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1、10申请公布号CN102321170A43申请公布日20120118CN102321170ACN102321170A21申请号201110271343822申请日20110914C07K14/605200601C07K1/20200601C07K1/06200601C07K1/04200601C07K1/107200601A61K38/26200601A61K47/48200601A61P3/10200601A61P3/0420060171申请人深圳翰宇药业股份有限公司地址518000广东省深圳市南山区高新技术工业园中区翰宇生物医药园办公大楼四层72发明人潘俊锋刘建马亚平袁建成74专利代理机构。
2、深圳市科吉华烽知识产权事务所44248代理人胡吉科陈本发54发明名称利拉鲁肽变构体及其缀合物57摘要本发明提供一种利拉鲁肽变构体及其制备方法，利拉鲁肽变构体的氨基酸序列为X1ALAGLUX2THRPHEX3X4ASPVALX5X6TYRLEUX7GLYGLNALAX8LYSNNPALMITOYLLGLUTAMYLGLUPHEILEX9TRPX10VALARGGLYARGX11；其中X1为HIS或CYS；X2为GLY或CYS；X3为THR或CYS；X4为SER或CYS；X5为SER或CYS；X6为SER或CYS；X7为GLU或CYS；X8为ALA或删除；X9为ALA或CYS；X10为LEU或CY。
3、S或DALA；X11为GLY或CYS或GLYGLY。本发明还提供一种利拉鲁肽变构体缀合物及其制备方法。本发明提供的利拉鲁肽变构体及其缀合物保留了利拉鲁肽的生物学活性，延长了半衰期，有利于患者负担的减轻。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书10页附图4页CN102321175A1/2页21一种利拉鲁肽变构体，其特征在于氨基酸序列为X1ALAGLUX2THRPHEX3X4ASPVALX5X6TYRLEUX7GLYGLNALAX8LYSNNPALMITOYLLGLUTAMYLGLUPHEILEX9TRPX10VALARGGLYARGX11；其中X1为HI。
4、S或CYS；X2为GLY或CYS；X3为THR或CYS；X4为SER或CYS；X5为SER或CYS；X6为SER或CYS；X7为GLU或CYS；X8为ALA或删除；X9为ALA或CYS；X10为LEU或CYS或DALA；X11为GLY或CYS或GLYGLY。2根据权利要求1所述的利拉鲁肽变构体，其特征在于氨基酸序列为HISALAGLUGLYTHRPHETHRSERASPVALCYSSERTYRLEUGLUGLYGLNALAALALYSNNPALMITOYLLGLUTAMYLGLUPHEILEALATRPLEUVALARGGLYARGGLY，所述X5为CYS。3根据权利要求1所述的利拉鲁肽变构体。
5、，其特征在于氨基酸序列为HISALAGLUGLYTHRPHETHRSERASPVALSERSERTYRLEUGLUGLYGLNALALYSNNPALMITOYLLGLUTAMYLGLUPHEILEALATRPLEUVALARGGLYARGGLY，所述X8删除。4根据权利要求1所述的利拉鲁肽变构体，其特征在于氨基酸序列为HISALAGLUGLYTHRPHETHRSERASPVALSERSERTYRLEUGLUGLYGLNALAALALYSNNPALMITOYLLGLUTAMYLGLUPHEILEALATRPDALAVALARGGLYARGGLY，所述X10为DALA。5根据权利要求1所述的利拉鲁。
6、肽变构体，其特征在于氨基酸序列为HISALAGLUGLYTHRPHETHRSERASPVALSERSERTYRLEUGLUGLYGLNALAALALYSNNPALMITOYLLGLUTAMYLGLUPHEILEALATRPLEUVALARGGLYARGGLYGLY，所述X11为GLYGLY。6一种制备权利要求1所述的利拉鲁肽变构体的方法，其特征在于包括如下步骤A）2CTC树脂用DMF洗涤23次，用DMF溶胀30分钟；B）称取N端FMOC保护的氨基酸，加入有机碱DIEA，活化35分钟，加入反应柱反应13小时；C）用体积比为14的哌啶和DMF混合液脱除FMOC保护基20分钟，用茚三酮法检测FMOC。
