人类乳头瘤病毒空衣壳粒子的制备方法及其产品 技术领域 本发明涉及人类乳头瘤病毒空衣壳粒子的制备方法， 尤其涉及利用重组杆状病毒 在昆虫体内表达人乳头瘤病毒 (HPV)16 型和 18 型衣壳蛋白基因的方法以及由该方法制备 得到的产品， 属于人类乳头瘤病毒空衣壳粒子的制备领域。
背景技术 子宫颈癌是中国较常见的妇科恶性肿瘤， 是一类严重威胁妇女生命健康的疾病， 发病率仅次于乳腺癌， 而宫颈癌的病死率为妇女恶性肿瘤的首位。全世界每年大约有 50 万 宫颈癌新发病例， 其中约一半死亡。近年来， 宫颈癌有逐年上升的趋势， 特别在较年轻的城 市女性人群中。过去几十年的研究证明高危型 HPV 感染是宫颈癌发病重要病因， 在 80％～ 90％的宫颈癌组织中可检测到 HPV16 型和 ( 或 )HPV18 型的存在， HPV16 型和 HPV18 型被认 为是妇女宫颈癌的主要病原 ( 陈俊等， 医学综述， 2007， 7-0512-03)。
人类乳头瘤病毒 (human papillomavirus， HPV)( 子宫颈癌病毒 ) 属 DNA 病毒。 人体皮肤及黏膜的复层鳞状上皮 HPV 的惟一宿主， 尚未在体外培养成功。病毒颗粒直径为 50 ～ 55nm。需借助电子显微镜才能看到。HPV 的类型很多， 近年来分子生物学技术研究发 展迅速， 证实 HPV 有 60 种以上的抗原型， 即这一家族里有 60 多个相似而又不同的病毒 ( 亚 型 )， 其中 16、 18 型是国内外研究宫颈癌、 外阴癌甚至阴茎癌的最热门的病毒因子。HPV 感 染是一种常见的性传播疾病， 尽管大多数感染为良性， 但高危型 HPV 与肛门及生殖器区域 的癌前病变及恶性病变有关。对多数患者来说， 生殖道 HPV 存留可达 1 年， 直到出现另一新 型的 HPV 感染才自然消退。研究显示， HPV16 和 HPV18 会存留更长时间周期。持续 HPV 感 染是宫颈上皮癌变的重要危险因子。与宫颈癌及泌尿生殖道其他癌症的发生关系密切， 在 50％的宫颈癌和低分化宫颈上皮不良增生的患者和 25％的高分化宫颈上皮不良增生患者 中均可检测到 HPV16DNA 的存在。因此防止 HPV16 持续性感染的疫苗可从根本上减少宫颈 癌的发病率。但因 HPV 不能经细胞培养增殖， 故 HPV 基因工程疫苗的研制成为近年来研究 热点 ( 夏焕章等， 中国生物工程杂志， 2008， 28(9) ： 130-134)。
HPV 病毒衣壳粒子是主要衣壳蛋白基因 L1 和次要衣壳蛋白基因 L2 完全组装而 成的， 而主要衣壳蛋白基因 L1 单独也可自我组装成病毒样颗粒 (Viral like particles， VLPs)。L1 主要衣壳蛋白含量是 L2 蛋白的 3 ～ 5 倍， 含多个抗原表位， 其结构保守， 具有较 强的免疫原性， 只能产生特异性抗体而没有交叉反应， 此特性决定了它常常被作为预防性 疫苗的靶抗原。L2 蛋白虽然含量少但变异较多， 可以产生交叉反应， 且具有 B 细胞抗原表 位， 可以在皮肤粘膜表面产生中和抗体。L1 和 L2 的共表达有可能提高病毒衣壳粒子的装 配效率， 且 L2 蛋白可能存在中和性抗原表位和 CTL 表位 ( 王建伟等， 中国生物工程杂志， 2007， 27(4) ： 104-109)。因此， L1 和 L2 的共表达不仅可以提高衣壳粒子的产量， 而且可能 增加有效的抗原表位以便获得较强的局部黏膜免疫和系统的体液免疫和细胞免疫反应。 由 于 L1-L2 双基因共表达会受到如多启动子互相干扰等问题困扰， 一直没有成功进行表达。 所以目前， 临床应用的预防性子宫颈癌疫苗都是只针对 HPV16 和 HPV18 的 L1 基因研发而成
的 ( 郝飞等， 免疫学杂志， (2010)06-0546-05)。 发明内容 本发明所要解决的技术问题是克服现有的人类乳头瘤病毒空衣壳粒子制备方法 中所存在的生产成本过高、 能耗大及安全性差等缺陷， 提供一种新的人类乳头瘤病毒空衣 壳粒子制备方法， 该方法利用杆状病毒表达系统在昆虫体内安全、 高效的表达一种抗原或 由两种抗原组成的人类乳头瘤病毒空衣壳粒子， 具有安全、 高效、 能耗少、 成本低等诸多优 点。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的 ：
一种人类乳头瘤病毒空衣壳粒子的制备方法， 包括 ： (1) 将人类乳头瘤病毒空衣 壳粒子的主要衣壳蛋白基因或人类乳头瘤病毒空衣壳粒子的主要衣壳蛋白基因和次要衣 壳蛋白基因联合表达的组合转移到杆状病毒的基因组上， 构建得到重组杆状病毒 ； (2) 用 所构建的重组杆状病毒感染昆虫宿主或昆虫细胞 ； (3) 培养被感染的昆虫宿主或昆虫细 胞； (4) 收获并纯化所表达的抗原， 即得。
其中， 所述的人类乳头瘤病毒空衣壳粒子的主要衣壳蛋白基因优选为人乳头瘤病 毒 16 型的主要衣壳蛋白基因 L1 或人乳头瘤病毒 18 型的主要衣壳蛋白基因 L1 ； 其中， 所述 人乳头瘤病毒 16 型的主要衣壳蛋白基因 L1 的核苷酸序列为 SEQ ID NO ： 1 所示， 其氨基酸 序列为 SEQ ID NO ： 2 所示 ； 所述人乳头瘤病毒 18 型的主要衣壳蛋白基因 L1 的核苷酸序列 为 SEQ ID NO ： 5 所示， 其氨基酸序列为 SEQ ID NO ： 6 所示。
所述的人类乳头瘤病毒空衣壳粒子的主要衣壳蛋白基因和次要衣壳蛋白基因联 合表达的组合可以是由人乳头瘤病毒 16 型的主要衣壳蛋白基因 L1 和人乳头瘤病毒 16 型 的次要衣壳蛋白基因 L2( 核苷酸序列为 SEQ ID NO ： 3 所示， 其氨基酸序列为 SEQID NO ： 4所 示 ) 所组成的联合表达的组合 ； 优选的， 本发明通过 SEQ ID NO ： 13 所示的 IRES 核苷酸序列 ( 内部核糖体进入位点， Chain A， Structure OfRibosome-Bound Cricket Paralysis Virus Ires Rna.) 将人乳头瘤病毒 16 型的主要衣壳蛋白基因 L1 和次要衣壳蛋白基因 L2 连接得 到核苷酸序列为 SEQ ID NO ： 9 所示 ( 其氨基酸序列为 SEQID NO ： 10 所示 ) 的联合表达的组 合。
所述的人类乳头瘤病毒空衣壳粒子的主要衣壳蛋白基因和次要衣壳蛋白基因联 合表达的组合还可以是由人乳头瘤病毒 18 型的主要衣壳蛋白基因 L1 和人乳头瘤病毒 18 型的次要衣壳蛋白基因 L2( 核苷酸序列为 SEQ ID NO ： 7， 氨基酸序列为 SEQ IDNO ： 8) 所组 成的联合表达的组合 ； 优选的， 本发明通过 SEQ ID NO ： 13 所示的 IRES 核苷酸序列将人乳头 瘤病毒 18 型的主要衣壳蛋白基因 L1 和人乳头瘤病毒 18 型的次要衣壳蛋白基因 L2 连接得 到核苷酸序列为 SEQ ID NO ： 11 所示 ( 其氨基酸序列为 SEQID NO ： 112 所示 ) 的联合表达的 组合。
优选的， 步骤 (1) 中所述的重组杆状病毒按照以下方法构建得到 ：
(a) 将人类乳头瘤病毒空衣壳粒子的主要衣壳蛋白基因或人类乳头瘤病毒空衣 壳粒子的主要衣壳蛋白基因和次要衣壳蛋白基因联合表达的组合克隆到杆状病毒运载 载体中， 构建得到转移表达载体 ； (b) 将所构建的转移表达载体与杆状病毒 DNA 进行共转 染 ( 以发生同源重组或转座 )， 构建得到重组杆状病毒 ； 其中， 所述的杆状病毒运载载体
的表达盒优选为由多角体蛋白启动子、 p10 启动子或 ie-1 启动子与增强子所组合成的 表达盒， 例如， 所述的杆状病毒运载载体可选自 pBM034， pBM93， AcRP23-lacZ， AcRP6-SC， AcUW1-lacZ， BacPAK6， Bac to Pac， Bacmid， BlucBacII(pETL)， p2Bac， p2Blue， p89B310， pAc360， pAc373， pAcAB3， pAcAB 4， PAcAS3， pAcC 129， pAcC4， DZI， pAcGP67， pAcIE1， pAcJP1， pAcMLF2， pAcMLF7， pAcMLF8， pAcMP1， pAcMP2， pAcRP23， pAcRP25， pAcRW4， pAcsMAG， pAcUW1， pAcUW21， pAcUW2A， pAcUW2B， pAcUW3， pAcUW31， pAcUW41， pAcUW42， pAcUW43， pAcUW51， pAcVC2， pAcVC3， pAcYM1， pAcJcC5， pBac1， pBac2， pBlueBacIII， pBlueBacHis， pEV55， mXIV， pIEINeo， pJVETL， pJVNhel， pJVP10， pJVrsMAG， pMBac， pP10， pPAKl， pPBac， pSHONEX 1.1， pSYN XIV VI+， pSYNVI+wp， pSYNXIV VI-， pVL1391， pVL 1392， pVL 1393， pVL941， pVL 945， pVL 985， pVTBac， pBM030， pUAC-5 或其它类似的杆状病毒同源重组或转座载体中的任意一 种， 更优选为 pVL1393 状病毒运载载体。
所述的杆状病毒优选自 BmNPV、 AcMNPV、 ApNPV、 、 HaNPV、 HzNPV、 LdMNPV、 MbMNPV、 OpMNPV、 SlMNPV、 SeMNPV 或 SpltNPV 中 的 任 意 一 种 ； 更优选为家蚕杆状病毒亲本株 Bm-NPV-ZJ8。
步 骤 (2) 中 所 述 的 昆 虫 宿 主 优 选 为 家 蚕 (Bombyx mori)、 野 蚕 (Bombyx mandarina)、 蓖 麻 蚕 (Philosamia cynthia ricim)、 樟 蚕 (Dictyoplocajapanica)、 樗 蚕 (Philosamia cynthia pryeri)、 柞 蚕 (Antheraea pernyi)、 日 本 柞 蚕 (Antheraea yamamai)、 野 天 蚕 (Antheraea polyphymus)、 苜 蓿 尺 蠖 (Atographa califorica)、 茶 尺 蠖 (Ectropis obliqua)、 甘 兰 夜 蛾 (Mamestra brassicae)、 斜 纹 夜 蛾 (Spodoptera littoralis)、 秋粘虫 (Spodoptera frugiperda)、 粉纹夜蛾 (Trichoplusia ni)、 行军虫 (Thaumetopoea wilkinsoni)、 棉 铃 虫 (Heliothis armigera)、 美 国 棉 铃 虫 (Heliothis zea)、 烟 青 虫 (Heliothis assulta)、 烟 草 夜 蛾 (Heliothis virescens)、 东方粘虫 (Pseudaletia separata) 或舞毒蛾 (Lymantria dispar) 中的任意一种 ； 更优选为家蚕 (Bombyx mori)。
步骤 (2) 中所述的感染是指重组杆状病毒通过吞食或透过表皮来感染 1-5 龄的昆 虫幼虫或蛹体 ； 较佳的， 将重组家蚕杆状病毒感染家蚕细胞或穿刺接种 1-5 龄的家蚕幼虫 或蛹， 在感染 3-6 天后收集含人乳头瘤病毒抗原的家蚕幼虫或蛹的体液或组织匀浆 ； 其中， 所述的蛹体最优选为 1-2 天的早期嫩蛹。
