达玛20S,25R环氧3Β,12Β,26三醇及其提取方法和其药物用途.pdf

达玛 -20S, 25R- 环氧 -3β, 12β, 26- 三醇及其提取方法 和其药物用途
    【技术领域】
     本发明涉及达玛 -20S， 25R- 环氧 -3β， 12β， 26- 三醇及其提取方法， 和其在制备 抗肿瘤药物中的应用。背景技术
     红参是商品人参中的一个主要品种， 经人参蒸制加工制成。性偏温， 功效大补元 气。 目前国内外出口人参的换汇率均以红参为主， 较之白参有 “防虫蛀、 防腐易保存， 保持药 效” 之优点。近年来对红参的加工方法、 化学成分和药理作用探讨颇多。
     红参化学成分和药理作用研究
     刘丹， 等从中国红参中从红参中分离并鉴定了 14 个化合物， 分别为 ： 三七皂苷 R2(1)， 20(S)- 人参皂苷 Rg3(2)， 20(R)- 人参皂苷 Rg3(3)， 20(S)- 人参皂苷 Rg2(4)， 20(R)- 人 参皂苷 Rg2(5)， 20(S)- 人参皂苷 Rh1(6)， 20(R)- 人参皂苷 Rh1(7)， 人参皂苷 Rh4(8)， -Ro(9) ， -Rb1(10)， -Rg1(11)， -Re(12)， -Rf(13)， 麦芽酚 (14)。
     焦连庆， 等利用反相高效液相色谱技术从红参须根中分得一个新的多肽化合物。 根据氨基酸组成分析， SDS- 聚丙烯酸胺凝胶电泳和高效排阻层析分子量测定结果， 鉴定为 33 肽。
     邓辉， 等通过观察糖尿病 (DM) 大鼠视网膜神经节细胞 (RGCs) 凋亡及血管内皮细 胞生长因子 (VEGF) 在视网膜表达的变化， 探讨了红参对 RGCs 凋亡及 VEGF 表达的影响以及 后两者之间的关系。结果表明红参能抑制 DM 大鼠视网膜 VEGF 的表达， 减少 DM 大鼠 RGCs 的凋亡， DM 大鼠 RGCs 凋亡数量与 VEGF 在视网膜表达呈正相关。
     陈明玉， 等探讨了红参提取物对家兔红细胞和血小板电泳率的影响。结果表明实 验组血小板及红细胞的电泳率显著高于对照组 (P ＜ 0.01)。 说明红参对维持细胞膜的稳定 有重要作用。
     雷小虹， 等报道了红参提取液对 DMBA/ 巴豆油诱发昆明小鼠皮肤乳头状瘤形成的 抑制作用和红参提取物对移植性肿瘤的抑制作用。
     随着对人参有效成分之一 ： 人参皂苷研究的深入， 研究人员倾向于认为人参抗肿 瘤的活性成分可能是人参皂苷。 特别是当学者们发现白参与其被加工后制成的商品红参有 内在质量上的区别之后， 对人参皂苷抗肿瘤作用的研究更引起学术界的关注。
     文献报道给小鼠或大鼠服用红参的粗提物， 然后再注射化学致癌物质， 来观察红 参对实验性肿瘤的预防和治疗效果。致癌物质包括 ： 9， 10- 二甲基苯 -1， 2- 苯并蒽 (DMBA)、 乌拉坦、 N-2- 乙芴基乙酰胺 (AAF)、 黄曲霉毒素和烟草凝聚物等。将上述致癌物注入出生 24h 之内的 TCR 鼠肩胛下， 进行实验观察。结果表明 ： 红参与 DMBA 合并用药后第 26 周肺腺 红参与乌拉坦组合并用药后第 28 周， 大鼠肺腺瘤的发 病瘤发病率较单纯 DMBA 组减少 17％， 病率较单纯乌拉坦减低 15％， 肺浸润扩散发病率减少 14％。但组间平均的尺寸并无差异。 红参与 AAF 合并用药组未见大鼠肺腺瘤发生， 单纯 AAF 组发病率却为 31％， 红参与黄曲霉毒素合并用药后， 大鼠肺腺瘤发病率降低了 29％。可见， 动物在长期服用红参之后， 不仅能明 显降低肿瘤的发生率， 而且可抑制肿瘤的生长， 具有良好的预防作用。
     目前未见到有关达玛 -20S， 25R- 环氧 -3β， 12β， 26- 三醇的提取方法及化合物的 报道， 该化合物属于新化合物， 属于首次分离得到 ； 该化合物的新的药物用途属首次发现。 发明内容
     本发明的目的在于提供一种化合物 ： 达玛 -20S， 25R- 环氧 -3β， 12β， 26- 三醇， 结 构式是 ：分子式 ： C30H52O4
     分子量 ： 476.4