7、是否脱除完全；D）重复上述步骤A、B和C，按照所述利拉鲁肽变构体的氨基酸序列，逐个偶联相应的氨基酸，其中，赖氨酸采用FMOCLYSALLOCOH，直到序列中最后一个氨基酸偶联结束；E）脱除赖氨酸ALLOC侧链保护基，偶联上PALMITOYLGLUOTBU，得到利拉鲁肽变构体树脂；F）将得到的利拉鲁肽变构体树脂用TFA裂解，反应13小时，将多肽从树脂上裂解下来，同时脱除侧链保护基；G）对裂解下来的多肽溶液用乙醚沉淀，得到粗肽，然后用C8色谱柱，用常规的流动相洗脱，收集组分，冻干得到所需要的利拉鲁肽变构体；权利要求书CN102321170ACN102321175A2/2页3H）用HPLC方法检测其。
8、纯度和含量，用二级质谱和EDMAN降解分析其序列。7根据权利要求1至5中任一项所述的利拉鲁肽变构体在制备用于降低血糖的药物中的用途。8根据权利要求1至5中任一项所述的利拉鲁肽变构体在制备用于降低体重的药物中的用途。9一种利拉鲁肽变构体缀合物，其特征在于包含PEG修饰基团和权利要求1至5中任一项所述的利拉鲁肽变构体。10根据权利要求9所述的利拉鲁肽变构体缀合物，其特征在于所述PEG修饰基团通过CYS、N端氨基、侧链羧基、C端羧基或组氨酸侧链咪唑基缀合到利拉鲁肽变构体上。11根据权利要求9所述的利拉鲁肽变构体缀合物，其特征在于所述PEG修饰基团的分子量在2KDA20KDA之间。12根据权利要求9所。
9、述的利拉鲁肽变构体缀合物，其特征在于所述PEG修饰基团选自以下结构CH32CHOCH2CH2N，CH3CH2MOCH2CH2N，ROCH2CH2N，LYSPEG2，GLUPEG2，TRISPEG3，BIOTINPEG11；其中，M表示16之间的整数；N表示40120之间的整数；R选自H、（C1C30）烷基、环（C6C30）烷基或苯基（C6C30）烷基；LYSPEG2表示以赖氨酸为核的二分支型PEG；GLUPEG2表示以谷氨酸为核的二分支型PEG；TRISPEG3表示三分支型PEG；BIOTINPEG11表示末端连接生物素的11个单元PEG。13根据权利要求9所述的利拉鲁肽变构体缀合物，其特征在。
10、于所述PEG修饰基团选自PEG或MPEG。14一种制备权利要求9所述的利拉鲁肽变构体缀合物的方法，其特征在于包括如下步骤A）称取一定量的所述利拉鲁肽变构体，溶于适当的缓冲溶液中；B）按一定的PEG修饰基团与利拉鲁肽变构体摩尔比，称取PEG修饰基团，加入上述缓冲溶液中，适当摇匀使PEG修饰基团溶解并与利拉鲁肽变构体反应；C）用过量的CYS溶液终止反应，RPHPLC检测反应并纯化得到目标化合物。15根据权利要求14所述的利拉鲁肽变构体缀合物的方法，其特征在于所述缓冲溶液选自醋酸醋酸钠缓冲溶液、磷酸钠盐缓冲溶液、碳酸氢钠、EDTANH4AC缓冲溶液或EDTA磷酸钠盐缓冲溶液。16根据权利要求14所述。
11、的利拉鲁肽变构体缀合物的方法，其特征在于所述PEG修饰基团与所述利拉鲁肽变构体的摩尔比为35；所述PEG修饰基团与所述利拉鲁肽变构体的反应时间为0512小时。17根据权利要求9所述的利拉鲁肽变构体缀合物在制备用于降低血糖的药物中的用途。18根据权利要求9所述的利拉鲁肽变构体缀合物在制备用于降低体重的药物中的用途。权利要求书CN102321170ACN102321175A1/10页4利拉鲁肽变构体及其缀合物技术领域0001本发明涉及利拉鲁肽变构体及其缀合物。背景技术0002利拉鲁肽是由丹麦诺和诺德公司研制的胰高血糖素样肽1（GLP1）受体激动剂，在分子结构、生物活性、作用靶点及免疫原性等方面与G。
12、LP1相似。利拉鲁肽的分子结构与GLP1736类似，不同之处在于利拉鲁肽将GLP1的第34位赖氨酸替换为精氨酸，并在第26位增加了一个棕榈酰脂肪酸侧链。0003多肽类药物普遍存在体内半衰期较短，物理、化学稳定性较差，易被体内各种蛋白酶降解的特性。利拉鲁肽作为一种皮下注射制剂，半衰期约1214H，需每天一次使用，能起到良好的降低血糖作用，但给患者身体、心理和经济带来较大的负担，限制了患者用药依从性。因此，对利拉鲁肽进行结构改造及开发新的剂型，从而延长其血浆周期和增加其系统性药物暴露，具有重要意义。发明内容0004为解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种利拉鲁肽变构体及其缀合物，延长了半衰期。
