一种狗用的转移因子及其制备方法和用途.pdf

一种在宠物上应用的转移因子溶液的制备方法，包括：将冷冻的鸡脾脏用蒸馏水洗净后切成小块，加入无热源质蒸馏水，用高压匀制机破碎细胞，制成匀浆，加无热源质蒸馏水，混匀，置-20℃反复冻融8次；将冻融的匀浆离心，去沉淀，留上清液用微孔滤膜进行过滤，然后用超滤膜进行超滤得到原液；去除病毒后配制加入1％-2％的硬脂酸锌作为稳定剂，用微孔滤膜除菌过滤；过滤后加入甘油作为耐热保护剂，直接分装。本方法所制备的转移因子，可用于宠物狗的疾病预防和治疗，节约人力和物力，提高了提取率。

1、  一种在用于宠物的转移因子溶液的制备方法，包括：
(1)将冷冻的鸡脾脏1kg，去除脂肪、被摸和大的血管，用去热原蒸馏水洗净后切成小块，加入1L无菌生理盐水；
(2)用高压匀制机进行细胞破碎，同时加入240ml的1％壳聚糖溶液作为絮凝剂，混匀后制成匀浆；
(3)置-20℃冷冻和室温融化，反复冻融8次；
(4)然后在4℃，以6000rpm离心并取上清液，反复3次后，将上清置于透析袋中并将透析袋放入盛有无菌生理盐水的容器内，置于0-4℃透析72h；
(5)用4％MaHCO₃调整透析液PH值至中性，并加入0.3％的氯仿作防腐剂；
(6)将透析液通过微孔滤膜进行过滤，然后用超滤膜进行超滤，即为含有转移因子的原液；
(7)在原液中加入浓度为1.5％的硬脂酸锌的2ml稳定剂后，通过0.25μm微孔滤膜除菌过滤，然后加入5ml甘油的耐热保护剂，直接分装，即得到转移因子溶液。

2、  权利要求1的方法，其中所述的高压细胞破碎机的工作参数，优选100Mpa、50Hz。

3、  权利要求1或2的方法，其中使用0.45μm的微孔滤膜和截留分子量为5000道尔顿的超滤膜。

4、  根据权利要求1或3任一项所述的在宠物上应用的转移因子溶液在狗上的应用，其特征在于：可与疫苗配合使用以巩固疫苗效果，还可治疗细菌与病毒的混合性感染。用量：45日龄，0.6-1ml/kg。

