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用于减轻肺部炎症的左氧氟沙星吸入剂
    相关申请的交叉引用
     本申请要求 2008 年 10 月 7 日提交的题目为 “用于减轻肺部炎症的左氧氟沙星的 局部使用” 的第 61/103,496 号美国临时申请的优先权， 其以引用的形式以其整体并入本文。
     发明领域 本发明涉及治疗肺部炎症的方法和组合物。特别地， 本发明提供了使用左氧氟沙 星或氧氟沙星气雾剂减轻肺部炎症的方法和组合物。
     背景
     炎症是血管化组织对损伤的反应， 其感觉为红、 热、 肿胀和疼痛且通常伴随不同程 度的功能丧失。在其持续时间短的急性期中， 包括血管渗出物和间质水肿以及炎症细胞的 渗透增加， 中性粒细胞显著增加。在湿粘膜组织中， 例如沿呼吸道排列的那些， 还可有表面 上皮细胞和粘液分泌的损失。这种形式的炎症反应被认为是保护性的， 且因此在短期内对 宿主是有益的。 然而， 如果损伤为反复的或严重的， 炎症渗透的特征可变为一种占优势的单 核细胞 ( 即淋巴细胞、 单核细胞和巨噬细胞 ) 且其可能成为持续的。
     炎症疾病折磨世界各地的数百万人， 造成痛苦、 经济损失和早逝。和诸如哮喘、 慢 性阻塞性肺病 (COPD) 的炎性肺部疾病一样， 其它的炎性疾病包括过敏性鼻炎、 类风湿关节 炎、 骨关节炎、 炎性肠病和牛皮癣。炎性鼻窦疾病包括由于急性、 亚急性和慢性感染造成的 鼻窦炎 ； 过敏性鼻炎 ； 以及由于诸如过敏、 枯草热、 过敏性鼻炎、 鼻炎和哮喘的其它潜在原 因导致的炎症， 其影响鼻腔或四鼻窦， 其各自具有左半球和右半球、 额窦、 上颌窦、 筛窦和蝶 窦。
     慢性炎症可由未解决症状的急性炎症发展而成或可由潜伏数月时间而没有明显 临床表现的急性发病演化。慢性炎症的组织病理学特征包括占优势的巨噬细胞和淋巴细 胞， 培育的结构多样和高渗透型小血管、 纤维化和坏疽的增殖。 激活的巨噬细胞和淋巴细胞 在释放增强免疫反应的炎症介质或细胞因子中相互作用。 细胞因子包括一系列生物反应调 节剂， 其包括白介素、 趋化因子、 干扰素、 生长因子和白细胞集落刺激因子。 细胞因子由白细 胞、 结缔组织细胞和内皮细胞分泌。趋化因子由 8- 至 10-kd 蛋白质组成， 当一部分宿主对 抗原侵入反应时， 所述蛋白质刺激白细胞补充和迁移。 在慢性炎症中， 延长的炎症反应常同 时伴随组织的破坏和修复。
     概述
     本发明涉及治疗肺部炎症的方法和组合物。特别地， 本发明提供了使用左氧氟沙 星或氧氟沙星气雾剂降低肺部炎症的方法和组合物。
     某些实施方案包括治疗个体肺部炎症的方法， 其中所述方法包括给予有需要的个 体包含左氧氟沙星或氧氟沙星以及二价或三价阳离子的溶液的气雾剂。
     某些实施方案包括治疗个体的肺部炎症的方法， 其中所述肺部炎症由一种或多种 促炎细胞因子诱导， 其中所述方法包括给予有需要的个体包含左氧氟沙星或氧氟沙星以及 二价或三价阳离子的溶液的气雾剂以实现所述细胞因子的肺部浓度降低至少 10％。
     某些实施方案包括治疗个体的肺部炎症的方法， 其中所述方法包括给予有需要的 个体包含左氧氟沙星或氧氟沙星以及二价或三价阳离子的溶液的气雾剂以实现降低一种 或多种促炎细胞因子的肺部浓度， 所述促炎细胞因子包括 IL-1β、 IL-6 和 IL-8， 由此降低 或抑制所述肺部炎症。
     某些实施方案包括治疗个体的肺部炎症的方法， 其中所述肺部炎症由一种或多种 包括 TNFα 和 LPS 的介质诱导， 其中所述方法包括给予有需要的个体包含左氧氟沙星或氧 氟沙星以及二价或三价阳离子的溶液的气雾剂。
     某些实施方案包括降低个体促炎细胞因子的肺部浓度的方法， 其中所述方法包括 给予有需要的个体包含左氧氟沙星或氧氟沙星以及二价或三价阳离子的溶液的气雾剂， 由 此降低所述细胞因子的肺部浓度。
     附图简述
     图 1A 示出对用对照、 TNFα 及具有左氧氟沙星、 莫西沙星或环丙沙星的 TNFα 处 理反应的 NL20 细胞产生的 IL-6 水平的图表。图 1B 示出对用对照、 TNFα 及具有左氧氟沙 星、 莫西沙星或环丙沙星的 TNFα 反应的 NL20 细胞产生的 IL-8 水平的图表。
     图 2A 示出对用对照、 LPS 及具有左氧氟沙星、 莫西沙星或环丙沙星的 LPS 反应的 HBE135 细胞产生的 IL-6 水平的图表。图 2B 示出对用对照、 LPS 及具有左氧氟沙星、 莫西沙 星或环丙沙星的 LPS 反应的 HBE135 细胞产生的 IL-8 水平的图表。 图 3A 示出使用增加浓度的左氧氟沙星、 莫西沙星或环丙沙星处理的 NL20 细胞的 细胞存活百分比的图表。图 3B 示出使用增加浓度的左氧氟沙星、 莫西沙星或环丙沙星处理 的 HBE135 细胞的细胞存活百分比的图表。
     图 4A 示出对增加浓度的左氧氟沙星及配有 MgCl2 的左氧氟沙星反应的用 TNF-α 处理的 NL20 细胞产生的相对 IL-6 水平的图表。图 4B 示出对增加浓度的左氧氟沙星及配 有 MgCl2 的左氧氟沙星反应的用 TNF-α 处理的 NL20 细胞产生的相对 IL-8 水平的图表。图 4C 示出对增加浓度的左氧氟沙星及配有 MgCl2 的左氧氟沙星反应的用 LPS 处理的 HBE135 细胞产生的相对 IL-6 水平的图表。图 4D 示出对增加浓度的左氧氟沙星及配有 MgCl2 的左 氧氟沙星反应的用 LPS 处理的 HBE 细胞产生的相对 IL-8 水平的图表。
     图 5A 示出对用对照、 TNF-α 及具有 10μg/ml、 30μg/ml、 100μg/ml 或 300μg/ ml 的左氧氟沙星或妥布霉素处理反应的 NL20 细胞产生的 IL-6 水平的图表。图 5A 示出对 用对照、 TNF-α 及具有 10μg/ml、 30μg/ml、 100μg/ml 或 300μg/ml 的左氧氟沙星或妥布 霉素处理反应的 NL20 细胞产生的 IL-8 水平的图表。结果为三次重复的平均值 ±SD。*P ＜ 0.005。
     图 6 示出对用 LPS 及具有增加浓度的左氧氟沙星或妥布霉素的 LPS 处理反应的 HBE135 细胞产生的 IL-6 和 IL-8 水平的图表。相对于仅使用 LPS(n ＝ 3) 处理的细胞， 显 * ** 示 IL-6 和 IL-8 水平。 P ＜ 0.05， 与仅使用 LPS 相比， 使用 LPS 和抗生素处理的细胞。 P ＜ 0.005， 与仅使用 LPS 相比， 使用 LPS 和抗生素处理的细胞。
     图 7A 示出用对照 ； LPS ； 以及 10μg/ml、 30μg/ml、 100μg/ml、 300μg/ml 的左氧 氟沙星和 LPS 处理的 THP-1 细胞中的 IL-1β 水平的图表。图 7B 示出用对照 ； LPS ； 以及 10μg/ml、 30μg/ml、 100μg/ml、 300μg/ml 的左氧氟沙星和 LPS 处理的 THP-1 细胞中的 TNFα 水平的图表。图 7C 示出用对照 ； LPS ； 以及 10μg/ml、 30μg/ml、 100μg/ml、 300μg/
     ml 的左氧氟沙星和 LPS 处理的 THP-1 细胞中的 IL-6 水平的图表。图 7D 示出用对照 ； LPS ； 以及 10μg/ml、 30μg/ml、 100μg/ml、 300μg/ml 的左氧氟沙星和 LPS 处理的 THP-1 细胞中 的 IL-8 水平的图表。单独使用 LPS 或使用具有左氧氟沙星的 LPS 孵育细胞 24h。用 ELISA 测定细胞培养基中的细胞因子浓度。结果表示为平均值 ±SD(n ＝ 3)。*P ＜ 0.05， 与仅使 ** 用 LPS 相比， 使用 LPS 和抗生素处理的细胞。 P ＜ 0.005， 与仅使用 LPS 相比， 使用 LPS 和 抗生素处理的细胞。