13、，可有效地降低血糖浓度。0005本发明首先提供一种利拉鲁肽变构体，其氨基酸序列为X1ALAGLUX2THRPHEX3X4ASPVALX5X6TYRLEUX7GLYGLNALAX8LYSNNPALMITOYLLGLUTAMYLGLUPHEILEX9TRPX10VALARGGLYARGX11；其中X1为HIS或CYS；X2为GLY或CYS；X3为THR或CYS；X4为SER或CYS；X5为SER或CYS；X6为SER或CYS；X7为GLU或CYS；X8为ALA或删除；X9为ALA或CYS；X10为LEU或CYS或DALA；X11为GLY或CYS或GLYGLY。0006采用上述技术方案，利拉鲁肽变构。
14、体保留了利拉鲁肽的生物学活性，可有效地降低血糖，且延长了半衰期，为患者提供了更多的药物选择余地。0007作为本发明的进一步改进，所述利拉鲁肽变构体的氨基酸序列为HISALAGLUGLYTHRPHETHRSERASPVALCYSSERTYRLEUGLUGLYGLNALAALALYSNNPALMITOYLLGLUTAMYLGLUPHEILEALATRPLEUVALARGGLYARGGLY，所述X5为CYS。0008作为本发明的进一步改进，所述利拉鲁肽变构体的氨基酸序列为HISALAGLUGLYTHRPHETHRSERASPVALSERSERTYRLEUGLUGLYGLNALALYSNNPALMIT。
15、OYLLGLUTAMYLGLUPHEILEALATRPLEUVALARGGLYARGGLY，所述X8删除。0009作为本发明的进一步改进，所述利拉鲁肽变构体的氨基酸序列为HISALAGLUGLYTHRPHETHRSERASPVALSERSERTYRLEUGLUGLYGLNALAALALYSNN说明书CN102321170ACN102321175A2/10页5PALMITOYLLGLUTAMYLGLUPHEILEALATRPDALAVALARGGLYARGGLY，所述X10为DALA。0010作为本发明的进一步改进，所述利拉鲁肽变构体的氨基酸序列为HISALAGLUGLYTHRPHETHRSER。
16、ASPVALSERSERTYRLEUGLUGLYGLNALAALALYSNNPALMITOYLLGLUTAMYLGLUPHEILEALATRPLEUVALARGGLYARGGLYGLY，所述X11为GLYGLY。0011相应的，本发明还提供一种利拉鲁肽变构体的制备方法，包括如下步骤A）2CTC树脂用DMF洗涤23次，用DMF溶胀30分钟；B）称取N端FMOC保护的氨基酸，加入有机碱DIEA，活化35分钟，加入反应柱反应13小时；C）用体积比为14的哌啶和DMF混合液（DBLK）脱除FMOC保护基20分钟，用茚三酮方法检测FMOC是否脱除完全，树脂有颜色，表明FMOC已脱除；D）重复上述步骤A、。
17、B和C，按照所述利拉鲁肽变构体的氨基酸序列，逐个偶联相应的氨基酸，其中，赖氨酸采用FMOCLYSALLOCOH，直到序列中最后一个氨基酸偶联结束；E）脱除赖氨酸ALLOC侧链保护基，偶联上PALMITOYLGLUOTBU，得到的肽树脂用DCM洗3次，加入12EQ苯基硅烷，反应5分钟，加入08EQPDPPH34，反应60分钟，用茚三酮检测，树脂有颜色，表明FMOC已脱除；加入5EQPALMITAMIDEGLUOTBU，5EQHOAT，5EQHATU，10EQTMP，偶联2小时，收缩，抽干得到利拉鲁肽变构体树脂；F）将得到的利拉鲁肽变构体树脂用TFA裂解，反应13小时，将多肽从树脂上裂解下来，同时。
18、脱除侧链保护基；G）对裂解下来的多肽溶液用乙醚沉淀，得到粗肽，然后用C8色谱柱，用常规的流动相洗脱，收集组分，冻干得到所需要的利拉鲁肽变构体；H）用HPLC方法检测其纯度和含量，用二级质谱和EDMAN降解分析其序列。0012本发明还提供所述利拉鲁肽变构体在制备用于降低血糖的药物中的用途。0013本发明还提供所述利拉鲁肽变构体在制备用于降低体重的药物中的用途。0014本发明还提供一种利拉鲁肽变构体缀合物，包含所述PEG修饰基团和所述利拉鲁肽变构体。0015采用上述技术方案，通过PEG修饰基团的修饰，提供的利拉鲁肽变构体缀合物，在保留利拉鲁肽生物学活性的同时，大大延长了半衰期，不易被体内的蛋白酶降。
19、解，提高了稳定性，可以减少患者的用药次数。0016作为本发明的进一步改进，所述PEG修饰基团的分子量在2KDA20KDA之间。0017作为本发明的进一步改进，一个或者多个PEG修饰基团缀合到利拉鲁肽变构体上，所述PEG修饰基团可以相同，也可以不同。所述PEG修饰基团可以修饰的利拉鲁肽变构体位点包括1）CYS的修饰PEG修饰基团可以通过CYS残基缀合到利拉鲁肽变构体上，以硫醚的形式实现特异性修饰；2）N端氨基的修饰采用的PEG修饰基团为MPEG丙醛，MPEG丙醛的一个重要特性就是在酸性条件（PH50）下，与氨基的耦合具有很高的选择性；说明书CN102321170ACN102321175A3/10。