本发明的一个特别优选的整体技术方案如下 ： 将人乳头瘤病毒 16 型主要衣壳 蛋白基因 L1(SEQ ID NO ： 1)、 人乳头瘤病毒 18 型主要衣壳蛋白基因 L1(SEQ IDNO ： 5)、 人乳头瘤病毒 16 型主要衣壳蛋白基因 L1 和次要衣壳蛋白基因 L2 的联合表达组合 ( 即 HPV16L1-IRES-HPV16L2 组合基因， SEQ ID NO ： 9) 或人乳头瘤病毒 18 型主要衣壳蛋白基 因 L1 和次要衣壳蛋白基因 L2 的联合表达组合 ( 即 HPV18L1-IRES-HPV18L2 组合基因， SEQ ID NO ： 11) 克隆到运载载体 pVL1393 上， 再通过体内重组将全长人乳头瘤病毒 HPV16L1、 HPV18L1、 HPV16L1-IRES-HPV16L2、 HPV18L1-IRES-HPV18L2 基因分别转移到家蚕杆状病毒亲 本株 Bm-NPV-ZJ8 的基因组上， 替代基因组上的 Polyhedrin 基因， 通过空斑筛选技术和 PCR 检测技术， 获得携带人乳头瘤病毒不同基因组合的重组家蚕杆状病毒 rBmNPV(HPV16L1)、 rBmNPV(HPV18L1)、 rBmNPV(HPV16L1-IRES-HPV16L2)、 rBmNPV(HPV18L1-IRES-HPV18L2)。
本发明将所构建的两株重组家蚕杆状病毒 rBmNPV(HPV16L1-IRES-HPV16L2) 以及rBmNPV(HPV18L1-IRES-HPV18L2) 分别提交到专利认可的机构进行保藏 ； 其中， 重组家蚕杆 状病毒 rBmNPV(HPV16L1-IRES-HPV16L2) 的微生物保藏号是 ： CGMCC No.5126 ； 分类命名是 ： nucleopolyhedrovirus Bombyx Mori Nucleopolyhedrovirus(Bm NPV) ； 保藏时间是 ： 2011 年 8 月 15 日 ； 保藏单位是 ： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ； 保藏地址是 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究所。
重组家蚕杆状病毒 rBmNPV(HPV18L1-IRES-HPV18L2) 的微生物保藏号是 ： CGMCC No.5127 ； 分类命名是 ： nucleopolyhedrovirus Bombyx Mori Nucleopolyhedrovirus(Bm NPV) ； 保藏时间是 ： 2011 年 8 月 15 日 ； 保藏单位是 ： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心 ； 保藏地址是 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究所。
本发明进一步将所构建的重组家蚕杆状病毒感染家蚕细胞系或穿刺 接 种 1-5 龄 的 家 蚕 幼 虫 或 蛹，大 量 繁 殖 rBmNPV(HPV16L1)、 rBmNPV(HPV18L1)、 rBmNPV(HPV16L1-IRES-HPV16L2)、 rBmNPV(HPV18L1-IRES-HPV18L2) ； 当 rBmNPV(HPV16L1)、 rBmNPV(HPV18L1)、 rBmNPV(HPV16L1-IRES-HPV16L2)、 rBmNPV(HPV18L1-IRES-HPV18L2) 在蚕 体内复制时， HPV16L1、 HPV18L1、 HPV16L1-IRES-HPV16L2 或 HPV18L1-IRES-HPV18L2 基因在 多角体蛋白基因 (polh) 启动子控制下表达， 并自我组装成为人类乳头瘤病毒 ( 子宫颈癌病 毒 ) 空衣壳粒子 ； 在感染 3-6 天 ( 最佳为 5 天， 25℃饲养温度 ) 后收集含子宫颈癌病毒空衣 壳粒子的家蚕幼虫或蛹的体液 ( 或整体匀浆 )， 经过纯化后便得到安全、 高效的子宫颈癌病 毒空衣壳粒子， 可用于制备预防子宫颈癌的注射用疫苗 ； 或者将其经过简单纯化， 经脂肪酸 乳化后也可制备成预防子宫颈癌的口服型疫苗。 本发明采用基因重组技术将来源于人乳头瘤病毒的不同基因组合， 包括人乳头瘤 病毒 16 型主要衣壳蛋白 L1、 人乳头瘤病毒 18 型主要衣壳蛋白 L1、 人乳头瘤病毒 16 型主要 衣壳蛋白基因 L1 和次要衣壳蛋白基因 L2 的基因联合表达组合 (HPV16L1-IRES-HPV16L2) 或人乳头瘤病毒 18 型主要衣壳蛋白基因 L1 和次要衣壳蛋白基因 L2 的基因联合表达组合 (HPV18L1-IRES-HPV18L2) 构建到由启动子为多角体蛋白， p10， ie-1 等及与增强子组合所 驱动的杆状病毒表达所用表达盒的杆状病毒表达转移运载载体上， 在多角体启动子、 p10 启 动子或别的病毒和真核生物的强启动子控制之下， 通过体内或体外 (in vivo/in vitro) 重 组， 使 HPV16L1、 HPV18L1、 HPV16L1-IRES-HPV16L2、 HPV18L1-IRES-HPV18L2 整合到杆状病毒 的基因组上， 得到重组杆状病毒 ； 重组杆状病毒可通过经口食下或采用各种手段透过表皮 感染 1-5 龄 ( 最优时间为四或五龄 ) 的昆虫幼虫或蛹体 ( 最优时间为 1-2 天的早期嫩蛹 )， 表达生产各种子宫颈癌病毒空衣壳粒子。
同时为探究不同的 HPV16L1 基因的结构和表达量的关系， 本发明将 HPV16L1 基因 (SEQ ID NO ： 1) 的 N 端的 26 个氨基酸 (MQVTFIYILVITCYENDVNVYHIFFQ) 删去或将 HPV16L1 基因的 C 端的 34 个氨基酸 (AGLKAKPKFTLGKRKATPTTSSTSTTAKRKKRKL) 删去构建不同长度的 表达载体 HPV16L1N 或 HPV16L1C， 并进行重组或表达， 发现 HPV16L1 的蛋白表达量和空衣壳 病毒粒子的组装效率并没有很大的改善。
本发明方法采用杆状病毒表达系统在家蚕生物反应器中安全、 高效生产的人乳头 瘤病毒衣壳蛋白粒子， 其生产成本仅为现有的制备子宫颈癌病毒空衣壳粒子方法 ( 例如通 过昆虫细胞表达抗原蛋白的方法 ) 成本的几十分之一， 甚至百分之一。本发明方法建厂， 三 废， 电力和水资源等能源消耗极少。此外， 家蚕为食药兼用昆虫， 本发明方法所制备的抗原
具有极高的安全性。总之， 本发明方法可以大幅度降低子宫颈癌病毒空衣壳粒子的生产成 本， 具有安全、 高效、 能耗少、 成本低等诸多优点。 附图说明
图 1HPV16L1-HPV16L2 病毒样颗粒的电镜观察。
图 2HPV16L1-HPV16L2 病毒样颗粒的免疫电镜观察， 样品 40 倍稀释， 所用的一抗为 HPV16L1。
图 3HPV16L1-HPV16L2 病毒样颗粒的免疫电镜观察， 样品 40 倍稀释， 所用的一抗为 HPV16L2。 具体实施方式
以下通过实施例来进一步描述本发明的制备方法及有益效果， 应该理解的是， 这 些实施例仅用于例证的目的， 决不限制本发明的保护范围。
试验材料
1. 大肠杆菌株 E.coli DH5α 购自 Promega 公司 ； 克隆载体 pEASY-T3 购自全式金公 司； 克隆载体 Pmd18-T 购自 TAKARA 公司 ； 运载载体 pVL1393 购自于 Invitrogen 公司、 家蚕 细胞 BmN 由中国农业科学院生物技术研究所保存 ； 人乳头瘤病毒抗体购自 santa 公司 ； 家 蚕核型多角体病毒亲本株 Bm-NPV-ZJ8 和高表达家蚕品种 JY1 由中国农业科学院生物技术 研究所保存 ( 同时也可向中国科学院武汉病毒研究所或中国农业科学院蚕业研究所购买 获得 )。
2. 酶与试剂 ： 限制性内切酶、 PNK 酶、 连接酶为 Promega 公司产品。
3. 生化试剂 ： IPTG、 X-Gal 为 Promega 公司产品。基因组 DNA 提取试剂为 TaKaRa 公司产品。Lipofectin、 低融点琼脂糖 LMP、 PCR 试剂盒、 T4DNA 连接酶、 RNA 酶、 Proteinase K、 胎牛血清及其他试剂购于 Invitrogen 公司， 细胞培养基 TC-100 购于 Sigma 公司。
4. 培 养 基 ： 大 肠 杆 菌 培 养 基 为 LB(1 ％ 蛋 白 胨、 0.5 ％ 酵 母 提 取 物、 1 ％ NaCl， pH7.0) ； 家蚕细胞培养基为 TC-100。
实施例一人乳头瘤病毒 (HPV)16 型主要衣壳蛋白基因 L1 在家蚕生物反应器中的 表达及免疫实验
1 实验方法
1.1. 有关溶液和培养基的配置
溶液 I ： 50mmol/L 葡萄糖， 25mmol/L Tris-HCl(pH8.0)， 10mmol/L EDTA。
溶液 II ： 0.2mol/L NaOH， 1％ SDS( 现配现用 )。
溶液 III ： 100mL 体系， 5mol/L 醋酸钾 80mL， 冰乙酸 12mL， ddH2O8mL。
TAE(50×) ： 242gTris 碱， 57.1mL 冰乙酸， 100mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0)， 无菌水 定容至 1000mL。
TER 溶液 ： 胰 RNAse(RNAse A) 溶解于 10mM Tris-HCl、 15mMNaCl 中， 配成 10mg/mL 的储存液 -20℃冻存， 再用 1×TE buf 稀释成 20μg/mL 的工作液 4℃保存。
PPt Buffer ： 异丙醇 22mL ； 5mol/mL KAc 1mL ； ddH202mL。
PEG 溶液 ： 称取一定质量的 NaCl， 配成 1.6M 的盐溶液， 加入一定量的 PEG， 使其终浓度为 13％。
6mol/L NaI ： 将 0.75g Na2SO3 溶于 40mL ddH2O 中， 加入 45gNaI 并搅拌至完全溶解， 4℃储存。
玻璃奶 (Glassmilk) ： 将 10g(100mg/mL， Sigma S-5631) 的 Silica 溶于 100mL PBS 中， 沉淀 2h， 弃上清， 重复该步骤 2 ～ 3 次 ； 2000g 离心 2min， 将沉淀物溶于 3mol/L 的 NaI 中， 终浓度为 100mg/mL， 4℃下避光保存。
New Wash 洗液 ： Tris-HCl(pH 7.4)20mmol/L ； EDTA 1mmol/L ； NaCl 100mmol/L ； 与 等体积的无水乙醇配制而成。
LB 培养基 ： 胰蛋白胨 10g/L， 酵母粉 5g/L， 氯化钠 10g/L， 调整 pH 值到 7.0( 固体培 养基含 1.5％琼脂 )。
蛋 白 上 样 缓 冲 液 (2×) ： 100mmol/L Tris-HCl(pH6.8)、 200mmol/L 二 硫 苏 糖 醇 (DTT)、 4％ SDS、 0.2％溴酚蓝、 10％甘油。
30％丙烯酰胺溶液 29g ： 丙烯酰胺， 1gN， N′ - 亚甲叉丙烯酰胺， 溶于 100mL 水， 过 滤。
考马斯亮蓝染液 ： 0.24g 考马斯亮蓝 R250 溶于 90mL 甲醇∶水 (1 ∶ 1， v/v) 和 10mL 冰乙酸中。
脱色液 ： 10％冰乙酸。
1.2. 人乳头瘤病毒 (HPV)16 型主要衣壳蛋白基因 L1 的获得
