一种植物渗透或水分变化原初感应的蛋白分子、 及其基因 和应用 技术领域 本发明涉及基因工程领域， 具体地， 涉及一种植物体内的渗透变化或水分感应的 蛋白分子、 及其基因和应用。
背景技术 植物感知、 适应逆境涉及一系列复杂的基因表达网络调控， 细胞受到逆境胁迫之 后， 通过感应分子的作用能迅速感知外界信号， 依靠复杂的信号转导途径， 一方面激活特定 转录调控因子， 与特定的顺时作用元件结合， 进而调控目标基因的转录表达， 另一个方面， 在翻译后水平激活特异的修饰蛋白， 调节靶蛋白和靶基因， 最终提高植物的耐逆性。
植物在从感知胁迫的信号到基因表达产生适应性的过程中， 进化出一系列复杂机 制以最大限度减轻胁迫伤害， 其中一些基因在快速应答的过程中起了至关重要的作用， 它 们成为将物理性的逆境信号， 如： 干旱、 高温、 低温等逆境， 转化为生化信号的原初载体， 脱 水或渗透势的变化是这类逆境反应的共同特征， 即： 引起细胞模形变的机械刺激， 在转录水 平上， 植物中发现了一类快速应答诱导基因， 命名为 ERD 基因 ( 脱水诱导早期应答基因 ) (Taji T， et al.， 1999)， 主要结果局限在拟南芥的研究， 然而原初的信号接收分子， 却一直 是一个不解之谜。
在拟南芥中已经找到 16 个 ERD 成员， 这些基因分别属于叶绿体 ATP 蛋白依赖酶， 热激蛋白 hsp70-1 和 hsp80-2、 质膜蛋白、 脯氨酸脱氢酶、 糖转运蛋白、 衰老诱导基因， 硫代 谷胱甘肽转移酶、 II 型 LEA 蛋白、 茉莉酸甲酯合成酶和泛素蛋白等。
ERD1 基因是拟南芥中研究比较深入的一个脱水诱导早期应答基因， 编码一个类 似叶绿素蛋白酶的调节亚基 (Nakashima K， et， al.1997， Lam-Son P T， et， al.， 2007)。 ERD2、 ERD8 和 ERD16 受干旱胁迫强烈表达， 分别属于热激蛋白 hsp70-1、 hsp80-2 和泛素蛋 白 (Kiyosue T， et， al.， 1994)。ERD4 编码一个膜蛋白， 推测有 9 个跨膜区， 但它的功能目 前还不清楚 (Froehlich J E， et， al， ， 2003)。ERD5 编码脯氨酸脱氢酶 (ProDH)， 催化脯氨 酸转化成谷氨酸的第一步反应 (Nakashima K， et， al.， 1998)。ERD6 是在拟南芥干旱胁迫 1h 后获得的， 研究表明该基因编码的蛋白具有 12 个跨膜区， 并且有一个亲水中心， 属于糖 转运蛋白， 受干旱和冷诱导表达 (Kiyosue T， et， al， .1998)。ERD10 和 ERD14 属于 II 型 LEA 蛋白家族 (Kiyosue T， et， al.， 1994)。ERD14 在磷酸化的状态下具有离子结合的活性， 2+ 2+ 主要结合 Ca 和 Fe 离子， 它的作用机制还在研究中 (Muath KA， et， al.， 2003)。ERD11 和 ERD13 编码的产物属于硫代谷胱甘肽转移酶 (Kyiosue T， et， al.， 1993)。ERD15 可能是一 个新的与 ABA 信号胁迫相关的调节器， 该基因的功能和作用机制还需要深入研究 (Kariola T， et， al.， 2006)。综上所述， 在拟南芥中获得的 16 个 ERD 基因属于不同的基因家族， 作用 不同的代谢途径， 它们可能分别通过感知并传递信号胁迫， 产生功能蛋白， 参与重要的代谢 反应， 降解毒素等不同的方式增强拟南芥的耐逆性。
水分的重要性不言而喻， 越来越严重的干旱等逆境胁迫对作物产量的影响尤为严
重， 从感应水分的原初反应出发， 发掘关键的分子开关基因， 并对其功能进行深入的解析， 从而利用这一分子的特性， 不仅可以为抗旱 ( 逆 ) 育种提供具有巨大应用价值的基因资源， 也可以为人类应对水分的流失或皮肤的衰老提供全新的防护理论。 发明内容 本发明的发明人为了解决上述问题提出并完成了这一发明。
本发明的目的是提供一种植物体内的渗透或水分变化感应的蛋白分子。
本发明的再一目的是提供一种植物体内的渗透或水分变化感应的基因。
本发明的再一目的是提供上述植物体内的渗透或水分变化感应蛋白分子的应用。
根据本发明的植物体内的渗透变化或水分感应的蛋白分子， 其氨基酸序列如 SEQ ID No.1 所示。
根据本发明的植物体内的渗透变化或水分感应的基因， 编码上述蛋白分子， 优选 地， 其核苷酸序列如 SEQ ID No.2 所示。
本发明还提供了上述植物体内的渗透或水分变化感应的蛋白分子作为钙离子通 道的应用。
钙离子作为细胞的第二信使， 其胞内浓度的变化或者说波动， 可以启动一系列的 生理反应过程， 根据本发明的技术方案， 所述钙离子通道的定义为 ： 钙离子通道是可以介导 钙离子快速跨膜转运的分子结构， 细胞内钙离子的波动， 主要是依赖钙离子通道的调控。 细 胞的渗透势可以帮助维持细胞的形状， 物质的流动， 渗透势的变化， 反应细胞内水分和离子 浓度的变化， 也会引起细胞形状的变化。本发明发明阐述了 AtERDRT08 分子， 据二级结构 分析具有两个明显的功能区， 首先是作为水分变化的感应分子， 其中一部分 ( 如 ： 膜外结构 域 ) 能感知渗透势引起的细胞膜的轻微变动， 并将这种变化传导到分子的另一部分 ( 通道 结构域 )， 通过这一分子的通道结构部分， 行使钙通道的功能， 将原初感知、 传递和启动钙第 二信使合为一个分子， 这也是本发明的一个最重要的特性， 也是 30 多年来， 很多研究者孜 孜以求， 而未发现的原初信号感应、 接收分子。
本发明还提供了包含上述植物体内的渗透变化或水分感应的基因的植物表达载 体。
本发明还提供了上述植物体内的渗透变化或水分感应的蛋白分子用于感应植物 体内的渗透变化或水信号变化的应用。
进而， 本发明还提供了上述植物体内的渗透变化或水分感应的蛋白分子用于植物 抗旱的应用。
本发明首先选定具有跨膜结构域的 ERD4 和 ERD6 类似同源基因家族为研究对象， 将 15 个 CDS 克隆到 pcDNA3.1， 转化 CHO 细胞， 获得了多个转化的细胞株， 通过 Fura2 荧光 检测筛选， 转化 AtERDRT08(At4g22120) 的细胞株与转化空白质粒 pcDNA3.1 对照细胞株相 比， 经过高渗溶液处理， 可获得显著瞬时上升的钙信号 ( 图 1)， 同时获得了 AtERDRT08 相关 基因的 T-DNA 突变体库， 然后利用不同的逆境因子处理， 获得了同一个基因的两个耐高渗 胁迫的纯和突变体株系， 具有强烈抵御高渗的能力， 进一步分析发现， 这一基因可对渗透势 的变化作出快速而精细的反应， 介导钙离子的快速内流， 类似动物中冷、 热的感受通道的变 化， 具有去敏化的钙通道特征。 渗透势的变化是冷、 热、 干旱逆境反应的共同特征， 也是水分
