去乙酰真菌环氧乙酯作为 Hsp90 抑制剂的应用 技术领域 本发明涉及一种化合物去乙酰真菌环氧乙酯 (Deacetylmycoepoxydiene， 缩写为 DAM)， 尤其是涉及一种去乙酰真菌环氧乙酯作为 Hsp90 抑制剂在制备炎症抑制剂和医药各 领域的应用。去乙酰真菌环氧乙酯又名南强菌素 (Nanqiangmycin)。
背景技术 热休克蛋白 (Heat shock proteins， Hsps) 是真核细胞中的一类分子伴侣， 其主要 功能是参与新生蛋白的合成、 变性蛋白的复性及细胞内部蛋白的迁移等生命活动。 Hsp90 作 为 Hsps 家族中重要的一员， 在细胞的生命活动中扮演重要的角色， 其在细胞中的含量约占 细胞蛋白总量的 1％～ 2％。
Hsp90 参与细胞代谢、 生长、 发育、 分化、 死亡和免疫等几乎所有的生理过程的调 节， 因此其活性异常与人体的许多疾病 ( 如神经退行性疾病、 心血管类疾病、 病毒感染和 癌症等 ) 密切相关。炎症反应是机体免疫系统的重要组成部分之一， 机体通过多种途径 对其进行精密的调控。但当炎症反应不可控时， 会导致机体多种疾病， 如类风湿性关节炎 (rtheumatoid arthriti)、 炎症性肠病 (Inflammatory bowel disease， IBD)、 神经退化性 疾病 (neurodegenerative disorder)) 等等， 长期的炎症反应刺激还会诱发机体癌变， 这些 都严重威胁着人们的身心健康 (1、 Monaco， et al.， Curr Drug Targets Inflamm Allergy， 2004， 3， 35-42 ； 2、 Schwartsburd et al.， Cancer Metastasis Rev， 2003， 22， 95-102)， 因 此对机体过激的炎症反应进行有效控制是目前开发治疗这些疾病药物的主要方向。研究 表明， 上述疾病中的炎症反应虽然所表现的症状不同， 但是介导这些炎症反应的因子或 介质是相同的， 如肿瘤坏死因子 -α(Tumor necrosis factor alpha， TNF-α)、 白细胞介 素 -1β(Interleukin-1beta， IL-1β)、 白细胞介素 -6(IL-6) 等。一氧化氮 (NO) 等在炎症 反应中可被诱导表达， 从而加剧机体的炎症程度 (3、 Heller et al.， Proc Natl Acad Sci USA， 1997， 94， 2150-2155 ； 4、 Feldmann et al.， Nat Med， 2003， 9， 1245-1250)， 因此对这些 炎症因子进行抑制将有助于改善机体的炎症反应。
目 前， 吲 哚 美 辛 (indometacin)、 阿 司 匹 林 (aspirin) 等 非 类 固 醇 类 抗 炎 药 物 (Non-steroidal anti-inflammatory drugs， NSAIDs) 已经广泛地用于治疗类风湿性关节 炎等炎症相关的疾病 (5、 Day et al.， Med J Aust， 1988， 148， 195-199)， 但是所用的 NSAIDs 一般都具有副作用， 长期服用后会导致胃肠损伤及肾功能不正常等症状 (Lichtenberger et al.， Nat Med， 1995， 1， 154-158 ； Fernandez et al.， Nat Med， 1995， 1， 602-603)。因此， 需要进一步寻找有效抑制炎症反应的化合物， 为以后开发低副作用的抗炎药物提供新的思 路。
本申请人在中国专利 200610036892.6 中公开了一种抗肿瘤化合物去乙酰真菌环 氧乙酯及其制备方法， 又在中国专利 200810071738.1 中公开一种抗肿瘤化合物去乙酰真 菌环氧乙酯的发酵基质， 还在中国专利 200910112353.X3 中公开了一种去乙酰真菌环氧乙 酯的制备方法， 化合物 Deacetylmycoepoxydiene 是由一株拟茎点霉 A-1-2-3 发酵提取物中