一种狗用的转移因子及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于生物工程技术领域中一种用来提高狗免疫力的转移因子，特别涉及一种在狗上应用的转移因子溶液及其制备方法及在狗上的应用。
背景技术
随着人们生活工作节奏的不断加快，人与人之间的交流变得越来越少，因此宠物成了人们理想的精神寄托，并且随着宠物在人们心目中地位的不断提升，一些宠物福利也跟着提高，所以宠物疾病是我们刻不容缓要加强重视的问题。目前狗的一些病毒性疾病已成为困扰人们的一大难题。现有的普遍的解决方法就是打疫苗，然而由于种种原因，有时难免会造成免疫失败，爆发疾病，给诊断和治疗带来一定困难。在免疫失败后往往依赖抗生素治疗，造成了耐药菌株的增加和交叉感染的产生。
转移因子(TF，Transfer Factor)是从淋巴细胞中提取的一类低分子肽与核苷酸复合物，具有传递免疫信息、激发免疫细胞活性、调节免疫功能、增强机体非特异性细胞免疫功能等作用，被誉为T细胞活性的触发剂，细胞免疫的增强剂、细胞免疫调节剂及干扰素产生启动剂。转移因子分子量小、无毒、无抗原性、不起过敏反应，不产生对抗抗体且可超越种系界限应用等优点。自美国著名的免疫学专家Lawrence发现和研究转移因子以来，世界各国不但进行了许多理论研究，而且进行了大量的临床应用研究，使得转移因子成为目前应用广泛的增强免疫制剂。
目前现有的转移因子技术，将去净脂肪和门静脉的动物脾冷冻后一次绞碎，然后加入室温生理盐水进行组织捣碎，装入透析袋内置于盛有室温生理盐水的不锈钢桶内，盖上盖后放入4℃冰箱内透析24小时。这种方法的不足之处是，受透析液腐败因素的制约，透析时间短，透析液中转移因子含量低，仅为每毫升0.4至0.5毫克。
另外，常规采用Laurence方法，即利用两次透析法回收转移因子此法操作简单，但生产周期长工序繁琐(生产周期约需要20天)，耗时长，浪费大量人力物力。因此这些方法都难以进行工业化大规模生产。
因此，需要一种在狗上应用的转移因子溶液及其制备方法及在狗上的应用，以满足目前的宠物狗市场，有效巩固狗打疫苗后的免疫效果。
发明内容
本发明原理基于：Libuid E M等(1972)发现，TF的作用不受种属的限制，即猪的TF能将其免疫活性转移给牛、羊、犬、鸡和人。因此，为使转移因子在宠物中得以广泛应用，同时避免猪、狗、牛等其他动物脾脏成本过高等问题，本发明采用肉鸡脾脏提取转移因子，并对传统转移因子的提取工艺进行比较优化，设计出出产率高、生产成本低且延长透析时间，提高透析液中转移因子的含量的方法。
本发明的第一个目的是提供一种在宠物狗上应用的转移因子溶液的制备方法，步骤包括：
(1)将冷冻的鸡脾脏1kg，去除脂肪、被摸和大的血管，用去热原蒸馏水洗净后切成小块，加入1L无菌生理盐水；
(2)用高压匀制机(100Mpa)进行细胞破碎，混匀后制成匀浆；
(3)置-20℃冷冻和室温融化，反复冻融8次；
(4)然后在4℃，以6000rpm离心并取上清液，反复3次后，将上清置于透析袋中并将透析袋放入盛有无菌生理盐水的容器内，置于0-4℃透析72h；
(5)用4％MaHCO₃调整透析液PH值至中性，并加入0.3％的氯仿作防腐剂；
(6)将透析液通过微孔滤膜进行过滤，然后用超滤膜进行超滤，即为含有转移因子的原液；
(7)在原液中加入稳定剂后，通过0.25μm微孔滤膜除菌过滤，然后加入耐热保护剂，直接分装，即得到转移因子溶液。
在一个具体实施方案中，透析液用无菌过滤，微孔滤膜可用0.45μm，然后用截留分子量为5000道尔顿超滤膜进行超滤，即为原液。
在另一个具体实施方案中，所述的稳定剂是浓度范围为1％-2％的硬脂酸锌2ml，所述的耐热保护剂是5ml甘油。
在一个具体实施方案中，所述的蒸馏水是去热原的蒸馏水。
在另一个具体实施方案中，步骤(2)中同时加入240ml的1％絮凝剂，其中所述的絮凝剂是壳聚糖溶液。
本发明的第二个目的是提供通过上述方法所制备的狗用的转移因子溶液。
由于转移因子是从淋巴细胞中提取的一类低分子肽与核苷酸复合物，目前并没有明确的组分或结构，制备方法的不同，所得的转移因子也会差异，因此通常在生产过程中是通过限定制备方法的参数来明确转移因子。在本发明中，由于限定了具体的制备方法，因此所得到的转移因子具有组分稳定、纯度高、活性好等特点，具有很好的应用前景。
本发明的第三个目的是提供所制备的转移因子在宠物狗疾病预防和治疗上的用途。
术语：
“热原”系指由微生物产生的能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。这里所指的“热原”，主要是指细菌性热原，是某些细菌的代谢产物、细菌尸体及内毒素。致热能力最强的是革兰氏阴性杆菌的产物，其次是革兰阳性杆菌类，革兰阳性球菌则较弱，霉菌、酵母菌、甚至病毒也能产生热原。热原通常是磷脂多醇与蛋白质结合而成的复合物。磷脂多醇是复合物的活性中心，致热作用最强。其化学组成因菌种不同而有所差异。分子量为5×104～5×105，分子量越大致热作用也越强。
去热原的方法包括：