变化的本质， 通过比对发现 AtERDRT08 的同源基因存在于已知的所有多细胞生命体， 因此， 这一分子有可能是多细胞生物体感受水分或渗透变化的分子感应通道。
具体地， 根据本发明的实施例， 首先从拟南芥 (Arabdopsis t) 中克隆了 ERD 相关 基因的 15 个同源 CDS， 转化动物细胞 CHO 筛选到转化 AtERDRT08 基因 (At4g22120) 的细胞株 具有明显的渗透刺激钙信号， 通过鉴定获得 T-DNA 插入突变体， 观察突变体植株在高渗处 理条件下的萌发和生长情况， 发现突变体生长优于野生型， 由此初步验证了 AtERDRT08 基 因对水分变化信号的快速感应 ； 进一步， 利用双电极电压钳技术 (TEVC) 和体外异源表达系 统 - 非洲爪蟾卵母细胞， 表达分析了 AtERDRT08 离子通道活性、 发现 AtERDRT08 为一个 Ca2+ 通道， 而且在高渗处理时通道活性可以快速改变。 虽然 ERD 基因发现已经 10 多年的时间了， 但是大多数的工作主要集中在转录水平的研究， 即水分逆境诱导的转录水平变化。原初信 号的接收分子功能一直无从知晓， 解析何种分子将机械刺激的信号转化为具有生理功能的 生化信号， 是 Rasmussen1978 年提出钙第二信使之后， 30 多年来， 人们追求的目标， 至今为 止， 世界范围内没有任何的报道， 本发明通过推测， 利用异源细胞系 (CHO) 转化基因， 经过 渗透刺激筛选引起早期 (1 分钟之内 ) 钙信号的膜蛋白基因， 发现了具有感应和钙通道活性 的分子， 这一分子可以将渗透变化的原初机械刺激信号转化为生化的钙第二信使信号， 在 高渗刺激时， 通道活性可以导致细胞内钙流的快速波动， 形成具有脱敏特性的钙波 - 钙第 二信使， 由此启动应对水分变化的下游生理过程， 包括诱导应答基因的表达、 行使生理功能 等。本发明为有效利用这一基因资源打下了坚实的基础。 附图说明
图 1、 拟南芥 AtERDRT08 基因的克隆， AtERDRT08 基因的 PCR 扩增产物和 pEASY-T1 重组质粒的酶切及 PCR 鉴定， 其中，
图 1A ： M 为 Marker III(TransGene) ； lane2 为 AtERDRT08 的 PCR 结果 ；
图 1B ： M 为 Marker III(TransGene) ； lane1 为 AtERDRT08 的 BamHI/XbaI 酶切结 果；
图 1C ： M 为 1kb plus marker(TransGene) ； lane1， 9， 10， 12， 15 为菌落 PCR 检测结 果。
图 2、 拟南芥 AtERDRT08 转化 CHO 细胞， 检测钙荧光反应。
图 3、 Aterdrt08T-DNA 纯合突变体的鉴定，
图 3A ： 为基因组鉴定结果， M 为 Marker III(TransGene) ； lane1， 2， 3， 4， 5， 7， 8， 9， 10， 11， 12， 13 为 T-DNA insertion 检测结果， WT 为野生型 (Col-0)。
图 3B ： WT 为野生型 (Col-0) ； lane2 为 Aterdrt08 的 RNA 检测结果， 表示为纯合突 变体。
图 4、 Aterdrt08 表现出强烈地抵御高渗的能力
图 4A ： 左图为 1/2MS 培养基的结果 ； 右图为含 300mM 甘露醇的 1/2MS 培养基的结 果， 图中右为 Aterdrt08 ； 左为野生型 Col-0 ；
图 4B ： 突变体莲座叶的失水实验左为 Aterdrt08 ； 右为野生型 Col-0。
图 5、 拟南芥 AtERDRT08 表达载体的构建与鉴定
图 5A ： 左： lane1， 2， 3， 4， 5， 6， 7， 8， 9， 10， 11， 12， 13， 14， 16 为 pCAMBIA1302 菌落 PCR检测结果， M 为 Marker III(TransGene) ；
右： M 为 Marker III(TransGene) ； lane1 为 pCAMBIA1302 的 BamHI/XbaI 酶切结果。
图 5B ： lane1， 2， 3， 5， 6， 7 为 AtERDRT08 启动子 pBI101.1 菌落 PCR 检测结果 ； M为 Marker III(TransGene)。
图6： AtERDRT08 定位于原生质体质膜
从左至右依次为可见光、 红光、 绿光和红绿融合
图7 ： AtERDRT08 具有感应渗透变化的典型反应、 Ca2+ 通道活性和去敏化特征， 介导 2+ Ca 的瞬时内流
A： 基本浴液为 10mM MES-TRIS pH5.6， 1.8mM 氯化镁， 2mM 氯化钙， 30mM 氯化钠， 150mM 甘露醇 ； B： 10mM MES-TRIS pH5.6， 1.8mM 氯化镁， 30mM 氯化钙， 300mM 甘露醇， 溶液灌 流具体方式如图 7 所示。
图 8 为 pGEMHE 载体图。 具体实施方式
实施例 1 ： 拟南芥 AtERDRT08 基因的克隆 提取生长 4 周的拟南芥总 RNA 并以其为模板， 以 Oligo dT 为引物作逆转录， 反应 完成后取 1μl 逆转录产物作为模板， 以 At4g22120 特异引物 ERDRT8F 和 ERDRT8R 进行 PCR 扩增。结果得到约 2.3kb 左右的单一产物 ( 图 1A)。将此扩增条带纯化回收后， 与 peasyT1 Vector 连接的重组质粒， 并转化大肠杆菌感受态细胞 DH5α。挑取单克隆质粒进行酶切检 测 ( 图 1B) 及菌落 PCR 鉴定 ( 图 1C) 后， 选取阳性克隆并测序。
ERDRT8F ： ATGGCGACACTTCAGGATATTGG
ERDRT8R ： TTAGACTAGTTTACCACTAAAG
AtERDRT08 的 cDNA 序列及其编码的蛋白质的氨基酸序列如下 ： SEQ ID No.1 ：
MATLQDIGVS AGINILSAFV FFIIFAVLRL QPFNDRVYFS KWYLKGLRSS
PARGGAFAQR 60
FVNLDFRSYM KFLNWMPEAL KMPEPELIDH AGLDSVVYLR IYWLGLKIFT
PIAVLAWAVL 120