分离得到的。 经前期研究发现， 去乙酰真菌环氧乙酯具有较好的抗肿瘤活性。 MTT 法体外检 测抗肿瘤活性得到其对于 Raji 细胞株的 IC50 为 12.1μM， 但文献未报道其具有抗炎症等生 理活性。
去乙酰真菌环氧乙酯生产菌株 A-1-2-3 是一株拟茎点霉 (Phomopsis sp.)， 该菌 株分离于福建省漳州市九龙江口浮宫镇草埔头村红树林生态区红树植物秋茄叶子 ( 杨丽 珊， 红树植物内生菌株生物活性及菌株 A-1-2-3 次级代谢产物的初步研究 [D]， 厦门 ： 厦门 大学， 2006)。 菌株 A-1-2-3 在 20％海水配方马铃薯琼脂培养基 (PDA) 上， 生长良好， 菌丝纯 白， 无明显色素产生， 不产孢子， 发酵时间为 14 天。
所述去乙酰真菌环氧乙酯是菌株 A-1-2-3 代谢产生的化合物， 所述菌株 A-1-2-3 是一株拟茎点霉 (Phomopsis sp.)。 发明内容
本发明的目的在于提供去乙酰真菌环氧乙酯在制备 Hsp90 抑制剂及其炎症抑制 剂的应用， 特别是去乙酰真菌环氧乙酯在制备治疗由炎症因子 TNF-α 等介导的炎症性疾 病药物中的应用。
所述去乙酰真菌环氧乙酯的化学式为 C14H16O4， 分子量为 246， 其化学名为 2-(8- 甲 基 -9- 氧杂 - 双环 [4.2.1] 九 -2， 4- 二烯 -7- 基 )-6- 氧 -3， 6- 二氢 -2H- 吡喃酮， 为一白 色羽状或棒状透明结晶， 化学结构式为 ：
所述去乙酰真菌环氧乙酯可以来源于真菌发酵产物或化学合成。
所述去乙酰真菌环氧乙酯在制备 Hsp90 抑制剂及其炎症抑制剂的应用， 特别是去 乙酰真菌环氧乙酯在制备治疗由炎症因子 TNF-α 等介导的炎症性疾病药物中的应用。
所述炎症性疾病包括风湿性关节炎、 炎症性肠病、 神经退化性疾病等。
经实验证实， 去乙酰真菌环氧乙酯 ( 记为南强菌素， DAM) 能有效地抑制 Hsp90 以 及炎症因子如肿瘤坏死因子 (TNF-α)、 白细胞介素 6(IL-6) 和一氧化氮 (NO) 的表达， 并能 抑制由 TNF-α 诱导的炎症因子产生的信号通路 NF-kappaB 的激活作用。可作为炎症抑制 剂用于制备治疗风湿性关节炎、 炎症性肠病、 神经退化性疾病等由炎症因子介导的炎症性 疾病的药物。
附图说明
图 1 为 DAM( 南强菌素 ) 作用于 RAW264.7 细胞后的 MTT 实验结果图。在图 1 中， 横坐标为 DAM 浓度 (μmol/L)， 纵坐标为吸光度值 (595nm)。
图 2 为在细菌脂多糖刺激下 DAM 作用于 RAW264.7 细胞后的 MTT 实验结果图。在 图 2 中， 横坐标为 DAM 浓度 (μmol/L)， 纵坐标为 595nm 的吸光度值 ； LPS 浓度均为 100ng/ mL。图 3 为 DAM 对经细菌脂多糖刺激的 RAW264.7 细胞中前炎症因子 TNF-α 表达的影 响图。在图 3 中， 横坐标为 DAM(μmol/L)， 纵坐标为前炎症因子 TNF-α(pg/ml) ； DAM 浓度 为 0 的组为 DMSO 空白对照组， 其他浓度组分别与 DMSO 组进行 t 检验 ； * 表示 p ＜ 0.05， ** 表示 p ＜ 0.01
图 4 为 DAM 对经细菌脂多糖刺激的 RAW264.7 细胞中前炎症因子 IL-6 表达的影响 图。在图 4 中， 横坐标为 DAM 浓度 (μmol/L)， 纵坐标为前炎症因子 IL-6(pg/ml) ； DAM 浓度 为 0 的组为 DMSO 空白对照组， 其他浓度组分别与 DMSO 组进行 t 检验 ； ** 表示 p ＜ 0.01。