20、页63）侧链羧基的修饰利拉鲁肽变构体含有谷氨酸、天冬氨酸，谷氨酸和天冬氨酸是很有活性的修饰位点。第一种方法是以MPEGNH2为原料修饰谷氨酸或天冬氨酸侧链，得到FMOCASPMPENHOH或FMOCGLUMPENHOH，再以这种氨基酸PEG修饰物为原料直接合成利拉鲁肽PEG侧链修饰物；第二种方法是选用烯丙酯保护的谷氨酸和天冬氨酸，肽链组装完毕后直接脱除烯丙酯，再与MPEGNH2偶联，得到PEG修饰产物；4）C端羧基的修饰采用的PEG修饰基团为PEGNH2，用PEGNH2在二环己基碳二亚胺或者13二甲基氨基丙基3乙基碳化二亚胺盐酸盐作用下与C端羧基偶联，得到PEG修饰产物；5）组氨酸侧链咪唑基的。
21、修饰。0018作为本发明的进一步改进，所述PEG修饰基团选自以下结构CH32CHOCH2CH2N，CH3CH2MOCH2CH2N，ROCH2CH2N，LYSPEG2，GLUPEG2，TRISPEG3，BIOTINPEG11。其中，M表示16之间的整数；N表示40120之间的整数；R选自H、（C1C30）烷基、环（C6C30）烷基或苯基（C6C30）烷基；LYSPEG2表示以赖氨酸为核的二分支型PEG；GLUPEG2表示以谷氨酸为核的二分支型PEG；TRISPEG3表示三分支型PEG；BIOTINPEG11表示末端连接生物素的11个单元PEG。0019作为本发明的进一步改进，所述PEG修饰基团选。
22、自PEG或MPEG。0020相应的，本发明还提供一种制备所述利拉鲁肽变构体缀合物的方法，包括如下步骤A）称取一定量的所述利拉鲁肽变构体，溶于适当的缓冲溶液中；B）按一定的PEG修饰基团与利拉鲁肽变构体摩尔比，称取PEG修饰基团，加入上述缓冲溶液中，适当摇匀使PEG修饰基团溶解并与利拉鲁肽变构体反应；C）用过量的CYS溶液终止反应，RPHPLC检测反应并纯化得到目标化合物。0021作为本发明的进一步改进，所述缓冲溶液选自醋酸醋酸钠缓冲溶液、磷酸钠盐缓冲溶液、碳酸氢钠、EDTANH4AC缓冲溶液或EDTA磷酸钠盐缓冲溶液。0022作为本发明的进一步改进，所述PEG修饰基团与所述利拉鲁肽变构体的摩尔。
23、比为35；所述PEG修饰基团与所述利拉鲁肽变构体的反应时间为0512小时。0023本发明还提供所述利拉鲁肽变构体缀合物在制备用于降低血糖的药物中的用途。0024本发明还提供所述利拉鲁肽变构体缀合物在制备用于降低体重的药物中的用途。0025与现有技术相比，本发明的有益效果是本发明提供的利拉鲁肽变构体保留了利拉鲁肽的生物学活性，延长了半衰期，为患者提供了更多的药物选择余地；本发明在提供利拉鲁肽变构体的基础上，通过PEG修饰基团的修饰，提供的利拉鲁肽变构体缀合物，在保留利拉鲁肽生物学活性的同时，延长了半衰期，不易被体内的蛋白酶降解，提高了稳定性，可以减少患者的用药次数；本发明提供的利拉鲁肽变构体及其。
24、缀合物的制备方法简便，降血糖和降体重的效果好，为降低血糖药物和降低体重药物的制备提供了更多的选择，延长了半衰期，提高了稳定性，降低了生产成本，有利于患者负担的减轻。附图说明0026图1为本发明利拉鲁肽变构体的固相合成工艺流程图。0027图2为本发明利拉鲁肽与利拉鲁肽变构体5在体外对细胞内CAMP活性的影响。说明书CN102321170ACN102321175A4/10页70028图3为本发明利拉鲁肽变构体5及其缀合物在体外对细胞内CAMP活性的影响。0029图4为本发明利拉鲁肽与利拉鲁肽变构体5降血糖作用实效试验。0030图5为本发明利拉鲁肽与利拉鲁肽变构体5缀合物降血糖作用实效试验。0031。
25、图6为本发明利拉鲁肽变构体5及其缀合物对体重的影响。具体实施方式0032下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。0033说明书和权利要求书中所使用的缩写的含义列于下表中。0034本文中使用的术语“缀合物”是指多肽或多肽变体与本文所述的修饰基团共价或非共价连接后形成的产物，所述修饰基团包括但不限于上文所述的例子。本文中使用的术语“PEG修饰基团”包括一般意义上所说的PEG（聚乙二醇）和聚乙二醇衍生物。由于PEG是聚合物，是由一定分布范围内的不同聚合度的分子构成，一般用平均分子量来表示聚合物的分子量，具体来说可以是数均分子量或重均分子量。BIOTINPEG11MAL和说明书CN1023211。