VPVNWTNNTL EMAKQLRNVT SSDIDKLSVS NIPEYSMRFW THIVMAYAFT
IWTCYVLMKF 180
YETIANMRLQ FVASEARRPD QFTVLVRNVP PDADESVSEL VEHFFLVNHP
DHYLTHQVVC 240
NANKLADLVK KKKKLQNWLD YYQLKYARNN SQRIMVKLGF
LGLWGQKVDA IEHYIAEIDK 300
ISKEISKERE EVVNDPKAIM PAAFVSFKTR WAAAVCAQTQ QTRNPTQWLT
EWAPEPRDVF 360
WSNLAIPYVS LTVRRLIMHV AFFFLTFFFI VPIAFVQSLA TIEGIVKAAP
FLKFIVDDKF 420
MKSVIQGFLP GIALKLFLAF LPSILMIMSK FEGFTSISSL ERRAAFRYYI
FNLVNVFLAS 480
VIAGAAFEQL NSFLNQSANQ IPKTIGVAIP MKATFFITYI MVDGWAGVAG EILMLKPLIM 540 FHLKNAFLVK TDKDREEAMD PGSIGFNTGE PRIQLYFLLG LVYAPVTPML LPFILVFFAL 600 AYIVYRHQII NVYNQEYESA AAFWPDVHGR VIAALVISQL LLMGLLGTKH AALAAPFLIA 660 LPVLTIGFHH FCKGRYEPAF IRYPLQEAMM KDTLETAREP NLNLKGYLQN AYVHPVFKGD 720 EDDYDIDDKL GKFEDEAIIV PTKRQSRRNT PAPSIISGDD SPSLPFSGKL V 771 SEQ ID No.2 ： atggcgacac ttcaggatat tggtgtatca gctgggataa acattctcag tgcctttgtt ttcttcataa tctttgcggt tttgaggctt cagcctttca atgatagagt ttacttctca aaatggtatc tcaaggggtt aagaagcagc cctgctcgtg gtggcgcctt tgcgcagagg tttgtgaacc tggacttcag gtcttatatg aagttcttga attggatgcc agaggctctg aagatgcctg atttactggc gtgccagtca tcgagcgaca actcatatag tatgagacaa cagttcactg gtagagcatt aatgcaaaca tactaccagc cttgggctat atatcaaaag ccagcagcgt cagacccgaa tggtcaaatc gccttcttct accattgaag atgaaatcgg ctgccatcca gagagacgag gttatcgctg atccccaaaa atggttgatg ttccatctca agcctgagct tggggcttaa actggactaa ttgacaaact taatggctta ttgctaacat tccttgttag ttttcctggt agctggccga tcaaatacgc ggggacaaaa agatcagtaa ttgtctcctt acccaaccca ttgctattcc tcctaacctt ggattgtgaa tgatacaagg ttttgatgat cagcgtttcg gagctgcgtt ccattggtgt gttgggcagg aaaacgcctt tattgatcat gatctttact taacacattg ctctgtttca tgcctttacc gaggctccag gaatgtacct caatcatcct tttggtgaaa taggaataac agtcgatgcc agaaagagag taaaacacga atggctgacc atatgtttct cttcttcatt agctgctccg tttccttccg catgtccaaa atattacatc tgaacagctt ggcgataccg agttgcagga cttggttaag760 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680gctggtttgg attcagttgt ttatctccgg ccaatagcag tgcttgcttg ggcagttctt gagatggcta agcagttaag gaatgtaact aatattccag agtattcaat gaggttttgg atctggactt gttatgtgct gatgaaagaa tttgttgcat cagaagctcg tcgacctgac ccggacgcag atgaatctgt aagtgaactg gatcactacc taacacatca ggttgtatgc aagaagaaaa agctgcagaa ttggcttgat tctcagagaa ttatggtgaa gcttggcttt attgaacatt acattgctga aattgacaaa gaagtggtga atgatcctaa ggccattatg tgggctgctg cggtttgtgc tcagactcaa gaatgggctc cagaaccgcg tgatgtgttt ctgacagtaa ggaggttgat catgcatgtt gtccccatcg cgtttgttca atctcttgct ttcttgaagt ttattgtaga tgataaattc ggtattgcac tgaagctttt cctcgccttt tttgaaggct tcacatcgat ctcatcttta ttcaacttag tgaacgtctt tcttgctagc aactctttcc tcaatcaatc cgcaaaccaa atgaaagcaa ctttcttcat cacgtatata gagattctaa tgctgaaacc attgattatg actgataaag acagagagga agcaatggac102329383 A CN 102329393
说明书6/7 页ccgggaagca ttggttttaa cacgggtgag cctcggatac agctctactt tcttctcggt 1740