1.2.1DNAiso(TaKaRa 公司 ) 试剂法提取基因组 DNA
(1) 将子宫颈癌患病组织放入盛有 DNAiso(25 ～ 50mg 组织 /1mL) 的玻璃匀浆器中 匀浆， 直至没有明显块状组织沉淀。
(2) 将匀浆液在室温下放置， 以使核蛋白质复合体完全裂解。
(3) 将裂解液移至离心管中， 4℃， 10000g 离心 10 分钟。
(4) 将上清移至新的离心管， 加入 DNAiso1/2 体积量的无水乙醇。反复颠倒混匀 1 ～ 3 分钟。
(5) 管中出现的云雾状 DNA 沉淀， 将上清液轻轻倒出。
(6) 用 1mL75％乙醇沿管壁缓慢加入， 轻轻上下颠倒洗涤 ； 然后 4℃， 12000g 离心 5 分钟。
(7) 弃上清， 干燥 ； 沉淀重溶于 30μL DEPC 处理的双蒸水 (ddH2O)。
1.2.2 目的基因的引物设计与合成
设计引物， 通过 PCR 的方法扩增出人乳头瘤病毒 16 型主要衣壳蛋白 L1 基因 (SEQ
ID NO ： 1)。所设计的人乳头瘤病毒 16 型主要衣壳蛋白 L1 基因的扩增引物为 ：
HPV16L1 上游 ：
5′ -CGAGATCTAACATGCAGGTGACTTTTATTTACATCC-3′
BglII
HPV16L1 下游 ：
5′ -CGTCTAGATTACAGCTTACGTTTTTTGCGTTTAGC-3′
XbaI
1.2.3HPV16L1 基因扩增的 PCR 反应 ：50μL 反应体系 PCR 反应程序
10×PCR buffer ： 5μL 95℃预变性 5min
dNTP(10mM) ： 1μL 94℃ 1min
模板 DNA ： 1μL 60℃ 40sec
primer1(20pmol/μL) ： 1μL 72℃ 2min
Primer2(20pmol/μL) ： 1μL 以上三步为一个循环， 循环 30 次
Taq 酶 ： 1μL 72℃延伸 10min
ddH2O ： 40μL
PCR 扩增结束后， 取 5.0μL 反应产物用 1.0％的 TAE 琼脂糖凝胶中电泳， 凝胶中含 有 0.5μg/mL 的溴化乙锭， 电泳缓冲液为 1×TAE， 80 ～ 100V， 大约 10 ～ 20min 于紫外凝胶 成像系统观察片段大小， 与标准的 DNA Marker 比较， 进行分析。
1.3 玻璃奶纯化回收 DNA 片段
1.4PCR 产物与克隆载体 pEASY-T3 的连接
连接体系如下 ：
pEASY-T3 1μL
目的 DNA 2μL
ddH2O 2μL
混匀后， 25℃连接 15min， 连接产物用于转化 DH5α 感受态细胞。
1.5 连接产物的转化
1.51 感受态细胞的小量制备
(1)-20℃冻藏的 DH5α 甘油菌在 LB 平板上复苏 ；
(2) 用灭菌牙签挑取单菌落， 放入 4mL LB 培养基中， 37℃振荡培养过夜， 取 100μL 过夜培养物接种到另一 4mL LB 培养基中， 37℃振荡培养 2 ～ 2.5h， 使 OD 值在 0.6 左右 ；
(3)5,000g 离心 4min 收集菌体， 将菌体重悬于 800μL75mmol/L 冷 CaCl2 中， 冰浴 30min， ；
(4)5,000g 离心 4min， 弃上清， 加入 200μL75mmol/L 冷 CaCl2， 轻轻敲打管壁， 使混 合均匀， 冰上放 2h 后用于转化。
1.52 感受态细胞的大量制备
(1)-70℃冻藏的 DH5α 甘油菌在 LB 平板上复苏 ；
(2) 挑取单菌落 ( 直径约 2 ～ 3mm)， 放入 4mL LB 培养基中 ( 不含 Amp)， 另外挑一 个放入加有 Amp 抗生素的 LB 培养基中， 37℃振荡培养 8h ； 在前者生长后者不生张说明没有 污染。前者取 1mL 接种 100mL 新鲜的 LB 液体培养基， 37℃振荡培养 2 ～ 3h ；
(3) 培养物收集在灭菌的离心管中， 5,000r/min 4 ℃离心 5min， 将菌体重悬于 20 ～ 30mL 75mmol/L 的预冷 CaCl2 溶液中， 冰浴 30min ；
(4)5,000r/min 低 温 离 心 5min， 弃 上 清， 加 入 10mL 含 10 ％ 甘 油 的 75mmol/L 冷 CaCl2 溶液， 轻轻敲打管壁， 使混合均匀， 冰上放 3 ～ 4h 后分装小管， -70℃冻存。
1.53 连接产物的转化
(1) 质粒 DNA20 ～ 100ng 或连接混合物 5μL 加到 100μL 上述制备的感受态细胞 中， 轻轻混匀， 冰浴 30min ；(2) 进行热休克 (42℃保温 90sec)， 迅速置冰上 1 ～ 2min， 加入 1mL 已温育至 37℃ 的 LB 培养基， 37℃振荡培养 1h，
(3) 稍离心， 去部分上清后重悬沉淀， 涂布于数个含相应抗生素的 LB 平板上。 37℃ 倒置培养过夜。
1.6 重组质粒的鉴定
1.61 细胞破碎法快速鉴定
重组后的质粒与原来的质粒分子量有一定差别时可用此法检出重组子 (Beuken， et al.， 998)。
(1) 分别挑取多个单菌落转化子接种于 4mL 含 80μg/mLAmp 抗生素的 LB 培养基 中， 37℃振荡培养过夜 ；
(2) 取 300 ～ 500μL 菌液于离心管中， 12,000g 离心 10sec， 弃上清， 加入 30μL 缓 冲液 (6％蔗糖， 0.1％溴酚蓝 )， 再加入 20μL 酚 / 氯仿 (1 ∶ 1)， 充分振荡将菌体弹起 ；
(3)12,000g 离心 5min， 取上清上样电泳， 观察结果。
1.62 重组质粒的进一步酶切鉴定
(1) 质粒 DNA 的提取
加入物 体积 ( 共 30ul)
质粒 5ul BglII 1ul XbaI 1ul Buffer D 3ul 补水 20ul(2) 重组质粒的酶切鉴定 鉴定体系如下 ：37℃酶切 1 ～ 2h， 加 Marker 作为参考标准， 用琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。
1.63 重组质粒的测序鉴定以及分析
将鉴定为阳性克隆 ( 全长基因分别命名为 pT3-HPV16L1) 的菌种重新加入含有 Amp 抗生素的 LB 培养液， 220r/min 摇培过夜后后， 吸取 1mL 新鲜菌液至无菌的离心管中， 加入少 量甘油， 以封口膜封好后进行测序。测序结果为 SEQ ID NO ： 1， 用 DNAStar、 DNAMAN 软件对 序列进行分析， 得氨基酸序列为 SEQ ID NO ： 2。
1.7 重组杆状病毒转移载体 pVL1393-HPV16L1 的构建
1.7.1HPV16L1 基因片段的双酶切 (BglII-XbaI)
(1) 质粒 pT3-HPV16L1 的提取， 具体方法同前。
(2) 双酶切 (BglII-XbaI) 体系
加入物 体积 (50ul) 质粒 10ul BglII 1ul XbaI 1ul bufferD 5ul BSA(100x) 0.5ul 补水 32.5ul
37℃温育 2 小时。 (3) 酶切产物大小的鉴定与回收 将 酶 切 产 物 进 行 1 ％ 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳， 在 DNAmaker 的 参 照 下， 将符合大小的HPV16L1 基因片段切胶回收 (1600bp)。在紫外灯下用灭菌手术刀切取含相应 DNA 片段的凝 胶， 然后用 Geneclean 试剂盒进行纯化。方法如下 ： 切取凝胶片段并称重， 将其放入灭菌的 1.5ml 小离心管中， 加入 3 倍 (v/w) 体积的 6M NaI， 37℃将凝胶溶解后， 加入 10μl 玻璃奶 (Glass milk)， 混匀后室温下放置 5 分钟， 使 DNA 充分吸附在玻璃奶上， 12000rpm 离心 5 秒 钟， 再用 New Wash 溶液洗三次， 每次均将沉淀弹起， 并离心。最后将沉淀晾干后加入 30μl 0.1×TE Buffer 溶解 DNA， 离心后去沉淀， 取上清作进行下一步实验。
1.72 转移载体 pVL1393 的双酶切 (BamHI-XbaI)
(1)pVL1393 质粒提取， 具体方法同前。
(2) 双酶切 (BamHI-XbaI) 体系
加入物 体积 (50ul)
质粒 5ul BamHI 1ul XbaI 1ul bufferE 5ul BSA(100x) 0.5ul 补水 37.5ul37℃温育 2 小时， 65℃灭活 15 分钟。
(3) 酶切载体大小的鉴定与回收
将部分酶切产物进行 1％琼脂糖凝胶电泳， 在未进行酶切的质粒参照下， 将符合大 小、 酶切完全的线性载体片段作为下一步实验用品。
1.73 酶切回收的 HPV16L1 基因片段与酶切后的转移载体 pVL1393 的连接。
用 T4DNA 连接酶进行 DNA 连接。连接体系如下 ：
加入物 10ul HPV16L1 3ul pVL1393 1ul T4DNA 连接酶 1ul buffer 1ul 补水 4ul16℃过夜连接。
1.74 重组质粒的转化与鉴定。
将上述连接产物转化大肠埃希氏菌 DH5α 感受态细胞， 在含氨苄青霉素抗性的琼脂 平板上筛选， 挑选克隆培养后， 提取质粒。重组质粒经过 EcoRI 单酶切和菌液 PCR 鉴定， 并 送至三博生物测序， 得序列 SEQ ID NO ： 1， 软件转化氨基酸序列为 SEQ IDNO ： 2。 将鉴定正确 的重组质粒命名为 pVL1393-HPV16L1。
酶切体系如下 ：
加入物 体积 (30ul)
质粒 5ul EcoRI 1ul bufferH 1ul BSA(100x) 0.3ul 补水 22.7ul1.8HPV-16L1 蛋白的多抗制备与抗体效价测定将 HPV16L1 部分基因片段克隆到 pET 系列大肠杆菌表达载体中， 用镍柱层析法纯 化变性的表达蛋白， 经质谱分析确认表达的蛋白质序列正确后， 免疫兔子。一共免疫四次， 每次免疫时间为十天。待四免结束后， 取血清， 即获得目的蛋白的多克隆抗体。用大肠杆菌表达蛋白包被酶标板条， 以 100× 两倍倍比稀释抗体到 51200 倍进行检测。结果表明找到 400 倍为一个较为合适的稀释度， 可用以下一步检测家蚕中 HPV16L1 的表达。
1.9 重组家蚕杆状病毒 rBmNPV(HPV16L1) 的构建和获得
接种大约 1×106 细胞于 15cm2 培养瓶中， 细胞贴壁后， 除去含胎牛血清 (FBS) 培养 基， 用不含 FBS 的培养基洗三次， 加 1.5ml 无 FBS 培养基。向一灭菌管中依次加入 1μg 家 蚕杆状病毒亲本株 Bm-NPV-ZJ8DNA， 2μg 重组转移质粒 pVL1393(HPV16L1)DNA 和 5μl 脂质 体， 用无菌双蒸水补足体积到 60μl， 轻轻混匀， 静置 15min 后， 逐滴加入到培养瓶中进行共 转染。27℃培养 4 小时后补加 1.5ml 无血清培养基和 300ul FBS。27℃恒温培养 4 ～ 5 天， 收集上清液用于重组病毒的筛选。 1.10 重组家蚕杆状病毒 rBmNPV(HPV16L1) 的筛选和纯化
接种适量细胞 ( 约 70 ～ 80％ ) 于 35mm 小平皿中， 细胞贴壁后， 吸去培养基， 将共 转染上清进行不同浓度稀释， 取 1ml 共转染液加到贴壁细胞中， 分布均匀。27℃感染 1 小 时后， 吸去感染液， 将 2％低融点琼脂糖凝胶于 60℃水浴中融化， 冷至 40℃与 40℃预热的 2×TC-100 培养基 ( 含 20％ FBS) 混合均匀， 每平皿加 4ml 胶， 待凝固后用 Parafilm 封口， 27℃倒置培养 3 ～ 5 天， 显微镜观察。将不含有多角体的空斑挑选出来， 重复以上步骤， 经 过 2 ～ 3 轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒 rBmNPV(HPV16L1)。
