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1、10申请公布号CN102343133A43申请公布日20120208CN102343133ACN102343133A21申请号201110145683622申请日20110531A62D3/02200701C12P17/16200601A62D101/28200701C12R1/0120060171申请人南京师范大学地址210046江苏省南京市栖霞区亚东新城区文苑路1号72发明人戴亦军张会娟周广灿姬微微袁生74专利代理机构南京知识律师事务所32207代理人卢亚丽54发明名称烟碱类杀虫剂噻虫啉的微生物降解方法57摘要本发明涉及一种烟碱类杀虫剂噻虫啉的微生物降解技术以及其应用于酰胺噻虫啉的微生物合。
2、成。将接种具有降解噻虫啉能力的微生物于培养液中，于2040培养1048H后，洗涤和收集菌体；将菌体加入到含降解底物10200MG/L噻虫啉的PH6085的缓冲液中，于2040振荡培养；进行噻虫啉的降解并同时将噻虫啉转化为酰胺噻虫啉。该技术操作简便，可以应用于治理含噻虫啉的废水污水或噻虫啉污染的土壤修复以及生物合成酰胺噻虫啉产物。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书3页附图3页CN102343151A1/1页21一种烟碱类杀虫剂噻虫啉的微生物降解方法，其特征在于接种具有降解噻虫啉能力的微生物于培养液中，于2040培养1048H后，洗涤和收集菌体；将菌。
3、体加入到含降解底物10200MG/L噻虫啉的PH6085的缓冲液中，于2040振荡培养；进行噻虫啉的降解并同时将噻虫啉转化为酰胺噻虫啉。2根据权要求1所述的烟碱类杀虫剂噻虫啉的微生物降解方法，其特征在于具有降解噻虫啉能力的微生物是VARIOVORAXPARADOXUSCGMCC11842；ACINETOBACTERJOHNSONIIACCC02175；OCHROBACTERIUMANTHROPICGMCC12501或SINORHIZOBIUMMEDICAECGMCC12547。权利要求书CN102343133ACN102343151A1/3页3烟碱类杀虫剂噻虫啉的微生物降解方法技术领域0001。
4、本发明涉及一种可用于烟碱类杀虫剂噻虫啉微生物降解技术及其在酰胺噻虫啉生物合成中的应用。背景技术0002氯代烟碱类杀虫剂是用于防治刺吸口器和一些咀嚼口器害虫最有效的农药有效成分之一。噻虫啉（THIACLOPRID，图1）是一种对刺吸口器害虫有高效的广谱杀虫剂，对梨果类水果、棉花、蔬菜和马铃薯上的重要害虫有优异的生物活性。除对蚜虫和粉虱有效外，噻虫啉对各种甲虫和鳞翅目害虫也有效。目前，噻虫啉在全球50多种农作物上使用。近几年来在我国开始推广和使用。噻虫啉的环境行为研究表明，噻虫啉可在动植物体内被羟基化，脱氢，水解等。噻虫啉在土壤中的主要代谢途径为水解氰基亚胺基药效基团生成酰胺噻虫啉。申请人所在实验。
5、室报道了一株红酵母RHODOTORULAMUCILAGINOSAIM2可降解噻虫啉并生成产物酰胺噻虫啉，然而RMUCILAGINOSAIM2的生长细胞需要在添加葡萄糖的矿物盐培养基中才能降解噻虫啉（DAIETAL2010）。葛峰等人申请了一种酰胺噻虫啉的化学合成方法的发明专利（专利公开号CN101792439A），然而该方法需要使用强酸和强碱以及反应介质丙酮。0003本发明采用微生物非生长细胞（静息细胞）进行噻虫啉的降解以及合成酰胺噻虫啉，不需高温高压、方法温和且更为安全。在噻虫啉降解和合成酰胺噻虫啉过程中不需要添加葡萄糖等初级能源物质用于噻虫啉的共代谢降解。因而该技术具有工艺简单、节约原料等。