cttgtctacg ctcctgtgac accgatgctt cttcctttta tcttggtctt cttcgccctt 1800
gcttacattg tatatcgcca ccaaatcatt aacgtataca atcaagaata cgagagtgct 1860
gcagcgtttt ggccagacgt tcatggacga gtcatagcag cattggtaat atcacagttg 1920
cttctgatgg gtctattggg aacaaagcac gctgcattag ctgcaccgtt tctcattgct 1980
ttgcctgtgc ttaccattgg tttccaccac ttctgcaaag gtcgttatga gccagctttc 2040
atcagatacc ctttacagga agctatgatg aaagatacat tagaaaccgc aagagaacca 2100
aacctgaacc ttaaaggcta cttgcaaaat gcttacgttc atccggtttt caaaggcgat 2160
gaagacgatt atgacattga tgacaagctc gggaagtttg aggatgaagc cattattgtt 2220
cccaccaaac gtcagtcgag gagaaatact ccggctccta gcataatcag tggggacgat 2280
tcgccgtctt tgccctttag tggtaaacta gtctaa 2316
实施例 2 ： 拟南芥 AtERDRT08 基因感应高渗刺激， 介导钙离子内流。
克隆 AtERDRT08 基因， 构建 pcDNA3.1 载体， 转染 CHO 细胞， 筛选稳定表达的细胞 系， Fura2 染色， 含有 10mM CaCl2 的高渗和等渗溶液灌流， 通过荧光显微镜观察记录， 经过 高渗和等渗处理的细胞系， 发现高渗处理可以记录到明显的钙离子内流， 即钙离子的荧光， 恢复等渗溶液后， 荧光消失， 表明 AtERDRT08 具有感应高渗刺激的功能， 同时， 还可以转化 为生化信号， 即钙离子的内流波动 ( 图 2)， 以其他粒子取代灌流液中的钙离子， 未观察到荧 光信号变化。 实施例 3 ： 拟南芥 AtERDRT08 基因 T-DNA 插入突变体的获得以及表型分析
购买 AtERDRT08 基因的 T-DNA 插入突变体， 采用 “双引物法” 对突变体进行鉴定 ( 图 3A)， 然后挑选鉴定为纯和插入突变的植株提取 RNA 进行鉴定 ( 图 3B)。结果显示已经 成功获得该基因的插入突变体。
将获得突变体种子与野生型的种子一起进行高渗处理 ( 在 1/2MS 培养基中加入 300mM 的 Mannitol)， 结果发现突变体的生长状况都优于野生型植株 ( 图 4A)， 此外还发现与 野生型相比， 突变体植株失水更快 ( 图 4B)。 证明 AtERDRT08 在植物早期脱水反应过程中发 挥作用。
实施例 4 ： 拟南芥 AtERDRT08 基因的真核表达载体的构建及亚细胞定位分析
1、 拟南芥 AtERDRT08 表达载体的构建
将拟南芥 AtERDRT08 构建到 pCAMBIA1302 载体中 ( 该载体购自 Invitrogen 公 司 )， 将该基因上游 2.0Kb 的片段作为启动子区构建到 pBI101.1 载体中 ( 该载体购自 Invitrogen 公司 )， 转化大肠杆菌后， 提取质粒并检测 ( 图 5)。
2、 重组质粒的瞬时表达
将构建好的 pCAMBIA1302::AtERDRT08 质粒， 通过 PEG 介导转化拟南芥原生质体， 进行瞬时表达， 在激光共聚焦显微镜下观察 AtERDRT08 在细胞内的定位 ( 图 6)。
实施例 5 ： 拟南芥 AtERDRT08 基因的电生理功能分析
将拟南芥 AtERDRT08 基因构建到 pGEMHE 载体 ( 该载体最先由 Harvard Medical School 的 Liman 等将非洲爪蟾的一个 β-globin 基因的 3’ -UTR 和 5’ UTR 引入 pGEM-3Z 载体改造而成， 本实验所用的 pGEMHE 载体由 University of California at Berkeley 的 Dr.E Y.Isacoff 赠与， 载体结构图参见图 8)( 载体鉴定如图 5A)， 以特异引物 M13 和 M13R
背景技术 植物感知、 适应逆境涉及一系列复杂的基因表达网络调控， 细胞受到逆境胁迫之 后， 通过感应分子的作用能迅速感知外界信号， 依靠复杂的信号转导途径， 一方面激活特定 转录调控因子， 与特定的顺时作用元件结合， 进而调控目标基因的转录表达， 另一个方面， 在翻译后水平激活特异的修饰蛋白， 调节靶蛋白和靶基因， 最终提高植物的耐逆性。
植物在从感知胁迫的信号到基因表达产生适应性的过程中， 进化出一系列复杂机 制以最大限度减轻胁迫伤害， 其中一些基因在快速应答的过程中起了至关重要的作用， 它 们成为将物理性的逆境信号， 如： 干旱、 高温、 低温等逆境， 转化为生化信号的原初载体， 脱 水或渗透势的变化是这类逆境反应的共同特征， 即： 引起细胞模形变的机械刺激， 在转录水 平上， 植物中发现了一类快速应答诱导基因， 命名为 ERD 基因 ( 脱水诱导早期应答基因 ) (Taji T， et al.， 1999)， 主要结果局限在拟南芥的研究， 然而原初的信号接收分子， 却一直 是一个不解之谜。
在拟南芥中已经找到 16 个 ERD 成员， 这些基因分别属于叶绿体 ATP 蛋白依赖酶， 热激蛋白 hsp70-1 和 hsp80-2、 质膜蛋白、 脯氨酸脱氢酶、 糖转运蛋白、 衰老诱导基因， 硫代 谷胱甘肽转移酶、 II 型 LEA 蛋白、 茉莉酸甲酯合成酶和泛素蛋白等。
