， 培养皿下部为 1.5％ WA 培养基， 每 12h 转动培养皿盖一次 ( 因共生菌与共生藻孢子同时喷 射， 所以可以通过上述孢子释放方法同时得到共生菌与共生藻 )， 以获得单一孢子形成的菌 落。当观察到孢子萌发后， 将含有萌发子囊孢子的琼脂块转入 PDA 斜面培养基， 22℃黑暗培 养地衣共生菌， 生长后转入 DBD 液体培养基， 150rpm 黑暗培养。
     以上操作均在无菌条件下进行。通过上述方法获得一株地衣共生菌， 将其命名为 F07020。
     3、 地衣共生菌 F07020 的鉴定
     1)、 形态特征
     将地衣共生菌 F07020 接种于 PDA 斜面培养基上， 22℃黑暗培养 30 天， 观察菌落形 态。观察结果为 ： 菌落直径 0.8-0.9cm， 呈不规则圆形， 表面粗糙， 边缘整齐或否， 暗褐色至 浅灰色。
     2)、 nrDNA-ITS(ITS1-5.8S-ITS2) 序列的 PCR 扩增和序列测定
     A)DNA 提取 ：
     分别取地衣体及其共生菌 F07020 10-20mg ； 液氮研磨后加入 300μl 2×CTAB， 轻 轻混匀， 90℃水浴 2min ； 加入 300μl 酚∶氯仿∶异戊醇 (25 ∶ 24 ∶ 1)， 振荡混匀， 12000r/ min 离心 5min 去除蛋白质 ； 取上清加入等体积的 DNA 结合液 ( 结合液成分 ： 4.0mol/L 异硫 氰酸胍， 0.5mol/L、 pH5.0 乙酸钾， 终体积浓度为 30％的异丙醇 ) 颠倒混匀， 随即移入吸附柱 静置 2min， 12000r/mim 离心 15s， 弃残液 ； 加入 300μl 洗涤液 ( 洗涤液成分 ： 10mmol/L， 终 体积浓度为 80％的乙醇 )， 12000r/min 离心 15s， 去残液， 重复一次 ； 12000r/min 离心干燥 1min ； 将吸附柱移入新无菌离心管， 加入 30μlTE 洗脱液静置 5min， 12000r/min 离心 15s， 重复洗涤一次， 去除吸附柱， 离心管内即为 DNA 模板。
     B)nrDNA-ITS(ITS1-5.8S-ITS2) 基因的 PCR 扩增及序列测序
     用 于 地 衣 体 及 其 共 生 菌 F07020 PCR 扩 增 的 正 向 引 物 为 ITS1 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’(SSU nt1769-1787) ， 反 向 引 物 为 ITS4 5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ (LSU nt60-79) ； PCR 扩增体系 (50μl) ： 10×buffer 5μl ； 25mmol/L MgCl2 3μl ； 2.5mmol/L dNTPs 4μl ； 10μmol/L 引物各 1μl ； ddH2O 34μl ； Taq DNA 酶 1μl(0.25U) ； 模 板 1μl(50ug)。PCR 扩 增 条 件 为 95 ℃ 180s， 94 ℃ 30s， 52 ℃ 30s， 72℃ 90s， 37 个循环 ； 72℃ 600s， 4℃保存。
     PCR 扩增产物经北京标凯生物技术有限公司测序， 测序结果经 DNAman5.2.2 进行 双序列比对分析。
     测序结果表明， 荒漠地衣及其共生菌 F07020 的 nrDNA-ITS(ITS1-5.8S-ITS2) 序列 长度均为 557bp， 其核苷酸序列完全相同 ( 如序列表序列 1 所示 )， 表明该荒漠地衣共生菌 由其相应标本分离得到。根据地衣共生菌的学名就是其地衣物种的学名， 以及荒漠地衣共 生菌 F07020 与荒漠地衣标本 nrDNA-ITS(ITS1-5.8S-ITS2) 同源序列的比对结果， 将荒漠地 衣共生菌 F07020 鉴定为石果衣共生菌 Endocarpon pusillum Hedwig。
     石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 已于 2010 年 05 月 31 日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ( 简称 CGMCC， 地址为 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究所 )， 保藏登记号为 CGMCC No.3893。 4、 石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 的生长特性
     挑取定量石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893， 转接于 DBD 液体培养基中， 22 ℃， 黑暗条件， 150rpm 振荡培养， 每 15 天测定一次菌丝干重， 每次 3 个重复， 取平均值， 以培养时间为横坐标， 菌丝干重为纵坐标绘制生长曲线 ( 如图 5 所示 )， 结果表明， 石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 在培养 30 天后到 达对数生长期， 与 Ahmadjian V.and H.(1970) 报道的地衣共生菌 (The culture and synthesis of Endocarpon pusillum and Staurothele clopima.Lichenologist， 4： 259-267.) 需培养 1 年相比， 差异显著。
     5、 石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 的耐旱性
     1) 活化 ： 将对数生长期的石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 转接入 PDA 液体培养基中， 150rpm 黑暗培养 30 天。
     2) 干燥胁迫 ： 在无菌条件下， 将步骤 1) 得到的菌液转入不含培养基的培养皿 ( 直 径 35mm) 中， 将培养皿放入含变色硅胶的干燥器中 ( 相对空气湿度≤ 10 ％， 环境温度为 20 ～ 27℃， 自然光照条件 )， 以造成干燥胁迫。
     每月将胁迫处理的石果衣共生菌转接到含固体 PDA 培养基中， 环境温度 20 ～ 27℃， 黑暗培养， 并观察石果衣共生菌的生长情况。