26、70ACN102321175A5/10页8MALPEG4PEG4OME3购自康肽德生物医药技术有限公司，PEG5000、MPEG10000MAL、MPEG20000MAL、PEG30000MAL、BIOTINPEG30000MAL、LYSPEG2MAL、TRISPEG3MAL、PEG40000MAL、MPEG5000CH2CH2CHO、SCMPEG10000和MPEG5000NH2均购自派格生物医药（苏州）有限公司。0035实施例一利拉鲁肽变构体的固相合成。0036使用2氯三苯甲基氯树脂（2CTC树脂）类型的固相载体，选用FMOC保护氨基策略合成利拉鲁肽巯基变体，其步骤为第一步2CTC树脂用D。
27、MF洗涤23次，用DMF溶胀30分钟；第二步称取N端FMOC保护的氨基酸，DIEA为激活剂，活化35分钟，加入反应柱反应13小时；第三步用体积比为14的哌啶和DMF混合液脱除FMOC保护基20分钟，用茚三酮方法检测FMOC是否脱除完全，树脂有颜色，表明FMOC已脱除；第四步重复第一步至第三步的过程，按照所述利拉鲁肽变构体的氨基酸序列，逐个偶联相应的氨基酸，其中，赖氨酸采用FMOCLYSALLOCOH，直到序列中最后一个氨基酸偶联结束；第五步脱除赖氨酸ALLOC侧链保护基，偶联上PALMITOYLGLUOTBU；得到的肽树脂用DCM洗3次，加入12EQ苯基硅烷，反应5分钟，加入08EQPDPPH。
28、34，反应60分钟，用茚三酮方法检测，树脂有颜色，表明FMOC已脱除；加入5EQPALMITOYLGLUOTBU，5EQPYBOP，6EQHOBT，10EQDIEA，偶联2小时，收缩，抽干得到利拉鲁肽变构体肽树脂；第六步得到的利拉鲁肽变构体肽树脂用TFA裂解，反应13小时，将多肽从树脂上裂解下来，同时脱除侧链保护基；第七步对裂解下来的多肽溶液用乙醚沉淀，得到粗肽，然后用C8色谱柱，用常规的流动相洗脱，收集组分，冻干得到所需要的利拉鲁肽巯基变体；第八步用HPLC方法检测其纯度和含量，用二级质谱和EDMAN降解分析其序列。0037采用上述方法合成的利拉鲁肽变构体有1）N端第1位为CYS的利拉鲁肽变。
29、构体1，氨基酸序列为CYSALAGLUGLYTHRPHETHRSERASPVALSERSERTYRLEUGLUGLYGLNALAALALYSNNPALMITOYLLGLUTAMYLGLUPHEILEALATRPLEUVALARGGLYARGGLYOH；2）N端第4位为CYS的利拉鲁肽变构体2，氨基酸序列为HISALAGLUCYSTHRPHETHRSERASPVALSERSERTYRLEUGLUGLYGLNALAALALYSNNPALMITOYLLGLUTAMYLGLUPHEILEALATRPLEUVALARGGLYARGGLYOH；3）N端第7位为CYS的利拉鲁肽变构体3，氨基酸序列为HISA。
30、LAGLUGLYTHRPHECYSSERASPVALSERSERTYRLEUGLUGLYGLNALAALALYSNNPALMITOYLLGLUTAMYLGLUPHEILEALATRPLEUVALARGGLYARGGLYOH；4）N端第8位为CYS的利拉鲁肽变构体4，氨基酸序列为HISALAGLUGLYTHRPHETHRCYSASPVALSERSERTYRLEUGLUGLYGLNALAALALYSNNPALMITOYLLGLUTAMYLGLUPHEILEALATRPLEUVALARGG说明书CN102321170ACN102321175A6/10页9LYARGGLYOH；5）N端第11位为CYS。
31、的利拉鲁肽变构体5，氨基酸序列为HISALAGLUGLYTHRPHETHRSERASPVALCYSSERTYRLEUGLUGLYGLNALAALALYSNNPALMITOYLLGLUTAMYLGLUPHEILEALATRPLEUVALARGGLYARGGLYOH；6）N端第12位为CYS的利拉鲁肽变构体6，氨基酸序列为HISALAGLUGLYTHRPHETHRSERASPVALSERCYSTYRLEUGLUGLYGLNALAALALYSNNPALMITOYLLGLUTAMYLGLUPHEILEALATRPLEUVALARGGLYARGGLYOH；7）C端第1位为CYS的利拉鲁肽变构体7，氨基酸。