ERD1 基因是拟南芥中研究比较深入的一个脱水诱导早期应答基因， 编码一个类 似叶绿素蛋白酶的调节亚基 (Nakashima K， et， al.1997， Lam-Son P T， et， al.， 2007)。 ERD2、 ERD8 和 ERD16 受干旱胁迫强烈表达， 分别属于热激蛋白 hsp70-1、 hsp80-2 和泛素蛋 白 (Kiyosue T， et， al.， 1994)。ERD4 编码一个膜蛋白， 推测有 9 个跨膜区， 但它的功能目 前还不清楚 (Froehlich J E， et， al， ， 2003)。ERD5 编码脯氨酸脱氢酶 (ProDH)， 催化脯氨 酸转化成谷氨酸的第一步反应 (Nakashima K， et， al.， 1998)。ERD6 是在拟南芥干旱胁迫 1h 后获得的， 研究表明该基因编码的蛋白具有 12 个跨膜区， 并且有一个亲水中心， 属于糖 转运蛋白， 受干旱和冷诱导表达 (Kiyosue T， et， al， .1998)。ERD10 和 ERD14 属于 II 型 LEA 蛋白家族 (Kiyosue T， et， al.， 1994)。ERD14 在磷酸化的状态下具有离子结合的活性， 2+ 2+ 主要结合 Ca 和 Fe 离子， 它的作用机制还在研究中 (Muath KA， et， al.， 2003)。ERD11 和 ERD13 编码的产物属于硫代谷胱甘肽转移酶 (Kyiosue T， et， al.， 1993)。ERD15 可能是一 个新的与 ABA 信号胁迫相关的调节器， 该基因的功能和作用机制还需要深入研究 (Kariola T， et， al.， 2006)。综上所述， 在拟南芥中获得的 16 个 ERD 基因属于不同的基因家族， 作用 不同的代谢途径， 它们可能分别通过感知并传递信号胁迫， 产生功能蛋白， 参与重要的代谢 反应， 降解毒素等不同的方式增强拟南芥的耐逆性。
水分的重要性不言而喻， 越来越严重的干旱等逆境胁迫对作物产量的影响尤为严
植物在从感知胁迫的信号到基因表达产生适应性的过程中， 进化出一系列复杂机 制以最大限度减轻胁迫伤害， 其中一些基因在快速应答的过程中起了至关重要的作用， 它 们成为将物理性的逆境信号， 如： 干旱、 高温、 低温等逆境， 转化为生化信号的原初载体， 脱 水或渗透势的变化是这类逆境反应的共同特征， 即： 引起细胞模形变的机械刺激， 在转录水 平上， 植物中发现了一类快速应答诱导基因， 命名为 ERD 基因 ( 脱水诱导早期应答基因 ) (Taji T， et al.， 1999)， 主要结果局限在拟南芥的研究， 然而原初的信号接收分子， 却一直 是一个不解之谜。
在拟南芥中已经找到 16 个 ERD 成员， 这些基因分别属于叶绿体 ATP 蛋白依赖酶， 热激蛋白 hsp70-1 和 hsp80-2、 质膜蛋白、 脯氨酸脱氢酶、 糖转运蛋白、 衰老诱导基因， 硫代 谷胱甘肽转移酶、 II 型 LEA 蛋白、 茉莉酸甲酯合成酶和泛素蛋白等。
ERD1 基因是拟南芥中研究比较深入的一个脱水诱导早期应答基因， 编码一个类 似叶绿素蛋白酶的调节亚基 (Nakashima K， et， al.1997， Lam-Son P T， et， al.， 2007)。 ERD2、 ERD8 和 ERD16 受干旱胁迫强烈表达， 分别属于热激蛋白 hsp70-1、 hsp80-2 和泛素蛋 白 (Kiyosue T， et， al.， 1994)。ERD4 编码一个膜蛋白， 推测有 9 个跨膜区， 但它的功能目 前还不清楚 (Froehlich J E， et， al， ， 2003)。ERD5 编码脯氨酸脱氢酶 (ProDH)， 催化脯氨 酸转化成谷氨酸的第一步反应 (Nakashima K， et， al.， 1998)。ERD6 是在拟南芥干旱胁迫 1h 后获得的， 研究表明该基因编码的蛋白具有 12 个跨膜区， 并且有一个亲水中心， 属于糖 转运蛋白， 受干旱和冷诱导表达 (Kiyosue T， et， al， .1998)。ERD10 和 ERD14 属于 II 型 LEA 蛋白家族 (Kiyosue T， et， al.， 1994)。ERD14 在磷酸化的状态下具有离子结合的活性， 2+ 2+ 主要结合 Ca 和 Fe 离子， 它的作用机制还在研究中 (Muath KA， et， al.， 2003)。ERD11 和 ERD13 编码的产物属于硫代谷胱甘肽转移酶 (Kyiosue T， et， al.， 1993)。ERD15 可能是一 个新的与 ABA 信号胁迫相关的调节器， 该基因的功能和作用机制还需要深入研究 (Kariola T， et， al.， 2006)。综上所述， 在拟南芥中获得的 16 个 ERD 基因属于不同的基因家族， 作用 不同的代谢途径， 它们可能分别通过感知并传递信号胁迫， 产生功能蛋白， 参与重要的代谢 反应， 降解毒素等不同的方式增强拟南芥的耐逆性。
水分的重要性不言而喻， 越来越严重的干旱等逆境胁迫对作物产量的影响尤为严
重， 从感应水分的原初反应出发， 发掘关键的分子开关基因， 并对其功能进行深入的解析， 从而利用这一分子的特性， 不仅可以为抗旱 ( 逆 ) 育种提供具有巨大应用价值的基因资源， 也可以为人类应对水分的流失或皮肤的衰老提供全新的防护理论。 发明内容 本发明的发明人为了解决上述问题提出并完成了这一发明。
本发明的目的是提供一种植物体内的渗透或水分变化感应的蛋白分子。
本发明的再一目的是提供一种植物体内的渗透或水分变化感应的基因。
本发明的再一目的是提供上述植物体内的渗透或水分变化感应蛋白分子的应用。
根据本发明的植物体内的渗透变化或水分感应的蛋白分子， 其氨基酸序列如 SEQ ID No.1 所示。
根据本发明的植物体内的渗透变化或水分感应的基因， 编码上述蛋白分子， 优选 地， 其核苷酸序列如 SEQ ID No.2 所示。
本发明还提供了上述植物体内的渗透或水分变化感应的蛋白分子作为钙离子通 道的应用。
钙离子作为细胞的第二信使， 其胞内浓度的变化或者说波动， 可以启动一系列的 生理反应过程， 根据本发明的技术方案， 所述钙离子通道的定义为 ： 钙离子通道是可以介导 钙离子快速跨膜转运的分子结构， 细胞内钙离子的波动， 主要是依赖钙离子通道的调控。 细 胞的渗透势可以帮助维持细胞的形状， 物质的流动， 渗透势的变化， 反应细胞内水分和离子 浓度的变化， 也会引起细胞形状的变化。本发明发明阐述了 AtERDRT08 分子， 据二级结构 分析具有两个明显的功能区， 首先是作为水分变化的感应分子， 其中一部分 ( 如 ： 膜外结构 域 ) 能感知渗透势引起的细胞膜的轻微变动， 并将这种变化传导到分子的另一部分 ( 通道 结构域 )， 通过这一分子的通道结构部分， 行使钙通道的功能， 将原初感知、 传递和启动钙第 二信使合为一个分子， 这也是本发明的一个最重要的特性， 也是 30 多年来， 很多研究者孜 孜以求， 而未发现的原初信号感应、 接收分子。
本发明还提供了包含上述植物体内的渗透变化或水分感应的基因的植物表达载 体。
本发明还提供了上述植物体内的渗透变化或水分感应的蛋白分子用于感应植物 体内的渗透变化或水信号变化的应用。
进而， 本发明还提供了上述植物体内的渗透变化或水分感应的蛋白分子用于植物 抗旱的应用。