     对照： 初 始 未 胁 迫 的 石 果 衣 共 生 菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893。
     上述石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 在干燥胁迫 210 天后仍未死亡， 转接于 PDA 培养基培养后， 证明其仍有活性 ( 图 6， h)。
     6、 石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 的固沙实验
     活化 ： 将 对 数 生 长 期 的 石 果 衣 共 生 菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 转接入液体 PDA 培养基中， 150rpm 黑暗培养 30 天。
     将活化后的石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 菌丝球在无菌条件下研 碎， 用无菌水稀释至浓度为 1.57g/ml( 以菌丝球湿重计 ) 后撒播于铺有无菌沙粒培养皿中 ( 培养皿直径 10cm， 沙粒厚 5mm， 以无菌水刚刚润湿沙粒为准 )， 每皿喷施 5mL， 使该共生菌的 2 撒播量为 0.1g/cm ( 以菌丝球湿重计 )， 12h 光照 /12h 黑暗， 20℃培养 30 天后观察。
     石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 在 30 天后有新鲜菌 丝长出， 同时可以见到新形成的石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 菌丝与沙粒形 成的结皮， 厚约 2mm( 图 7， 图 8)
     二、 石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 的分离培养与 鉴定
     1、 地衣共生藻的分离培养
     利用孢子释放方法从 “一’ ’ 中的步骤 1 获得的石果衣标本中分离地衣共生藻， 具 体方法为 ： 将新鲜地衣标本的成熟子囊器， 用水浸湿后吸去表面多余水分， 用凡士林将子囊 器倒置在培养皿盖内侧， 培养皿下部为 1.5％ WA 培养基， 为获得单一孢子萌发形成的藻落， 每 12h 转动培养皿盖一次 ( 因共生菌与共生藻孢子同时喷射， 所以可以通过上述孢子释放 方法同时得到共生菌与共生藻 )， 当观察到有藻生长后， 转入 PDA 斜面培养基， 22℃， 12h 光 照 /12h 黑暗， 光照强度 2000lux 条件下培养地衣共生藻， 大量生长后转入 DBD 液体培养基， 150rpm 同样条件下振荡培养。
     以上操作均在无菌条件下进行， 通过上述方法获得一株地衣共生藻， 将其命名为 A07020。
     2、 地衣共生藻 A07020 的鉴定
     1)、 形态特征
     将地衣共生藻藻株 A07020 接种于 PDA 斜面培养基， 在 22℃， 12h 光照 12h 黑暗， 光 强 2000lux 条件下培养 10 天， 观察藻细胞形态。 观察结果为 ： 细胞椭圆形至钝圆柱形 ； 椭圆 形细胞大小为 3.8×4.8μm， 圆柱形细胞长 5.8-8.6μm， 宽 3.8-4.8μm ； 叶绿体片状、 侧生 ； 细胞外侧有水质胶壳包裹。
     2)、 nrDNA-ITS(ITS1-5.8S-ITS2) 序列的 PCR 扩增和序列测定
     A)DNA 提取
     分 别 取 10-20mg 石果衣标本 及其地衣 共生 藻 A07020 ； 液氮 研磨 ； 加入 300μl 2×CTAB， 轻轻混匀， 90℃水浴 2min ； 加入 300μl 酚∶氯仿∶异戊醇 (25 ∶ 24 ∶ 1)， 振荡混 匀， 12000r/min 离心 5min 去除蛋白质 ； 取上清加入等体积的 DNA 结合液 (4.0mol/L 异硫氰 酸胍， 0.5mol/L， pH5.0 乙酸钾， 终体积浓度为 30％异丙醇 ) 颠倒混匀， 随即移入吸附柱静置 2min， 12000r/mim 离心 15s， 弃残液 ； 加入 300μl 洗涤液 (10mmol/L， pH5.0 乙酸钾， 终体积 浓度为 80％乙醇 )， 12000r/min 离心 15s， 去残液， 重复一次 ； 12000r/min 离心干燥 1min ； 将 吸附柱移入新无菌离心管， 加入 30μlTE 洗脱液静置 5min， 12000r/min 离心 15s， 重复洗涤 一次， 去除吸附柱， 离心管内即为 DNA 模板。
     B)nrDNA-ITS(ITS1-5.8S-ITS2) 基因的 PCR 扩增及序列测序
     用 于 石 果 衣 标 本 及 其 地 衣 共 生 藻 A07020 PCR 扩 增 的 正 向 引 物 为 5’ -CTGCGGAAGGATCATTGATTC-3’ (18S nt1780-1800) ， 反 向 引 物 为 5’ -AGTTCAGCGGGTGGTCTTG-3’ (28S nt0012-0030)。PCR 扩 增 体 系 (50μl) ： 10×buffer5μl ； 25mmol/L MgCl2 3μl ； 2.5mmol/L dNTPs 4μl ； 10μmol/L 引 物 各 1μl ； ddH2O 34μl ； Taq DNA 酶 1μl ； 模 板 1μl。PCR 扩 增 条 件 为 95 ℃ 180s， 94 ℃ 30s， 52 ℃ 30s， 72℃ 90s， 37 个循环 ； 72℃ 600s， 4℃保存。
     PCR 扩增产物经北京标凯生物技术有限公司测序， 测序结果经 DNAman5.2.2 进行 双序列比对分析。
     测序结果表明， 石果衣及其共生藻 A07020 的 nrDNA-ITS(ITS1-5.8S-ITS2) 序列长 度均为 744bp， 其核苷酸序列完全相同 ( 如序列表序列 2 所示 )， 表明该石果衣共生藻由其 相应标本分离得到。 将石果衣共生藻 A07020 的 nrDNA-ITS(ITS1-5.8S-ITS2) 序列在 Genbank 中进行同源比对分析， 其序列与 Stichococcus diplosphaera Chodat ＝ Diplosphaera chodatii Bialosuknia 的 nrDNA-ITS(ITS1-5.8S-ITS2) 序列相似度为 100％。根据形态特 征以及 nrDNA-ITS(ITS1-5.8S-ITS2) 序列在 Genbank 中同源序列的比对结果， 将荒漠地衣共 生藻 A07020 鉴定为 Diplosphaera chodatii Bialosuknia。