32、序列为HISALAGLUGLYTHRPHETHRSERASPVALSERSERTYRLEUGLUGLYGLNALAALALYSNNPALMITOYLLGLUTAMYLGLUPHEILEALATRPLEUVALARGGLYARGCYSOH；8）N端第15位为CYS的利拉鲁肽变构体8，氨基酸序列为HISALAGLUGLYTHRPHETHRSERASPVALSERSERTYRLEUCYSGLYGLNALAALALYSNNPALMITOYLLGLUTAMYLGLUPHEILEALATRPLEUVALARGGLYARGGLYOH；9）C端第6位为CYS的利拉鲁肽变构体9，氨基酸序列为HISALAGLUG。
33、LYTHRPHETHRSERASPVALSERSERTYRLEUGLUGLYGLNALAALALYSNNPALMITOYLLGLUTAMYLGLUPHEILEALATRPCYSVALARGGLYARGGLYOH；10）C端第8位为CYS的利拉鲁肽变构体10，氨基酸序列为HISALAGLUGLYTHRPHETHRSERASPVALSERSERTYRLEUGLUGLYGLNALAALALYSNNPALMITOYLLGLUTAMYLGLUPHEILECYSTRPLEUVALARGGLYARGGLYOH；11）C末端添加GLY的利拉鲁肽变构体11，氨基酸序列为HISALAGLUGLYTHRPHETHR。
34、SERASPVALSERSERTYRLEUGLUGLYGLNALAALALYSNNPALMITOYLLGLUTAMYLGLUPHEILEALATRPLEUVALARGGLYARGGLYGLYOH；12）C端第6位为DALA的利拉鲁肽变构体12，氨基酸序列为HISALAGLUGLYTHRPHETHRSERASPVALSERSERTYRLEUGLUGLYGLNALAALALYSNNPALMITOYLLGLUTAMYLGLUPHEILEALATRPDALAVALARGGLYARGGLYOH；13）C端第13位缺失ALA的利拉鲁肽变构体13，氨基酸序列为HISALAGLUGLYTHRPHETHRSER。
35、ASPVALSERSERTYRLEUGLUGLYGLNALAL说明书CN102321170ACN102321175A7/10页10YSNNPALMITOYLLGLUTAMYLGLUPHEILEALATRPLEUVALARGGLYARGGLYOH。0038实施例二利拉鲁肽变构体1的PEG5000缀合物的制备。0039取5MG利拉鲁肽变构体1溶解于8ML20MM的磷酸钠盐缓冲液PH65，按PEG5000与利拉鲁肽变构体1摩尔比为31的量称取20MGPEG5000，加入到上述溶液中，适当摇匀而使PEG5000溶解并与利拉鲁肽变构体1混合均匀，在25条件下反应2小时，然后用过量的05M半胱氨酸溶液终止。
36、反应，最后放置于20下为分离纯化备用。用WATERS2695型高效液相色谱仪检测反应并纯化得到目标化合物。PEG5000与利拉鲁肽变构体1摩尔比为31是根据多次实验结果总结出来的，可以使利拉鲁肽变构体1修饰完全。0040实施例三利拉鲁肽变构体2的PEG5000缀合物的制备。0041取5MG利拉鲁肽变构体2溶解于8ML20MM的磷酸钠盐缓冲液PH65，按PEG5000与利拉鲁肽变构体2摩尔比为31的量称取20MGPEG5000，加入到上述溶液中，适当摇匀而使PEG5000溶解并与利拉鲁肽变构体2混合均匀，在25条件下反应2小时，然后用过量的05M半胱氨酸溶液终止反应，最后放置于20下为分离纯化备。
37、用。用WATERS2695型高效液相色谱仪检测反应并纯化得到目标化合物。0042实施例四利拉鲁肽变构体3的MPEG10000缀合物的制备。0043称取10MG利拉鲁肽变构体3溶解到水中，用碳酸氢钠调PH78，加入3当量的MPEG10000MAL,在室温下搅拌15小时，然后用过量的05M半胱氨酸溶液终止反应，最后放置于20下为分离纯化备用；用WATERS2695型高效液相色谱仪检测反应并纯化得到目标化合物，纯度为985。最终产物以MALDITOFMS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱）确定分子量。0044实施例五利拉鲁肽变构体4的MPEG20000缀合物的制备。0045称取10MG利拉鲁肽变构体。