本发明首先选定具有跨膜结构域的 ERD4 和 ERD6 类似同源基因家族为研究对象， 将 15 个 CDS 克隆到 pcDNA3.1， 转化 CHO 细胞， 获得了多个转化的细胞株， 通过 Fura2 荧光 检测筛选， 转化 AtERDRT08(At4g22120) 的细胞株与转化空白质粒 pcDNA3.1 对照细胞株相 比， 经过高渗溶液处理， 可获得显著瞬时上升的钙信号 ( 图 1)， 同时获得了 AtERDRT08 相关 基因的 T-DNA 突变体库， 然后利用不同的逆境因子处理， 获得了同一个基因的两个耐高渗 胁迫的纯和突变体株系， 具有强烈抵御高渗的能力， 进一步分析发现， 这一基因可对渗透势 的变化作出快速而精细的反应， 介导钙离子的快速内流， 类似动物中冷、 热的感受通道的变 化， 具有去敏化的钙通道特征。 渗透势的变化是冷、 热、 干旱逆境反应的共同特征， 也是水分
变化的本质， 通过比对发现 AtERDRT08 的同源基因存在于已知的所有多细胞生命体， 因此， 这一分子有可能是多细胞生物体感受水分或渗透变化的分子感应通道。
具体地， 根据本发明的实施例， 首先从拟南芥 (Arabdopsis t) 中克隆了 ERD 相关 基因的 15 个同源 CDS， 转化动物细胞 CHO 筛选到转化 AtERDRT08 基因 (At4g22120) 的细胞株 具有明显的渗透刺激钙信号， 通过鉴定获得 T-DNA 插入突变体， 观察突变体植株在高渗处 理条件下的萌发和生长情况， 发现突变体生长优于野生型， 由此初步验证了 AtERDRT08 基 因对水分变化信号的快速感应 ； 进一步， 利用双电极电压钳技术 (TEVC) 和体外异源表达系 统 - 非洲爪蟾卵母细胞， 表达分析了 AtERDRT08 离子通道活性、 发现 AtERDRT08 为一个 Ca2+ 通道， 而且在高渗处理时通道活性可以快速改变。 虽然 ERD 基因发现已经 10 多年的时间了， 但是大多数的工作主要集中在转录水平的研究， 即水分逆境诱导的转录水平变化。原初信 号的接收分子功能一直无从知晓， 解析何种分子将机械刺激的信号转化为具有生理功能的 生化信号， 是 Rasmussen1978 年提出钙第二信使之后， 30 多年来， 人们追求的目标， 至今为 止， 世界范围内没有任何的报道， 本发明通过推测， 利用异源细胞系 (CHO) 转化基因， 经过 渗透刺激筛选引起早期 (1 分钟之内 ) 钙信号的膜蛋白基因， 发现了具有感应和钙通道活性 的分子， 这一分子可以将渗透变化的原初机械刺激信号转化为生化的钙第二信使信号， 在 高渗刺激时， 通道活性可以导致细胞内钙流的快速波动， 形成具有脱敏特性的钙波 - 钙第 二信使， 由此启动应对水分变化的下游生理过程， 包括诱导应答基因的表达、 行使生理功能 等。本发明为有效利用这一基因资源打下了坚实的基础。 附图说明
图 1、 拟南芥 AtERDRT08 基因的克隆， AtERDRT08 基因的 PCR 扩增产物和 pEASY-T1 重组质粒的酶切及 PCR 鉴定， 其中，
图 1A ： M 为 Marker III(TransGene) ； lane2 为 AtERDRT08 的 PCR 结果 ；
图 1B ： M 为 Marker III(TransGene) ； lane1 为 AtERDRT08 的 BamHI/XbaI 酶切结 果；
图 1C ： M 为 1kb plus marker(TransGene) ； lane1， 9， 10， 12， 15 为菌落 PCR 检测结 果。
图 2、 拟南芥 AtERDRT08 转化 CHO 细胞， 检测钙荧光反应。
图 3、 Aterdrt08T-DNA 纯合突变体的鉴定，
图 3A ： 为基因组鉴定结果， M 为 Marker III(TransGene) ； lane1， 2， 3， 4， 5， 7， 8， 9， 10， 11， 12， 13 为 T-DNA insertion 检测结果， WT 为野生型 (Col-0)。
图 3B ： WT 为野生型 (Col-0) ； lane2 为 Aterdrt08 的 RNA 检测结果， 表示为纯合突 变体。
图 4、 Aterdrt08 表现出强烈地抵御高渗的能力
图 4A ： 左图为 1/2MS 培养基的结果 ； 右图为含 300mM 甘露醇的 1/2MS 培养基的结 果， 图中右为 Aterdrt08 ； 左为野生型 Col-0 ；
图 4B ： 突变体莲座叶的失水实验左为 Aterdrt08 ； 右为野生型 Col-0。
图 5、 拟南芥 AtERDRT08 表达载体的构建与鉴定
图 5A ： 左： lane1， 2， 3， 4， 5， 6， 7， 8， 9， 10， 11， 12， 13， 14， 16 为 pCAMBIA1302 菌落 PCR检测结果， M 为 Marker III(TransGene) ；
右： M 为 Marker III(TransGene) ； lane1 为 pCAMBIA1302 的 BamHI/XbaI 酶切结果。
图 5B ： lane1， 2， 3， 5， 6， 7 为 AtERDRT08 启动子 pBI101.1 菌落 PCR 检测结果 ； M为 Marker III(TransGene)。
图6： AtERDRT08 定位于原生质体质膜
从左至右依次为可见光、 红光、 绿光和红绿融合
图7 ： AtERDRT08 具有感应渗透变化的典型反应、 Ca2+ 通道活性和去敏化特征， 介导 2+ Ca 的瞬时内流
A： 基本浴液为 10mM MES-TRIS pH5.6， 1.8mM 氯化镁， 2mM 氯化钙， 30mM 氯化钠， 150mM 甘露醇 ； B： 10mM MES-TRIS pH5.6， 1.8mM 氯化镁， 30mM 氯化钙， 300mM 甘露醇， 溶液灌 流具体方式如图 7 所示。
图 8 为 pGEMHE 载体图。 具体实施方式
实施例 1 ： 拟南芥 AtERDRT08 基因的克隆 提取生长 4 周的拟南芥总 RNA 并以其为模板， 以 Oligo dT 为引物作逆转录， 反应 完成后取 1μl 逆转录产物作为模板， 以 At4g22120 特异引物 ERDRT8F 和 ERDRT8R 进行 PCR 扩增。结果得到约 2.3kb 左右的单一产物 ( 图 1A)。将此扩增条带纯化回收后， 与 peasyT1 Vector 连接的重组质粒， 并转化大肠杆菌感受态细胞 DH5α。挑取单克隆质粒进行酶切检 测 ( 图 1B) 及菌落 PCR 鉴定 ( 图 1C) 后， 选取阳性克隆并测序。