图 5 为 DAM 对经细菌脂多糖刺激的 RAW264.7 细胞中前炎症因子 IL-1β 表达的影 响图。 在图 5 中， 横坐标为 DAM 浓度 (nmol/L)， 纵坐标为前炎症因子 IL-1β(pg/ml) ； DAM 在 9、 12μmol/L 浓度下对经细菌脂多糖刺激的 RAW264.7 细胞中前炎症因子 IL-1β 的表达具 有明显的抑制作用 ； DAM 浓度为 0 的组为 DMSO 空白对照组， 其他浓度组分别与 DMSO 组进行 t 检验。
图 6 为 DAM 对不同浓度细菌脂多糖刺激的 RAW264.7 细胞中促炎症介质 TNF-α 表 达的影响。在图 6 中， 横坐标为细菌脂多糖的浓度梯度 (ng/ml)， 纵坐标为 TNF-α 的浓度 (pg/ml) ： DAM 在 10μmol/L 浓度下对经不同浓度的细菌脂多糖刺激的 RAW264.7 细胞中促 炎症介质 TNF-α 表达具有明显的抑制作用。 图中 LPS 组分别与 LPS+DAM 组进行 t 检验， DAM 浓度为 10μmol/L ； * 表示 p ＜ 0.05 ； 为 LPS， 为 LPS+DAM。
图 7 为 DAM 对不同浓度细菌脂多糖刺激的 RAW264.7 细胞中促炎症介质 IL-6 表达 的影响。在图 7 中， 横坐标为细菌脂多糖的浓度梯度 (ng/ml)， 纵坐标为 IL-6 的浓度 (pg/ ml) ： DAM 在 10μmol/L 浓度下对经不同浓度的细菌脂多糖刺激的 RAW264.7 细胞中促炎症 介质 IL-6 表达具有明显的抑制作用 ； 图中 LPS 组分别与 LPS+DAM 组进行 t 检验， DAM 浓度 为 10μmol/L ； ** 表示 p ＜ 0.01 ； 为 LPS， 为 LPS+DAM。
图 8 为 DAM 对不同浓度细菌脂多糖刺激的 RAW264.7 细胞中促炎症介质 IL-1β 表 达的影响。在图 8 中， 横坐标为细菌脂多糖的浓度梯度 (ng/ml)， 纵坐标为 IL-1β 的浓度 (pg/ml) ： DAM 在 10μmol/L 浓度下对经不同浓度的细菌脂多糖刺激的 RAW264.7 细胞中促 炎症介质 IL-1β 表达具有明显的抑制作用。 图中 LPS 组分别与 LPS+DAM 组进行 t 检验， DAM 浓度为 10μmol/L ； 为 LPS， 为 LPS+DAM。
图 9 为 DAM 对经细菌脂多糖刺激的 RAW264.7 细胞中 NO 表达的影响。 在图 9 中， 横 坐标为 DAM 的浓度梯度 (μmol/L)， 纵坐标为 NO 的浓度 (μmol/L)， DAM 在 9、 12μmol/L 浓 度下对经细菌脂多糖刺激的 RAW264.7 细胞中 NO 的表达具有明显的抑制作用 ； 图中 DAM 浓 度为 0 的组为 DMSO 空白对照组， 其他浓度组分别与 DMSO 组进行 t 检验 ； * 表示 p ＜ 0.05， ** 表示 p ＜ 0.01。
图 10 为去乙酰真菌环氧乙酯 (DAM) 对 RAW264.7 细胞中炎症因子产生的核因子 (NF-kappaB) 信号转导通路的抑制作用。在图 10 中， 显示用 1、 2.5 和 5μg/mL 的去乙酰真 菌环氧乙酯 (DAM) 处理 HeLa 细胞 12h， 细胞浆和细胞核中的核因子 (RelA) 及其抑制蛋白 质 IκB 的表达水平。β-actin 为细胞浆中的蛋白质对照 ； PARP 为细胞核中的蛋白质对照 ( 图 10)。
图 11 为以 LPS(100ng/mL) 激活 0.5h， 用 1、 2、 4 和 6μg/mL 的去乙酰真菌环氧乙酯 (DAM) 处理 RAW264.7 细胞 5.5h， 细胞浆和细胞核中的核因子 (RelA) 及其抑制蛋白质 IκB的表达水平。 β-actin 为细胞浆中的蛋白质对照 ； PARP 为细胞核中的蛋白质对照 ( 图 10)。