1.11 重组家蚕杆状病毒 rBmNPV(HPV16L1) 在家蚕细胞中的扩增
将重组家蚕杆状病毒 rBmNPV(HPV16L1) 感染正常生长的 BmN 细胞， 培养 3 天后收 集上清液， 上清液中即含有大量的重组病毒 rBmNPV(HPV16L1)。
1.12 重组家蚕杆状病毒 rBmNPV(HPV16L1) 的鉴定
利用 PCR 方法分析外源基因整合。游离病毒基因组 DNA 的提取方法如下 ： 取病毒 上清 150μl， 加入 150μl(0.5mol/L) 的 NaOH 后混匀， 再加入 20μl(8mol/L) 的醋酸铵， 混 匀后用等体积的酚和氯仿分别抽提一次， 酒精沉淀后用 20μl 的 TE 溶解 DNA。寡核苷酸引 物为 ：
HPV16L1 上游 ：
5′ -CGAGATCTAACATGCAGGTGACTTTTATTTACATCC-3′
BglII
HPV16L1 下游 ：
5′ -CGTCTAGATTACAGCTTACGTTTTTTGCGTTTAGC-3′
XbaI
取 上 述 病 毒 基 因 组 DNA 1ul 进 行 PCR 扩 增， 反应条件为： 95 ℃ 变 性 5min、 94℃ 1min、 60℃ 40sec、 72℃ 2min， 30 个循环， 最后 72℃延伸 10min。取 15ul 反应产物电泳 分析， 结果证明获得了重组病毒。
1.13HPV16L1 基因在家蚕蛹和蚕体中高效表达
本实验所用的家蚕蛹为高表达品种为 JY1( 由本发明人实验室保存 )。JY1 品种家 蚕饲养按吕鸿声主编的 《中国养蚕学》 ( 上海科学技术出版社， 1991) 的常规方法进行。结 茧七天后选择平均体重相同的 15 粒蚕蛹， 每头蚕蛹和蚕接种约 1.0×105rBmNPV(HPV16L1)， 4-5 天后收集发病蚕蛹和取蚕血， -20℃冻存以进行 ELISA 检测。从 OD 值测定实验结果来 看， 表明获得了高表达， 而对照 Bm-NPV-ZJ8 感染的蚕血淋巴中未检测到抗原表达。
1.14HPV16L1 基因在家蚕中的表达检测以及 ELISA 和 Western 结果将重组病毒培养液按 105pfu/ 头注射五龄幼蚕， 待家蚕发病后， 剪掉足， 收集蚕 血， -20℃冻存， 用 ELISA 法检测 HPV16L1 抗原基因在蚕体中的表达情况。
注射病毒后的家蚕， 待发病时收集蚕血。 ELISA 方法检测 HPV16L1 抗原蛋白表达量 的高低， 包被液作为空白对照， 以正常蚕血作为阴性对照， 原核表达的 HPV16L1 蛋白免疫新 西兰大白兔之后的兔血清为第一抗体， HRP 标记的羊抗兔抗体为第二抗体。通过 ELISA 检 测家蚕中 HPV16L1 的表达。从 100× 两倍倍比稀释到 6400 倍。检测结果表明 HPV16L1 基 因在家蚕中得到了高量的表达， 在 1600 倍稀释甚至更高稀释度下仍能检测到抗原与抗体 的特异性反应 ( 表 1)。
表1
稀释倍数 HPV16L1 阴性对照 100 1.012 0.392 200 0.827 0.323 400 0.670 0.295 800 0.466 0.230 1600 0.294 0.178 3200 0.196 0.159 6400 0.183 0.142 空白 0.127 0.111Western 检测表明在重组病毒感染后家蚕的血淋巴样品的上清液中可检测到 58kD 左右大小的特异性条带， 表明存在表达。
1.15HPV16L1 病毒样颗粒的收集与纯化和电镜观察
将含表达有 HPV16L1 的蚕蛹用预冷的 PBS( 料液比为 1 ∶ 9) 在匀浆器中研磨， 再经 5 超声波破碎后， 用 0.45um 滤器过滤。 在 30％蔗糖溶液中， 1.5X10 g 超高速离心 3 小时。 用含 0.1M Nacl 的 Tris-HCL(pH7.0) 的溶液把沉淀复溶到原体积， 过阳离子交换层析填料 SP(GE 公司 )， 0.5M Nacl 的 Tris-HCL(pH7.0) 洗脱。再通过凝胶过滤层析层析 Sepharose6Fast Flow(GE 公司 )。经高效液相层析色谱检测纯度可达 95％以上， 得率可达 50.8％ ( 表 2)。 同时也建立了相应的家蚕表达基因工程子宫颈癌病毒空衣壳粒子的纯化方法， 并得出每克 蚕蛹表达的病毒粒子为 2-3mg。经过电镜观察表明 HPV16L1 在家蚕中可自主形成病毒样颗 粒。
表2
纯化步骤 得率 纯度
蚕蛹浆 100％ 0.21％ 超速离心 75.4％ 80.5％ SP 59.6％ 92.3％ S epharo se6FF 50.8％ 97.1％1.16HPV16L1 病毒样颗粒的动物免疫实验。
将收集的纯化抗原 HPV16L1 病毒样颗粒经肌肉注射和口服途径各免疫 10 只小白 鼠为试验组， 另设 5 只小白鼠不注射和喂食抗原的为对照组。20 微克的抗原与油佐剂等 体积混合试制疫苗， 0.5ml/ 只在小白鼠进行上进行动物试验， 一个月后， 进行 ELISA 抗体 效价检测， 试验组全部产生针对 HPV16L1 的抗体， 注射组检测效价可达 1 万倍以上 ； 将初步 纯化的空衣壳病毒粒子， 按每只小白鼠 200μg 的量与同样体积的含 25％ -35％脂肪酸和8％ -12％的蜂胶混合 ( 最佳浓度为脂肪酸 30％ + 蜂胶 10％ ( 脂肪酸组成为棕榈酸 8％、 油酸 19％、 其它成分为 3％ )， 经超声波乳化后灌注， 一个月后， 口服组检测 IgA 效价也达到 5000 倍， 结果试验组 100％产生保护抗体， 而对照组没有检测到抗体。
实施例二人乳头瘤病毒 (HPV)16 型衣壳蛋白基因 L1-L2 在家蚕生物反应器中的联 合表达及免疫实验
1 实验方法
1.1. 有关溶液和培养基的配置
本实施例的常规试剂配制同实施例一。
1.2. 人乳头瘤病毒 (HPV)16 型主要衣壳蛋白基因 L2 与 IRES 基因的获得。
1.21DNAiso(TaKaRa 公司 ) 试剂法提取基因组 DNA
本实施例的人乳头瘤病毒 DNA 制备同实施例一。
1.2.2 目的基因的引物设计与合成
设计引物， 通过 PCR 的方法扩增出人乳头瘤病毒 16 型次要衣壳蛋白 L2 基因 (SEQID NO ： 3)。所设计的人乳头瘤病毒 16 型次要衣壳蛋白 L2 基因的扩增引物为 ：
HPV16L2 上游 ： 5′ -GGAGATCTTCAACATGCGACACAAACGTTCTGCAAAAC-3′
BglII
HPV16L2 下游 ：
5′ -AGAATTCCTAGGCAGCCAAAGAGACATCTGA-3′
EcoRI
设计引物， 通过 PCR 的方法扩增出本研究室保存的 pBacPAK8-IRES 质粒上的 IRES 基因 (SEQ ID NO ： 13)。所设计的 IRES 基因的扩增引物为 ：
IRES 上游引物 ： 5′ -GGCCTCGAGTCTAGAAAAGCAAAAAT-3′
XhoI XbaI
IRES 下游引物 ： 5′ -GCAGATCTTATCTTGAAATGTAGCAGGTAAATTTCT-3′
BglII
1.2.3HPV16L2 和 IRES 基因扩增的 PCR 反应 ：
50μL 反应体系 PCR 反应程序
10×PCR buffer ： 5μL 95℃预变性 5min
dNTP(10mM) ： 1μL 94℃ 1min
60℃ 40sec
72℃ 2min
模板 DNA ： 1μL
primer1(20pmol/μL) ： 1μL
Primer2(20pmol/μL) ： 1μL 以上三步为一个循环， 循环 30 次
Taq 酶 ： 1μL 72℃延伸 10min
ddH2O ： 40μL
PCR 扩增结束后， 取 5.0μL 反应产物用 1.0％的 TAE 琼脂糖凝胶中电泳， 凝胶中含 有 0.5μg/mL 的溴化乙锭， 电泳缓冲液为 1×TAE， 80 ～ 100V， 大约 10 ～ 20min 于紫外凝胶
成像系统观察片段大小， 与标准的 DNA Marker 比较， 进行分析。
1.3 玻璃奶纯化回收 DNA 片段
本实施例的 DNA 回收纯化方法同实施例一。
1.4PCR 产物与克隆载体 pEASY-T3 的连接
本实施例的 PCR 产物与克隆载体 pEASY-T3 的连接方法同实施例一。
1.5 连接产物的转化
本实施例的感受态细胞的小量、 大量制备， 连接产物的转化方法同实施例一。
1.6 重组质粒的鉴定
1.61 细胞破碎法快速鉴定
本实施例的细胞破碎法快速鉴定方法同实施例一。
1.62 重组质粒的进一步酶切鉴定
(1) 质粒 DNA 的提取
(2) 重组质粒的酶切鉴定
pT3-HPV16L2 鉴定体系如下 ：
加入物 体积 ( 共 30ul)
加入物 体积 ( 共 30ul)
质粒 5ul XbaI 1ul BglII 1ul Buffer D 3ul 补水 20ul 质粒 5ul BglII 1ul EcoRI 1ul Buffer D 3ul 补水 20ulpT3-IRES 鉴定体系如下 ：37℃酶切 1 ～ 2h， 加 Marker 作为参考标准， 用琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。
1.63 重组质粒的测序鉴定以及分析
将鉴定为阳性克隆 ( 全长基因分别命名为 pT3-HPV16L2 和 pT3-IRES 的菌种重新 加入含有 Amp 抗生素的 LB 培养液， 220r/min 摇培过夜后后， 吸取 1mL 新鲜菌液至无菌的 Eppendorf 管中， 加入少量甘油， 以封口膜封好后进行测序。 测序结果为 SEQ ID NO ： 3 和 SEQ ID NO ： 13。用 DNAStar、 DNAMAN 软件对序列 SEQ ID NO ： 3 进行分析， 得氨基酸序列 SEQ ID NO ： 4。
1.7 重组杆状病毒转移载体 pVL1393-HPV16L1-IRES-16L2 的构建
1.7.1 重组杆状病毒转移载体 pVL1393-HPV16L1 构建
本实施例的质粒 pVL1393-HPV16L1 构建方法同实施例一。
1.7.2 克隆载体 pBM035-IRES 的构建
1.7.2.1IRES 基因片段的双酶切 (BglII-XhoI)
(1) 质粒 pT3-IRES 的提取， 具体方法同前。
(2) 双酶切 (BglII-XhoI) 体系
16102321635 A CN 102321642 加入物 体积 (50ul)
加入物 体积 (50ul)
质粒 5ul BglII 1ul 质粒 10ul BglII 1ul说XhoI 1ul明书bufferD 5ul BSA(100x) 0.5ul 补水14/28 页32.5ul37℃温育 2 小时。 酶切产物大小的鉴定与回收方法同前。 1.7.2.2 克隆载体 pBM035-IRES 获得 (1)pBM035 质粒提取， 具体方法同前。 (2) 双酶切 (XhoI-BglII) 体系XhoI 1ul bufferE 5ul BSA(100x) 0.5ul 补水 37.5ul37℃温育 2 小时， 65℃灭活 15 分钟。