ERDRT8F ： ATGGCGACACTTCAGGATATTGG
ERDRT8R ： TTAGACTAGTTTACCACTAAAG
AtERDRT08 的 cDNA 序列及其编码的蛋白质的氨基酸序列如下 ： SEQ ID No.1 ：
MATLQDIGVS AGINILSAFV FFIIFAVLRL QPFNDRVYFS KWYLKGLRSS
PARGGAFAQR 60
FVNLDFRSYM KFLNWMPEAL KMPEPELIDH AGLDSVVYLR IYWLGLKIFT
PIAVLAWAVL 120
VPVNWTNNTL EMAKQLRNVT SSDIDKLSVS NIPEYSMRFW THIVMAYAFT
IWTCYVLMKF 180
YETIANMRLQ FVASEARRPD QFTVLVRNVP PDADESVSEL VEHFFLVNHP
DHYLTHQVVC 240
NANKLADLVK KKKKLQNWLD YYQLKYARNN SQRIMVKLGF
LGLWGQKVDA IEHYIAEIDK 300
ISKEISKERE EVVNDPKAIM PAAFVSFKTR WAAAVCAQTQ QTRNPTQWLT
EWAPEPRDVF 360
WSNLAIPYVS LTVRRLIMHV AFFFLTFFFI VPIAFVQSLA TIEGIVKAAP
FLKFIVDDKF 420
MKSVIQGFLP GIALKLFLAF LPSILMIMSK FEGFTSISSL ERRAAFRYYI
FNLVNVFLAS 480
VIAGAAFEQL NSFLNQSANQ IPKTIGVAIP MKATFFITYI MVDGWAGVAG EILMLKPLIM 540 FHLKNAFLVK TDKDREEAMD PGSIGFNTGE PRIQLYFLLG LVYAPVTPML LPFILVFFAL 600 AYIVYRHQII NVYNQEYESA AAFWPDVHGR VIAALVISQL LLMGLLGTKH AALAAPFLIA 660 LPVLTIGFHH FCKGRYEPAF IRYPLQEAMM KDTLETAREP NLNLKGYLQN AYVHPVFKGD 720 EDDYDIDDKL GKFEDEAIIV PTKRQSRRNT PAPSIISGDD SPSLPFSGKL V 771 SEQ ID No.2 ： atggcgacac ttcaggatat tggtgtatca gctgggataa acattctcag tgcctttgtt ttcttcataa tctttgcggt tttgaggctt cagcctttca atgatagagt ttacttctca aaatggtatc tcaaggggtt aagaagcagc cctgctcgtg gtggcgcctt tgcgcagagg tttgtgaacc tggacttcag gtcttatatg aagttcttga attggatgcc agaggctctg aagatgcctg atttactggc gtgccagtca tcgagcgaca actcatatag tatgagacaa cagttcactg gtagagcatt aatgcaaaca tactaccagc cttgggctat atatcaaaag ccagcagcgt cagacccgaa tggtcaaatc gccttcttct accattgaag atgaaatcgg ctgccatcca gagagacgag gttatcgctg atccccaaaa atggttgatg ttccatctca agcctgagct tggggcttaa actggactaa ttgacaaact taatggctta ttgctaacat tccttgttag ttttcctggt agctggccga tcaaatacgc ggggacaaaa agatcagtaa ttgtctcctt acccaaccca ttgctattcc tcctaacctt ggattgtgaa tgatacaagg ttttgatgat cagcgtttcg gagctgcgtt ccattggtgt gttgggcagg aaaacgcctt tattgatcat gatctttact taacacattg ctctgtttca tgcctttacc gaggctccag gaatgtacct caatcatcct tttggtgaaa taggaataac agtcgatgcc agaaagagag taaaacacga atggctgacc atatgtttct cttcttcatt agctgctccg tttccttccg catgtccaaa atattacatc tgaacagctt ggcgataccg agttgcagga cttggttaag760 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680gctggtttgg attcagttgt ttatctccgg ccaatagcag tgcttgcttg ggcagttctt gagatggcta agcagttaag gaatgtaact aatattccag agtattcaat gaggttttgg atctggactt gttatgtgct gatgaaagaa tttgttgcat cagaagctcg tcgacctgac ccggacgcag atgaatctgt aagtgaactg gatcactacc taacacatca ggttgtatgc aagaagaaaa agctgcagaa ttggcttgat tctcagagaa ttatggtgaa gcttggcttt attgaacatt acattgctga aattgacaaa gaagtggtga atgatcctaa ggccattatg tgggctgctg cggtttgtgc tcagactcaa gaatgggctc cagaaccgcg tgatgtgttt ctgacagtaa ggaggttgat catgcatgtt gtccccatcg cgtttgttca atctcttgct ttcttgaagt ttattgtaga tgataaattc ggtattgcac tgaagctttt cctcgccttt tttgaaggct tcacatcgat ctcatcttta ttcaacttag tgaacgtctt tcttgctagc aactctttcc tcaatcaatc cgcaaaccaa atgaaagcaa ctttcttcat cacgtatata gagattctaa tgctgaaacc attgattatg actgataaag acagagagga agcaatggac102329383 A CN 102329393