     图 8 示出用对照； TNFα ； TNFα 和 100μg/ml 的 左 氧 氟 沙 星 ； 以 及 TNFα 和 100μg/ml 的左氧氟沙星刺激的 NL20 细胞中相对的 IL-8mRNA 的水平的图表。接种细胞， 血清饥饿 24h， 并添加单独的 TNFα 或具有抗生素的 TNFα， 并孵育 24h。用实时 PCR 检测 mRNA 水平。结果表示为四次重复的平均值 ±SD。
     图 9 示出用对照； TNFα ； TNFα 和 100μg/ml 的 左 氧 氟 沙 星 ； 以 及 TNFα 和 100μg/ml 的左氧氟沙星刺激的 NL20 细胞中构造的 NFκB 启动子的相对荧光素酶活性的图 表。使用报道基因质粒转染细胞， 并在使用单独的 TNFα 或具有抗生素的 TNFα 处理 24h 之后， 接着孵育另外 8h。使用商用检验检测 NFκB- 依赖的荧光素酶活性。结果表示为六次 重复的平均值 ±SD。 图 10A 示出用 60mg/kg 的盐水、 60mg/kg 的配有 MgCl2 的左氧氟沙星或 60mg/kg 的 妥布霉素处理的小鼠的 BAL 中的 MIP-2 水平的图表。图 10B 示出用 60mg/kg 的盐水、 60mg/ kg 的配有 MgCl2 的左氧氟沙星或 60mg/kg 的妥布霉素处理的小鼠的 BAL 中的 IL-6 水平的 图表。
     详述
     本发明涉及治疗与肺部炎症有关的病症和疾病的方法和组合物。特别地， 本发明 提供了使用配有二价或三价阳离子的左氧氟沙星或氧氟沙星的气雾剂降低炎症的方法和 组合物。 某些实施方案包括通过直接给予炎症部位局部配有二价或三价阳离子的左氧氟沙 星或氧氟沙星的气雾剂治疗肺或上呼吸道的急性或慢性炎症。
     对肺的损伤和随后在慢性炎症中发生的肺功能衰退主要由嗜中性组织渗透介导， 所述嗜中性组织渗透通过释放多种水解和氧化酶诱导随后的损伤。在粘膜表面上串联的 这种炎症由产生脂多糖 (LPS) 的细菌介导， 且所述 LPS 诱导 TNFα 从巨噬细胞中释放或直 接释放在肺上皮表面。TNFα 以及诸如 IL-8 和 IL-6 的炎症细胞因子二者的释放， 导致嗜 中性粒细胞活化和趋化。当细菌感染在炎症过程中起重要作用时， 还认为在囊性纤维化或 其它疾病中受损的氯化物分泌也对细胞因子水平的增加负有部分责任 (Perez A. 等人 Am J.Physiol.Lung Cell Mol Physiol(2007)292 ： 383-395， 以其整体以引用的形式并入 )。
     已经发现， 局部给予配有二价或三价阳离子的左氧氟沙星能显著降低体外和体内 的细胞因子和趋化因子产生水平。促炎细胞因子水平的这种降低可导致嗜中性粒细胞 - 介 导的炎症的减少。促炎细胞因子的实例包括 IL-1、 IL-6、 IL-7 和 IL-8。通过吸入能将高浓 度的左氧氟沙星给予肺和上呼吸道。 出人意料地， 在肺中， 具有二价或三价阳离子的左氧氟 沙星制剂比仅含左氧氟沙星的制剂具有更大的有效性。因此， 本发明涉及通过给予配有诸 2+ 如 Mg 的二价或三价阳离子的气雾化的诸如左氧氟沙星的氟喹诺酮减轻肺和上呼吸道炎 症的方法和组合物。
     降低慢性炎症的治疗方法为改善 CF 和 COPD 患者的肺功能的可行策略。非甾体
     抗炎剂 (NSAID)( 例如布洛芬 ) 和阿奇霉素的抗炎性质已经与某些 CF 患者亚群的受益有 关 (Flume PA， 等人 Cystic fibrosis pulmonary guidelines ： chronic medications for maintenance of lung health.( 肺囊性纤维化指南 ： 维持肺健康的慢性药物 )Am J Respir Crit Care Med 2007 ； 176 ： 957-969， 以其整体以引用的形式并入 )。此外， 红霉素抗生 素降低了 COPD 患者的肺部恶化的发生率 (Seemungal TA 等人 Long-term erythromycin therapy is associated with decreased chronic obstructive pulmonary disease exacerbations.( 长期红霉素治疗与降低慢性阻塞性肺病恶化有关 )Am J Respir Crit Care Med 2008 ； 178 ： 1139-1147， 以其整体以引用的形式并入 )。 在这些环境中阿奇霉素和 红霉素的效力可能在很大程度上是由于免疫调节和抗炎作用而非抗菌作用。
     某些氟喹诺酮可具有免疫调节活性以及抗菌活性。在也为细胞毒的浓度下， 这些 活性可为不同的且仅在体内是明显的。某些氟喹诺酮可通过与多种细胞因子和趋化因子 的产生和分泌有关的多种信号通路影响它们的免疫调节活性。然而， 并非所有的氟喹诺酮 都显示免疫调节活性。 而且， 不同的氟喹诺酮禁止不同的反应， 例如诱导或抑制特定的细胞 因子和趋化因子。免疫调节活性还可依赖于细胞类型、 免疫刺激物和氟喹诺酮的浓度。例 如， 诸如莫西沙星和格帕沙星而不是环丙沙星的氟喹诺酮能抑制诸如 IL-8、 IL-6、 ERK1/2、 JNK 和 NFκB 的促炎因子在人肺上皮细胞中分泌 (Blau， H.， K. 等人， 2007， Moxifloxacin but not ciprofloxacin or azithromycin selectively inhibits IL-8， IL-6， ERK1/2， JNK， and NF-kappaB activation in a cystic fibrosis epithelial cell line.( 莫 西沙 星而 不是 环丙沙 星 或阿奇霉素选 择性抑制 IL-8、 IL-6、 ERK1/2、 JNK 和 NF-κB 在 囊性纤维化上皮细胞系中活化 )Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 292 ： L343-52 ； Donnarumma， G.， I. 等人， 2007， Anti-inflammatory effects of moxifloxacin and human beta-defensin 2association in human lung epithelial cell line(A549)stimulated with lipopolysaccharide.( 在用脂多糖刺激的人肺上皮细胞系 (A549) 中莫西沙星和 人 β- 防 卫 素 2 的 结 合 的 抗 炎 效 果 )Peptides 28 ： 2286-92 ； Hashimoto， S.， K. 等 人， 2000， Grepafloxacin inhibits tumor necrosis factor-alpha-induced interleukin-8 expression in human airway epithelial cells.( 格帕沙星抑制肿瘤坏死因子 -α- 诱导 的白介素 -8 在人呼吸道上皮细胞中表达 )Life Sci 66 ： PL 77-82， 以其整体以引用的形式 并入 )。然而， 在所有研究中， 使用浓度小于 50μg/ml 的抗生素处理细胞， 所述浓度相当于 全身给药之后获得的血清药物浓度。
     在扁桃体淋巴细胞中， 左氧氟沙星在 50mg/L 的浓度下抑制 TNF-α 和 IFNγ 产生， 并且在 5mg/L 的浓度下抑制 IL-8 产生。此外， 左氧氟沙星抑制在从鼻息肉患者的鼻上皮细 胞中释放的 RANTES。然而， 左氧氟沙星对促炎因子产生的抑制活性远低于诸如环丙沙星和 莫西沙星的其它氟喹诺酮的抑制活性。例如， 左氧氟沙星对诸如 TNF-α、 IL-1 和 IL-8 的促 炎因子产生的抑制活性需要 100mg/L 的左氧氟沙星。