     石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 已于 2010 年 5 月 31 日保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ( 简称 CGMCC， 地址为 ： 北京市朝阳区北辰西 路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究所 )， 保藏登记号为 CGMCC No.3892。 3、 石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 的生长特性
     挑取定量石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892， 转接 于 DBD 液体培养基中， 22℃， 150rpm 12h 光照 12h 黑暗， 光照强度为 2000lux 培养， 通过叶 绿素在 665nm 处的吸光值测定共生藻的生长量， 每 3 天测定一次， 每次 3 个重复， 以培养时 间为横坐标， 665nm 处吸光值为纵坐标绘制生长曲线 ( 图 9)， 培养 10 天后石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 达到对数生长期。
     4、 石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 的耐旱性验证
     1) 活化 ： 将对数生长期的石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 转接入液体 PDA 培养基中， 150rpm 黑暗培养 10 天。
     2) 干燥胁迫 ： 无菌条件下， 将 1) 得到的藻液转入不含培养基的培养皿 ( 直径 35mm) 中， 将培养皿放入含变色硅胶的干燥器中 ( 相对空气湿度≤ 10％， 环境温度为 20 ～ 27℃， 自然光照条件 )， 以造成干燥胁迫。
     每月将胁迫处理的石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 转接到固体 PDA 培养基中， 环境温度 20 ～ 27℃， 黑暗培养， 并观察共生藻的生长情况 ( 图 10)。
     对照： 初 始 未 胁 迫 石 果 衣 共 生 藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892( 图 10， a)。
     上述石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 在干燥胁迫 30 天后仍未死亡， 转接于 PDA 培养基培养后， 证明其仍有活性 ( 图 10， b)。
     5、 石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 的固沙实验
     活化 ： 将石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 接入土豆 浸汁 (PDA) 液体培养基中， 22℃、 12h 光照 /12h 黑暗 150rpm 培养 10 天。
     将活化后的石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 藻悬 液在无菌条件下撒播于铺有无菌沙粒培养皿中 ( 沙粒厚约 5mm， 以无菌水刚刚润湿沙粒为
     本发明涉及一种人工生物结皮治理荒漠的方法及专用地衣。背景技术 中国是世界上荒漠化范围最广、 危害程度最深的地区之一。截止 2009 年底， 我国 荒漠化土地面积为 262.37 万平方公里， 沙化土地面积为 173.11 万平方公里， 分别占国土总 面积的 27.33％和 18.03％。并且还在继续扩大蔓延， 危害着农田、 牧场、 交通及人民生活， 给国家和社会经济带来了巨大的损失。以我国现有沙化土地为例， 可治理面积有 53 万平方 公里， 按每年所见 1717 平方公里 ( 国家林业局 2011) 的速度计算， 将可治理沙地变成非沙 化土地大约需要 300 年的时间。因此荒漠治理是国家在生态建设和环境保护方面的迫切需 求。
     机械方法、 化学方法及生物方法等多种方法均已被陆续采用， 但机械固沙工程量 繁重， 效果不佳， 化学方法则存在固定剂老化， 土地无法再利用等问题。生物方法成为荒漠 治理的首选方法， 而人工植树， 建造防风林耗时长， 需要数年至十几年， 流沙在相当一段时 间内仍是流动的， 利用微型生物结皮固沙耗时相对较短， 可同时固沙并改善荒漠生态环境。
     微型生物结皮是由蓝藻、 地衣、 苔藓、 细菌、 真菌等微型生物及其缠绕附着的地表 沙土形成的一层特殊结构， 是荒漠地区所特有的景观。 微型生物结皮的形成历经蓝藻结皮、 地衣结皮及苔藓结皮等阶段， 最终各种高等植物入驻， 整个荒漠生态系统得以恢复。杨军 ( 中国北方荒漠地衣及其生态学意义 . 中国科学院博士论文， 2009， p53) 通过对宁夏沙坡头 地区不同恢复时间的微型生物结皮组成成分研究发现， 随着恢复时间的延长， 最先出现的 蓝细菌 ( 蓝藻 ) 结皮的盖度呈现逐年减少的趋势， 而地衣的盖度逐年稳步增加， 成熟的结皮 以地衣和苔藓为主。
     地衣被称为 “拓荒者” ， 是由真菌与藻类或者蓝细菌形成的， 具有独特形态结构的 互惠共生生物体。真菌为藻类积蓄水分， 提供无机盐， 并保护藻类免受过强的阳光辐射 ； 藻 类或者蓝细菌通过光合作用为真菌提供营养物质， 二者互惠， 因此地衣具有更强的生命力。 地衣能够吸收水分而迅速膨胀， 此后水分缓慢的释放而被利用， 对于保持土壤水分具有重 要的意义 ； 其所进行的光合与固氮作用会增加裸露荒漠地表的有机物含量， 是荒漠生态系 统中碳、 氮元素的重要来源， 改善了荒漠生态的微环境 ； 其具有的根状结构 ( 假根 ) 可穿透 土壤， 提高了沙表的稳定性， 起到了显著地防止风蚀、 雨蚀的固沙作用 ； 其自身分泌的地衣 酸类可以侵蚀岩石表面， 同时和其他有机化合物一起粘结土壤颗粒促进土壤的形成， 为苔 藓植物及高等植物的入驻、 生长提供良好的 条件， 提高生态环境的多样性和稳定性。因此 荒漠地衣及地衣结皮在荒漠治理， 流沙固定过程中具有重要的应用价值。