6、特点。发明内容0004本发明的目的是提供一种在噻虫啉降解和合成酰胺噻虫啉过程中不需要添加葡萄糖等初级能源物质用于噻虫啉的共代谢降解的方法。0005本发明的原理如图1所示，是采用微生物降解进行噻虫啉的降解以及合成酰胺噻虫啉。0006本发明先培养获得微生物菌体，将菌体加入到含有一定浓度噻虫啉的缓冲溶液中，一定时间后取样，高效液相色谱法（HPLC）分析噻虫啉的浓度。如噻虫啉浓度与不加菌体的对照组相比，有明显降低，则表示该微生物菌株具有噻虫啉的降解能力。采用上述方法，本发明从菌种库中筛选到VARIOVORAXPARADOXUSCGMCC11842；ACINETOBACTERJOHNSONIIACCC0。
7、2175；OCHROBACTERIUMANTHROPICGMCC12501；SINORHIZOBIUMMEDICAECGMCC12547等菌种具有噻虫啉降解能力。降解过程中噻虫啉的氰基转变为酰胺基，生成酰胺噻虫啉。0007本发明所述的烟碱类杀虫剂噻虫啉的微生物降解方法，是接种可降解噻虫啉的微生物于培养液中，于2040培养1048H后，洗涤和收集菌体；将菌体加入到含降解底物10200MG/L噻虫啉的PH6085的缓冲液中，于2040振荡培养。利用微生物的代谢能说明书CN102343133ACN102343151A2/3页4力同时进行噻虫啉的降解和酰胺噻虫啉的生物合成。该方法工艺简单安全，操作简便。
8、，可用于噻虫啉的污水处理和噻虫啉污染土壤修复以及酰胺噻虫啉的生物合成。0008上述具有噻虫啉降解能力的菌株可以是VARIOVORAXPARADOXUSCGMCC11842；ACINETOBACTERJOHNSONIIACCC02175；OCHROBACTERIUMANTHROPICGMCC12501；SINORHIZOBIUMMEDICAECGMCC12547等菌种。上述菌种可在菌种保藏管理中心购买到。0009上述应用于菌体培养的培养液没有特别的限制，可以是任何一种适合于上述微生物生长的营养物质。0010上述微生物发酵培养条件是2040，50300RPM摇瓶振荡通气、或搅拌通气供氧，发酵104。
9、8H。0011上述微生物在发酵过程中不需要添加特别的诱导剂诱导降解酶和酰胺噻虫啉合成酶。0012上述发酵液与菌体分离，可采用离心分离方法、或过滤分离方法获得菌体细胞。0013上述降解噻虫啉的条件为，底物噻虫啉的浓度介于10200MG/L，在任意一种PH6085缓冲溶液中进行降解和合成酰胺噻虫啉，温度范围在2040，50300RPM摇瓶振荡通气、或搅拌通气供氧，反应时间介于1060H。附图说明0014图1微生物降解噻虫啉生成产物酰胺噻虫啉。0015图2VARIOVORAXPARADOXUSCGMCC11842降解噻虫啉和生成酰胺噻虫啉曲线。0016图3VARIOVORAXPARADOXUSCGM。
10、CC11842降解噻虫啉的HPLC及质谱分析。0017图4未添菌体的噻虫啉对照的HPLC分析。0018图5添加葡萄糖对VARIOVORAXPARADOXUSCGMCC11842降解噻虫啉影响的HPLC分析。具体实施方式0019实施例1将VARIOVORAXPARADOXUSCGMCC11842划线于LB固体培养基上，于30培养36H。将200MLLB培养液装入500ML三角瓶，121高压蒸汽灭菌15MIN后，冷却至室温后，接入上述于固体培养基上生长的菌种，30，200RPM振荡发酵培养24H后，停止发酵，5000RPM离心使菌体和发酵液分离，菌体用PH70的磷酸缓冲液洗涤后，悬浮于总体积为20。
11、0ML的含有200MG/L噻虫啉磷酸盐缓冲液（PH70）的500ML三角瓶中，30，200RPM振荡通气进行静息细胞降解和转化噻虫啉，60H后，停止反应，离心去除菌体。HPLC检测上清液中噻虫啉含量降低至760MG/L；酰胺噻虫啉含量增加至130MG/L（图2和图3），未加入微生物菌体的对照组的噻虫啉浓度则没有减少（图3），同时也未检测到酰胺噻虫啉的生成（图4）。离心去除菌体的上清液用等体积的乙酸乙酯萃取两次，浓缩后得到的晶体用乙腈洗涤去除底物噻虫啉，可得到20MG纯度为97的酰胺噻虫啉晶体。酰胺噻虫啉的核磁共振碳谱数据为1685、1638、1501、1497、1401、1323、1247、4。