     如本文所述， 永生化人呼吸道上皮细胞保留了呼吸道上皮细胞的某些特征， 且已 被广泛用于描述其它抗生素的免疫调节效果 (Blau， H.， K. 等人 Moxifloxacin but not ciprofloxacin or azithromycin selectively inhibits IL-8， IL-6， ERK1/2， JNK， and NF-kappaB activation in a cystic fibrosis epithelial cell line.( 莫西沙 星而不是环丙沙星或阿奇霉素选择性抑制 IL-8、 IL-6、 ERK1/2、 JNK 和 NF-κB 在囊性纤维化上皮细胞系中活化 )Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2007， 292 ： L343-52h 和 Donnarumma， G.， I. 等人 Anti-inflammatory effects of moxifloxacin and human beta-defensin 2 association in human lung epithelial cell line(A549)stimulated with lipopolysaccharide.( 在用脂多糖刺激的人肺上皮细胞系 (A549) 中莫西沙星和人 β- 防卫素 2 的结合的抗炎效果 )Peptides 2007， 28 ： 2286-92， 以其整体以引用的形式并 入 )。在那些细胞中的 IL-6 和 IL-8 产生能受 TNFα 或受以高浓度存在于 CF 和 COPD 患者 的肺液中的细菌 LPS 的强烈诱导 (Sagel SD 等人 Sputum biomarkers of inflammation in cystic fibrosis lung disease.( 在囊性纤维化肺疾病中炎症的痰生物标志 )Proc Am Thorac Soc 2007 ； 4： 406-417， 以其整体以引用的形式并入 )。IL-6 和 IL-8 二者在 调节 CF 肺的炎症反应中是非常重要的， 因为后者对诱导嗜中性粒细胞趋化具有最强的潜 力 (Strieter RM.Interleukin-8 ： a very important chemokine of the human airway epithelium.( 白介素 -8 ： 人呼吸道上皮细胞的非常重要的趋化因子 )Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2002 ； 283 ： L688-689， 以其整体以引用的形式并入 )。 已经发现， 在培育 的人呼吸道上皮细胞中， 左氧氟沙星产生 TNFα 和 LPS 诱导的 IL-6 和 IL-8 水平的剂量依 赖性降低。左氧氟沙星还降低了人单核细胞中 LPS 诱导的 IL-1β、 IL-6 和 IL-8 产生。此 外， 左氧氟沙星降低了体内的 IL-6 和 IL-8 产生。
     定义
     术语 “给药 (administration)” 或 “给药 (administering)” 是指给予脊椎动物一 定剂量的抗炎药物组合物的方法。给药的优选方法能够依赖多种因素而变化， 例如药物组 合物的成分、 炎症的部位以及急性炎症的严重性。
     “载体” 或 “赋形剂” 为用于促进给予化合物， 例如用于增加化合物的溶解性的化合 物或材料。固体载体包括， 例如淀粉、 乳糖、 磷酸二钙、 蔗糖和高岭土。液体载体包括， 例如 无菌水、 盐水、 缓冲剂、 非离子表面活性剂和诸如油、 花生油和芝麻油的食用油。此外， 可以 包括诸如在本领域中常用的多种佐剂。在文献中描述了这些和其它这样的化合物， 例如在 Merck Index， Merck&Company， Rahway， NJ. 中描述的。例如在以其整体以引用的方式并入 本文的 Gilman et al.(Eds.)(1990) ； Goodman 和 Gilman 的 The Pharmacological Basis of Therapeutics( 治疗学的药理学基础 )， 第八版， Pergamon Press 中描述了药物组合物 中包含的多种成分的考虑。
     术语 “哺乳动物” 以其通常的生物学含义使用。因此， 其具体包括人、 牛、 马、 狗和 猫， 但还包括许多其它物种。
     术语 “药物可接受的载体” 或 “药物可接受的赋形剂” 包括任何和所有溶剂、 分散介 质、 包衣、 抗菌剂和抗真菌剂、 等渗剂和吸收延迟剂 (absorption delaying agent) 等。用 于药物活性物质的这样的介质和作用剂的使用为本领域公知的。 除目前与活性成分不相容 的任何介质或作用剂之外， 预期将其用于治疗组合物。还能将补充活性成分并入组合物。
     术语 “药物可接受的盐” 是指保留本发明化合物的生物有效性和特性的盐， 且其不 是生物学的或其他不需要的盐。在许多情况下， 本发明的化合物能通过存在的氨基和 / 或 羧基或与其相似的基团形成酸和 / 或碱盐。能用无机酸和有机酸形成药物可接受的酸加成 盐。 能从其获得盐的无机酸包括， 例如盐酸、 氢溴酸、 硫酸、 硝酸、 磷酸等。 能从其获得盐的有 机酸包括， 例如醋酸、 丙酸、 萘甲酸、 油酸、 棕榈酸、 双羟萘酸 ( 扑酸 )、 硬脂酸、 羟基乙酸、 丙酮酸、 草酸、 马来酸、 丙二酸、 琥珀酸、 富马酸、 酒石酸、 柠檬酸、 抗坏血酸、 葡庚糖酸、 葡糖醛 酸、 乳酸、 乳糖酸、 酒石酸、 苯甲酸、 肉桂酸、 扁桃酸、 甲磺酸、 乙磺酸、 对甲苯磺酸、 水杨酸等。 能用无机碱和有机碱形成药物可接受的碱加成盐。能从其获得盐的无机碱包括， 例如钠、 钾、 锂、 铵、 钙、 镁、 铁、 锌、 铜， 锰、 铝等 ； 特别优选的是铵、 钾、 钠、 钙和镁盐。能从其获得盐的 有机碱包括， 例如伯胺、 仲胺和叔胺， 取代的胺， 其包括自然产生取代的胺、 环胺、 碱性离子 交换树脂等， 具体地例如异丙胺、 三乙胺、 二乙胺、 三乙胺、 三丙胺、 组氨酸、 精氨酸、 赖氨酸、 苯乙苄胺、 N- 甲基葡糖胺和乙醇胺。其它酸包括十二烷基硫酸、 萘 -1， 5- 二磺酸、 萘 -2- 磺 酸和糖精。
     “溶剂化物” 是指由溶剂和氟喹诺酮抗菌剂、 代谢物或其盐的相互作用形成的化合 物。合适的溶剂化物为包括水合物在内的药物可接受的溶剂化物。
     “治疗有效量” 或 “药物有效量” 是指如本发明公开的具有治疗效果的氟喹诺酮抗 炎剂。在治疗中有效的氟喹诺酮抗炎剂的剂量为治疗有效量。因此， 如本文所用的治疗有 效量是指如由临床试验结果和 / 或模型动物抗炎研究所判断的产生期望治疗效果的氟喹 诺酮抗炎剂的那些量。 在特定的实施方案中， 按预定剂量给予氟喹诺酮抗炎剂， 因此治疗有 效量为所述给作用剂量的量。 该量和氟喹诺酮抗炎剂的量能由本领域技术人员常规确定且 依赖诸如所涉及的特殊炎症的若干因素而变化， 所述因素例如炎症部位， 炎症的严重性。 该 量还能依赖患者的身高、 体重、 性别、 年龄和病史。 对于预防治疗， 治疗有效量为对预防特定 炎症有效的量。 “治疗效果” 在某种程度上缓解炎症的一种或多种症状， 且包括治愈炎症。 “治愈” 是指消除炎症的症状。然而， 炎症的某些长期或永久影响可即使在得到治愈之后仍存在 ( 例如大量组织损伤 )。如本文使用的 “治疗效果” 的定义为统计学上显著减少的炎症、 炎 症出现或如通过人临床结果或动物研究所检测的炎症症状的改善。
     如本文所用的 “治疗 (Treat)” 、 “治疗 (treatment)” 或 “治疗 (treating)” 是指为 了预防和 / 或治疗目的给予药物组合物。术语 “预防性治疗” 是指治疗还未患有炎症但易 患特定炎症或以其他方式处于特定炎症危险中的患者， 使得炎症的发病降低。 术语 “治疗性 治疗” 是指对已经患炎症的患者给予治疗。因此， 在优选的实施方案中， 治疗是给予哺乳动 物 ( 治疗或预防目的 ) 治疗有效量的氟喹诺酮抗炎剂。
     术语 “给药间隔” 是指在多个给药方案中， 给予药物的两个连续剂量之间的时间。 例如， 在口服给予环丙沙星的情况下， 其每日给予两次 ( 常规疗程为 400mg b.i.d) 和在口 服给予左氧氟沙星的情况下， 其每日给予一次 (500mg 或 750mg q.d.)， 给药间隔分别为 12 小时和 24 小时。