(3) 酶切载体大小的鉴定与回收
将部分酶切产物进行 1％琼脂糖凝胶电泳， 在未进行酶切的质粒参照下， 将符合大 小、 酶切完全的线性载体片段作为下一步实验用品。酶切回收的 IRES 基因片段与酶切后的 转移载体 pBM035 的连接。
(4) 用 T4DNA 连接酶进行 DNA 连接。连接体系如下 ：
加入物 10ul IRES 3ul pBM035 1ul T4DNA 连接酶 1ul buffer 1ul 补水 4ul16℃过夜连接。
将上述连接产物转化大肠埃希氏菌 DH5α 感受态细胞， 在含氨苄青霉素抗性的琼脂 平板上筛选， 挑选克隆后， 提取质粒。重组质粒经过双酶切和菌液 PCR 鉴定， 将鉴定正确的 重组质粒命名为 pBM035-IRES。具体方法同前。
1.7.3 克隆载体 pBM035-IRES-16L2 的构建
1.7.3.116L2 基因片段的双酶切 (BglII-EcoRI)
(1) 质粒 pT3-16L2 的提取， 具体方法同前。
(2) 双酶切 (Bgl II-EcoRI) 体系
加入物 体积 ( 共 50ul)
质粒 10ul BglII 1ul EcoRI 1ul bufferD 5ul BSA(100x) 0.5ul 补水 32.5ul37℃温育 2 小时。 (3) 酶切产物大小的鉴定与回收方法同前。 1.7.3.2 克隆载体 pBM035-IRES 的双酶切 (BglII-EcoRI)(1)pBM035-IRES 质粒提取， 具体方法同前。 (2) 双酶切 (BglII-EcoRI) 体系EcoRI 1ul bufferE 5ul BSA(100x) 0.5ul 补水 37.5ul37℃温育 2 小时， 65℃灭活 15 分钟。
(3) 酶切载体大小的鉴定与回收
将部分酶切产物进行 1％琼脂糖凝胶电泳， 在未进行酶切的质粒参照下， 将符合大 小、 酶切完全的线性载体片段作为下一步实验用品。
1.7.3.3 酶切回收的 16L2 基因片段与酶切后的载体 pBM035-IRES 的连接。
用 T4DNA 连接酶进行 DNA 连接。连接体系如下 ：
加入物 10ul
16L2 3ul pBM035-IRES 1ul T4DNA 连接酶 1ul buffer 1ul 补水 4ul16℃过夜连接。
1.7.3.4 重组质粒的转化与鉴定。
将上述连接产物转化大肠埃希氏菌 DH5α 感受态细胞， 在含氨苄青霉素抗性的琼脂 平板上筛选， 挑选克隆后， 提取质粒。重组质粒经过双酶切和菌液 PCR 鉴定， 将鉴定正确的 重组质粒命名为 pBM035-IRES-16L2。具体方法同前。
1.7.4 重组杆状病毒转移载体 pVL1393-HPV16L1-IRES-16L2 的构建
1.7.4.1IRES-16L2 基因片段的双酶切 (XbaI-NotI)
(1)pBM035-IRES-16L2 质粒的提取， 具体方法同前。
(2) 双酶切 (XbaI-NotI) 体系
加入物 体积 (50ul)
质粒 10ul XbaI 1ul NotI 1ul bufferD 5ul BSA(100x) 0.5ul 补水 32.5ul37℃温育 2 小时。 (3) 酶切产物大小的鉴定与回收 具体方法同前 1.7.4.2 克隆载体 pVL1393-16L1 的双酶切 (XbaI-NotI) (1)pVL1393-16L1 质粒提取， 具体方法同前。 (2) 双酶切 (XbaI-NotI) 体系18102321635 A CN 102321642 加入物 体积 (50ul)
质粒 5ul XbaI 1ul说NotI 1ul明书bufferD 5ul BSA(100x) 0.5ul 补水16/28 页37.5ul37℃温育 2 小时， 65℃灭活 15 分钟。
(3) 酶切载体大小的鉴定与回收
将部分酶切产物进行 1％琼脂糖凝胶电泳， 在未进行酶切的质粒参照下， 将符合大 小、 酶切完全的线性载体片段作为下一步实验用品。
1.7.4.3 酶切回收的 IRES-16L2 基因片段与酶切后的转移载体 pVL1393-16L1 的连 接。
用 T4DNA 连接酶进行 DNA 连接。连接体系如下 ：
加入物 10ul IRES-16L2 3ul pVL1393-16L1 1ul T4DNA 连接酶 1ul buffer 1ul 补水 4ul16℃过夜连接。
1.7.4.4 重组质粒的转化与鉴定。
具体方法同前， 并对 pVL1393-HPV16L1-IRES-16L2 质粒进行测序， 得序列 SEQID NO ： 9， 用 DNAStar、 DNAMAN 软件对序列 SEQ ID NO ： 9 进行分析， 得氨基酸序列 SEQ ID NO ： 11。
1.8HPV16L2 蛋白的多抗制备与抗体效价测定
将 HPV16L2 部分基因片段克隆到 pET 系列大肠杆菌表达载体中， 用镍柱层析法纯 化变性的表达蛋白， 经质谱分析确认表达的蛋白质序列正确后， 免疫兔子。一共免疫四次， 每次免疫时间为十天。待四免结束后， 取血清， 即获得目的蛋白的多克隆抗体。用大肠杆菌 表达蛋白包被酶标板条， 以 100× 两倍倍比稀释抗体到 51200 倍进行检测。结果表明找到 800 倍为一个较为合适的稀释度， 可用以下一步检测家蚕中 HPV16L1-HPV16L2 的表达。
1.9 重组家蚕杆状病毒 rBmNPV(HPV16L1-IRES-HPV16L2) 的构建和获得
本实施例的重组家蚕杆状病毒构建和获得方法同实施例一。
1.10 重组家蚕杆状病毒 rBmNPV(HPV16L1-IRES-HPV16L2) 的筛选和纯化
本实施例的重组家蚕杆状病毒筛选和纯化方法同实施例一。
1.11 重组家蚕杆状病毒 rBmNPV(HPV16L1-IRES-HPV16L2) 在家蚕细胞中的扩增
本实施例的重组家蚕杆状病毒的扩增方法同实施例一。
1.12 重组家蚕杆状病毒 rBmNPV(HPV16L1-IRES-HPV16L2) 的鉴定
利用 PCR 方法分析外源基因整合。游离病毒基因组 DNA 的提取方法如下 ： 取病毒 上清 150μl， 加入 150μl(0.5mol/L) 的 NaOH 后混匀， 再加入 20μl(8mol/L) 的醋酸铵， 混 匀后用等体积的酚和氯仿分别抽提一次， 酒精沉淀后用 20μl 的 TE
溶解 DNA。寡核苷酸引物为 ： HPV16L1 上游 ： 5′ -CGAGATCTAACATGCAGGTGACTTTTATTTACATCC-3′BglII
HPV16L1 下游 ：
5′ -CGTCTAGATTACAGCTTACGTTTTTTGCGTTTAGC-3′
XbaI
HPV16L2 上游 ：
5′ -GGAGATCTTCAACATGCGACACAAACGTTCTGCAAAAC-3′
BglII
HPV16L2 下游 ：
5′ -AGAATTCCTAGGCAGCCAAAGAGACATCTGA-3′
EcoRI
取 上 述 病 毒 基 因 组 DNA 1μl 进 行 PCR 扩 增， 反应条件为 ： 95 ℃ 变 性 5min、 94℃ 1min、 60℃ 40sec、 72℃ 2min， 30 个循环， 最后 72℃延伸 10min。取 15μl 反应产物电 泳分析， 结果证明获得了重组病毒。
1.13HPV16L1-HPV16L2 基因在家蚕蛹和蚕体中高效表达
本实验所用的家蚕蛹为高表达品种为 JY1( 由本发明人实验室保存 )。JY1 品种家 蚕饲养按吕鸿声主编的 《中国养蚕学》 ( 上海科学技术出版社， 1991) 的常规方法进行。结 茧七天后选择平均体重相同的 15 粒蚕蛹， 每头蚕蛹和蚕接种约 1.0×105rBmNPV(HPV16L1)， 4-5 天后收集发病蚕蛹和取蚕血， -20℃冻存以进行 ELISA 检测。从 OD 值测定实验结果来 看， 表明获得了高表达， 而对照 Bm-NPV-ZJ8 感染的蚕血淋巴中未检测到抗原表达。
1.14HPV16L1-HPV16L2 基因在家蚕中的表达检测以及 ELISA 和 Western 结果
将重组病毒培养液按 105pfu/ 头注射五龄幼蚕， 待家蚕发病后， 剪掉足， 收集蚕 血， -20℃冻存， 用 ELISA 法检测 HPV16L1-HPV16L2 抗原基因在蚕体中的表达情况。
注 射 病 毒 后 的 家 蚕， 待 发 病 时 收 集 蚕 血。ELISA 方 法 检 测 HPV16L1-HPV16L2 抗原蛋白表达量的高低， 包被液作为空白对照， 以正常蚕血作为阴性对照， 原核表达的 HPV16L1-HPV16L2 蛋白免疫新西兰大白兔之后的兔血清为第一抗体， HRP 标记的羊抗兔抗 体为第二抗体。
通过 ELISA 检测家蚕中 HPV16L1-HPV16L2 的表达。从 100× 两倍倍比稀释到 6400 倍。检测结果表明 HPV16L1-16L2 基因在家蚕中得到了高量的表达。使用 16L1 抗体在 3200 倍稀释甚至更高稀释度下仍能检测到抗原与抗体的特异性反应 ( 表 3)。使用 16L2 抗体在 800 倍稀释甚至更高稀释度下仍能检测到抗原与抗体的特异性反应 ( 表 4)。
表3
稀释倍数 HPV16L1 阴性对照
20 100 1.214 0.392 200 0.927 0.323 400 0.706 0.295 800 0.496 0.230 1600 0.409 0.178 3200 0.288 0.159 6400 0.183 0.142 空白 0.127 0.111表4102321635 A CN 102321642 稀释倍数 HPV16L2 阴性对照
100 0.827 0.392 200 0.670 0.323 400 0.452 0.295说明800 0.384 0.230书1600 0.185 0.178 3200 0.152 0.159 6400 0.143 0.14218/28 页 空白 0.135 0.111Western 检测表明在重组病毒感染后家蚕的血淋巴样品的上清液中可检测到 58kD 和 51kD 左右大小的特异性条带， 表明存在表达。
1.15HPV16L1-HPV16L2 病毒样颗粒的收集与纯化和电镜观察
将含表达有 HPV16L1-16L2 的蚕蛹用预冷的 PBS( 料液比为 1 ∶ 9) 在匀浆器中 研磨， 再经超声波破碎后， 用 0.45um 滤器过滤。在 30％蔗糖溶液中， 1.5X105g 超高速离心 3 小时。用含 0.1M Nacl 的 Tris-HCL(PH7.0) 的溶液把沉淀复溶到原体积， 过阳离子交换 层析填料 SP(GE 公司 )， 0.5M Nacl 的 Tris-HCL(PH7.0) 洗脱。再通过凝胶过滤层析层析 Sepharose6Fast Flow(GE 公司 )。经高效液相层析色谱检测纯度可达 95％以上， 得率可达 40％以上 ( 表 5)。 同时也建立了相应的家蚕表达基因工程子宫颈癌病毒空衣壳粒子的纯化 方法， 并得出每克蚕蛹表达的病毒粒子为 2-3mg。 经过电镜观察表明 HPV16L1-HPV16L2 在家 蚕中可自主形成病毒空衣壳粒子。
纯化步骤 得率 纯度
蚕蛹浆 100％ 0.25％ 超速离心 82.4％ 78.3％ SP 56.7％ 93.9％ S epharo se6FF 45.8％ 98.1％表5表明本实施例所获得的病毒粒子含有 L1 和 L2 两种蛋白， 并能正确组装成病毒空 衣壳粒子。
1.16HPV16L1-HPV16L2 病毒衣壳粒子的动物免疫实验