     化学名称： 达 玛 -20S， 25R- 环 氧 -3β， 12β， 26- 三 醇， 英 文 名 Dammar-20S， 25R-epoxy-3β， 12β， 26-triol。
     白色针晶 ( 乙酸乙酯 )， mp 189-190℃。 TLC 检测， 10％硫酸 - 乙醇为显色剂， 105℃ 下加热显紫红色斑点。是从红参中分离得到的新单体化合物。
     发明采取的提取分离方法是 ：
     取 红 参， 粉 碎， 加 3-8 倍 量 的 60-95 ％ 乙 醇 加 热 回 流 提 取， 每 次 3-6 小 时， 共 提 取 5-7 次， 合 并 提 取 液， 回收溶剂至干 ； 将 乙 醇 提 取 物 经 反 复 硅 胶 柱 色 谱， 洗脱剂 ： CHCl3 ∶ MeOH ＝ 90 ～ 120 ∶ 10 ～ 30 ； C-18 反 相 柱 色 谱， 洗脱剂 ： MeOH ∶ H2O ＝ 80 ～ 90 ∶ 20 ～ 10 ； 乙醇∶水＝ 2 ∶ 4 ～ 6 重结晶， 得到达玛 -20S， 25R- 环氧 -3β， 12β， 26- 三 醇。
     达玛 -20S， 25R- 环氧 -3β， 12β， 26- 三醇在制备抗肿瘤药物中的应用。
     当本发明用于制备抗肿瘤药物时， 其口服或胃肠外给药， 均是安全的， 在口服情况 下， 其可以任何常规形式给药， 如散剂、 粒剂、 片剂、 胶囊剂、 丸剂、 溶液剂、 悬浮液、 糖浆、 口 腔含片、 舌下含片等 ： 当该药物肠胃外给药时， 可采取任何常规形式， 例如注射剂 ： 如静脉 内注射、 软膏剂、 栓剂、 经皮给药、 吸入剂等。
     本发明制备抗肿瘤的药物是由有效成分单体或有效成分与固体或液体的赋形剂 一起构成的， 这里使用的固体或液体的赋形剂在本领域是众所周知的， 下面举几个具体例
     子， 散剂是内服的粉末剂， 它的赋形剂有乳糖、 淀粉、 浆糊精、 碳酸钙、 合成或天然硫酸铝、 氧 化镁、 硬脂酸镁， 碳酸氢钠、 干燥酵母等 ； 溶液剂的赋形剂有水、 甘油、 1， 2- 丙二醇、 单糖浆、 乙醇、 乙二醇、 聚乙二醇、 山梨糖醇等 ； 软膏剂的赋形剂可以使用脂油， 含水羊毛脂、 凡士林、 甘油、 蜂腊、 木腊、 液体石腊、 树脂、 高级腊等组合成的疏水剂或亲水剂。
     本发明的有益效果在于， 新化合物达玛 -20S， 25R- 环氧 -3β， 12β， 26- 三醇可用 于制备抗肿瘤的药物， 具有疗效显著的特点。
     有效物质的剂量可以根据服用方式， 病人的年龄和体重及病情严重程度和其它类 似的因素而改变， 口服量为 ： 50 ～ 200mg， 每日二次服用 ； 注射 10 ～ 40mg， 每日 1 ～ 2 次。 附图说明
     图 1 是本发明化合物的 1H NMR 谱图 ； 图 2 是本发明化合物的 13C NMR 谱图 ； 图 3 是本发明化合物的 HMQC 谱图 ； 图 4 是本发明化合物的 HMBC 谱图 ； 图 5 是本发明化合物的 NOE 谱图 (1) ； 图 6 是本发明化合物的 NOE 谱图 (2)。具体实施方式
     实施例 1 ：
     取红参 1000g， 粉碎， 加 5.5 倍量的 77％乙醇加热回流提取， 每次 3 小时， 共提取 5 次， 合并提取液， 回收溶剂至干 ； 将乙醇提取物经反复硅胶柱色谱， 洗脱剂 ： CHCl3 ∶ MeOH ＝ 100 ∶ 20 ； C-18 反相柱色谱， 洗脱剂 ： MeOH ∶ H2O ＝ 80 ∶ 20 ； 乙醇∶水＝ 2 ∶ 4 重结晶， 得 到达玛 -20S， 25R- 环氧 -3β， 12β， 26- 三醇 0.432g。
     实施例 2 ：
     取红参 1000g， 粉碎， 加 8 倍量的 60 ％乙醇加热回流提取， 每次 6 小时， 共提取 7 次， 合并提取液， 回收溶剂至干 ； 将乙醇提取物经反复硅胶柱色谱， 洗脱剂 ： CHCl3 ∶ MeOH ＝ 120 ∶ 30 ； C-18 反相柱色谱， 洗脱剂 ： MeOH ∶ H2O ＝ 90 ∶ 10 ； 乙醇∶水＝ 2 ∶ 6 重结晶， 得 到达玛 -20S， 25R- 环氧 -3β， 12β， 26- 三醇 0.381g。