     如本文所用的药物的体内浓度的 “高峰期” 的定义为当药物浓度不小于其最大血 浆或炎症部位浓度的 50％时， 药物给药间隔的时间。在某些实施方案中， “高峰期” 用于描 述抗炎剂量的间隔。
     “呼吸递送剂量” 为在等于或小于 5 微米的呼吸模拟器的吸气阶段吸入的药物的 量， 使用的模拟器被设计为每分钟呼吸 15 次的欧洲标准模式， 吸气与呼气的比例为 1 ∶ 1。
     如本文使用的， “肺部浓度” 能够包括个体肺中的物质浓度、 个体痰中的物质浓度 和 / 或个体的支气管肺泡灌洗中的物质浓度。应当理解， 能通过多种方法检测 “肺部浓度” 。
     治疗或预防的方法
     在某些实施方案中， 提供了用于治疗具体包括哺乳动物在内的动物炎症的方法， 其用配有二价或三价阳离子的氟喹诺酮抗炎剂治疗患这样的炎症的动物且具有提高的肺 部有效性。在某些实施方案中， 可采用气雾剂形式和吸入剂给予氟喹诺酮抗炎剂。由于肠 胃外递送的抗炎剂需要高的肠胃外剂量水平 ( 其能导致不期望的副作用 ) 或由于缺乏任何 临床有效的抗炎剂， 所以该治疗方法尤其适用于治疗使用肠胃外递送的抗炎剂难以治疗的 肺部炎症。 在一个这样的实施方案中， 该方法可用于直接向炎症部位给予氟喹诺酮抗炎剂。 这样的方法可减少全身暴露且最大化炎症部位抗炎剂的量。
     在某些实施方案中， 可以作为治疗或结合预防或用其它气雾剂、 口服或肠胃外抗 生素交替治疗顺序给予氟喹诺酮气雾剂治疗。通过非限制性实例， 这可包括妥布霉素和 / 或其它氨基糖苷类气雾剂、 氨曲南和 / 或其它 β- 巴坦或单 - 巴坦 (bactam)、 碳青霉烯类气 雾剂、 环丙沙星和 / 或其它氟喹诺酮类气雾剂、 阿奇霉素和 / 或其它大环内脂类或酯内酮类 气雾剂、 四环素和 / 或其它四环素类、 奎奴普汀和 / 或其它链酶杀阳菌素类、 利奈唑胺和 / 或其它噁唑烷酮类、 万古霉素和 / 或其它糖肽类、 红霉素、 以及氯霉素和 / 或其它苯丙醇类、 以及粘杆菌素和 / 或其它多粘菌素类气雾剂。
     此外， 本文提供的组合物和方法能够包括与另外的活性剂结合或交替治疗顺序作 为治疗或预防给予的氟喹诺酮气雾剂治疗。如上所述， 某些这样的另外的作用剂包括抗生 素。更多另外的作用剂能够包括支气管扩张药、 抗胆碱能药、 糖皮质激素、 类花生酸抑制剂 及其组合。 支气管扩张药的实例包括沙丁胺醇、 左旋沙丁胺醇、 特布他林、 非诺特罗、 特布他 林、 吡布特罗、 丙卡特罗、 比托特罗、 利米特罗、 卡布特罗、 妥布特罗、 瑞普特罗、 沙美特罗、 福 莫特罗、 阿福特罗、 班布特罗、 克伦特罗、 茚达特罗、 茶碱、 罗氟司特、 西洛司特。抗胆碱能药 的实例包括异丙托溴铵和噻托溴铵。糖皮质激素的实例包括强的松、 氟替卡松、 布地奈德、 莫米松、 环索奈德和倍氯米松。类花生酸的实例包括孟鲁司特、 普仑司特、 扎鲁司特、 齐留 通、 雷马曲班和塞曲司特。 更多另外的作用剂能够包括百慕时 (pulmozyme)、 高渗盐水、 恢复 CF 中氯通道功能的作用剂、 吸入的 β- 兴奋剂、 吸入的抗毒蕈碱剂、 吸入的皮质甾类和吸入 或口服的磷酸二酯酶抑制剂。更多另外的作用剂包括 CFTR 调节剂， 例如 VX-770、 阿他卢仑 (atluren)、 VX-809。更多另外的作用剂包括恢复呼吸道表面液体的作用剂， 例如地纽福索 (denufosol)、 甘露醇、 GS-9411、 和 SPI-8811。更多另外的作用剂能够包括抗炎剂， 例如布 洛芬、 西地那非和斯伐他汀。更多另外的作用剂包括抗炎剂。抗炎剂的实例包括甾族和非 甾族抗炎剂。甾族抗炎剂的实例包括 21- 乙酰氧基孕烯醇酮、 阿氯米松、 阿尔孕酮、 安西奈 德、 倍氯米松、 倍他米松、 氯泼尼松、 环索奈德， 氯倍他索、 氯倍他松、 氯可托龙、 氯泼尼醇、 皮 质酮、 可的松、 可的伐唑、 地夫可特、 desciclesonide、 地奈德、 去羟米松、 地塞米松、 双氟拉 松、 二氟可龙、 双氟泼尼酯、 甘草次酸、 氟扎可特、 氟氯奈德、 氟美松、 氟尼缩松、 氟轻松、 氟轻 松醋酸酯、 氟可丁丁酯、 氟可龙、 氟米龙、 醋酸氟培龙、 醋酸氟泼尼定、 氟泼尼龙、 氟氢缩松、 丙酸氟替卡松、 醛基缩松、 哈西奈德、 卤倍他索丙酸酯、 卤米松、 醋酸卤泼尼松、 氢可他酯、 氢 化可的松、 衣碳氯替泼诺、 马坡尼酮、 甲羟松、 甲泼尼松、 甲基强的松龙、 糠酸莫米他松、 帕拉 米松、 泼尼卡酯、 泼尼松龙、 25- 二乙基氨基 - 醋酸泼尼松龙、 泼尼松龙磷酸钠、 强的松、 泼 尼松龙戊酸酯、 泼尼立定、 利美索龙、 替可的松、 曲安西龙、 曲安奈德、 苯曲安奈德、 己曲安奈 德、 任何它们的衍生物、 类似物及其组合。非甾族抗炎剂的实例包括 COX 抑制剂 (COX-1 或 COX 非特异性抑制剂 )( 例如水杨酸酸衍生物、 阿司匹林、 水杨酸钠、 三水杨酸胆碱镁、 双水杨酯、 二氟苯水杨酸、 柳氮磺胺吡啶和奥沙拉嗪 ； 诸如对乙酰氨基酚的对氨基酚衍生物 ； 诸 如吲哚美辛和舒林酸的吲哚和茚乙酸 ； 诸如托美丁、 双氯芬酸和酮咯酸的杂芳基乙酸 ； 诸 如布洛芬、 萘普生、 氟比洛芬、 酮洛芬、 非诺洛芬和奥沙普嗪的芳基丙酸 ； 诸如甲芬那酸和美 洛昔康的邻氨基苯甲酸 ( 芬那酸 ) ； 诸如昔康类 ( 吡罗昔康、 美洛昔康 ) 的烯醇酸和诸如萘 丁美酮的链烷酮和选择性的 COX-2 抑制剂 ( 例如， 诸如罗非昔布的二芳基取代的呋喃酮 ； 诸如塞来昔布的二芳基取代的吡唑 ； 诸如依托度酸的吲哚乙酸和诸如尼美舒利的磺酰苯胺 (sulfonanilide))。
     药物组合物
     对于本文所述的方法， 可使用吸入器给予具有提高的肺部有效性的配有二价或三 价阳离子的氟喹诺酮抗炎剂。在某些实施方案中， 以适用于气雾剂形式的药物组合物的形 式制备本文所公开的氟喹诺酮抗炎剂， 其具有良好的口感、 储存稳定性和患者安全性以及 耐受性。 在某些实施方案中， 为了耐受性、 抗炎活性和稳定性可最优化制成的氟喹诺酮的异 构体含量。
     制剂能够包含二价或三价阳离子。所述二价或三价阳离子能够包括， 例如镁、 钙、 锌、 铜、 铝和铁。 在某些实施方案中， 溶液包含氯化镁、 硫酸镁、 氯化锌或氯化铜。 在某些实施 方案中， 二价或三价阳离子的浓度能够为约 25mM 至约 400mM、 约 50mM 至约 400mM、 约 100mM 至约 300mM、 约 100mM 至约 250mM、 约 125mM 至约 250mM、 约 150mM 至约 250mM、 约 175mM 至 约 225mM、 约 180mM 至约 220mM 和约 190mM 至约 210mM。在某些实施方案中， 氯化物的浓度 能够为约 25mM 至约 800mM、 约 50mM 至约 400mM、 约 100mM 至约 300mM、 约 100mM 至约 250mM、 约 125mM 至约 250mM、 约 150mM 至约 250mM、 约 175mM 至约 225mM、 约 180mM 至约 220mM 和约 190mM 至约 210mM。在某些实施方案中， 氯化镁、 硫酸镁、 氯化锌或氯化铜的浓度为约 5％至 约 25％、 约 10％至约 20％和约 15％至约 20％。 在某些实施方案中， 氟喹诺酮与二价或三价 阳离子的比例能够为 1 ∶ 1 至 2 ∶ 1 或 1 ∶ 1 至 1 ∶ 2。
     如本文所述的使用的非限制性的氟喹诺酮包括左氧氟沙星、 氧氟沙星、 环丙沙星、 依诺沙星、 加替沙星、 吉米沙星、 洛美沙星、 莫西沙星、 诺氟沙星、 培氟沙星、 司帕沙星、 加雷 沙星、 西他沙星和 DX-619。
