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1、10申请公布号CN102319206A43申请公布日20120118CN102319206ACN102319206A21申请号201110298750822申请日20110928A61K9/08200601A61K38/20200601A61K47/26200601A61K47/18200601A61P7/00200601A61P1/00200601A61P19/08200601A61P25/00200601A61P19/0220060171申请人厦门特宝生物工程股份有限公司地址361022福建省厦门市海沧新阳工业区翁角路330号72发明人杨美花雷利芳孙黎张林忠张子民刘满荣王秋红游一玉刘斌林辉。
2、煌胡斌74专利代理机构厦门市新华专利商标代理有限公司35203代理人渠述华54发明名称一种稳定的重组人白介素11水溶液及其制备方法57摘要本发明公开一种稳定的重组人白介素11水溶液及其制备方法，其特征在于包括如下组分1）浓度为02520MG/ML的重组人白介素11；2）维持PH在4585范围内的浓度为1MM200MM的缓冲液体系；3）足以稳定重组人白介素11的稳定剂；4）等渗剂；5）注射用水。本发明创造性地发明了一种适合RHIL11的水溶液配方，其中适宜的稳定剂和缓冲体系是RHIL11在溶液状态下保持稳定的关键因素。本发明改善了RHIL11冻干粉针重建溶液外观不佳、不溶性微粒偏高、可见异物超标。
3、等问题，而且产品质量比粉针剂型有明显提高。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页附图1页CN102319209A1/1页21一种稳定的重组人白介素11水溶液，其特征在于包括如下组分1）浓度为02520MG/ML的重组人白介素11；2）维持PH在4585范围内的浓度为1MM200MM的缓冲液体系；3）稳定重组人白介素11的稳定剂；4）等渗剂；5）注射用水。2如权利要求1所述的一种稳定的重组人白介素11水溶液，其特征在于所述的水溶液中各组分，每04ML中按如下配方配制浓度为02520MG/ML的重组人白介素112MG；2）维持PH在4585范围内的浓。
4、度为1MM200MM的缓冲液体系0311MG；3）稳定重组人白介素11的稳定剂按总体积的00011加入；4）等渗剂按总体积的015加入；5）注射用水加至04ML。3如权利要求2所述的一种稳定的重组人白介素11水溶液，其特征在于所述的水溶液中各组分，每04ML中按如下配方配制浓度为02520MG/ML的重组人白介素112MG；2）维持PH在4585范围内的浓度为1MM200MM的缓冲液体系0406MG；3）稳定重组人白介素11的稳定剂按总体积的001005加入；4）等渗剂按总体积的015加入；5）注射用水加至04ML。4如权利要求3所述的一种稳定的重组人白介素11水溶液，其特征在于所述的缓冲体系。
5、采用磷酸盐缓冲液，醋酸盐缓冲液，枸橼酸盐缓冲液，丁二酸盐缓冲液，TRIS缓冲液中的一种；其中磷酸盐缓冲液，其组成为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠或者是磷酸二氢钾和磷酸氢二钾；所述的醋酸盐缓冲液，其组成为醋酸和醋酸钠或者是醋酸和醋酸钾；所述的枸橼酸缓冲液，其组成为枸橼酸和磷酸氢二钠或者是枸橼酸和磷酸氢二钾；丁二酸缓冲液，其组成为丁二酸和丁二酸钠；TRIS缓冲液，其组成为TRIS碱和盐酸。5如权利要求4所述的一种稳定的重组人白介素11水溶液，其特征在于所述的缓冲体系采用磷酸盐缓冲液。6如权利要求3所述的一种稳定的重组人白介素11水溶液，其特征在于所述的稳定剂采用聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯、聚氧乙烯失水山梨。
6、醇单月桂酸酯中的一种。7如权利要求6所述的一种稳定的重组人白介素11水溶液，其特征在于所述的稳定剂采用聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。8如权利要求3所述的一种稳定的重组人白介素11水溶液，其特征在于所述的等渗剂采用氨基酸、氯化钠溶液中的一种；且所述的氨基酸加入量为总体积的055；氯化钠溶液的加入量为总体积的0120。9如权利要求8所述的一种稳定的重组人白介素11水溶液，其特征在于所述的氨基酸采用甘氨酸，且其加入量为总体积的23。10一种如权利要求1所述的稳定的重组人白介素11水溶液的制备方法，其特征在于包括如下步骤称取浓度为1MM200MM的缓冲液体系0311MG；稳定剂按总体积的001005量取。
7、；等渗剂按总体积的015量取；依次用无菌无热源注射用水溶解、配制，除菌过滤后加入浓度为02520MG/ML重组人白介素11原液2MG；注射用水稀释至04ML，再次过滤，混匀；所述的除菌过滤器用02M孔径滤膜无菌滤器，分装前取样检测无菌、内毒素；分装在无菌灌封室层流罩内进行，分装于容量为2ML的西林瓶中，单剂量装每瓶05ML，得到各实施例制备的稳定的重组人白介素11水溶液。权利要求书CN102319206ACN102319209A1/7页3一种稳定的重组人白介素11水溶液及其制备方法技术领域0001本发明涉及一种稳定的重组人白介素11水溶液及其制备方法；尤其是一种稳定的不含防腐剂和血液提取成分的。