     发明内容
     本发明的目的是提供一种人工生物结皮治理荒漠的方法及专用地衣。
     本发明提供一种用于制备地衣的成套产品， 由独立包装的菌和藻组成， 所述菌为Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893， 所述藻为 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892。
     本 发 明 所 提 供 的 地 衣 是 由 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 和 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 形成的。
     本发明还提供一种制备所述地衣的方法， 包括将 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 和 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 均接入固体基质进行共 培养得到地衣的步骤。
     所述固体基质为沙土、 PDA 固体培养基或其它固体基质 ；
     所述 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 的接种量以菌丝球的湿重计 为 0.03-0.07 克 / 平方厘米， 如 0.05 克 / 平方厘米 ；
     所述 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 的接种量为 0.18×106 个 细胞 /ml-0.24×106 个细胞 /ml， 如 0.21×106 个细胞 /ml。
     所述共培养的温度、 光照条件如下 ： 室温、 每天 24 小时中 12 小时光照 12 小时黑 暗、 光照强度 2000lux ； 所述室温为 18-25℃。
     本 发 明 所 提 供 的 地 衣 以 及 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 和 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 可应用于人工防沙固沙、 治理荒漠和 / 或 改善生态环境。 本发明还提供一种固沙的方法， 包括将 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 和 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 混匀后撒播于沙土表面形成结 皮的步骤 ；
     所述 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 的撒播量以菌丝球的湿重计 为 0.03-0.07 克 / 平方厘米， 如 0.05 克 / 平方厘米 ；
     所述 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 的撒播量为 0.18×106 个 细胞 /ml-0.24×106 个细胞 /ml， 如 0.21×106 个细胞 /ml。
     所述固沙的方法中， 所述形成结皮的步骤中还包括辅以保水剂的步骤。
     所述固沙的方法中还可以同时撒播荒漠蓝藻、 真菌、 细菌、 苔藓等微型生物。
     本发明所提供的将所述地衣和 / 或所述 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 和 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 撒播于沙土表面形成人工结 皮治理荒漠的方法， 一年即可形成结皮， 每平方米的结皮覆盖率可达 80％， 该方法可直接促 进地衣结皮的形成， 缩短了微型生物结皮成熟的时间， 操作简便， 可以有效持久固沙， 提高 荒漠生态系统的营养元素及生物多样性， 同时其形成的生态景观不仅可以为荒漠地区旅游 业带来经济价值， 而且可以为干旱半干旱地区城镇绿化提供材料， 在人工防沙固沙、 治理荒 漠和 / 或改善生态环境中具有广阔的应用前景。
    附图说明 图 1 为实验室条件下石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 和共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 形成的结皮。
     图 2 为石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 与共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 在室内共培养形成结皮的纵剖面电镜扫描
     图。 图 3 为喷洒样方的制作。其中， 左图为示意图， 右图为实际的草障方格。
     图 4 为野外固沙实验形成人工地衣结皮。其中， 左上图结皮已初具规模， 右上图结 皮厚度已达到 0.4-0.6cm， 左下图对照未形成结皮， 右下图已出现 Endocarpon sp.。
     图 5 为石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 的生长曲线。
     图 6 为石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 的耐旱性实 验。其中， a 为对照， 未进行干燥胁迫 ； h 为干燥胁迫 210 天后， 转接于 PDA 培养基。
     图 7 为石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 形成的结皮。
     图 8 为石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 形成结皮的 微观照。
     图 9 为石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 的生长曲 线。
     图 10 为石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 的耐旱性 验证。其中， a 为对照， 未进行干燥胁迫 ； b 为干燥胁迫 30 天后， 转接于 PDA 培养基。