说明书6/7 页ccgggaagca ttggttttaa cacgggtgag cctcggatac agctctactt tcttctcggt 1740
cttgtctacg ctcctgtgac accgatgctt cttcctttta tcttggtctt cttcgccctt 1800
gcttacattg tatatcgcca ccaaatcatt aacgtataca atcaagaata cgagagtgct 1860
gcagcgtttt ggccagacgt tcatggacga gtcatagcag cattggtaat atcacagttg 1920
cttctgatgg gtctattggg aacaaagcac gctgcattag ctgcaccgtt tctcattgct 1980
ttgcctgtgc ttaccattgg tttccaccac ttctgcaaag gtcgttatga gccagctttc 2040
atcagatacc ctttacagga agctatgatg aaagatacat tagaaaccgc aagagaacca 2100
aacctgaacc ttaaaggcta cttgcaaaat gcttacgttc atccggtttt caaaggcgat 2160
gaagacgatt atgacattga tgacaagctc gggaagtttg aggatgaagc cattattgtt 2220
cccaccaaac gtcagtcgag gagaaatact ccggctccta gcataatcag tggggacgat 2280
tcgccgtctt tgccctttag tggtaaacta gtctaa 2316
实施例 2 ： 拟南芥 AtERDRT08 基因感应高渗刺激， 介导钙离子内流。
克隆 AtERDRT08 基因， 构建 pcDNA3.1 载体， 转染 CHO 细胞， 筛选稳定表达的细胞 系， Fura2 染色， 含有 10mM CaCl2 的高渗和等渗溶液灌流， 通过荧光显微镜观察记录， 经过 高渗和等渗处理的细胞系， 发现高渗处理可以记录到明显的钙离子内流， 即钙离子的荧光， 恢复等渗溶液后， 荧光消失， 表明 AtERDRT08 具有感应高渗刺激的功能， 同时， 还可以转化 为生化信号， 即钙离子的内流波动 ( 图 2)， 以其他粒子取代灌流液中的钙离子， 未观察到荧 光信号变化。 实施例 3 ： 拟南芥 AtERDRT08 基因 T-DNA 插入突变体的获得以及表型分析
购买 AtERDRT08 基因的 T-DNA 插入突变体， 采用 “双引物法” 对突变体进行鉴定 ( 图 3A)， 然后挑选鉴定为纯和插入突变的植株提取 RNA 进行鉴定 ( 图 3B)。结果显示已经 成功获得该基因的插入突变体。
将获得突变体种子与野生型的种子一起进行高渗处理 ( 在 1/2MS 培养基中加入 300mM 的 Mannitol)， 结果发现突变体的生长状况都优于野生型植株 ( 图 4A)， 此外还发现与 野生型相比， 突变体植株失水更快 ( 图 4B)。 证明 AtERDRT08 在植物早期脱水反应过程中发 挥作用。
实施例 4 ： 拟南芥 AtERDRT08 基因的真核表达载体的构建及亚细胞定位分析
1、 拟南芥 AtERDRT08 表达载体的构建
将拟南芥 AtERDRT08 构建到 pCAMBIA1302 载体中 ( 该载体购自 Invitrogen 公 司 )， 将该基因上游 2.0Kb 的片段作为启动子区构建到 pBI101.1 载体中 ( 该载体购自 Invitrogen 公司 )， 转化大肠杆菌后， 提取质粒并检测 ( 图 5)。
2、 重组质粒的瞬时表达
将构建好的 pCAMBIA1302::AtERDRT08 质粒， 通过 PEG 介导转化拟南芥原生质体， 进行瞬时表达， 在激光共聚焦显微镜下观察 AtERDRT08 在细胞内的定位 ( 图 6)。
实施例 5 ： 拟南芥 AtERDRT08 基因的电生理功能分析
将拟南芥 AtERDRT08 基因构建到 pGEMHE 载体 ( 该载体最先由 Harvard Medical School 的 Liman 等将非洲爪蟾的一个 β-globin 基因的 3’ -UTR 和 5’ UTR 引入 pGEM-3Z 载体改造而成， 本实验所用的 pGEMHE 载体由 University of California at Berkeley 的 Dr.E Y.Isacoff 赠与， 载体结构图参见图 8)( 载体鉴定如图 5A)， 以特异引物 M13 和 M13R
进行 PCR 扩增， 将产物做 Capping RNA， 通过显微注射技术将其注射到 Xenopus oocytes 中 表达约 2 天， 再利用 TEVC(Two-electrode voltage-clamp) 技术对 AtERDRT08 基因做电生 理分析。结果表明该基因具有 Ca2+ 通道活性， 而且高渗灌流 (300mM Mannitol， 10mM HEPS 2+ pH7.4， 10mM CaC1) 时， 介导 Ca 的瞬时内流， 具有典型去敏化特征， 用同样的溶液刺激， Ca2+ 的瞬时内流越来越小 ； 当灌流液中 Mg2+ 取代 Ca2+， 纪录不到明显的阳离子内流， 用其他的单 + + + + 价阳离子 (K 、 Na 、 Li 、 NH4 ) 得到相似的结论。因此， 结合 CHO 的钙离子荧光的测定结果 ( 实施例 2)， AtERDRT08 在异源系统中表达， 可以特异的选择 Ca2+， 不选择其他的单价阳离 + + + + 2+ 2+ 子： K、 Na 、 Li 、 NH4 和 Mg 、 Ba 等二价阳离子， 阴离子的变化也不影响其活性， 只介导 Ca2+ 的内流， 离子通道的活性被渗透势变化调节， 高渗透势激活者一同到活性， 说明本发明的分 2+ 子为感应渗透变化的 Ca 通道。9102329383 A CN 102329393
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