8、重组人白介素11水溶液及其制备方法。背景技术0002人白介素11（IL11）是一种存在于人体骨髓、神经、呼吸道及消化道上皮等多种组织，具有广泛生理功能的细胞因子。IL11是一种强疏水性蛋白，无分子内和分子间二硫键的结构，也没有潜在的糖基化位点，同时其PI值高达117。0003IL11对造血细胞尤其是巨核细胞具有重要的调控作用，对神经细胞、脂肪细胞及小肠腺窝绒毛干细胞等非造血细胞亦具有明显的生物活性，在骨髓造血调控中发挥重要作用。IL11用于治疗肿瘤放化疗引起的血小板减少症，替代血小板输注。对肿瘤放化疗及骨髓移植治疗具有较高的临床应用价值。0004除用于治疗血小板减少症外，重组人白介素11（RH。
9、IL11）还具有广阔的临床应用前景。如调节肠上皮细胞的生长，促进胃肠道黏膜损伤愈合，刺激破骨细胞的发育和神经祖细胞的增殖，对活动性类风湿性关节炎有缓解作用等。0005目前国内外市场销售的RHIL11尚无水针剂型被批准，目前只有粉针剂。粉针剂成本高，使用时需要加入注射用水，给临床使用带来不便。尤其重要的是，粉针剂型存在着外观不佳、不溶性微粒偏高、可见异物超标等问题，对病人的安全性存在着一定的隐患，因此研制开发RHIL11水针剂型具有重要的意义。0006以前的研究结果表明，RHIL11溶液在存放过程中稳定性较差，不溶性微粒逐渐增高，很快超过允许限度，溶液出现絮状凝集物或细小蛋白颗粒。我们针对这个课。
10、题，展开了一系列的研究，对处方进行了优化，最终研制成功了稳定的RHIL11的溶液配方，该配方可开发成直接注射给药的水针剂。0007水针剂型取代冻干剂型是生物制品的发展趋势，许多医药公司都积极将细胞因子类蛋白质药物制成水针剂型，如干扰素、白介素2、GCSF、EPO等。与冻干剂型相比，水针剂型具有明显优势，水针无需溶解，直接注射，给药方便，制造成本明显降低，易于被医生和患者接受，质量风险较小等。但是，截止目前，尚无RHIL11注射液剂型被批准。发明内容0008本发明的目的在于创造性地发明一种稳定的RHIL11水溶液及其制备方法用于改善RHIL11粉针重建溶液外观不佳、不溶性微粒偏高、可见异物超标等。
11、问题，而且RHIL11水溶液产品质量比粉针剂型有显著提高。本发明中适宜的稳定剂和缓冲体系是RHIL11在溶液状态下保持稳定的关键要素。0009为了达成上述目的，本发明的解决方案是一种稳定的重组人白介素11水溶液，其特征在于包括如下组分1）浓度为02520MG/ML的重组人白介素11；说明书CN102319206ACN102319209A2/7页42）维持PH在4585范围内的浓度为1MM200MM的缓冲液体系；3）稳定重组人白介素11的稳定剂；4）等渗剂；5）注射用水。0010所述的水溶液中各组分，每04ML中按如下配方配制浓度为02520MG/ML的重组人白介素112MG；2）维持PH在45。
12、85范围内的浓度为1MM200MM的缓冲液体系0311MG；3）稳定重组人白介素11的稳定剂按总体积的00011加入；4）等渗剂按总体积的015加入；5）注射用水加至04ML。0011所述的水溶液中各组分，每04ML中优选按如下配方配制浓度为02520MG/ML的重组人白介素112MG；2）维持PH在4585范围内的浓度为1MM200MM的缓冲液体系0406MG；3）稳定重组人白介素11的稳定剂按总体积的001005加入；4）等渗剂按总体积的015加入；5）注射用水加至04ML。0012所述的缓冲体系采用磷酸盐缓冲液，醋酸盐缓冲液，枸橼酸盐缓冲液，丁二酸盐缓冲液，TRIS缓冲液中的一种；其中磷。
13、酸盐缓冲液，其组成为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠或者是磷酸二氢钾和磷酸氢二钾；所述的醋酸盐缓冲液，其组成为醋酸和醋酸钠或者是醋酸和醋酸钾；所述的枸橼酸缓冲液，其组成为枸橼酸和磷酸氢二钠或者是枸橼酸和磷酸氢二钾；丁二酸缓冲液，其组成为丁二酸和丁二酸钠；TRIS缓冲液，其组成为TRIS碱和盐酸。0013所述的缓冲体系优选采用磷酸盐缓冲液。0014所述的稳定剂采用聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯中的一种。（购买厂商德国默克）所述的稳定剂优选采用聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。0015所述的等渗剂采用氨基酸、氯化钠溶液中的一种；且所述的氨基酸加入量为总体积的055；氯化钠溶液的加入量为总。
14、体积的0120。0016所述的氨基酸优选采用甘氨酸，且其加入量为总体积的23。0017一种稳定的重组人白介素11水溶液的制备方法，包括如下步骤称取浓度为1MM200MM的缓冲液体系；0311MG；稳定剂按总体积的001005量取；等渗剂按总体积的015量取；依次用无菌无热源注射用水溶解、配制，除菌过滤后加入浓度为02520MG/ML重组人白介素11原液2MG（购于厦门特宝生物工程股份有限公司，申请（专利）号2010102012151）；注射用水稀释至04ML，再次过滤，混匀；所述的除菌过滤器用02M孔径滤膜无菌滤器，分装前取样检测无菌、内毒素。分装在无菌灌封室层流罩内（A级区）进行，分装于容量。