38、4溶解到EDTANH4AC缓冲溶液中，调PH69，加入5当量的MPEG20000MAL，在室温下搅拌15小时，然后用过量的05M半胱氨酸溶液终止反应，最后放置于20下为分离纯化备用；用WATERS2695型高效液相色谱仪检测反应并纯化得到目标化合物。最终产物以MALDITOFMS确定分子量。0046实施例六利拉鲁肽变构体4的PEG30000缀合物的制备。0047取10MG利拉鲁肽变构体4溶解于5ML的磷酸钠盐缓冲液PH65，按PEG30000MAL与PEG30000MAL摩尔比为41的量称取40MGPEG30000MAL，加入上述溶液中，适当摇匀而使PEG30000MAL溶解并与利拉鲁肽变构体。
39、4混合均匀，在20条件下反应25小时，然后用过量的05M半胱氨酸溶液终止反应，最后放置于20,然后分离纯化。用WATERS2695型高效液相色谱仪检测反应并纯化得到目标化合物。最终产物以MALDITOFMS确定分子量。0048实施例七利拉鲁肽变构体4的BIOTINPEG30000缀合物的制备。0049取10MG利拉鲁肽变构体4溶解于5ML的磷酸钠盐缓冲液PH65，按BIOTINPEG30000MAL与利拉鲁肽变构体4摩尔比为41的量称取40MGBIOTINPEG30000MAL，加入上述溶液中，适当摇匀而使BIOTINPEG30000MAL溶解并与利拉鲁肽变构体4混合均匀，在20条件下反应25。
40、小时，然后用过量的05M半胱氨酸溶液终止反应，最后放置于20,然后分离纯化。用WATERS2695型高效液相色谱仪检测反应并说明书CN102321170ACN102321175A8/10页11纯化得到目标化合物。最终产物以MALDITOFMS确定分子量。0050实施例八利拉鲁肽变构体4的BIOTINPEG11缀合物的制备。0051取10MG利拉鲁肽变构体4溶解于5ML的磷酸钠盐缓冲液PH65，按BIOTINPEG11MAL与利拉鲁肽变构体4摩尔比为41的量称取20MGBIOTINPEG11MAL，加入上述溶液中，适当摇匀而使BIOTINPEG11MAL溶解并与利拉鲁肽变构体4混合均匀，在20条。
41、件下反应25小时，然后用过量的05M半胱氨酸溶液终止反应，最后放置于20,然后分离纯化。用WATERS2695型高效液相色谱仪检测反应并纯化得到目标化合物。最终产物以MALDITOFMS确定分子量为46892。0052实施例九利拉鲁肽变构体6的二分支型PEG2缀合物的制备。0053称取10MG利拉鲁肽变构体6溶解到EDTA磷酸盐缓冲溶液中，调PH65，加入5当量的LYSPEG2MAL（分子量为20KDA）,在室温下搅拌15小时，用WATERS2695型高效液相色谱仪检测反应，反应结束后，加入过量的05M半胱氨酸溶液以终止反应，并纯化得到目标化合物。最终产物以MALDITOFMS确定分子量。00。
42、54实施例十利拉鲁肽变构体7三分支型PEG3缀合物的制备。0055称取10MG利拉鲁肽变构体7溶解到EDTA磷酸盐缓冲溶液中，调PH65，加入5当量的TRISPEG3MAL（分子量为30KDA），在室温下搅拌15小时，用WATERS2695型高效液相色谱仪检测反应，反应结束后，加入过量的05M半胱氨酸溶液以终止反应，并纯化得到目标化合物。最终产物以MALDITOFMS确定分子量。0056实施例十一利拉鲁肽变构体7的PEG4PEG4OME3缀合物的合成。0057取10MG利拉鲁肽变构体7溶解于15ML的磷酸钠盐缓冲液PH65，按MALPEG4PEG4OME3与肽摩尔比为51的量称取40MGMAL。
43、PEG4PEG4OME3，加入上述溶液，适当摇匀而使PEG溶解并与肽混合均匀，在20条件下反应30小时，然后用过量的05M半胱氨酸溶液终止反应，最后放置于20,然后分离纯化。用WATERS2695型高效液相色谱仪检测反应并纯化得到目标化合物。最终产物以MALDITOFMS确定分子量为51006。0058实施例十二利拉鲁肽变构体8的PEG40000缀合物的制备。0059称取10MG利拉鲁肽变构体8溶解到EDTA磷酸盐缓冲溶液中，调PH65，加入5当量的PEG40000MAL，在室温下搅拌15小时，用WATERS2695型高效液相色谱仪检测反应，反应结束后，加入过量的05M半胱氨酸溶液以终止反应，。