图 12 为以炎症因子 TNF-α(20ng/mL) 激活 0.5h， 用 1、 2、 4 和 6μg/mL 的去乙酰真 菌环氧乙酯 (DAM) 处理 RAW264.7 细胞 5.5h， 细胞浆和细胞核中的核因子 (RelA) 及其抑制 蛋白质 IκB 的表达水平 ； β-actin 为细胞浆中的蛋白质对照 ； PARP 为细胞核中的蛋白质 对照 ( 图 12)。
图 13 为 DAM 对 HeLa 细胞中的 Hsp90 及其相关蛋白质表达的影响图。在图 13 中， 显示 DAM 作用 HeLa 细胞 24h 后相关蛋白质表达的 Western blot 分析结果。图 13 表明随 着 DAM 浓度 (1， 2.5， 5μg/mL) 的增加， Hsp90 的客户蛋白 ( 简写为 Akt， IKKα， IKKβ， 磷酸 化的 Akt) 表达量下调， 而 Hsp70 的表达量显著上调， 即 DAM 对 Hsp90 客户蛋白质具有降解 作用 ； 图 13 中的 GA( 格尔德霉素 ) 为阳性对照。
图 14， 图 15 为 DAM 对炎症因子 TNF-α 激活的核因子 (NF-kappaB) 信号转导通 路的抑制作用。在图 14 中， 显示用 1、 2.5 和 5μg/mL 的去乙酰真菌环氧乙酯 (DAM) 处理 HeLa 细胞 23.5h， 并以炎症因子 TNF-α(20ng/mL) 激活 0.5h。细胞浆和细胞核中的核因子 (RelA) 及其抑制蛋白质 IκB 的表达水平。β-actin 为细胞浆中的蛋白质对照 ； PARP 为细 胞核中的蛋白质对照 ( 图 14) ； 在图 8 中， 显示以 2.5μg/mL 的去乙酰真菌环氧乙酯 (DAM) 处理 HeLa 细胞 23.5h， 再以炎症因子 TNF-α(20ng/mL) 激活 0.5h。细胞以及核因子 RelA 的染色结果。细胞核染色后显蓝色， RelA 显橙色或红色， 入核后与细胞核显色叠加而呈现 粉红色 ( 图 15)。 图 16 为 DAM 对人乳腺癌 MCF-7 细胞中的 Hsp90 及其相关蛋白质表达的影响图。 在 图 16 中， 显示 DAM 作用 MCF-7 细胞 6h 后相关蛋白质表达的 Western blot 分析结果。图 16 表明随着 DAM 浓度 (10， 2.0， 30 和 50μmol/L) 的增加， Hsp90 的客户蛋白 ( 简写为 Akt) 在 6h 的作用时间下， 呈现降解趋势， 但下降不明显， 磷酸化的 Akt 的量明显下调， 而 Hsp70 的表 达量上调， 即 DAM 对 Hsp90 客户蛋白质具有降解作用。图 16 中的 GA( 格尔德霉素 ) 为阳性 对照。
图 17 为 DAM 对人肺癌 H1299 细胞中的 Hsp90 及其相关蛋白质表达的影响图。在 图 17 中， 显示 DAM 作用 H1299 细胞 24h 后相关蛋白质表达的 Western blot 分析结果。图 17 表明随着 DAM 浓度 (10， 2.0， 30 和 50μmol/L) 的增加， Hsp90 的客户蛋白 ( 简写为 Akt， IKK 等 ) 在 24h 的作用时间下， 呈现降解趋势， 而 Hsp70 的表达量上调， 即 DAM 对 H1299 细胞 中 Hsp90 客户蛋白质也具有降解作用。图 17 中的 GA( 格尔德霉素 ) 为阳性对照。
图 18 为 DAM 对人胃癌细胞 BGC-823 中的 Hsp90 及其相关蛋白质表达的影响随着时 间变化图。在图 18 中， 显示 DAM 作用 BGC-823 细胞不同时间后相关蛋白质表达的 Western blot 分析结果。图 18 表明随着 DAM 作用时间的延长， Hsp90 的客户蛋白 ( 简写为 Akt)， 出 现明显的降解， 而 Hsp70 的表达量上调， 即 DAM 对 Hsp90 客户蛋白质具有降解作用。图 18 中的 GA( 格尔德霉素 ) 为阳性对照。