     所述制剂含有的诸如左氧氟沙星或氧氟沙星的氟喹诺酮的浓度能大于约 50mg/ ml、 约 60mg/ml、 约 70mg/ml、 约 80mg/ml、 约 90mg/ml、 约 100mg/ml、 约 110mg/ml、 约 120mg/ ml、 约 130mg/ml、 约 140mg/ml、 约 150mg/ml、 约 160mg/ml、 约 170mg/ml、 约 180mg/ml、 约 190mg/ml 和约 200mg/ml。在某些实施方案中， 所述制剂含有的诸如左氧氟沙星或氧氟沙星 的氟喹诺酮浓度为约 50mg/ml 至约 200mg/ml、 约 75mg/ml 至约 150mg/ml、 约 80mg/ml 至约 125mg/ml、 约 80mg/ml 至约 120mg/ml、 约 90mg/ml 至约 125mg/ml、 约 90mg/ml 至约 120mg/ml 和约 90mg/ml 至约 110mg/ml。
     所述制剂的重量摩尔渗透压浓度能够为约 300mOsmol/kg 至约 500mOsmol/kg、 约 325mOsmol/kg 至约 450mOsmol/kg、 约 350mOsmol/kg 至约 425mOsmol/kg 和约 350mOsmol/ kg 至 约 400mOsmol/kg。 在 某 些 实 施 方 案 中， 所述制剂的重量摩尔渗透压浓度大于约 300mOsmol/kg、 约 325mOsmol/kg、 约 350mOsmol/kg、 约 375mOsmol/kg、 约 400mOsmol/kg、 约 425mOsmol/kg、 约 450mOsmol/kg、 约 475mOsmol/kg 和约 500mOsmol/kg。
     所述制剂的 pH 能够为约 4.5 至约 8.5、 约 5.0 至约 8.0、 约 5.0 至约 7.0、 约 5.0 至约 6.5、 约 5.5 至约 6.5 和 6.0 至约 6.5。
     所述制剂能够包含常规的药物载体、 赋形剂等 ( 例如甘露醇、 乳糖、 淀粉、 硬脂酸 镁、 糖精钠、 滑石、 纤维素、 交联羧甲基纤维素钠、 葡萄糖、 明胶、 蔗糖、 碳酸镁等 )， 或诸如湿 润剂、 乳化剂、 加溶剂、 pH 缓冲剂等 ( 例如醋酸钠、 柠檬酸钠、 环糊精衍生物、 脱水山梨糖醇 单月桂酸酯、 三乙醇胺醋酸酯、 三乙醇胺油酸酯等 ) 的辅助物质。在某些实施方案中， 所述 制剂能够缺少常规药物载体、 赋形剂等。某些实施方案包括不含乳糖的制剂。某些实施方 案包含浓度小于约 10％、 5％、 1％或 0.1％的乳糖。在某些实施方案中， 所述制剂基本上包 含左氧氟沙星或氧氟沙星以及二价或三价阳离子。
     在某些实施方案中， 制剂能够包含浓度为约 75mg/ml 至约 150mg/ml 的左氧氟 沙星， 浓度为约 150mM 至约 250mM 的氯化镁， pH 为约 5 至约 7， 重量摩尔渗透压浓度为约 300mOsmol/kg 至约 500mOsmol/kg 且不含乳糖。
     在某些实施方案中， 制剂包含浓度为约 100mg/ml 的左氧氟沙星， 浓度为约 200mM 的氯化镁， pH 为约 6.2， 重量摩尔渗透压浓度为约 383mOsmol/kg 且不含乳糖。在某些实施 方案中， 制剂基本上包含浓度为约 100mg/ml 的左氧氟沙星、 浓度为约 200mM 的氯化镁、 pH 为 约 6.2、 重量摩尔渗透压浓度为约 383mOsmol/kg 且不含乳糖。 在某些实施方案中， 剂型包含 浓度为约 100mg/ml 的左氧氟沙星， 浓度为约 200mM 的氯化镁， pH 为约 6.2， 重量摩尔渗透压 浓度为约 383mOsmol/kg 且不含乳糖。
     给药
     以治疗有效剂量给予配有二价或三价阳离子并具有提高的肺部有效性的氟喹诺 酮抗炎剂， 所述剂量例如足以给前面描述的疾病状态提供治疗的剂量。 当然， 给予的活性化 合物的量依赖治疗的个体和疾病状态、 炎症的严重性、 给药的方式和安排以及处方医师的 判断 ； 例如， 对于左氧氟沙星的气雾剂给予的可能剂量范围为每天约 20mg 至 300mg， 分别用 于较长或较短的肺部半衰期的所选择的活性剂。在某些实施方案中， 对于左氧氟沙星的气 雾剂给予的可能剂量范围为约 20mg 至 300mg BID( 每日两次 )。
     能通过为相似用途服务的任何可接受的给予作用剂的方式给予本文公开的氟喹 诺酮抗菌剂或其药物可接受的盐， 所述方式包括但不限于气雾剂吸入。以其整体以引用的 形式并入的第 2006/0276,483 号美国专利申请公开描述了递送的方法、 设备和组合物。
     药物可接受的组合物包括固体、 半固体、 液体和气雾剂型， 例如散剂、 液体剂、 悬浮 剂、 络合剂、 脂质体、 颗粒剂等。 优选地， 以适用于精确剂量的单一给药的单位剂型提供所述 组合物。
     能单独地或以某些替换物的形式， 与常规的药物载体、 赋形剂等 ( 例如甘露醇、 乳糖、 淀粉、 硬脂酸镁、 糖精钠、 滑石、 纤维素、 交联羧甲基纤维素钠、 葡萄糖、 明胶、 蔗糖、 碳 酸镁等 ) 结合给予氟喹诺酮抗炎剂。必要时， 药物组合物还能包含少量的无毒辅助物质， 例如湿润剂、 乳化剂、 加溶剂、 pH 缓冲剂等 ( 例如醋酸钠、 柠檬酸钠、 环糊精衍生物、 脱水 山梨糖醇单月桂酸酯、 三乙醇胺醋酸酯、 三乙醇胺油酸酯等 )。通常， 取决于预期的给药方 式， 以重量计， 药物制剂包含约 0.005％至 95％， 优选地为约 0.5％至 50％的本发明的化合 物。 制备这样的剂型的实际方法对本领域技术人员来说为已知的或显而易见的， 例如， 参见 Remington′ s Pharmaceutical Sciences( 雷氏药学大全 )， Mack Publishing Company， Easton， Pennsylvania。在一个优选的实施方案中， 所述组合物采取单位剂型的形式， 例如包含液体、 悬浮 的固体、 干燥的粉末、 lyophilate 或其它组合物的瓶， 并由此所述组合物可包含活性成分以 及诸如乳糖、 蔗糖、 磷酸二钙等的稀释剂 ； 诸如硬脂酸镁等的润滑剂以及诸如淀粉、 阿拉伯 树胶、 聚乙烯吡咯烷、 明胶、 纤维素、 纤维素衍生物等的粘合剂。
     能通过例如将如上所定义的活性化合物以及任选的药物佐剂溶解、 分散等在载体 ( 例如水、 盐水、 水性右旋糖、 丙三醇、 乙二醇、 乙醇等 ) 中以形成溶液或悬浮液来制备液态 药物可给予的组合物。 在气雾剂产生和吸入之前， 能以液体溶液或悬浮液、 乳剂或适用于溶 解或悬浮在液体中的固体形式的常规形式制备待气雾化的溶液。 包含在这样的气雾剂组合 物中的活性化合物的百分比高度依赖其特性以及所述化合物的活性和个体的需要。然而， 溶液中活性成分的百分比为 0.01％至 90％为适合使用的， 且如果所述组合物为固体时所 述百分比将更高， 随后将其稀释至上述百分比。在某些实施方案中， 在溶液中， 组合物包含 1.0％至 50.0％的活性剂。
     能以每日约 1、 2、 3、 4 或更多次， 每周 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7 或更多次， 每月 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 或更多次的频率给予本文所述的组合物。在特定的实施方案中， 每日给予两次所 述组合物。
     气雾剂递送
     对于肺部给药， 避免上呼吸道， 而对中和下呼吸道给药。 可通过经口和喉吸入气雾 剂来完成肺部药物递送。通常， 质量中质空气流动力学直径 (MMAD) 大于约 5 微米的颗粒不 能达到肺 ； 反而， 它们倾向于压迫喉的后部并被吞下且能口服吸收。直径为约 2 至约 5 微米 的颗粒足够小以能达到上肺区域至中肺区域 ( 传导性气道 )， 但太大而不能到达肺泡。 更小 的颗粒， 即约 0.5 至约 2 微米的颗粒能到达肺泡区域。尽管非常小的颗粒可被呼出， 但是直 径小于约 0.5 微米的颗粒还能通过沉降沉积在肺泡区域。