15、为2ML的西林瓶中，单剂量装每瓶05ML。分装后成品置28下保存。0018本发明的有益效果为本发明的独特之处在于不仅能保证水溶液的稳定性，解决了粉针剂型外观不佳的问题，而且首次发现PH对于降解物有关键的影响，发明的水针处方与冻干粉针剂型相比，质量有显著的提高。首先聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯的选择是本发明的一个独特之处，它既是非离子型表面活性剂，也是RHIL11的稳定剂。该稳定剂可保持RHIL11的水溶液澄清和性质稳定。适用于本发明的非离子表面活性剂聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯和聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。而缓冲体系对RHIL11的影响是本发明的另一个独特之处当PH超过70时，加速试验表明，SD。
16、SPAGE电泳可见随着PH升说明书CN102319206ACN102319209A3/7页5高而逐渐增加的聚合物条带；当PH超过85，RHIL11聚合物继续增加出现沉淀，且这种沉淀是不可逆的；当PH在低于70，随着PH的逐步降低，SDSPAGE电泳可见随着PH降低逐渐增加的降解物条带，当PH降低至45左右时，降解物含量达到2。而在PH6070范围内，RHIL11样品质量能保持稳定，加速试验结果也保持稳定，产品纯度均在98以上，较传统的粉针剂型质量有明显的提高。进一步的研究包括等渗剂、缓冲液等。适用于本发明的等渗剂（同时也是蛋白保护剂）为氨基酸水溶液，氨基酸对蛋白有一定的保护作用，同时作为兼具酸。
17、性集团和碱性基团的两性分子，性质稳定，具有一定的缓冲能力，可保持溶液渗透压，减少对注射局部的刺激。其中优选的是甘氨酸。适合本发明的缓冲体系是能保持水溶液制剂的PH值范围在4585的缓冲体系，包括磷酸盐缓冲液，醋酸盐缓冲液，枸橼酸盐缓冲液，丁二酸盐缓冲液，TRIS盐酸缓冲液等，其中优选的是磷酸盐缓冲液体系综上所述本发明解决了冻干粉针剂型外观不佳、不溶性微粒偏高，可见异物超标等问题；其次首次发现了RHIL11溶液的稳定性与PH范围和非离子化的表面活性剂有密切关系，是保持水溶液稳定的关键因素；更重要的是本发明的RHIL11水溶液具有很好的稳定性，外观澄清、聚合物减少、不含防腐剂、不含血液成分；在规定。
18、条件下，可稳定保存24个月，且产品质量比粉针剂型有明显提高。附图说明0019图1是实施例117在28的RHIL11纯度（SDSPAGE法）图谱；图2是实施例117在45加速考察10天的RHIL11纯度（SDSPAGE法）图谱。具体实施方式0020以下通过实施例将进一步说明本发明实施例14中水溶液中各组分，每04ML中按表1配方配制；实施例58中水溶液中各组分，每04ML中按表2配方配制；实施例912中水溶液中各组分，每04ML中按表3配方配制；实施例1316中水溶液中各组分，每04ML中按表4配方配制；实施例1720中水溶液中各组分，每04ML中按表5配方配制；以上各实施例120均按照如下方法。
19、制备按表中所例的量称取取浓度为1MM200MM的缓冲液体系；稳定剂按表中所例的量量取；等渗剂按按表中所例的量量取；依次用无菌无热源注射用水溶解、配制，除菌过滤后按表中所例的量加入浓度为02520MG/MLRHIL11原液，注射用水稀释至04ML，再次过滤，混匀；所述的除菌过滤器用02M孔径滤膜无菌滤器，分装前取样检测无菌、内毒素。分装在无菌灌封室层流罩内（A级区）进行，分装于容量为2ML的西林瓶中，单剂量装每瓶05ML，得到各实施例制备的稳定的重组人白介素11水溶液。0021试验方案一实验例120均放置在45加速培养箱中考察，比较实验例120在0天与加速10天的不溶性微粒和纯度（HPLCRP）。
20、检测结果，不溶性微粒按照欧洲药典第7版不溶性微粒检查法进行，使用激光注射液微粒分析仪检测；纯度（HPLCRP）参考中国药典2010年版三部高效液相色谱法，使用WATERS公司生产的高效液相色谱仪检测。比较实验例117在0天与加速10天的纯度（SDSPAGE法）检测结果，纯度（SDSPAGE法）参考中国药典说明书CN102319206ACN102319209A4/7页62010年版三部SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法，使用稳压稳流电泳仪检测。0022试验结果1、实施例120在45加速考察10天不溶性微粒比较结果见表6，结论为实施例17在45加速考察10天不溶性微粒有明显升高，其它实施例加速10天均无显。