将收集的纯化抗原 HPV16L1-L2 病毒衣壳粒子经肌肉注射和口服途径各免疫 10 只小白鼠为试验组， 另设 5 只小白鼠不注射和喂食抗原的为对照组。20 微克的抗原与油佐 剂等体积混合试制疫苗， 0.5ml/ 只在小白鼠进行上进行动物试验， 一个月后， 进行 ELISA 抗 体效价检测， 试验组全部产生针对 HPV16 的抗体， 注射组检测效价可达 1 万倍以上 ； 将初步 纯化的空衣壳病毒粒子， 按每只小白鼠 200μg 的量与同样体积的含 25％ -35％脂肪酸和 8％ -12％的蜂胶混合 ( 最佳浓度为脂肪酸 30％ + 蜂胶 10％ ( 脂肪酸组成为棕榈酸 8％、 油酸 19％、 其它成分为 3％ )， 经超声波乳化后灌注， 一个月后， 口服组检测 IgA 效价也达到 5000 倍。结果试验组 100％产生保护抗体， 而对照组没有检测到抗体。
实施例三人乳头瘤病毒 (HPV)18 型主要衣壳蛋白基因 L1 在家蚕生物反应器中的 表达及免疫实验
1 实验方法
1.1. 有关溶液和培养基的配置
本实施例的常规试剂配制同实施例一。1.2. 人乳头瘤病毒 (HPV)18 型主要衣壳蛋白基因 L1 的获得。
1.2.1DNAiso(TaKaRa 公司 ) 试剂法提取基因组 DNA
本实施例的人乳头瘤病毒 DNA 制备同实施例一。
1.2.2 目的基因的引物设计与合成
设计引物， 通过 PCR 的方法扩增出人乳头瘤病毒 18 型主要衣壳蛋白 L1 基因 (SEQ ID NO ： 5)。所设计的人乳头瘤病毒 18 型主要衣壳蛋白 L1 基因的扩增引物为 ：
HPV18L1 上游 ：
5′ -CGCCGGATCCAACATGTGCCTGTATACACGGGTCCTG-3′
BamHI
HPV18L1 下游 ：
5′ -GGGGTCTAGATTACTTCCTGGCACGTACACGCAC-3′
XbaI
1.2.3HPV18L1 基因扩增的 PCR 反应 ：
50μL 反应体系 PCR 反应程序
10×PCR buffer ： 5μL 95℃预变性 5min
dNTP(10mM) ：1μL94℃ 60℃ 72℃1min 40sec 2min模板 DNA ： 1μL
primer1(20pmol/μL) ： 1μL
Primer2(20pmol/μL) ： 1μL 以上三步为一个循环， 循环 30 次
Taq 酶 ： 1μL 72℃ 延伸 10min
ddH2O ： 40μL
PCR 扩增结束后， 取 5.0μL 反应产物用 1.0％的 TAE 琼脂糖凝胶中电泳， 凝胶中含 有 0.5μg/mL 的溴化乙锭， 电泳缓冲液为 1×TAE， 80 ～ 100V， 大约 10 ～ 20min 于紫外凝胶 成像系统观察片段大小， 与标准的 DNA Marker 比较， 进行分析。
1.3 玻璃奶纯化回收 DNA 片段
本实施例的 DNA 回收纯化方法同实施例一。
1.4PCR 产物与克隆载体 pEASY-T3 的连接
本实施例的 PCR 产物与克隆载体 pEASY-T3 的连接同实施例一。
1.5 连接产物的转化
本实施例的感受态细胞的小量、 大量制备， 连接产物的转化方法同实施例一。
1.6 重组质粒的鉴定
1.61 细胞破碎法快速鉴定
本实施例的细胞破碎法快速鉴定方法同实施例一。
1.62 重组质粒的进一步酶切鉴定
(1) 质粒 DNA 的提取
(2) 重组质粒的酶切鉴定
鉴定体系如下 ：22102321635 A CN 102321642
加入物 体积 ( 共 30ul)
说质粒 5ul明BamHI 1ul书XbaI 1ul Buffer D 3ul 补水 20ul20/28 页37℃酶切 1 ～ 2h， 加 Marker 作为参考标准， 用琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。
1.63 重组质粒的测序鉴定以及分析
将鉴定为阳性克隆 ( 全长基因分别命名为 pT3-HPV18L1) 的菌种重新加入含有 Amp 抗生素的 LB 培养液， 220r/min 摇培过夜后后， 吸取 1mL 新鲜菌液至无菌的离心管中， 加入 少量甘油， 以封口膜封好后， 送到北京三博生物技术有限公司测序部进行测序。 测序结果为 SEQ ID NO ： 5， 用 DNAStar、 DNAMAN 软件对序列进行分析， 得氨基酸序列为 SEQ ID NO ： 6。
1.7 重组杆状病毒转移载体 pVL1393-HPV18L1 的构建
1.7.1HPV18L1 基因片段的双酶切 (BamHI-XbaI)
(1) 质粒 pT3-HPV18L1 的提取， 具体方法同前。
(2) 双酶切 (BamHI-XbaI) 体系
加入物 体积 ( 共 50ul)
加入物 体积 (50ul)
质粒 5ul BamHI 1ul XbaI 1ul bufferE 5ul BSA(100x) 0.5ul 补水 37.5ul 质粒 10ul BamHI 1ul XbaI 1ul bufferD 5ul BSA(100x) 0.5ul 补水 32.5ul37℃温育 2 小时。 (3) 酶切产物大小的鉴定与回收 本实施例的酶切产物大小的鉴定与回收方法同实施例一。 1.72 转移载体 pVL1393 的双酶切 (BamHI-XbaI) (1)pVL1393 质粒提取， 具体方法同前。 (2) 双酶切 (BamHI-XbaI) 体系37℃温育 2 小时， 65℃灭活 15 分钟。
(3) 酶切载体大小的鉴定与回收
将部分酶切产物进行 1％琼脂糖凝胶电泳， 在未进行酶切的质粒参照下， 将符合大 小、 酶切完全的线性载体片段作为下一步实验用品。
1.73 酶切回收的 HPV18L1 基因片段与酶切后的转移载体 pVL1393 的连接。
用 T4DNA 连接酶进行 DNA 连接。连接体系如下 ：
23102321635 A CN 102321642 加入物 10ul
HPV18L1 3ul说pVL1393 1ul明书T4DNA 连接酶 1ul buffer 1ul 补水 4ul21/28 页16℃过夜连接。
1.74 重组质粒的转化与鉴定。
将上述连接产物转化大肠埃希氏菌 DH5α 感受态细胞， 在含氨苄青霉素抗性的琼脂 平板上筛选， 挑选克隆培养后， 提取质粒。重组质粒经过 BamHI-XbaI 双酶切和菌液 PCR 鉴 定， 并送至三博生物测序， 得序列 SEQ ID NO ： 5， 软件转化氨基酸序列为 SEQ ID NO ： 6。 将鉴 定正确的重组质粒命名 pVL1393-HPV18L1， 具体方法同前。
鉴定体系如下 ：
加入物 体积 ( 共 30ul)
质粒 5ul BamHI 1ul XbaI 1ul Buffer D 3ul 补水 20ul1.8HPV-18L1 蛋白的多抗制备与抗体效价测定
将 HPV18L1 部分基因片段克隆到 pET 系列大肠杆菌表达载体中， 用镍柱层析法纯 化变性的表达蛋白， 经质谱分析确认表达的蛋白质序列正确后， 免疫兔子。一共免疫四次， 每次免疫时间为十天。待四免结束后， 取血清， 即获得目的蛋白的多克隆抗体。用大肠杆菌 表达蛋白包被酶标板条， 以 100× 两倍倍比稀释抗体到 51200 倍进行检测。结果表明找到 1600 倍为一个较为合适的稀释度， 可用以下一步检测家蚕中 HPV18L1 的表达。
1.9 重组家蚕杆状病毒 rBmNPV(HPV18L1) 的构建和获得
本实施例的重组家蚕杆状病毒构建和获得方法同实施例一。
1.10 重组家蚕杆状病毒 rBmNPV(HPV18L1) 的筛选和纯化
本实施例的重组家蚕杆状病毒筛选和纯化方法同实施例一。
1.11 重组家蚕杆状病毒 rBmNPV(HPV18L1) 在家蚕细胞中的扩增
本实施例的重组家蚕杆状病毒的扩增方法同实施例一
1.12 重组家蚕杆状病毒 rBmNPV(HPV18L1) 的鉴定
利用 PCR 方法分析外源基因整合。游离病毒基因组 DNA 的提取方法如下 ： 取病毒 上清 150μl， 加入 150μl(0.5mol/L) 的 NaOH 后混匀， 再加入 20μl(8mol/L) 的醋酸铵， 混 匀后用等体积的酚和氯仿分别抽提一次， 酒精沉淀后用 20μl 的 TE
溶解 DNA。寡核苷酸引物为 ：
HPV18L1 上游 ： 5′ -CGCCGGATCCAACATGTGCCTGTATACACGGGTCCTG-3′
BamHI
HPV18L1 下游 ： 5′ -GGGGTCTAGATTACTTCCTGGCACGTACACGCAC-3′
XbaI
取 上 述 病 毒 基 因 组 DNA 1μl 进 行 PCR 扩 增， 反应条件为 ： 95 ℃ 变 性 5min、 94℃ 1min、 60℃ 40sec、 72℃ 2min， 30 个循环， 最后 72℃延伸 10min。取 15μl 反应产物电 泳分析， 结果证明获得了重组病毒。1.13HPV18L1 基因在家蚕蛹和蚕体中高效表达
本实验所用的家蚕蛹为高表达品种为 JY1( 由本发明人实验室保存 )。JY1 品种家 蚕饲养按吕鸿声主编的 《中国养蚕学》 ( 上海科学技术出版社， 1991) 的常规方法进行。结 茧七天后选择平均体重相同的 15 粒蚕蛹， 每头蚕蛹和蚕接种约 1.0×105rBmNPV(HPV18L1)， 4-5 天后收集发病蚕蛹和取蚕血， -20℃冻存以进行 ELISA 检测。从 OD 值测定实验结果来 看， 表明获得了高表达， 而对照 Bm-NPV-ZJ8 感染的蚕血淋巴中未检测到抗原表达。
1.14HPV18L1 基因在家蚕中的表达检测以及 ELISA 和 Western 结果
将重组病毒培养液按 105pfu/ 头注射五龄幼蚕， 待家蚕发病后， 剪掉足， 收集蚕 血， -20℃冻存， 用 ELISA 法检测 HPV18L1 抗原基因在蚕体中的表达情况。
注射病毒后的家蚕， 待发病时收集蚕血。 ELISA 方法检测 HPV18L1 抗原蛋白表达量 的高低， 包被液作为空白对照， 以正常蚕血作为阴性对照， 原核表达的 HPV18L1 蛋白免疫新 西兰大白兔之后的兔血清为第一抗体， HRP 标记的羊抗兔抗体为第二抗体。
通过 ELISA 检测家蚕中 HPV18L1 的表达。从 100× 两倍倍比稀释到 6400 倍。检 测结果表明 HPV18L1 基因在家蚕中得到了高量的表达， 在 1600 倍稀释甚至更高稀释度下仍 能检测到抗原与抗体的特异性反应 ( 表 6)。
表6
稀释倍数 HPV16L1 阴性对照
100 1.115 0.392 200 1.014 0.323 400 0.701 0.295 800 0.516 0.230 1600 0.307 0.178 3200 0.175 0.159 6400 0.181 0.142 空白 0.139 0.111Western 检测表明在重组病毒感染后家蚕的血淋巴样品的上清液中可检测到 63kD 左右大小的特异性条带， 表明存在表达。
1.15HPV18L1 病毒样颗粒的收集与纯化和电镜观察
将含表达有 HPV18L1 的蚕蛹用预冷的 PBS( 料液比为 1 ∶ 9) 在匀浆器中研磨， 再经 5 超声波破碎后， 用 0.45um 滤器过滤。在 30％蔗糖溶液中， 1.5X10 g 超高速离心 3 小时。用含 0.1M Nacl 的 Tris-HCL(pH7.0) 的溶液把沉淀复溶到原体积， 过阳离子交换层析填料 SP(GE 公 司 )， 0.5M Nacl 的 Tris-HCL(pH7.0) 洗脱。 再通过凝胶过滤层析层析 Sepharose6Fast Flow(GE 公司 )。经高效液相层析色谱检测纯度可达 95％以上， 得率可达 50％以上 ( 表 7)。同时也建 立了相应的家蚕表达基因工程子宫颈癌病毒空衣壳粒子的纯化方法， 并得出每克蚕蛹表达的 病毒粒子为 2-3mg。经过电镜观察表明 HPV18L1 在家蚕中可自主形成病毒样颗粒。