     在一个实施方案中， 基于进行本文公开的 MMAD 主要为约 2 至约 5 微米的氟喹诺 酮抗炎剂气雾剂的形成来选择喷雾器。在一个实施方案中， 氟喹诺酮抗炎剂的递送量为 呼吸感染提供治疗效果。喷雾器能递送包含质量中质空气流动力学直径为约 2 微米至约 5 微米且几何标准差小于或等于约 2.5 微米、 质量中质空气流动力学直径为约 2.5 微米至 约 4.5 微米且几何标准差小于或等于约 1.8 微米以及质量中质空气流动力学直径为约 2.8 微米至约 4.3 微米且几何标准差小于或等于约 2 微米的气雾剂。在某些实施方案中， 能由 喷射式喷雾器 (jet nebulizer) 产生气雾剂。在某些实施方案中， 能使用振动网式喷雾器 (vibrating mesh nebulizer) 制备气雾剂。 振动网式喷雾器的实例包括 PARIE-FLOW 喷雾 器。在第 4,268,460 号 ； 第 4,253,468 号 ； 第 4,046,146 号 ； 第 3,826,255 号 ； 第 4,649,911 号； 第 4,510,929 号 ； 第 4,624,251 号 ； 第 5,164,740 号 ； 第 5,586,550 号 ； 第 5,758,637 号 ； 第 6,644,304 号 ； 第 6,338,443 号 ； 第 5,906,202 号 ； 第 5,934,272 号 ； 第 5,960,792 号 ； 第 5,971,951 号 ； 第 6,070,575 号 ； 第 6,192,876 号 ； 第 6,230,706 号 ； 第 6,349,719 号 ； 第 6,367,470 号 ； 第 6,543,442 号 ； 第 6,584,971 号 ； 第 6,601,581 号 ； 第 4,263,907 号 ； 第 5,709,202 号 ； 第 5,823,179 号 ； 第 6,192,876 号 ； 第 6,644,304 号 ； 第 5,549,102 号 ； 第 6,083,922 号 ； 第 6,161,536 号 ； 第 6,264,922 号 ； 第 6,557,549 号 ； 和第 6,612,303 号美国 专利中提供了更多的喷雾器实例， 所有专利均以其整体以引用的形式并入本文。能和本文 所述的制剂一起使用的喷雾器的更多商业实例包括由 Aerogen 生产的 Respirgard IIAeroneb Aeroneb Pro 和 Aeroneb Go ； 由 Aradigm 生产的 AERx 和 AERx EssenceTM ； 由 Respironics， Inc. 生产的 Porta-Neb Freeway FreedomTM、 Sidestream、 Ventstream 和 I-neb ； 以及由 PARI， GmbH 生产的 PARI LC-Plus PARILC-Star 另外的非限制性实 例， 第 6,196,219 号美国专利以其整体以引用的形式并入本文。
     能给予肺的左氧氟沙星或氧氟沙星的量能够包括至少约 20mg、 约 30mg、 约 40mg、 约 50mg、 约 60mg、 约 70mg、 约 80mg、 约 90mg、 约 100mg、 约 110mg、 约 120mg、 约 125mg、 约 130mg、 约 140mg、 约 150mg、 约 160mg、 约 170mg、 约 180mg、 约 190mg、 约 200mg、 约 210mg、 约 220mg、 约 230mg、 约 240mg、 约 250mg、 约 260mg、 约 270mg、 约 280mg、 约 290mg、 约 300mg、 约 310mg、 约 320mg、 约 330mg、 约 340mg、 约 350mg、 约 460mg、 约 470mg、 约 480mg、 约 490mg、 约 500mg、 约 510mg、 约 520mg、 约 530mg、 约 540mg、 约 550mg、 约 560mg、 约 570mg、 约 580mg、 约 590mg、 约 600mg、 约 610mg、 约 620mg、 约 630mg、 约 640mg、 约 650mg、 约 660mg、 约 670mg、 约 680mg、 约 690mg、 约 700mg、 约 710mg、 约 720mg、 约 730mg、 约 740mg、 约 750mg、 约 760mg、 约 770mg、 约 780mg、 约 790mg 和约 800mg。
     能在小于约 120 分钟、 约 100 分钟、 约 90 分钟、 约 80 分钟、 约 70 分钟、 约 60 分钟、 约 20 分钟、 约 10 分钟、 约 5 分钟、 约 4 分钟、 约 3 分钟、 约 2 分钟和约 1 分钟内给予肺气雾 剂。 适应症
     本文描述的方法和组合物的某些实施方案涉及治疗与炎症有关的特定病症和疾 病。在特定的实施方案中， 炎症能够为肺或上呼吸道的急性或慢性炎症。如本文所用的 “肺 部炎症” 能够指诸如肺和上呼吸道的至少一部分呼吸道的急性或慢性炎症。与肺部炎症有 关的这样的病症和疾病的实例包括哮喘、 囊性纤维化、 肺纤维化、 慢性支气管炎、 支气管扩 张、 慢性肉芽肿病、 鼻窦炎、 慢性阻塞性肺病和肺炎。
     某些实施方案包括实现减轻肺部炎症的方法。 减轻能够包括减轻肺部炎症的征兆 和症状。在某些实施方案中， 方法包括实现降低肺中促炎细胞因子水平。能通过多种方法 检测肺中促炎细胞因子水平的降低， 例如痰和 / 或 BAL 中促炎细胞因子水平的降低。在某 些实施方案中， 方法包括实现降低肺中 IL-1β、 IL-6 和 IL-8 水平。
     实施例
     实施例 1- 低浓度的左氧氟沙星、 环丙沙星和莫西沙星对 IL-6 和 IL-8 产生的体外活性 NL20 细胞和 HBE135 细胞为保留呼吸道上皮细胞的某些特征的永生化人呼吸道 上皮细胞且已经广泛用于表征其它抗生素的免疫调节效果 (Blau H 等人 Moxifloxacin but not ciprofloxacin or azithromycin selectively inhibits IL-8， IL-6， ERK1/2， JNK， and NF-kappaB activation in a cystic fibrosis epithelial cell line.( 莫西 沙星而不是环丙沙星或阿奇霉素选择性抑制 IL-8、 IL-6、 ERK1/2、 JNK 和 NF-κB 在囊性 纤维化上皮细胞系中活化 )Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2007 ； 292 ： L343-52 ； 和 Donnarumma， G.， 等 人 Anti-inflammatory effects of moxifloxacin and human beta-defensin 2 association in human lung epithelial cell line(A549)stimulated with lipopolysaccharide.( 在用脂多糖刺激的人肺上皮细胞系 (A549) 中莫西沙星和人
     β- 防卫素 2 的结合的抗炎效果 )Peptides 2007 ； 28 ： 2286-92， 以其整体以引用的形式并 入 )。 分别通过添加来自绿脓假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) 的 TNFα 或脂多糖 (LPS) 诱导 NL20 和 HBE135 细胞中的 IL-6 和 IL-8 产生。通过 ELISA 检验评价抗生素对细胞因子 水平的影响。
     将 NL20 细胞保持在包含 2mM 的 L- 谷氨酰胺、 0.1mM 的非必需氨基酸、 5μg/ml 的胰 岛素、 10ng/ml 的表皮生长因子、 1μg/ml 的转铁蛋白、 500ng/ml 的氢化可的松和 4％的 FBS 的 Ham′ s F12 培养基中。通常， 在包含 5ng/ml 的人重组 EGF 和补充有 5μg/ml 胰岛素和 500ng/ml 氢化可松的 0.05mg/ml 牛脑垂体提取物 (Invitrogen， San Diego， CA) 的角化细 胞无血清培养基中培养 HBE135 细胞。