     实施例 3 ：
     取红参 1000g， 粉碎， 加 3 倍量的 95％乙醇加热回流提取， 每次 4.5 小时， 共提取 6 次， 合并提取液， 回收溶剂至干 ； 将乙醇提取物经反复硅胶柱色谱， 洗脱剂 ： CHCl3 ∶ MeOH ＝ 90 ∶ 10 ； C-18 反相柱色谱， 洗脱剂 ： MeOH ∶ H2O ＝ 85 ∶ 15 ； 乙醇∶水＝ 2 ∶ 5 重结晶， 得 到达玛 -20S， 25R- 环氧 -3β， 12β， 26- 三醇 0.355g。
     制备药剂的实施例 1 ：
     达玛 -20S， 25R- 环氧 -3β， 12β， 26- 三醇 1.0g， 以 1， 2- 丙二醇 100ml 溶解， 过滤 后分装， 每支 1ml， 含达玛 -20S， 25R- 环氧 -3β， 12β， 26- 三醇 10mg。
     制备药剂的实施例 2 ：
     达玛 -20S， 25R- 环氧 -3β， 12β， 26- 三醇 10.0g， 药用淀粉适量， 二者充分混合， 装 胶囊， 制成 200 粒胶囊， 每粒重 0.20g， 含达玛 -20S， 25R- 环氧 -3β， 12β， 26- 三醇 50mg。实验例 1 ： 采用波谱学方法进行结构鉴定。 13
     ESI-MS 谱给出分子量为 477.4[M+H]+ 的准分子离子峰， 结合 1H NMR、 C NMR 谱确 定其分子式为 C30H52O4。 1
     H-NMR 谱 (500MHz， C5D5N) 中未给出烯氢质子信号 ； 中场未给出糖质子信号 ； 高场 给出 7 个甲基信号 ： δ1.31(3H， s)， 1.29(3H， s)， 1.21(3H， s)， 1.01(3H， s)， 1.00(3H， s)， 0.88(3H， s)， 0.86(3H， s) ； 与人参二醇比较， 少一个甲基质子信号。δ3.42(1H， m) 为 H-3 信 1 号， δ2.10(1H， m) 为 H-17 信号 ； H-NMR 谱中还给出其它质子信号。 13
     C-NMR 谱 (125.8MHz， C5D5N) 中共给出 30 个碳信号 ； δ78.0 为人参二醇组皂苷 C-3 位未连接糖的特征信号 ； δ56.5 为人参二醇组皂苷 C-5 位的特征信号 ； 将该化合物的 13 13 C-NMR 数据与人参二醇 C-NMR 数据相比较， 结果表明二者的母环部分基本一致， 差别在于 C-17 位所连接的六元环的化学位移的不同。该化合物的碳谱数据表明 C-17 位所连接的六 元环 C-25 连接有 1 个甲基和 1 个羟甲基。
     根据该化合物的 HMBC 谱归属了甲基质子的信号 ： 化学位移为 δ0.88 的甲基质 子 与 C-15(δ27.4)， C-8(δ40.1)， C-13(δ49.1) 和 C-14(δ52.3) 有 远 程 相 关， 指定为 H-30 位甲基 ； 化学位移为 δ1.00 的甲基质子与 C-7(δ35.2)， C-8(δ40.1)， C-9(δ50.9) 和 C-14(δ52.3) 有 远 程 相 关， 归 属 为 H-18 位 甲 基 ； 化 学 位 移 为 δ1.31 的 甲 基 质 子 与 C-24(δ31.1)， C-25(δ77.2) 和 C-26(δ71.4) 有远程相关， 指定为 H-27 位甲基 ； 化学位 移 为 δ1.01 的 甲 基 质 子 与 C-28(δ28.7)， C-4(δ39.6)， C-3(δ78.0) 和 C-5(δ56.5) 有 远 程 相 关， 归 属 为 H-29 位 甲 基 ； 化 学 位 移 为 δ1.29 的 甲 基 质 子 与 C-22(δ32.6)， C-17(δ51.61)， C-20(δ78.0) 有远程相关， 指定为 H-21 位甲基 ； 化学位移为 δ0.86 的甲 基质子与 C-10(δ37.4)， C-1(δ39.5) 和 C-9(δ50.9) 有远程相关， 归属为 H-19 位甲基 ； 化 学位移为 δ1.21 的甲基质子与 C-3(δ78.0)， C-4(δ39.6)， C-5(δ56.5) 和 C-29(δ16.3) 有远程相关， 指定为 H-28 位甲基。化学位移为 δ3.76(1H， d， J ＝ 11.5Hz)， 3.56(1H， d， J ＝ 11.5Hz) 的质子与 C-27(δ23.8)， 有远程相关， 指定为 H-26 位质子信号。