表7
纯化步骤 得率 纯度 蚕蛹浆 100％ 0.24％ 超速离心 78.9％ 83.5％ SP 53.7％ 90.3％ S epharo se6FF 52.1％ 96.8％1.16HPV18L1 病毒样颗粒的动物免疫实验。
将收集的纯化抗原 HPV18L1 病毒样颗粒经肌肉注射和口服途径各免疫 10 只小白 鼠为试验组， 另设 5 只小白鼠不注射和喂食抗原的为对照组。20 微克的抗原与油佐剂等 体积混合试制疫苗， 0.5ml/ 只在小白鼠进行上进行动物试验， 一个月后， 进行 ELISA 抗体 效价检测， 试验组全部产生针对 HPV18L1 的抗体， 注射组检测效价可达 1 万倍以上 ； 将初步 纯化的空衣壳病毒粒子， 按每只小白鼠 200μg 的量与同样体积的含 25％ -35％脂肪酸和 8％ -12％的蜂胶混合 ( 最佳浓度为脂肪酸 30％ + 蜂胶 10％ ( 脂肪酸组成为棕榈酸 8％、 油酸 19％、 其它成分为 3％ )， 经超声波乳化后灌注， 一个月后， 口服组检测 IgA 效价也达到 5000 倍。结果试验组 100％产生保护抗体， 而对照组没有检测到抗体。
实施例四人乳头瘤病毒 (HPV)18 型衣壳蛋白基因 L1-L2 在家蚕生物反应器中的联 合表达及免疫实验
1 实验方法
1.1. 有关溶液和培养基的配置
本实施例的常规试剂配制同实施例一。
1.2. 人乳头瘤病毒 (HPV)18 型主要衣壳蛋白基因 L2 的获得。
1.2.1DNAiso(TaKaRa 公司 ) 试剂法提取基因组 DNA
本实施例的人乳头瘤病毒 DNA 制备同实施例一。
1.2.2 目的基因的引物设计与合成
设计引物， 通过 PCR 的方法扩增出人乳头瘤病毒 18 型次要衣壳蛋白 L2 基因 (SEQ ID NO ： 7)。所设计的人乳头瘤病毒 18 型次要衣壳蛋白 L2 基因的扩增引物为 ：
HPV 18L2 上游 5’ ---GGAGATCTTCAACATGGTATCCCACCGTGCCGCAC---3’
BglII
HPV 18L2 下游 5’ ---AGAATTCCTAGGCCGCCACAAAGCCATC---3’
EcoRI
1.2.3HPV18L2 基因扩增的 PCR 反应 ：
50μL 反应体系 PCR 反应程序
10×PCR buffer ： 5μL 95℃预变性 5min
dNTP(10mM) ： 1μL 94℃ 1min
60℃ 40sec
72℃ 2min
模板 DNA ： 1μL
primer1(20pmol/μL) ： 1μL
Primer2(20pmol/μL) ： 1μL 以上三步为一个循环， 循环 30 次
Taq 酶 ： 1μL 72℃ 延伸 10min
ddH2O ： 40μL
PCR 扩增结束后， 取 5.0μL 反应产物用 1.0％的 TAE 琼脂糖凝胶中电泳， 凝胶中含 有 0.5μg/mL 的溴化乙锭， 电泳缓冲液为 1×TAE， 80 ～ 100V， 大约 10 ～ 20min 于紫外凝胶 成像系统观察片段大小， 与标准的 DNA Marker 比较， 进行分析。
1.3 玻璃奶纯化回收 DNA 片段本实施例的 DNA 回收纯化方法同实施例一。 1.4PCR 产物与克隆载体 pEASY-T3 的连接 本实施例的 PCR 产物与克隆载体 pEASY-T3 的连接方法同实施例一。 1.5 连接产物的转化 本实施例的感受态细胞的小量、 大量制备， 连接产物的转化方法同实施例一。 1.6 重组质粒的鉴定 1.61 细胞破碎法快速鉴定 本实施例的细胞破碎法快速鉴定方法同实施例一。 1.62 重组质粒的进一步酶切鉴定 (1) 质粒 DNA 的提取 (2) 重组质粒的酶切鉴定 pT3-HPV18L2 鉴定体系如下 ：质粒 ul BglII 1ul EcoRI 1ul Buffer D 3ul 补水 20ul37℃酶切 1 ～ 2h， 加 Marker 作为参考标准， 用琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。
1.63 重组质粒的测序鉴定以及分析
将鉴定为阳性克隆 ( 全长基因分别命名为 pT3-HPV18L2 的菌种重新加入含有 Amp 抗生素的 LB 培养液， 220r/min 摇培过夜后后， 吸取 1mL 新鲜菌液至无菌的离心管中， 加入少 量甘油， 以封口膜封好后， 到北京三博生物技术有限公司测序部进行测序。测序结果为 SEQ ID NO ： 7。用 DNAStar、 DNAMAN 软件对序列进行分析， 得氨基酸序列 SEQ ID NO ： 8。
1.7 重组杆状病毒转移载体 pVL1393-HPV18L1-IRES-18L2 的构建
1.7.1 重组杆状病毒转移载体 pVL1393-HPV18L1 构建
本实施例的质粒 pVL1393-HPV18L1 构建方法同实施例一。
1.7.2 克隆载体 pBM035-IRES 的构建
本实施例的质粒 pBM035-IRES 的构建方法同实施例二。
1.7.3 克隆载体 pBM035-IRES-18L2 的构建
1.7.3.118L2 基因片段的双酶切 (BglII-EcoRI)
(1) 质粒 pT3-18L2 的提取， 具体方法同前。
(2) 双酶切 (Bgl II-EcoRI) 体系
加入物 体积 (50ul)
质粒 10ul BglII 1ul EcoRI 1ul bufferD 5ul BSA(100x) 0.5ul 补水 32.5ul37℃温育 2 小时。 (3) 酶切产物大小的鉴定与回收方法同前。 1.7.3.2 克隆载体 pBM035-IRES 的双酶切 (BglII-EcoRI) (1)pBM035-IRES 质粒提取， 具体方法同前。(2) 双酶切 (BglII-EcoRI) 体系EcoRI 1ul bufferE 5ul BSA(100x) 0.5ul 补水 37.5ul37℃温育 2 小时， 65℃灭活 15 分钟。
(3) 酶切载体大小的鉴定与回收
将部分酶切产物进行 1％琼脂糖凝胶电泳， 在未进行酶切的质粒参照下， 将符合大 小、 酶切完全的线性载体片段作为下一步实验用品。
1.7.3.3 酶切回收的 18L2 基因片段与酶切后的转移载体 pBM035-IRES 的连接。
用 T4DNA 连接酶进行 DNA 连接。连接体系如下 ：
加入物 10ul
18L2 3ul pBM035-IRES 1ul T4DNA 连接酶 1ul buffer 1ul 补水 4ul16℃过夜连接。
1.7.3.4 重组质粒的转化与鉴定。
将上述连接产物转化大肠埃希氏菌 DH5α 感受态细胞， 在含氨苄青霉素抗性的琼脂 平板上筛选， 挑选克隆后， 提取质粒。重组质粒经过双酶切和菌液 PCR 鉴定， 将鉴定正确的 重组质粒命名为 pBM035-IRES-18L2。具体方法同前。
1.7.4 重组杆状病毒转移载体 pVL1393-HPV18L1-IRES-18L2 的构建
1.7.4.1IRES-18L2 基因片段的双酶切 (XbaI-NotI)
(1)pBM035-IRES-18L2 质粒的提取， 具体方法同前。
(2) 双酶切 (XbaI-NotI) 体系
加入物 体积 ( 共 50ul)
质粒 10ul XbaI 1ul NotI 1ul bufferD 5ul BSA(100x) 0.5ul 补水 32.5ul37℃温育 2 小时。 (3) 酶切产物大小的鉴定与回收 具体方法同前 1.7.4.2 克隆载体 pVL1393-18L1 的双酶切 (XbaI-NotI) (1)pVL1393-18L1 质粒提取， 具体方法同前。 (2) 双酶切 (XbaI-NotI) 体系28102321635 A CN 102321642 加入物 体积 ( 共 50ul) 质粒 5ul说XbaI 1ul明NotI 1ul书bufferD 5ul BSA(100x) 0.5ul26/28 页 补水 37.5ul37℃温育 2 小时， 65℃灭活 15 分钟。
(3) 酶切载体大小的鉴定与回收
将部分酶切产物进行 1％琼脂糖凝胶电泳， 在未进行酶切的质粒参照下， 将符合大 小、 酶切完全的线性载体片段作为下一步实验用品。
1.7.4.3 酶切回收的 IRES-18L2 基因片段与酶切后的转移载体 pVL1393-18L1 的连 接。
用 T4DNA 连接酶进行 DNA 连接。连接体系如下 ：
加入物 10ul IRES-18L2 3ul pVL1393-18L1 1ul T4DNA 连接酶 1ul buffer 1ul 补水 4ul16℃过夜连接。
1.7.4.4 重组质粒的转化与鉴定。
方法同前， 并对 pVL1393-HPV18L1-IRES-18L2 质粒进行测序， 得序列 SEQ IDNO ： 10， 用 DNAStar、 DNAMAN 软件对序列进行分析， 得氨基酸序列 SEQ ID NO ： 12。1.8HPV18L2 蛋 白的多抗制备与抗体效价测定
将 HPV18L2 部分基因片段克隆到 pET 系列大肠杆菌表达载体中， 用镍柱层析法纯 化变性的表达蛋白， 经质谱分析确认表达的蛋白质序列正确后， 免疫兔子。一共免疫四次， 每次免疫时间为十天。待四免结束后， 取血清， 即获得目的蛋白的多克隆抗体。用大肠杆菌 表达蛋白包被酶标板条， 以 100× 两倍倍比稀释抗体到 51200 倍进行检测。结果表明找到 200 倍为一个较为合适的稀释度， 可用以下一步检测家蚕中 HPV18L1-HPV18L2 的表达。
1.9 重组家蚕杆状病毒 rBmNPV(HPV18L1-IRES-HPV18L2) 的构建和获得
本实施例的重组家蚕杆状病毒构建和获得方法同实施例一。
1.10 重组家蚕杆状病毒 rBmNPV(HPV18L1-IRES-HPV18L2) 的筛选和纯化
本实施例的重组家蚕杆状病毒筛选和纯化方法同实施例一。
1.11 重组家蚕杆状病毒 rBmNPV(HPV18L1-IRES-HPV18L2) 在家蚕细胞中的扩增
本实施例的重组家蚕杆状病毒的扩增方法同实施例一。
1.12 重组家蚕杆状病毒 rBmNPV(HPV18L1-IRES-HPV18L2) 的鉴定
利用 PCR 方法分析外源基因整合。游离病毒基因组 DNA 的提取方法如下 ： 取病毒 上清 150μl， 加入 150μl(0.5mol/L) 的 NaOH 后混匀， 再加入 20μl(8mol/L) 的醋酸铵， 混 匀后用等体积的酚和氯仿分别抽提一次， 酒精沉淀后用 20μl 的 TE 溶解 DNA。寡核苷酸引 物为 ：
HPV18L1 上游 ：
5′ -CGCCGGATCCAACATGTGCCTGTATACACGGGTCCTG-3′
BamHI
HPV18L1 下游 ：
5′ -GGGGTCTAGATTACTTCCTGGCACGTACACGCAC-3′
XbaI
HPV18L2 上游 ：
5’ ---GGAGATCTTCAACATGGTATCCCACCGTGCCGCAC---3’
BglII
HPV18L2 下游 ：
5’ ---AGAATTCCTAGGCCGCCACAAAGCCATC---3’
EcoRI