21、著变化。说明增加聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯能减少不溶性微粒增加，因此对水溶液外观有明显改善作用。00232、实施例120在45考察10天RHIL11纯度（HPLCRP）结果见表7。结论为实施例120在45考察10天纯度（HPLCRP）均略有降低，其中实施例1、2、7、11、12、15比其它实施例纯度（HPLCRP）降低稍明显。00243、实施例117在45考察10天RHIL11纯度（SDSPAGE）结果见图1和图2。结论为实施例117在45考察10天均发现RHIL11有少量降解物产生，降解物的大小与缓冲液PH值有关，PH值过高或过低时降解物均会增加。0025试验方案二综合试验方案一的不溶性微粒。
22、、纯度（HPLCRP）和纯度（SDSPAGE）的考察结果可知RHIL11水溶液外观、不溶性微粒与缓冲液PH值有关，本发明内容范围内的PH值能使RHIL11水溶液外观澄清，且PH值过高或过低时降解物均会增加；氨基酸对RHIL11水溶液有保护作用，不加氨基酸的实施例会产生更多杂质；聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯能减少不溶性微粒增加，因此对水溶液外观有明显改善作用。因此我们将优选PH范围的实施例26、不含氨基酸的实施例15、不含聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯的实施例17进行进一步加速和长期试验，确定优选PH值的RHIL11水溶液在长期贮存中稳定，同时将不含氨基酸和不含聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯的水溶液进行对。
23、比，进一步确定这两种稳定剂的必要性。加速试验在252考察30天，主要考察项目有外观、不溶性微粒。长期试验主要是在药品贮存条件28实时考察，考察30个月，主要考察项目有外观、不溶性微粒、生物学活性、异常毒性等。0026试验结果1、实施例26、实施例15和实施例17在252加速考察稳定性情况A外观外观均为澄明液体，未见蛋白质聚集。0027B不溶性微粒不溶性微粒均合格，实施例26和实施例15的不溶性微粒无明显变化，实施例17的不溶性微粒有显著增加，加速结果说明聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯能有效减少不溶性微粒增加。10M不溶性微粒测定结果（粒/支）见表8。25M不溶性微粒测定结果（粒/支），见表9。00。
24、282、实施例26、实施例15和实施例17在28存放30个月稳定性情况A外观实施例26、实施例15和实施例17在28存放30个月外观均为澄明液体，未见蛋白质聚集。0029B实施例4在28存放30个月生物学活性合格。0030C实施例4在28存放30个月异常毒性检测合格。0031D实施例35在28存放30个月不溶性微粒检测合格，实施例17在28存放3个月不溶性微粒有显著增加，说明长期贮存过程中聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯也能有效减少不溶性微粒增加。10M不溶性微粒测定结果（粒/支），见表10；25M不说明书CN102319206ACN102319209A5/7页7溶性微粒测定结果（粒/支），见表11。
25、。0032表1实施例1配方（PH45）实施例2配方（PH55）实施例3配方（PH60）实施例4配方（PH65）RHIL11，2MGRHIL11，2MGRHIL11，2MGRHIL11，2MG甘氨酸92MG甘氨酸92MG甘氨酸92MG甘氨酸92MG磷酸二氢钠048MG磷酸二氢钠048MG磷酸二氢钠0421MG磷酸二氢钠0329MG适量氢氧化钠调节PH适量氢氧化钠调节PH磷酸氢二钠007MG磷酸氢二钠0179MG聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯按总体积001加入聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯按总体积001加入聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯按总体积001加入聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯按总体积001加入注射用水加至。
26、04ML注射用水加至04ML注射用水加至04ML注射用水加至04ML表2实施例5配方（PH70）实施例6配方（PH75）实施例7配方（PH85）实施例8配方（PH64）RHIL11，2MGRHIL11，2MGRHIL11，2MGRHIL11，2MG甘氨酸92MG甘氨酸92MG甘氨酸92MG甘氨酸92MG磷酸二氢钠0187MG磷酸二氢钠0077MG磷酸氢二钠0568MG枸橼酸0077MG磷酸氢二钠0346MG磷酸氢二钠0477MG适量磷酸调节PH枸橼酸钠0929MG聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯按总体积001加入聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯按总体积001加入聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯按总体积001加入。