图 19 为 DAM 对人乳腺癌细胞 MDA-MB-231 细胞迁移的抑制作用。在图 19 中， 显示 用 1μmol/L 和 5μmol/L 的 DAM 作用于 MDA-MB-231 细胞， 其细胞的迁移与对照比较， 明显 受到抑制， 随着作用时间的延长， DAM 对肿瘤细胞迁移的抑制作用越明显， 表现在划线两侧 细胞的距离越远。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。
实施例 1 去乙酰真菌环氧乙酯 ( 南强菌素， DAM) 细胞毒性试验
采用 MTT 法检测去乙酰真菌环氧乙酯 ( 南强菌素， DAM) 的细胞毒性， 具体步骤如 下：
将 RAW264.7 细胞 (8×105 个细胞 / 孔 ) 接入 96 孔培养板培养过夜， 加入细菌脂多 糖 (lipopolysaccharide， LPS)(100ng/ml) 及不同浓度的 DAM(3、 6、 9、 12μmol/L， 用 DMSO 作 为空白对照 ) 共同作用 24h 或不同浓度的 DAM(3、 6、 9、 12μmol/L， 用 DMSO 作为空白对照 ) 单独作用 24h， 然后加入 MTT 至终浓度 0.5mg/ml 作用 3h， 按 100μl/ 孔加入溶解液 (10％ SDS， 0.01mol/L HCL) 过夜后测定 OD590。
OD590 可反映细胞的生长情况， 因此通过比较 OD590 值来判断 DAM 是否存在细胞毒 性。
MTT 法 检 测 结 果 表 明 ( 参 见 图 1、 图 2) ： DAM 在 0 ～ 12μmol/L 浓 度 条 件 下 对 RAW264.7 细胞很可能不具有细胞毒性。
实施例 2 去乙酰真菌环氧乙酯 (DAM) 即南强菌素在抑制细菌脂多糖诱导的 RAW264.7 细胞炎症反应中的应用 通过检测细胞前炎症因子的浓度变化， 从而判明去乙酰真菌环氧乙酯 (DAM) 是否 可以抑制 RAW264.7 细胞炎症反应。具体试验方法如下 ：
1) 设置 DAM 浓度梯度。 将 RAW264.7 细胞 (4×105 细胞 /mL) 接入 12 孔培养板， 24h 后换液一次， 1 ～ 2h 后加入 LPS 至终浓度为 100ng/ml 刺激 6h， 同时加入不同浓度的 DAM(3、 6、 9、 12μmol/L， 用 DMSO 作为空白对照 )， 观察 DAM 对 LPS 刺激前炎症因子表达的影响， 提取 细胞培养上清液做酶联免疫吸附检测。通过 ELISA 检测试剂盒 ( 购自 eBioscience 公司， Mouse TNF-α(Cat# ： 88-7324-88， Lot# ： E09483-1334) 和 Mouse IL-6(Cat# ： 88-7064-88， Lot# ： E09362-1631) 试剂盒各一个， ) 检测 2 种前炎症因子的浓度 ： 细胞培养上清液中的肿 瘤坏死因子 -α(TNF-α) 和白介素 -6(IL-6)。
现将 eBioscience 公司 ELISA 检测试剂盒检测方法列举如下。
(1) 包被固定相抗体。使用 Corning Costar 9018ELISA 酶标板， 用包被缓冲液以 1/250 的比例稀释固相抗体， 混合摇匀后加入 100μL/ 孔， 将酶标板置于 4℃过夜反应。
(2) 清洗。弃去孔内溶液， 用清洗缓冲液清洗 5 次， 每次间隔 1min， 每次每孔洗液 不少于 250μL， 弃去洗液后轻轻在吸水纸上敲打以增加清洗效果。
(3) 封闭。将 5X 的实验稀释液稀释至 1X 后， 按 200μL/ 孔加入酶标板， 室温静置 反应 1h。
(4) 清洗。同步骤 (2)， 重复清洗至少 5 次。
(5) 加入适当抗原。 使用 1X 实验稀释液， 稀释阳性标准品， 阳性标准品 100μL/ 孔， 每个浓度做两个平行以保证其准确和可靠。加入稀释好的抗原样品 (100μL/ 孔 ) 至相应 的孔中， 盖上盖子置于室温静置反应 2h 或置于 4℃过夜以便使抗原抗体达到最大结合度。