取 上 述 病 毒 基 因 组 DNA 1μl 进 行 PCR 扩 增， 反应条件为 ： 95 ℃ 变 性 5min、 94℃ 1min、 60℃ 40sec、 72℃ 2min， 30 个循环， 最后 72℃延伸 10min。取 15μl 反应产物电 泳分析， 结果证明获得了重组病毒。
1.13HPV18L1-HPV18L2 基因在家蚕蛹和蚕体中高效表达
本实验所用的家蚕蛹为高表达品种为 JY1( 由本实验室保存 )。JY1 品种家蚕饲养 按吕鸿声主编的 《中国养蚕学》 ( 上海科学技术出版社， 1991) 的常规方法进行。结茧七天 后选择平均体重相同的 15 粒蚕蛹， 每头蚕蛹和蚕接种约 1.0×105rBmNPV(HPV18L1-IRES-HP V18L2)， 4-5 天后收集发病蚕蛹和取蚕血， -20℃冻存以进行 ELISA 检测。从 OD 值测定实验 结果来看， 表明获得了高表达， 而对照 Bm-NPV-ZJ8 感染的蚕血淋巴中未检测到抗原表达。
1.14HPV18L1-HPV18L2 基因在家蚕中的表达检测以及 ELISA 和 Western 结果
将重组病毒培养液按 105pfu/ 头注射五龄幼蚕， 待家蚕发病后， 剪掉足， 收集蚕 血， -20℃冻存， 用 ELISA 法检测 HPV18L1-HPV18L2 抗原基因在蚕体中的表达情况。
注 射 病 毒 后 的 家 蚕， 待 发 病 时 收 集 蚕 血。ELISA 方 法 检 测 HPV18L1-HPV18L2 抗原蛋白表达量的高低， 包被液作为空白对照， 以正常蚕血作为阴性对照， 原核表达的 HPV18L1-HPV18L2 蛋白免疫新西兰大白兔之后的兔血清为第一抗体， HRP 标记的羊抗兔抗 体为第二抗体。
通过 ELISA 检测家蚕中 HPV18L1-HPV18L2 的表达。从 100× 两倍倍比稀释到 6400 倍。检测结果表明 HPV18L1-18L2 基因在家蚕中得到了高量的表达。使用 18L1 抗体在 3200 倍稀释甚至更高稀释度下仍能检测到抗原与抗体的特异性反应 ( 表 8)。使用 18L2 抗体在 800 倍稀释甚至更高稀释度下仍能检测到抗原与抗体的特异性反应 ( 表 9)。
表8
稀释倍数 HPV18L1 阴性对照 100 1.415 0.392 200 1.207 0.323 400 0.918 0.295 800 0.533 0.230 1600 0.404 0.178 3200 0.297 0.159 6400 0.172 0.142 空白 0.141 0.111表9800 0.432 0.230 1600 0.207 0.178 3200 0.161 0.159 6400 0.142 0.142 空白 0.127 0.111Western 检测表明在重组病毒感染后家蚕的血淋巴样品的上清液中可检测到 63kD 和 50kD 左右大小的特异性条带， 表明存在表达。
1.15HPV18L1-HPV18L2 病毒样颗粒的收集与纯化和电镜观察 ：
将含表达有 HPV18L1-18L2 的蚕蛹用预冷的 PBS( 料液比为 1 ∶ 9) 在匀浆器中 研磨， 再经超声波破碎后， 用 0.45um 滤器过滤。在 30％蔗糖溶液中， 1.5X105g 超高速离心 3 小时。用含 0.1M Nacl 的 Tris-HCL(pH7.0) 的溶液把沉淀复溶到原体积， 过阳离子交换 层析填料 SP(GE 公司 )， 0.5M Nacl 的 Tris-HCL(pH7.0) 洗脱。再通过凝胶过滤层析层析 Sepharose6Fast Flow(GE 公司 )。经高效液相层析色谱检测纯度可达 95％以上， 得率可达 40％以上 ( 表 10)。同时也建立了相应的家蚕表达基因工程子宫颈癌病毒空衣壳粒子的纯 化方法， 并得出每克蚕蛹表达的病毒粒子为 2-3mg。 经过电镜观察表明 HPV18L1-HPV18L2 在 家蚕中可自主形成病毒空衣壳粒子。
纯化步骤 得率 纯度
蚕蛹浆 100％ 0.28％ 超速离心 70.8％ 83.5％ SP 51.2％ 92.3％ Sepharo se6FF 41.7％ 97.5％表 101.16HPV18L1-HPV18L2 病毒衣壳粒子的动物免疫实验。
将收集的纯化抗原 HPV18L1-L2 病毒衣壳粒子经肌肉注射和口服途径各免疫 10 只小白鼠为试验组， 另设 5 只小白鼠不注射和喂食抗原的为对照组。20 微克的抗原与油佐 剂等体积混合试制疫苗， 0.5ml/ 只在小白鼠进行上进行动物试验， 一个月后， 进行 ELISA 抗 体效价检测， 试验组全部产生针对 HPV18 的抗体， 注射组检测效价可达 1 万倍以上 ； 将初步 纯化的空衣壳病毒粒子， 按每只小白鼠 200μg 的量与同样体积的含 25％ -35％脂肪酸和 8％ -12％的蜂胶混合 ( 最佳浓度为脂肪酸 30％ + 蜂胶 10％ ( 脂肪酸组成为棕榈酸 8％、 油酸 19％、 其它成分为 3％ )， 经超声波乳化后灌注， 一个月后， 口服组检测 IgA 效价也达到 5000 倍。结果试验组 100％产生保护抗体， 而对照组没有检测到抗体。31102321635 A CN 102321642序列表1/41 页<110> <120> <130> <160> <170> <210> <211> <212> <213>中国农业科学院生物技术研究所 人乳头瘤病毒空衣壳粒子的制备方法及其产品 dqxi008 13 PatentIn version 3.5 1 1596 DNA human papillomavirus<400> 1 atgcaggtga cttttattta catcctagtt attacatgtt acgaaaacga cgtaaacgtt taccatattt tttttcagat gtctctttgg ctgcctagtg aggccactgt ctacttgcct cctgtcccag tatctaaggt tgtaagcacg gatgaatatg ttgcacgcac aaacatatat tatcatgcag gaacatccag actacttgca gttggacatc cctattttcc tattaaaaaa cctaacaata acaaaatatt agttcctaaa gtatcaggat tacaatacag ggtatttaga atacatttac ctgaccccaa taagtttggt tttcctgaca cctcatttta taatccagat acacagcggc tggtttgggc 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aaccttaact gcagacgtta tgacatacat acattctatg aattccacta ttttggagga ctggaatttt ggtctacaac ctcccccagg aggcacacta gaagatactt ataggtttgt aacatcccag gcaattgctt gtcaaaaaca tacacctcca gcacctaaag aagatcccct taaaaaatac actttttggg aagtaaattt aaaggaaaag ttttctgcag acctagatca gtttccttta ggacgcaaat ttttactaca agcaggatta aaggccaaac caaaatttac attaggaaaa cgaaaagcta cacccaccac ctcatctacc tctacaactg ctaaacgcaa aaaacgtaag ctgtaa720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1596<210> <211> <212> <213> <400>2 531 PRT human papillomavirus 233102321635 A CN 102321642序列表3/41 页Met Gln Val Thr Phe Ile Tyr Ile Leu Val Ile Thr Cys Tyr Glu Asn 1 5 10 15Asp Val Asn Val Tyr His Ile Phe Phe Gln Met Ser Leu Trp Leu Pro 20 25 30Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val Pro Val Ser Lys Val Val 35 40 45Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ala Arg Thr Asn Ile Tyr Tyr His Ala Gly 50 55 60Thr Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro Tyr Phe Pro Ile Lys Lys 65 70 75 80Pro Asn Asn Asn Lys Ile Leu Val Pro Lys Val Ser Gly 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gcattttctg atccgtccat tattgaagtt ccacaaactg gggaggtgtc aggtaatgta tttgttggta cccctacatc tggaacacat gggtatgagg aaataccttt acaaacattt gcttcttctg gtacggggga ggaacccatt agtagtaccc cattgcctac tgtgcggcgt gtagcaggtc cccgccttta cagtagggcc taccaacaag tgtcagtggc taaccctgag tttcttacac gtccatcctc tttaattaca tatgacaacc cggcctttga gcctgtggac actacattaa catttgatcc tcgtagtgat gttcctgatt cagattttat ggatattatc cgtctacata ggcctgcttt aacatccagg cgtggtactg ttcgctttag tagattaggt caaagggcaa ctatgtttac ccgcagcggt acacaaatag gtgctagggt tcacttttat catgatataa gtcctattgc accttcccca gaatatattg aactgcagcc tttagtatct gccacggagg acaatgactt gtttgatata tatgcagatg acatggaccc tgcagtgcct gtaccatcgc gttctactac ctcctttgca ttttctaaat attcgcccac tatatcttct gcctcttcct atagtaatgt aacggtccct ttaacctcct cttgggatgt gcctgtatac acgggtcctg atattacatt accatctact acctctgtat ggcccattgt atcacccaca gcccctgcct ctacacagta tattggtata catggtacac attattattt gtggccatta240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 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