     在 NOE 谱中， 当照射 H-17 质子时， 可观察到 H-21 质子信号增强， 说明 C-21 位的立 体构型为 S 构型。当照射 H-21 质子时， 可观察到 H-27 质子信号增强， 说明 C-25 位的立体 构型为 R 构型。
     又根据该化合物的 HMBC、 HMQC 谱归属了其他碳、 氢信号。数据见表 1。1H NMR 谱、 13 C NMR 谱、 HMQC 谱、 HMBC 谱、 NOE 谱分别见附图 1-6。
     综合分析， 鉴定该化合物为达玛 -20S， 25R- 环氧 -3β， 12β， 26- 三醇。 经 Science Finder 检索未发现有关该化合物的文献报道， 为一新化合物。
     表 1 达玛 -20S， 25R- 环氧 -3β， 12β， 26- 三醇的 NMR 数据和 HMBC 相关
     实验例 2、 MTT( 四唑盐 ) 法测定达玛 -20S， 25R- 环氧 -3β， 12β， 26- 三醇对肿瘤 细胞的杀伤作用的选择
     (1) 试验设计
     使用瘤株 ： MCF-7 人乳腺癌细胞、 PC3M 人前列腺癌细胞、 NCI-H446 人肺癌细胞三种 人体肿瘤细胞系。
     (注： 不同细胞采用不同的培养液 ： RPMI1640、 IMDM、 DMEM。)
     试验分组 ：
     达玛 -20S， 25R- 环氧 -3β， 12β， 26- 三醇剂量组 ： 1.0、 2.5、 5、 7.5、 10、 12.5、 15、 17.5、 20μg/ml ；
     空白对照组 ： 溶剂 ；
     阳性对照组 ： 5- 氟尿嘧啶 (1.0μg/ml)。
     (2) 方法 ：
     ① MTT 液 的 配 制 ： 250mgMTT， 放 入 小 烧 杯 中， 加 50mlPBS(pH7.4， 0.01M)， 搅拌 30min， 配制成浓度为 5mg/ml 溶液， 用 0.22um 的微孔滤器滤菌， 分装， 4℃保存， 两周内有效。
     ②取对数生长期的肿瘤细胞， 加入适量 0.25％胰蛋白酶， 使贴壁细胞脱落， 作细胞 4 计数， 一般不着色的活细胞应在 97％以上， 配成 6×10 /ml 细胞悬液。
     ③取 96 孔平板， 每孔加细胞悬液 100ul。将平板置 37℃ 5％ CO2 温箱 24h。
     ④孵育 24h 后， 于 96 孔板加入 100μl/ 孔不同浓度的 SPG-Rg3(SPG-Rg3 用无血清 培养基稀释， 调成所需浓度 )， 置 37℃ 5％ CO2 温箱孵育 72h。
     ⑤ 96 孔板每孔加入 20ulMTT 液 (MTT 用无血清 RPMI 1640 培养液配成 5mg/ml 溶 液 ) 继续孵育 4h， 终止培养。
     ⑥小心吸弃上清液， 每孔加入 150ul DMSO， 震荡 10min， 使结晶物充分溶解 ； ⑦用自动化分光光度平板读数计在 570nm 处测定每个小孔的光密度 (OD 值 )。 ⑧结果判定 ： a. 计算出细胞存活率 ： ( 计算细胞存活率时， 将各测试孔的 OD 值减去本底 OD 值， 各重复孔的 OD 值取均数±SD) b. 求出 T/C ＝ 50％时的药物浓度 (IC50) 及 T/C ＝ 10％时的药物浓度 (IC90)。
     c. 数据使用 SPSS 软件分析系统进行处理 ( 加权直线回归法 )。
     (3) 结果 ： 实验结果表明 ： 达玛 -20S， 25R- 环氧 -3β， 12β， 26- 三醇对 3 种人体肿 瘤细胞均有杀伤作用， 结果分别见表 2-4。
     表 2 对 MCF-7 人乳腺癌细胞的影响
     表 3 对 PC3M 人前列腺癌细胞的影响
     表 4 对 NCI-H446 人肺癌细胞的影响