     以 2×104 细胞 /ml 在 24 孔组织培养板上接种 NL20 细胞。在接种后一天， 细胞 接受不含血清的标准生长培养基并持续另外 24h。将相同的不含血清的培养基用于所有的 后续 NL20 细胞处理。通过使用 10ng/ml 的 TNFα 处理来诱导 NL20 单层细胞中的 IL-6 和 IL-8 产生。将 HBE135 细胞以 1x105 细胞 /ml 等分入 24 孔组织培养板中并在平板接种之后 约 24 小时将其用于细胞因子制备实验而不改变另外的培养基。通过使用 5μg/ml 的来自 绿脓假单胞菌 (P.aeruginosa) 的 LPS 处理来诱导 HBE135 细胞中的 IL-6 和 IL-8 产生。在 48h 之后， 收集、 净化细胞培养基， 并使用 QuantiGlo 化学发光 ELISA 试剂盒 (R&D Systems， Minneapolis， MN) 确定释放入培养基的 IL-6 和 IL-8 的量。为测试抗生素对 IL-6 和 IL-8 分泌的影响， 向培养基中添加抗生素以及 LPS 或 TNF-α 并如上所述进行处理。 TNF-α 诱导 NL20 细胞中的 IL-6 和 IL-8 产生增加数倍 ( 图 1A 和 1B)。LPS 诱导 HBE135 细胞中的 IL-8 水平增加 ( 图 2B)。在使用 10μg/ml 和 30μg/ml 的左氧氟沙星、 莫 西沙星或环丙沙星处理的 NL20 细胞中， IL-8 水平降低约 20％至 30％ ( 图 1A 和 1B)。在 使用左氧氟沙星或环丙沙星处理的细胞中没有观察到 IL-6 水平的显著变化。然而， 在使用 30μg/ml 的环丙沙星处理的 NL20 细胞中， 观察到了 IL-6 水平的增加。图 2A 和 2B 显示在 使用 10μg/ml 和 30μg/ml 的左氧氟沙星、 莫西沙星或环丙沙星处理的 HBE135 细胞中， 细 胞中的 IL-6 和 IL-8 水平。该实验显示低浓度的左氧氟沙星能降低使用 LPS 刺激的 HBE135 细胞中的 IL-8 水平。
     实施例 2- 左氧氟沙星、 环丙沙星和莫西沙星的体外细胞毒性
     使用 Alamar Blue 检验检测左氧氟沙星、 莫西沙星和环丙沙星对 NL20 和 HBE135 细胞系的细胞毒性。在使用抗生素孵育 48 小时之后， 将细胞在包含 5％的 Alamar Blue 染 料的新鲜生长培养基中孵育细胞并记录 0h 和 4h 下的荧光以评价抗生素细胞毒性。与莫西 沙星和环丙沙星相比， 较高的左氧氟沙星浓度对 NL20 或 HBE135 细胞的细胞毒性较低 ( 图 3A 和 3B)。在 300μg/ml 下， 莫西沙星和环丙沙星对 NL20 细胞的细胞毒性显著。
     实施例 3- 左氧氟沙星对 IL-6 和 IL-8 产生的体外活性
     使用 300μg/ml 的左氧氟沙星或 300μg/ml 的配有 MgCl2 的左氧氟沙星处理用 TNFα 诱导的 NL20 细胞和用 LPS 诱导的 HBE135 细胞。在使用 300μg/ml 的左氧氟沙星或 300μg/ml 的配有 MgCl2 的左氧氟沙星处理的 NL20 细胞中观察到 IL-6 和 IL-8 水平分别降 低约 10 倍和 5 倍 ( 图 4A 和 4B)。此外， 在使用 300μg/ml 的左氧氟沙星或 300μg/ml 的配 有 MgCl2 的左氧氟沙星处理的 HBE 细胞中观察到 IL-6 和 IL-8 水平的降低 ( 图 4C 和 4D)。 左氧氟沙星和配有 MgCl2 的左氧氟沙星具有相似的体外活性。
     实施例 5- 左氧氟沙星和妥布霉素的体外活性
     使用 10μg/ml 至 300μg/ml 的左氧氟沙星或妥布霉素处理 TNFα- 诱导的 NL20 细胞和 LPS- 诱导的 HBE135 细胞。在任何处理之间未观察到细胞毒性检验中细胞生存能力 的显著变化 ( 数据未示出 )。
     在 使 用 10ng/ml 的 TNFα 处 理 的 NL20 细 胞 中， 观 察 到 IL-6 产 生 增 加， 从 3.4±0.2pg/ml 至 40.3±2.3pg/ml( 图 5A)。IL-8 产 生 从 3.3±0.2pg/ml 增 加 至 197.3±28.9pg/ml( 图 5B)。使用 5μg/ml 的 LPS 孵育的 NL20 细胞的 IL-6 或 IL-8 产生没 有显著增加 ( 数据未示出 )。添加 10μg/ml 或 30μg/ml 的左氧氟沙星未显著改变由 NL20 细胞产生的 IL-6 和 IL-8 水平。 然而， 100μg/ml 和 300μg/ml 的左氧氟沙星分别导致 IL-6 水平减少 2 至 4 倍 (p ＜ 0.005)( 图 5A)。在使用 100μg/ml 和 300μg/ml 的左氧氟沙星 处理的 NL20 细胞中， IL-8 水平分别降低 50％和 60％ (p ＜ 0.005)( 图 5B)。10μg/ml 至 100μg/ml 的妥布霉素对 IL-6 或 IL-8 的产生没有显著影响 ( 图 5A 和 5B)。然而， 300μg/ ml 的妥布霉素导致 IL-6 产生增加 ( 图 5A)。因此， 左氧氟沙星显示出减少 NL20 细胞中的 体外促炎细胞因子产生的能力。
     使用 5μg/ml 的 LPS 孵育的 HBE135 细胞使 IL-6 产生从 46.1±6.4pg/ml 增加至 86.3±6.4pg/ml 且使 IL-8 产生从 280.7±54.9pg/ml 增加至 541.9±54.8pg/ml。使用 10 或 30μg/ml 的左氧氟沙星和 LPS 细胞孵育的 HBE135 细胞未显著改变 IL-6 和 IL-8 水平。 然而， 100μg/ml 和 300μg/ml 的左氧氟沙星分别导致 IL-6 水平减少 45％和 40％ ( 图 6)。 在使用 100μg/ml 和 300μg/ml 的左氧氟沙星处理的 HBE135 细胞中 IL-8 水平分别降低 30％和 20％ ( 图 6)。 使用 10μg/ml、 30μg/ml 或 100μg/ml 的妥布霉素孵育的细胞不影响 IL-6 的水平， 而 300μg/ml 的妥布霉素使 IL-6 水平增加 30％。使用 30μg/ml 至 300μg/ ml 的妥布霉素处理使 IL-8 产生增加 20％至 30％ (p ＜ 0.05)。
     这些体外研究表明在培养的人肺上皮细胞系中， 左氧氟沙星能诱导促炎细胞因 子、 IL-6 和 IL-8 的产生发生剂量相关降低。300μg/ml 的左氧氟沙星使 IL-6 水平减少 4 倍且使 IL-8 水平减少 2 倍 (p ＜ 0.05) ； 相比之下， 妥布霉素使 IL-6 水平增加 50％， 但对 IL-8 没有影响。这些发现表明按照使用配有 MgCl2 的左氧氟沙星气雾剂处理后在肺部组织 中获得的高浓度的左氧氟沙星给具有慢性肺部感染的患者提供了抗炎效果。
     实施例 6- 左氧氟沙星在人单核细胞中的体外活性
     人单核细胞系， 即 THP-1 为已建立的人单核细胞的体外模型且与 NL20 和 HBE135 细 胞 相 比， 能 分 泌 更 多 种 类 的 细 胞 因 子。 在 包 含 10 ％ 的 FBS、 0.05mM 的 2- 巯 基 乙 醇 的 RPMI-1640 培养基中培养 THP-1 细胞。在不含血清的生长培养基中以 1×106 细胞 / ml 在 24 孔组织培养板上接种 THP-1 细胞。第二天， 添加 100ng/ml 来自绿脓假单胞菌 (P.aeruginosa) 的 LPS 和抗生素， 并在收集培养基之前孵育细胞 24 小时以估计细胞因子产 生。按照上述对 NL20 细胞的描述进行 IL-6、 IL-8、 IL-1β 和 TNFα 产生的定量。