27、聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯按总体积001加入注射用水加至04ML注射用水加至04ML注射用水加至04ML注射用水加至04ML表3实施例9配方（PH64）实施例10配方（PH65）实施例11配方（PH60）实施例12配方（PH65）RHIL11，2MGRHIL11，2MGRHIL11，2MGRHIL11，2MG甘氨酸92MG甘氨酸92MG甘氨酸92MG组氨酸92MG枸橼酸0236MG丁二酸钠0648MG醋酸钠0328MG磷酸二氢钠0329MG磷酸氢二钠0787MG适量丁二酸调节PH适量醋酸或氢氧化钠调节PH磷酸氢二钠0179MG聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯按总体积001加入聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸。
28、酯按总体积001加入聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯按总体积001加入聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯按总体积001加入注射用水加至04ML注射用水加至04ML注射用水加至04ML注射用水加至04ML表4实施例13配方（PH65）实施例14配方（PH65）实施例15配方（PH65）实施例16配方（PH65）RHIL11，2MGRHIL11，04MGRHIL11，2MGRHIL11，2MG门冬氨酸92MG甘氨酸92MG氯化钠36MG甘氨酸92MG磷酸二氢钠0329MG磷酸二氢钠0329MG磷酸二氢钠0329MG磷酸二氢钠0329MG磷酸氢二钠0179MG磷酸氢二钠0179MG磷酸氢二钠0179MG磷酸氢二钠。
29、0179MG聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯按总体积001加入聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯按总体积001加入聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯按总体积001加入聚乙二醇4000按总体积001加入注射用水加至04ML注射用水加至04ML注射用水加至04ML注射用水加至04ML表5表6说明书CN102319206ACN102319209A6/7页8表7考察时间（天）010实施例199039676实施例299089682实施例399189738实施例499239783实施例599269771实施例699139727实施例799159621实施例899279764实施例999179755实施例1099159734实。
30、施例1199149690实施例1299149709实施例1399159731实施例1499109720实施例1598869689说明书CN102319206ACN102319209A7/7页9实施例1699039741实施例1799159767实施例1899039756实施例1999159748实施例2099149750表8考察日期实施例2实施例3实施例4实施例5实施例6实施例15实施例17原始数据108106167141113152156第10天124112150158121156153第20天1061501861801352401124第30天2634212162353684321364表。
31、9考察日期实施例2实施例3实施例4实施例5实施例6实施例15实施例17原始数据643646168第10天121620593564第20天2015242310153124第30天275161824215281表10考察日期实施例2实施例3实施例4实施例5实施例6实施例15实施例17原始数据108106167141113152156第一周124112150158121156153第二周106150186180135240130第三周2634212162353683546781个月14625213627612727813203个月28430135132121082523146个月3642402363。
32、105969个月58642118034012个月24812426724518个月24515814324个月12532412430个月457157389表11考察日期实施例2实施例3实施例4实施例5实施例6实施例15实施例17原始数据643646168第一周23233656793889第二周58285825215624第三周145354535138871011个月28487525241242453个月121104101861422022246个月562792251359个月281045713412个月3856389818个月23495924个月68684630个月382489说明书CN102319206ACN102319209A1/1页10图1图2说明书附图CN102319206A。