12、91、468、220；氢谱数据为841D1H、780DD1H、747D1H、654S1H、626S1H、470S2H、351T2H、301T2H。0020实施例2与实例一相同，区别在于含于噻虫啉的缓冲液中加入2G/L葡萄糖，HPLC说明书CN102343133ACN102343151A3/3页5检测（图5）上清液中噻虫啉含量降低至756/L；酰胺噻虫啉含量增加至1284MG/L。与实例1的结果相比，VPARADOXUSCGMCC11842降解噻虫啉和合成酰胺噻虫啉不需要葡萄糖作为能源物质。0021实施例3将200MLLB培养液放入500ML三角瓶，121高压蒸汽灭菌15MIN，接入ACINET。
13、OBACTERJOHNSONIIACCC02175菌种，30，50RPM振荡发酵培养，10H后，停止发酵，离心使菌体和发酵液分离，菌体加入500ML三角瓶中，并加入含150MG/L噻虫啉的磷酸盐缓冲液（PH85）200ML，30，220RPM振荡通气进行转化48H后，停止转化，8000RPM离心去除菌体，上清液中噻虫啉含量由150MG/L减少到106MG/L；酰胺噻虫啉含量增加至36MG/L。0022实施例4将300ML牛肉膏蛋白胨培养液PH70放入1000ML三角瓶，115高压蒸汽灭菌20MIN，冷却后，接入OCHROBACTERIUMANTHROPICGMCC12501，30，300RPM。
14、振荡发酵培养48H后，离心收集菌体。菌体悬浮于内装300ML含200MG/L噻虫啉的PH60缓冲液的1000ML三角瓶中，于30进行噻虫啉降解。60H后，取样HPLC分析，上清液中噻虫啉含量降低至170MG/L，酰胺噻虫啉含量增加至22MG/L。0023实施例5与实例1相同，接入的菌种为SINORHIZOBIUMMEDICAECGMCC12547。48H后取样分析，噻虫啉含量由200MG/L降低至82MG/L，酰胺噻虫啉含量增加至103MG/L。0024实施例6与实例1相同，取样时间不同。10H后取样分析，噻虫啉含量由200MG/L降低至148MG/L，酰胺噻虫啉含量增加至50MG/L。002。
15、5实施例7与实例1相同，菌体培养温度设为20，其他条件相同，取样分析，噻虫啉含量由200MG/L降低至876MG/L，酰胺噻虫啉含量增加至1125MG/L。0026实施例8与实例1相同。菌体培养温度设为40，其他条件相同。转化液中噻虫啉含量由200MG/L降低至176MG/L，酰胺噻虫啉含量增加至18MG/L。0027实施例9与实例1相同。菌体培养时摇瓶转速设为50RPM，其他条件相同。样品中噻虫啉含量由200MG/L降低至1459MG/L，酰胺噻虫啉含量增加至516MG/L。0028实施例10与实例1相同。菌体培养时摇瓶转速设为300RPM，其他条件相同。样品中噻虫啉含量由200MG/L降低。
16、至584MG/L，酰胺噻虫啉含量增加至1436MG/L。0029实施例11与实例1相同。降解噻虫啉时摇瓶转速设为50RPM，其他条件相同。样品中噻虫啉含量由200MG/L降低至687MG/L，酰胺噻虫啉含量增加至1332MG/L。0030实施例12与实例1相同。降解噻虫啉时摇瓶转速设为300RPM，其他条件相同。样品中噻虫啉含量由200MG/L降低至607MG/L，酰胺噻虫啉含量增加至1396MG/L。0031实施例13与实例1相同。底物噻虫啉浓度设为10MG/L，其他条件相同。样品中噻虫啉含量由降低至6MG/L，酰胺噻虫啉含量增加至3MG/L。0032实施例14与实例1相同。降解噻虫啉的温度为20，其他条件相同。样品中噻虫啉含量由200MG/L降低至801MG/L，酰胺噻虫啉含量增加至1178MG/L。0033实施例15与实例1相同。降解噻虫啉的温度为为40，其他条件相同。样品中噻虫啉含量由200MG/L降低至1815MG/L，酰胺噻虫啉含量增加至177MG/L。说明书CN102343133ACN102343151A1/3页6图1图2说明书附图CN102343133ACN102343151A2/3页7图3图4说明书附图CN102343133ACN102343151A3/3页8图5说明书附图CN102343133A。