     图 11 为石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 形成的结 皮。
     图 12 为石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 形成结皮 的微观照。
    具体实施方式
     下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。
     下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。
     下述实施例中所用培养基的配方如下 ：
     琼脂 (1.5％ WA) 培养基 ： 琼脂粉 15g， 蒸馏水 1L。
     大豆蛋白胨 (DBD) 液体培养基 ： 蛋白胨 10g， 酵母膏 5g， 葡萄糖 1g， 蒸馏水 1L。
     土豆浸汁 (PDA) 斜面培养基 ： 葡萄糖 20g， 琼脂粉 15g， 土豆浸汁 1L。
     实施例 1、 石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 与共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 室内共培养制备地衣与固沙实验
     将 石 果 衣 共 生 菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 与 共 生 藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 分别接种于 PDA 斜面培养基上， 活化 15 天 后， 当观察到培养基上有上述地衣共生菌和共生藻生长后， 将地衣共生菌和共生藻分别转 接入 PDA 液体培养基中 150rpm 大量培养， 培养周期分别为 30 天和 20 天， 培养条件分别为 ： 共生菌 22℃暗培养 ； 共生藻 22℃、 12h 光照 ( 光照强度 2000lux)/12h 暗培养。
     将 培 养 至 对 数 生 长 期 的 石 果 衣 共 生 菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 与共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 混匀， 使共生菌与共 6 生藻的浓度分别为 0.785g/ml( 以菌丝球湿重计 ) 和 3.25×10 个细胞 /ml。将得到的 混合液均匀喷洒于无菌沙土表面， 沙土颗粒大小均一， 盛于直径 10cm 的无菌平皿中， 厚约 0.5cm。每皿喷施 5mL 混合液， 做 3 皿重复， 平皿密封后置于光照培养箱中， 22℃、 12h 光照 (2000lux)/12h 黑暗条件下培养， 定期观察。培养 12 个月后， 三个重复均观察到地衣共生菌与共生藻形成结皮， 并且固着在沙 土颗粒之上， 覆盖了平皿的 80％ ( 图 1)。
     同 时， 对 结 皮 进 行 纵 切， 通 过 扫 描 电 镜 观 察 发 现 石 果 衣 共 生 菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 与 共 生 藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 发生接触， 并且菌丝将藻细胞包裹在内 ( 图 2)， 说明二者已经共生形成地衣的初始 阶段， 并且起到固着沙粒的作用。
     实施例 2、 野外固沙实验
     在平整固定沙丘上清理 3 个约 0.5m2 的沙面， 然后用麦草将每个沙面分成两部分， 形成草障方格， 0.4×0.5m 区作为喷洒清水对照方， 0.6×0.5m 区作为喷洒悬浮液实验方 ( 图 3)。
     将处于对数生长期的石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 和共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 及野外收集的地衣碎片 ( 经 鉴定， 该地衣为石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 和共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 共生形成的石果衣 ) 与水混合， 混合后得 7 -3 到浓度分别为 0.5g/ml( 以菌丝球湿重计 )、 0.21×10 个细胞 /ml、 5×10 g/ml 的悬浮液， 然后按每平方米 1L 悬浮液均匀撒播于实验方沙土表面， 每 3 天用清水浇灌 一次， 观察。对 照样方喷洒清水， 用量与悬浮液体积相同， 其他管理均相同。 以上处理辅以保水剂 (Super Absorbent Polymers， 简称 SAP， 购自北京金元易生 2 态工程技术中心 )， 将保水剂以 250g/m 的用量撒播于草方格之上保持水分。
     上述地衣碎片的制备方法如下 ： 将地衣 ( 经鉴定该地衣为石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 和共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 共生形成的石果衣 ) 及其下 4mm-12mm 的土壤同时取下， 碾碎经直径 0.5cm 的筛网过滤， 获得均一大小的地衣碎片。
     结果 ： 在 12 个月后的地衣结皮在自然条件下均已初具规模 ( 图 4， 左上 )， 结皮厚 度均已达 0.4-0.6cm( 图 4， 右上 )， 与对照方的差异明显 ( 图 4， 左下 )， 且有地衣着生 ( 图 4， 右下 )。
     以上结果表明， 该地衣及其共生藻与共生菌可以直接促进地衣结皮的形成， 缩短 了微型生物结皮成熟的时间， 操作简便， 可以有效持久固沙， 提高荒漠生态系统的营养元素 及生物多样性， 同时其形成的生态景观不仅可以为荒漠地区旅游业带来经济价值， 而且可 以为干旱半干旱地区城镇绿化提供材料。
     上 述 石 果 衣 共 生 菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 与 共 生 藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 的分离培养与鉴定实验如下 ：