     使用 10ng/ml 的 LPS 刺激的 THP-1 分别使 IL-1β、 TNFα、 IL-6 和 IL-8 水平增加 60 倍、 200 倍、 30 倍和 600 倍 ( 图 7A、 7B、 7C 和 7D)。LPS 与 100μg/ml 和 300μg/ml 的左 氧氟沙星的共孵育分别导致 IL-1β 水平减少 40％和 70％ ( 图 7A)。300μg/ml 的左氧氟 沙星使 TNFα 产生增加 ( 图 7B)。使用增加浓度的左氧氟沙星孵育导致 IL-6 产生的剂量 依赖性降低， 使用 300μg/ml 的左氧氟沙星使 IL-6 水平减少五倍 ( 图 7C)。100μg/ml 和300μg/ml 的左氧氟沙星使 IL-8 水平显著降低 ( 图 7D)。
     实施例 7- 左氧氟沙星对 IL-8 mRNA 表达的体外活性
     人单核细胞系， 即 THP-1 为已建立的人单核细胞的体外模型且与 NL20 和 HBE135 细胞相比， 能分泌更多种类的细胞因子。通过使用 10ng/ml 的 TNFα 处理来诱导 NL20 单层 细胞中的 IL-8 mRNA 表达。将左氧氟沙星与 TNFα 同时添加。在 24h 的孵育之后， 使用 PBS 洗涤细胞单层， 制备总细胞 RNA 并使用人 IL-8 特异性引物和购自 Ambion(Austin， TX) 的 “Cells-to-cDNA” 试剂盒进行逆转录。使用 PowerSYBR Green PCR master mix 和 GeneAmp 5700 仪器 (Applied Biosystems ； Warrington， UK) 对 cDNA 进行实时 PCR 分析。将所有数 据标准化为管家基因 β- 肌动蛋白。用 TNFα 刺激 NL-20 细胞导致 IL-8mRNA 水平统计学 上显著增加 (p ＜ 0.005)20 倍 ( 图 8)。该增加与由 TNFα 诱导的 IL-8 蛋白水平的增加有 关。添加 100μg/ml 和 300μg/ml 的左氧氟沙星对 IL-8 mRNA 表达水平没有显著影响 ( 图 4)。这些结果表明左氧氟沙星通过调节包括蛋白质翻译和 / 或蛋白质分泌在内的过程来降 低 IL-8 分泌的蛋白质水平。
     实施例 8- 左氧氟沙星对 NFκB 活性的体外活性
     NFκB 和 AP-1 为某些促炎细胞因子的转录活性的重要调节剂。 本实施例涉及左氧 氟沙星对 NFκB 的转录调节活性的影响。
     人单核细胞系， 即 THP-1 为已建立的人单核细胞的体外模型且与 NL20 和 HBE135 细胞相比， 能分泌更多种类的细胞因子。以 3×104 细胞 / 孔在 96 孔板上接种细胞并在 第二天在 NFκB 调节的启动子的控制下， 使用编码分泌的荧光素酶蛋白的 pMetLuc-NFκB 报道基因质粒 (Clontech) 转染。为标准化转染效率， 在强组成型启动子的控制下， 使用 编码分泌的碱性磷酸酶的 pSEAP 控制质粒 (Clontech) 共转染细胞。在转染后 24 小时， 使用包含 10ng/ml 的 TNF-α 和左氧氟沙星的新鲜的不含血清的培养基更换上述培养基。 在孵育之后 8 小时， 收集细胞上清液， 并使用 “Ready-to-Glow Dual Secreted Reporter assay” (Clontech， Mountain View， CA) 检测荧光素酶和碱性磷酸酶活性。在 NFκB 转录因 子的控制下， 使用编码荧光素酶基因的报道基因质粒转染的细胞产生低基础水平的荧光素 酶活性。使用 NFκB 通路的已知活化剂， 即 TNFα 刺激导致启动子的活性增加约 20 倍 ( 图 9)。添加 100μg/ml 和 300μg/ml 的左氧氟沙星对报道基因活性水平不产生显著影响。这 表明左氧氟沙星对 NFκB 的 TNFα 刺激的转录活性没有影响。
     实施例 9- 配有 MgCl2 的左氧氟沙星的体内抗炎活性
     通 过 腹 膜 内 途 径 给 小 鼠 (n ＝ 4) 注 射 50μg 的 LPS。 在 LPS 处 理 后 30 分 钟， 使用包含 60mg/kg 的盐水对照、 配有 MgCl2 的左氧氟沙星或妥布霉素的微喷气雾剂设备 (PennCentury， Philadelphia) 处理小鼠。在雾化处理之后 6 小时处死小鼠， 通过用 1ml 的 盐水灌洗收集支气管肺泡 (BAL) 液。用 ELISA 测定 IL-6 和 MIP-2( 人 IL-8 的鼠科动物同 源体 ) 水平。
     使用盐水、 配有 MgCl2 的左氧氟沙星和妥布霉素处理产生的平均 MIP-2 水平分别 为 515pg/ml、 233pg/ml 和 502pg/ml( 图 10A)。相对于盐水对照， 使用配有 MgCl2 的左氧氟 沙星处理导致 MIP-2 水平减少 2 倍以上。此外， 所述减少显著大于盐水和妥布霉素二者处 理的小鼠 (p ＜ 0.05)。在 IL-6 水平中观察到相似的趋势 ( 图 10B)。使用左氧氟沙星处理 导致 IL-6 水平比在盐水对照中的 IL-6 水平减小 2 倍以上 (p ＜ 0.05)。与盐水对照相比，使用妥布霉素处理导致 IL-6 水平增加。该体内数据与实施例 5 的体外数据一致， 其中使用 左氧氟沙星处理使 IL-6 和 IL-8 水平减少， 而妥布霉素对 IL-8 水平没有显著影响且趋向于 增加 IL-6 水平。
     该体内研究显示使用高浓度的配有 MgCl2 的左氧氟沙星处理能降低包括 IL-6 和 IL-8 在内的促炎细胞因子。因此， 这些发现表明， 除有效的抗细菌效果之外， 高浓度的左氧 氟沙星可对易患急性和慢性炎症的患者具有抗炎性， 例如患有 CF 和 COPD 的患者。
     实施例 10- 配有 MgCl2 的左氧氟沙星对 CF 患者的抗炎活性
     给予具有急性或慢性肺部炎症的 CF 患者配有 MgCl2 的左氧氟沙星气雾剂。治疗 之后， 观察到了急性炎症的减轻。观察到促炎细胞因子水平的降低。观察到肺中 IL-1β、 IL-6 和 IL-8 水平的降低。观察到痰和 / 或 BAL 中 IL-1β、 IL-6 和 IL-8 水平的降低。
     实施例 11- 配有 MgCl2 的左氧氟沙星对 COPD 患者的抗炎活性
     给予具有急性或慢性肺部炎症的 COPD 患者配有 MgCl2 的左氧氟沙星气雾剂。治 疗之后， 观察到急性炎症的减轻。观察到促炎细胞因子水平的降低。观察到肺中 IL-1β、 IL-6 和 IL-8 水平的降低。观察到痰和 / 或 BAL 中 IL-1β、 IL-6 和 IL-8 水平的降低。
     实施例 12- 配有 MgCl2 的左氧氟沙星对慢性支气管炎患者的抗炎活性
     给予具有急性或慢性肺部炎症的慢性支气管炎患者配有 MgCl2 的左氧氟沙星气 雾剂。治疗之后， 观察到急性炎症的减轻。观察到促炎细胞因子水平的降低。观察到肺中 IL-1β、 IL-6 和 IL-8 水平的降低。观察到痰和 / 或 BAL 中 IL-1β、 IL-6 和 IL-8 水平的降 低。
     实施例 13- 配有 MgCl2 的左氧氟沙星对支气管扩张患者的抗炎活性
     给予具有急性或慢性肺部炎症支气管扩张患者配制有 MgCl2 的左氧氟沙星气雾 剂。治疗之后， 观察到急性炎症的减轻。观察到促炎细胞因子水平的降低。观察到肺中 IL-1β、 IL-6 和 IL-8 水平的降低。观察到痰和 / 或 BAL 中 IL-1β、 IL-6 和 IL-8 水平的降 低。
     实施例 14- 配有 MgCl2 的左氧氟沙星对非 CF 支气管扩张患者的抗炎活性
     给予具有急性或慢性肺部炎症的非 CF 支气管扩张患者配有 MgCl2 的左氧氟沙星 气雾剂。治疗之后， 观察到急性炎症的减轻。观察到促炎细胞因子水平的降低。观察到肺 中 IL-1β、 IL-6 和 IL-8 水平的降低。观察到痰和 / 或 BAL 中 IL-1β、 IL-6 和 IL-8 水平的 降低。
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