44、用RPHPLC纯化得到目标化合物。最终产物以MALDITOFMS确定分子量。0060实施例十三利拉鲁肽变构体11的MPEG5000缀合物的制备（N端修饰）。0061称取5MG利拉鲁肽变构体11溶解到水中，加入到醋酸醋酸钠缓冲溶液调PH50，加入3当量的MPEG5000CH2CH2CHO，在室温下搅拌25小时，然后用过量的05M半胱氨酸溶液终止反应，最后放置于20下为分离纯化备用；用WATERS2695型高效液相色谱仪检测反应并纯化得到目标化合物。最终产物以MALDITOFMS确定分子量。0062实施例十四利拉鲁肽变构体12的MPEG10000缀合物的制备（N端修饰）。0063称取8MG利拉鲁肽。
45、变构体12溶解到水中，用02MPBS调PH68，加入5当量SCMPEG10000（MPEG琥珀酰亚胺碳酸酯）50MG，在室温反应3小时，然后用过量的05M半胱氨酸溶液终止反应，最后放置于20下为分离纯化备用，2小时后用HIPREP26/10脱盐说明书CN102321170ACN102321175A9/10页12柱脱盐处理，所用缓冲液体系为PH为85的25MMTRIS。脱盐以后采用WATERS2695型高效液相色谱仪纯化得到目标化合物。0064实施例十五利拉鲁肽变构体13的MPEG5000缀合物的制备（C端修饰）。0065取5MG利拉鲁肽变构体13溶解于10ML20MM的磷酸钠盐缓冲液PH60，。
46、按MPEG5000NH2与利拉鲁肽变构体摩尔比为41的量称取20MGMPEG5000NH2，加入到上述溶液，适当摇匀而使MPEG5000NH2溶解并与利拉鲁肽变构体13混合均匀，在室温条件下反应35小时，然后用过量的05M半胱氨酸溶液终止反应，最后放置于20下为分离纯化备用。用WATERS2695型高效液相色谱仪检测反应并纯化得到目标化合物。0066实施例十六利拉鲁肽与利拉鲁肽变构体5在体外对细胞内CAMP活性的影响。0067根据实施例一中提供的合成方法，按照利拉鲁肽的氨基酸序列合成利拉鲁肽。利拉鲁肽的氨基酸序列为HISALAGLUGLYTHRPHETHRSERASPVALSERSERTYRL。
47、EUGLUGLYGLNALAALALYSNNPALMITOYLLGLUTAMYLGLUPHEILEALATRPLEUVALARGGLYARGGLYOH；将PC12细胞（肾上腺嗜铬细胞瘤细胞）培养48小时，弃去培养液，并用缓冲液清洗23次，加入1ML含有1牛血清蛋白的缓冲液，将利拉鲁肽和利拉鲁肽变构体5分别与浓度为100M的IBMX共同孵育半小时，弃去培养基，加入盐酸终止酶对CAMP（环腺苷酸）的降解。收集细胞，超声裂解细胞，按BCA检测法测定细胞蛋白含量。按CAMP酶联免疫试剂盒说明进行操作，设立不同浓度的标准品组以建立标准曲线，反应完成后在酶标仪于450NM波长下测定光吸收值，用该光吸收值在。
48、标准曲线上读出对应的CAMP浓度，最后计算样品中CAMP浓度。0068所得结果如图2所示，利拉鲁肽呈剂量依赖式地增加PC12细胞内CAMP含量，增加CAMP最大值（EMAX）为161272PMOL/100G（蛋白），EC50值为17109M。利拉鲁肽变构体5在体外对PC12细胞内CAMP的影响与利拉鲁肽非常相似。其中利拉鲁肽变构体5增加CAMP最大值（EMAX）为152478PMOL/100G（蛋白）；EC50值为21109M。说明在N端第11位引入半胱氨酸（巯基）的利拉鲁肽变构体5保留了利拉鲁肽本身的生物学活性。0069实施例十七利拉鲁肽变构体5及其缀合物在体外对细胞内CAMP活性的影响。0。
49、070将PC12细胞培养48小时，弃去培养液，并用缓冲液清洗23次，加入1ML含有1牛血清蛋白的缓冲液，将利拉鲁肽变构体5、利拉鲁肽变构体5的PEG2000缀合物、利拉鲁肽变构体5的PEG5000缀合物、利拉鲁肽变构体5的PEG20000缀合物分别与浓度为100M的IBMX共同孵育半小时，弃去培养基，加入盐酸终止酶对CAMP的降解。收集细胞，超声裂解细胞，按BCA检测法测定细胞蛋白含量。按CAMP酶联免疫试剂盒说明进行操作，设立不同浓度的标准品组以建立标准曲线，反应完成后在酶标仪于450NM波长下测定光吸收值，用该光吸收值在标准曲线上读出对应的CAMP浓度，最后计算样品中CAMP浓度。0071所得结果如图3所示，实验结果表明，利拉鲁肽变构体5剂量依赖式地增加PC12细胞内CAMP含量，其增加CAMP最大值（EMAX）为103915PMOL/100G（蛋白），EC50值为13X109M。PEG化修饰呈分子量（200020000）依赖式地平行右移量效关系曲线，降低利拉鲁肽变构体5生物活性。随着PEG分子量的增大，它们EC50值分别为11X109,12X108,和13X107M。其中PEG。