     一、 石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 的分离培养与鉴 定
     1、 地衣标本的采集与鉴定
     从腾格里沙漠东南缘的沙坡头地区 ( 干旱多风， 年均降雨量不足 200mm) 采集获得 新鲜地衣标本， 采用形态解剖学方法对该标本进行鉴定。选取成熟、 发育良好的地衣体， 放 于盛有蒸馏水的培养皿中， 使地衣体浸透变软， 随后用干净滤纸吸去地衣体上的多余水分， 冷冻切片， 在解剖镜下选取较薄的切片置于载玻片水滴中， 加盖玻片， 在显微镜下观察， 结
     果如下 ：
     地衣体鳞片叶状， 鳞片叶聚集， 紧密贴生于基物， 宽约 2-5mm， 圆形至不规则形 状， 边缘完整至锯齿状， 上表面深棕色至浅棕色， 平坦至微下凹， 下表面黑色具有菌丝和 假根， 假根黑色， 5-7mm 长， 单一少分枝， 每个鳞片叶单个或多个假根。子囊壳球形， 直径 0.1-0.2mm 每个鳞片叶 1-6 个， 埋生于地衣体中， 孔口周围深棕色。
     地 衣 体 厚 140-200μm， 上 皮 层 厚 25-50μm， 透 明 无 色， 为假薄壁组织 ； 藻层厚 75-100μm， 藻细胞直径 5-10μm ； 髓层厚 10-25μm ； 下皮层厚 30-50μm， 下部浅黑色， 菌丝 细胞壁加厚。
     子囊壳通常圆形， 内腔高 220-400μm， 宽 200-380μm， 果壳棕色， 厚 25-37μm， 侧 丝 25-65μm 长， 子实层藻直径 4-7μm， 子囊棒状， 50-65×15-22μm， 子囊内含 2 个子囊孢 子， 砖壁型， 长椭圆形， 25-50×12-17μm。
     基物为沙土。
     通 过 以 上 观 察 结 果， 鉴 定 该 荒 漠 地 衣 标 本 为 石 果 衣 Endocarpon pusillum Hedwig， Descript.Adumbr.Musc.Frondos. ： 56(1789)。
     2、 地衣共生菌的分离、 培养 利用孢子释放方法从石果衣标本中分离地衣共生菌， 具体方法为 ： 将新鲜地衣标 本的成熟子囊器， 用水浸湿后吸去表面多余水分， 用凡士林将子囊器倒置在培养皿盖内侧， 培养皿下部为 1.5％ WA 培养基， 每 12h 转动培养皿盖一次 ( 因共生菌与共生藻孢子同时喷 射， 所以可以通过上述孢子释放方法同时得到共生菌与共生藻 )， 以获得单一孢子形成的菌 落。当观察到孢子萌发后， 将含有萌发子囊孢子的琼脂块转入 PDA 斜面培养基， 22℃黑暗培 养地衣共生菌， 生长后转入 DBD 液体培养基， 150rpm 黑暗培养。
     以上操作均在无菌条件下进行。通过上述方法获得一株地衣共生菌， 将其命名为 F07020。
     3、 地衣共生菌 F07020 的鉴定
     1)、 形态特征
     将地衣共生菌 F07020 接种于 PDA 斜面培养基上， 22℃黑暗培养 30 天， 观察菌落形 态。观察结果为 ： 菌落直径 0.8-0.9cm， 呈不规则圆形， 表面粗糙， 边缘整齐或否， 暗褐色至 浅灰色。
     2)、 nrDNA-ITS(ITS1-5.8S-ITS2) 序列的 PCR 扩增和序列测定
     A)DNA 提取 ：
     分别取地衣体及其共生菌 F07020 10-20mg ； 液氮研磨后加入 300μl 2×CTAB， 轻 轻混匀， 90℃水浴 2min ； 加入 300μl 酚∶氯仿∶异戊醇 (25 ∶ 24 ∶ 1)， 振荡混匀， 12000r/ min 离心 5min 去除蛋白质 ； 取上清加入等体积的 DNA 结合液 ( 结合液成分 ： 4.0mol/L 异硫 氰酸胍， 0.5mol/L、 pH5.0 乙酸钾， 终体积浓度为 30％的异丙醇 ) 颠倒混匀， 随即移入吸附柱 静置 2min， 12000r/mim 离心 15s， 弃残液 ； 加入 300μl 洗涤液 ( 洗涤液成分 ： 10mmol/L， 终 体积浓度为 80％的乙醇 )， 12000r/min 离心 15s， 去残液， 重复一次 ； 12000r/min 离心干燥 1min ； 将吸附柱移入新无菌离心管， 加入 30μlTE 洗脱液静置 5min， 12000r/min 离心 15s， 重复洗涤一次， 去除吸附柱， 离心管内即为 DNA 模板。
     B)nrDNA-ITS(ITS1-5.8S-ITS2) 基因的 PCR 扩增及序列测序
     用 于 地 衣 体 及 其 共 生 菌 F07020 PCR 扩 增 的 正 向 引 物 为 ITS1 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’(SSU nt1769-1787) ， 反 向 引 物 为 ITS4 5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ (LSU nt60-79) ； PCR 扩增体系 (50μl) ： 10×buffer 5μl ； 25mmol/L MgCl2 3μl ； 2.5mmol/L dNTPs 4μl ； 10μmol/L 引物各 1μl ； ddH2O 34μl ； Taq DNA 酶 1μl(0.25U) ； 模 板 1μl(50ug)。PCR 扩 增 条 件 为 95 ℃ 180s， 94 ℃ 30s， 52 ℃ 30s， 72℃ 90s， 37 个循环 ； 72℃ 600s， 4℃保存。
     PCR 扩增产物经北京标凯生物技术有限公司测序， 测序结果经 DNAman5.2.2 进行 双序列比对分析。
     测序结果表明， 荒漠地衣及其共生菌 F07020 的 nrDNA-ITS(ITS1-5.8S-ITS2) 序列 长度均为 557bp， 其核苷酸序列完全相同 ( 如序列表序列 1 所示 )， 表明该荒漠地衣共生菌 由其相应标本分离得到。根据地衣共生菌的学名就是其地衣物种的学名， 以及荒漠地衣共 生菌 F07020 与荒漠地衣标本 nrDNA-ITS(ITS1-5.8S-ITS2) 同源序列的比对结果， 将荒漠地 衣共生菌 F07020 鉴定为石果衣共生菌 Endocarpon pusillum Hedwig。