(6) 清洗。同步骤 (2)， 重复清洗至少 5 次。
(7) 加入检测抗体。使用 1X 实验稀释液以 1/250 的比例稀释检测抗体， 混合摇匀 后加入 100μL/ 孔， 置于室温静置反应 1h。
(8) 清洗。同步骤 (2)， 重复清洗至少 5 次。
(9) 加入酶标抗体。使用 1X 实验稀释液以 1/250 的比例稀释酶标抗体， 混合摇匀 后加入 100μL/ 孔， 置于室温静置反应 30min。
(10) 清洗。同步骤 (2)， 在此次清洗步骤中， 应当间隔 1 ～ 2min 清洗一次， 且重复 清洗至少 7 次。
(11) 加入反应底物。每孔加入底物溶液 100μL， 于室温静置反应 15min。
(12) 每孔加入终止液 50μL， 终体积 150μL， 终止反应。
(13) 将酶标板置于酶标仪 450nm 处测量其最大吸光值 (OD)， 并数据分析。 5
2)LPS 浓度梯度。将 RAW264.7 细胞 (4×10 细胞 /mL) 接入 12 孔培养板， 24h 后 换液一次， 1 ～ 2h 后加入 LPS 至终浓度为 100、 1000、 10000ng/ml 刺激 6h， 同时加终浓度 为 12μmol/L 的 DAM， 观察 DAM 对不同浓度的 LPS 刺激前炎症因子表达的影响， 提取细胞培 养上清液做酶联免疫吸附检测。通过 ELISA 检测试剂盒 ( 购自 eBioscience 公司， Mouse TNF-α(Cat# ： 88-7324-88， Lot# ： E09483-1334) 和 Mouse IL-6(Cat# ： 88-7064-88， Lot# ： E09362-1631) 试剂盒各一个， ) 检测 2 种前炎症因子的浓度 ： 细胞培养上清液中的肿瘤坏死 因子 -α(TNF-α) 和白介素 -6(IL-6)。 3) 将 RAW264.7 细 胞 (8×105 细 胞 /mL) 接 入 96 孔 培 养 板 培 养 过 夜， 然后加入 LPS(100ng/ml) 及不同浓度的 DAM(3、 6、 9、 12μmol/L， 用 DMSO 作为空白对照 ) 刺激 24h， 收 集细胞培养上清液， 通过 Griess 方法检测一氧化氮 (NO) 的含量。
实验结果 ( 参见图 3 ～ 14) 表明 ： DAM 可抑制细菌脂多糖诱导的 RAW264.7 细胞的 炎症反应。DAM 在制备治疗风湿性关节炎、 炎症性肠病、 神经退化性疾病和脓毒性休克等由 促炎症因子介导的炎症性疾病药物中的具有广泛的应用。
实施例 3、 去乙酰真菌环氧乙酯 (DAM) 对 Hsp90 客户蛋白的降解作用
在该实施例中， 采用 Western Blot 法检测去乙酰真菌环氧乙酯 (DAM) 对肿瘤细胞 中 Hsp90 的客户蛋白质的降解作用。
分别用 1、 2.5 和 5μg/mL 的去乙酰真菌环氧乙酯 (DAM) 处理人宫颈癌 HeLa 细胞、 人乳腺癌 MCF-7 细胞以及人肠癌 BGC-823 细胞 24h， 0.5μmol/L 的 GA 作为阳性对照， 等量 DMSO 作为阴性对照。 吸去培养液， 用 PBS 漂洗一次， 加入细胞裂解液， 4℃裂解 5min 左右， 快 速刮取细胞置于 1.5mL 离心管中。冰浴超声裂解细胞 10 次， 每次 1s， 得到的细胞裂解液于 4℃， 13500rpm 离心 15min。取上清， Bradford 法测定蛋白质浓度， 调整蛋白浓度一致， 加入 2×sample buffer( 样品缓冲液 ) 混匀， 100℃水浴 10min， 进行 SDS-PAGE 电泳。再 100V 电 泳转膜 1h 到预先用甲醇浸润过的硝酸纤维素 (PVDF) 膜上。5％ BSA 室温封闭 1h， 一抗 ( 体 积比 1 ∶ 1000 稀释 ) 室温孵育 2h， TBST 洗涤 3 次， 每次 10min。二抗 ( 体积比 1 ∶ 5000 稀 释 ) 室温孵育 1h， TBST 洗涤后的 PVDF 膜用增强型化学发光剂 (ECL) 溶液浸润， 显影观察。