     石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 已于 2010 年 05 月 31 日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ( 简称 CGMCC， 地址为 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究所 )， 保藏登记号为 CGMCC No.3893。 4、 石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 的生长特性
     挑取定量石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893， 转接于 DBD 液体培养基中， 22 ℃， 黑暗条件， 150rpm 振荡培养， 每 15 天测定一次菌丝干重， 每次 3 个重复， 取平均值， 以培养时间为横坐标， 菌丝干重为纵坐标绘制生长曲线 ( 如图 5 所示 )， 结果表明， 石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 在培养 30 天后到 达对数生长期， 与 Ahmadjian V.and H.(1970) 报道的地衣共生菌 (The culture and synthesis of Endocarpon pusillum and Staurothele clopima.Lichenologist， 4： 259-267.) 需培养 1 年相比， 差异显著。
     5、 石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 的耐旱性
     1) 活化 ： 将对数生长期的石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 转接入 PDA 液体培养基中， 150rpm 黑暗培养 30 天。
     2) 干燥胁迫 ： 在无菌条件下， 将步骤 1) 得到的菌液转入不含培养基的培养皿 ( 直 径 35mm) 中， 将培养皿放入含变色硅胶的干燥器中 ( 相对空气湿度≤ 10 ％， 环境温度为 20 ～ 27℃， 自然光照条件 )， 以造成干燥胁迫。
     每月将胁迫处理的石果衣共生菌转接到含固体 PDA 培养基中， 环境温度 20 ～ 27℃， 黑暗培养， 并观察石果衣共生菌的生长情况。
     对照： 初 始 未 胁 迫 的 石 果 衣 共 生 菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893。
     上述石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 在干燥胁迫 210 天后仍未死亡， 转接于 PDA 培养基培养后， 证明其仍有活性 ( 图 6， h)。
     6、 石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 的固沙实验
     活化 ： 将 对 数 生 长 期 的 石 果 衣 共 生 菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 转接入液体 PDA 培养基中， 150rpm 黑暗培养 30 天。
     将活化后的石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 菌丝球在无菌条件下研 碎， 用无菌水稀释至浓度为 1.57g/ml( 以菌丝球湿重计 ) 后撒播于铺有无菌沙粒培养皿中 ( 培养皿直径 10cm， 沙粒厚 5mm， 以无菌水刚刚润湿沙粒为准 )， 每皿喷施 5mL， 使该共生菌的 2 撒播量为 0.1g/cm ( 以菌丝球湿重计 )， 12h 光照 /12h 黑暗， 20℃培养 30 天后观察。
     石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 在 30 天后有新鲜菌 丝长出， 同时可以见到新形成的石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 菌丝与沙粒形 成的结皮， 厚约 2mm( 图 7， 图 8)
     二、 石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 的分离培养与 鉴定
     1、 地衣共生藻的分离培养
     利用孢子释放方法从 “一’ ’ 中的步骤 1 获得的石果衣标本中分离地衣共生藻， 具 体方法为 ： 将新鲜地衣标本的成熟子囊器， 用水浸湿后吸去表面多余水分， 用凡士林将子囊 器倒置在培养皿盖内侧， 培养皿下部为 1.5％ WA 培养基， 为获得单一孢子萌发形成的藻落， 每 12h 转动培养皿盖一次 ( 因共生菌与共生藻孢子同时喷射， 所以可以通过上述孢子释放 方法同时得到共生菌与共生藻 )， 当观察到有藻生长后， 转入 PDA 斜面培养基， 22℃， 12h 光 照 /12h 黑暗， 光照强度 2000lux 条件下培养地衣共生藻， 大量生长后转入 DBD 液体培养基， 150rpm 同样条件下振荡培养。
     以上操作均在无菌条件下进行， 通过上述方法获得一株地衣共生藻， 将其命名为 A07020。
     2、 地衣共生藻 A07020 的鉴定
     1)、 形态特征
     将地衣共生藻藻株 A07020 接种于 PDA 斜面培养基， 在 22℃， 12h 光照 12h 黑暗， 光 强 2000lux 条件下培养 10 天， 观察藻细胞形态。 观察结果为 ： 细胞椭圆形至钝圆柱形 ； 椭圆 形细胞大小为 3.8×4.8μm， 圆柱形细胞长 5.8-8.6μm， 宽 3.8-4.8μm ； 叶绿体片状、 侧生 ； 细胞外侧有水质胶壳包裹。
     2)、 nrDNA-ITS(ITS1-5.8S-ITS2) 序列的 PCR 扩增和序列测定
     A)DNA 提取
     分 别 取 10-20mg 石果衣标本 及其地衣 共生 藻 A07020 ； 液氮 研磨 ； 加入 300μl 2×CTAB， 轻轻混匀， 90℃水浴 2min ； 加入 300μl 酚∶氯仿∶异戊醇 (25 ∶ 24 ∶ 1)， 振荡混 匀， 12000r/min 离心 5min 去除蛋白质 ； 取上清加入等体积的 DNA 结合液 (4.0mol/L 异硫氰 酸胍， 0.5mol/L， pH5.0 乙酸钾， 终体积浓度为 30％异丙醇 ) 颠倒混匀， 随即移入吸附柱静置 2min， 12000r/mim 离心 15s， 弃残液 ； 加入 300μl 洗涤液 (10mmol/L， pH5.0 乙酸钾， 终体积 浓度为 80％乙醇 )， 12000r/min 离心 15s， 去残液， 重复一次 ； 12000r/min 离心干燥 1min ； 将 吸附柱移入新无菌离心管， 加入 30μlTE 洗脱液静置 5min， 12000r/min 离心 15s， 重复洗涤 一次， 去除吸附柱， 离心管内即为 DNA 模板。
     B)nrDNA-ITS(ITS1-5.8S-ITS2) 基因的 PCR 扩增及序列测序
     用 于 石 果 衣 标 本 及 其 地 衣 共 生 藻 A07020 PCR 扩 增 的 正 向 引 物 为 5’ -CTGCGGAAGGATCATTGATTC-3’ (18S nt1780-1800) ， 反 向 引 物 为 5’ -AGTTCAGCGGGTGGTCTTG-3’ (28S nt0012-0030)。PCR 扩 增 体 系 (50μl) ： 10×buffer5μl ； 25mmol/L MgCl2 3μl ； 2.5mmol/L dNTPs 4μl ； 10μmol/L 引 物 各 1μl ； ddH2O 34μl ； Taq DNA 酶 1μl ； 模 板 1μl。PCR 扩 增 条 件 为 95 ℃ 180s， 94 ℃ 30s， 52 ℃ 30s， 72℃ 90s， 37 个循环 ； 72℃ 600s， 4℃保存。
     PCR 扩增产物经北京标凯生物技术有限公司测序， 测序结果经 DNAman5.2.2 进行 双序列比对分析。
     测序结果表明， 石果衣及其共生藻 A07020 的 nrDNA-ITS(ITS1-5.8S-ITS2) 序列长 度均为 744bp， 其核苷酸序列完全相同 ( 如序列表序列 2 所示 )， 表明该石果衣共生藻由其 相应标本分离得到。 将石果衣共生藻 A07020 的 nrDNA-ITS(ITS1-5.8S-ITS2) 序列在 Genbank 中进行同源比对分析， 其序列与 Stichococcus diplosphaera Chodat ＝ Diplosphaera chodatii Bialosuknia 的 nrDNA-ITS(ITS1-5.8S-ITS2) 序列相似度为 100％。根据形态特 征以及 nrDNA-ITS(ITS1-5.8S-ITS2) 序列在 Genbank 中同源序列的比对结果， 将荒漠地衣共 生藻 A07020 鉴定为 Diplosphaera chodatii Bialosuknia。
     石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 已于 2010 年 5 月 31 日保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ( 简称 CGMCC， 地址为 ： 北京市朝阳区北辰西 路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究所 )， 保藏登记号为 CGMCC No.3892。 3、 石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 的生长特性
     挑取定量石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892， 转接 于 DBD 液体培养基中， 22℃， 150rpm 12h 光照 12h 黑暗， 光照强度为 2000lux 培养， 通过叶 绿素在 665nm 处的吸光值测定共生藻的生长量， 每 3 天测定一次， 每次 3 个重复， 以培养时 间为横坐标， 665nm 处吸光值为纵坐标绘制生长曲线 ( 图 9)， 培养 10 天后石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 达到对数生长期。
     4、 石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 的耐旱性验证
     1) 活化 ： 将对数生长期的石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 转接入液体 PDA 培养基中， 150rpm 黑暗培养 10 天。
     2) 干燥胁迫 ： 无菌条件下， 将 1) 得到的藻液转入不含培养基的培养皿 ( 直径 35mm) 中， 将培养皿放入含变色硅胶的干燥器中 ( 相对空气湿度≤ 10％， 环境温度为 20 ～ 27℃， 自然光照条件 )， 以造成干燥胁迫。
     每月将胁迫处理的石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 转接到固体 PDA 培养基中， 环境温度 20 ～ 27℃， 黑暗培养， 并观察共生藻的生长情况 ( 图 10)。
     对照： 初 始 未 胁 迫 石 果 衣 共 生 藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892( 图 10， a)。
     上述石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 在干燥胁迫 30 天后仍未死亡， 转接于 PDA 培养基培养后， 证明其仍有活性 ( 图 10， b)。
     5、 石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 的固沙实验
     活化 ： 将石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 接入土豆 浸汁 (PDA) 液体培养基中， 22℃、 12h 光照 /12h 黑暗 150rpm 培养 10 天。
     将活化后的石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892 藻悬 液在无菌条件下撒播于铺有无菌沙粒培养皿中 ( 沙粒厚约 5mm， 以无菌水刚刚润湿沙粒为
     准 )， 使该共生藻的撒播量为 0.42×106 个细胞 / 平方厘米， 光照条件下， 20℃培养， 60 天后 观察到该共生藻与沙粒形成的藻结皮， 绿色藻层厚约 2mm( 图 11， 图 12) 。11102318562 A CN 102318563
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