不同浓度的去乙酰真菌环氧乙酯 (DAM) 处理肿瘤细胞 24h 后， Western blot 检测 与 Hsp90 相关蛋白的表达水平， 结果发现， Akt 出现降解， p-Akt 的水平下调， 而核因子信号 转导通路相关的蛋白质激酶如 IKK 出现降解 ； 同时 Hsp70 表达量上调 ( 图 6， 9， 10)， 与阳性 对照 GA 的作用结果一致， 表明去乙酰真菌环氧乙酯 (DAM) 在细胞水平上， 对 Hsp90 具有较 强的抑制作用。
实施例 4、 去乙酰真菌环氧乙酯 (DAM) 即南强菌素对炎症因子 TNF-α 激活的核因
子 (NF-kappaB) 信号转导通路的抑制作用
在该实施例中， 分别采用蛋白质印迹 (Western Blot) 法和免疫荧光染色法检测去 乙酰真菌环氧乙酯 (DAM) 或南强菌素对肿瘤细胞 HeLa 中， 炎症因子 TNF-α(20ng/mL) 激活 的核因子 (NF-kappaB 或 RelA) 信号转导通路的抑制作用。
Western Blot 法检测南强菌素对肿瘤细胞 HeLa 中， 炎症因子 TNF-α 激活的核因 子 (NF-kappaB) 信号转导通路的抑制作用。分别用 1、 2.5 和 5μg/mL 的南强菌素 (DAM) 处 理 HeLa 细胞 23.5h， 并以炎症因子 TNF-α(20ng/mL) 激活 0.5h， 收集并裂解细胞， 以核抽 提试剂抽提细胞核。分别对细胞浆和细胞核中的核因子信号通路蛋白质如核因子 (RelA) 及其抑制蛋白质 IκB 的入核情况进行检测， 结果发现核因子 (RelA) 的入核作用受到抑制 ( 图 7)。
免疫荧光染色法检测去乙酰真菌环氧乙酯 (DAM) 即南强菌素对炎症因子 TNF-α 激活的核因子 (NF-kappaB) 信号转导通路的抑制作用。以 2.5μg/mL 的南强菌素 (DAM) 处理 HeLa 细胞 23.5h， 再以炎症因子 TNF-α(20ng/mL) 激活 0.5h， 收集细胞， 以 DAPI 进 行核染色， 并对核因子 RelA(p65) 通过免疫荧光染色法进行染色。结果发现在炎症因子 TNF-α(20ng/mL) 激活作用下， 核因子 RelA 的入核作用很明显， 细胞核出现明显的橙色。 经 与核染色后的蓝色相叠加， 有 RelA 入核作用的细胞核呈现粉红色 ； 而用南强菌素 (DAM) 处 理的 HeLa 细胞中， 虽然经过炎症因子 TNF-α(20ng/mL) 激活， 但核因子的入核被阻止， 整个 细胞核无论叠加与否均呈现蓝色 ( 图 8)。
核因子入核后通过与 DNA 结合而启动相关的细胞存活基因转录， 从而使细胞因子 等炎症因子表达， 细胞存活。而南强菌素 (DAM) 通过阻止核因子入核， 而达到相应的抗炎等 作用。
实施例 5、 去乙酰真菌环氧乙酯 (DAM) 即南强菌素对人乳腺癌细胞 MDA-MB-231 迁 移的抑制作用
所有需要灭菌的器械用前灭菌， 直尺和 marker 笔在操作前紫外照射 30min( 超净 台内 )。培养基 ： DMEM 无血清培养基， 用 24Well ComboPlate 培养
1、 先用 marker 笔在 24 孔板背后， 用直尺比着， 均匀划横线， 大约每隔 0.5 ～ 1cm 一道， 横穿过孔。
2、 铺盘密度 ： 1.0×105 个 /ml， 铺盘 24h 后加药。
3、 用枪头比着直尺， 尽量垂至于背后的横线划痕， 枪头要垂直， 不能倾斜。
4、 用 PBS 洗细胞 3 次， 去除游离的细胞， 加入无血清培养基。
5、 放入 37℃度 5％ CO2 培养箱， 培养。按 0， 24， 36 和 48h 取样， 拍照。