1.高温法：热原的耐热性能良好，60℃加热1h不被分解破坏，100℃不降解，但180℃3～4h、200℃60min或250℃30～45min可使热原彻底破坏。因此耐热物品如玻璃制品、金属制品、生产过程中所用的容器和其它用具以及注射时使用的注射器等，均可采用此法破坏热原。但在通常使用的注射剂热压灭菌条件下不足以破坏热原。
2.吸附法：热原在水溶液中可被活性炭、石棉、白陶土等吸附而除去。由于活性炭性质稳定、吸附性强兼具助滤和脱色作用，故广泛用于注射剂生产，但应注意吸附药液所造成的主药的损失。
3.超滤法：热原分子量为1×10⁶左右，体积较小，约1～5nm，可以通过一般滤器和微孔滤膜，但采用超滤法如用3.0～15nm超滤膜可将其除去。
4.蒸馏法：热原能溶于水但不挥发，但可随水蒸气的雾滴进入注射用水中，因此制备注射用水时，原水中的热原可经蒸馏除去，但需多次蒸馏，，并加有隔沫装置，单次蒸馏往往效果不理想。
5.酸碱法：热原能被强酸、强碱、强氧化剂破坏。玻璃容器及用具如配液用玻璃器皿、输液瓶等可用重铬酸钾硫酸清洁液或稀氢氧化钠处理，破坏热原。
6.其它：包括离子交换法、凝胶滤过法、反渗透法等。
有益效果
1.本发明在提取过程中，破碎后使用高压均质机再次进行破壁，使得组织或细胞内容物充分被释放，同时节约了大量的人力和物力，提高了提取率。
2.在破壁同时中加入了絮凝剂，使得溶液中的蛋白质沉淀，溶液变澄清，在超滤的过程中减少了堵塞中空纤维超滤柱的可能；
3.采用本发明生产转移因子，生产周期大大缩短，使得按传统反复冻融的方法进行细胞破壁、半透膜进行透析的方法，生产周期缩短20天左右；而采用本发明方法制备的转移因子生产周期只需要7天左右，节省了大量的人力物力；
4.提高了转移因子的生产效率，传统反复冻融的方法进行细胞破壁、半透膜进行透析的方法，生产的转移因子原液，每1000g脾脏约生产含量为2.0mg/mL左右的原液2000ml，而采用本发明生产每1000g脾脏约生产含量为7.0mg/mL左右的原液1000ml，折合产量增加175％。
5.在0-4℃低温透析环境，透析时间延长，透析液中转移因子的含量提高，达到每毫升0.8毫克多，比已有技术提高40％以上，转移因子活性也有所提高。
6.把耐热保护技术与转移因子相结合，使转移因子的保存温度由-15℃提高到常温，实现了转移因子的常温保存，该技术既适应了实际的需要，使转移因子在运输和使用中再无须低温环境，同时转移因子作为一种细胞免疫反应增强剂，提高了机体抗病能力，解除了机体的免疫抑制和免疫耐受性，对患病狗可产生紧急辅助治疗的作用，也弥补了疫苗接种后抗体产生前的免疫空白。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明做进一步的描述。
实施例1：转移因子的制备
(1)将冷冻的鸡脾脏1kg，去除脂肪、被摸和大的血管，用去热原蒸馏水洗净后切成小块，加入1L无菌生理盐水；
(2)用高压匀制机(100Mpa)进行细胞破碎，同时加入240ml的1％壳聚糖溶液作为絮凝剂，混匀后制成匀浆；
(3)置-20℃冷冻和室温融化，反复冻融8次；
(4)然后在4℃，以6000rpm离心并取上清液，反复3次后，将上清置于透析袋中并将透析袋放入盛有无菌生理盐水的容器内，置于0-4℃透析72h；
(5)用4％MaHCO₃调整透析液PH值至中性，并加入0.3％的氯仿作防腐剂；
(6)将透析液通过0.45μm微孔滤膜进行过滤，然后用截留分子量为5000道尔顿超滤膜进行超滤，即为含有转移因子的原液；
(7)在原液中加入浓度为1.5％的硬脂酸锌的2ml稳定剂后，通过0.25μm微孔滤膜除菌过滤，然后加入5ml甘油的耐热保护剂，直接分装，即得到转移因子溶液。
实施例2：对本发明所述工艺制备的转移因子的检测
对实施例1所述工艺制备的转移因子原液按照国家药品监督管理局、国家药品标准WS₁-XG-036-2000进行以下检测：
1、外观性状为微黄色澄明液体，符合转移因子溶液的外观性状。
2、氨基酸鉴别反应为正反应。
3、紫外分光光度测定：上述所得样品在251±2nm处有一吸收峰，且ABS₂₅₀/ABS₂₈₀＞2.0。
4、pH值在6.0～7.5之间。
5、20％磺基水杨酸检测：上述所得样品无浑浊及沉淀现象，说明蛋白反应均成阴性，其不含大分子蛋白质。
6、高分子量物质检测，在胰岛素出峰时间之前无吸收峰，说明本品中无高于分子量6000的大分子。
7、游离氨基酸检测：每1ml中本品氨基酸含量10mg。
7、转移因子活性测定：根据转移因子可使脱E受体后的胸腺T细胞恢复其受体功能，从而反应转移因子的生物活性。上述所得样品形成E玫瑰花结的百分率分别为31.2％、29.6％，比对照组分别增加17.8％、16.9％(P≤0.01)。
8、细菌学检验：上述所得样品中无需氧、厌氧、腐生菌和真菌存在。
9、过敏性、毒性试验：取健康小白鼠10只，雌雄各半，口服本品浓缩液，相当于正常口服剂量的100倍，观察小白鼠的生存能力的变化，结果：无任何过敏、毒性反应，也无任何死亡出现，说明本品是安全的，无任何毒性和副作用。
10、核酸含量测定：上述所得样品经地衣酚法测定核酸含量分别为621.05μg/mL、599.89μg/mL。
11、多肽含量测定：上述所得样品经Lowry法测定多肽含量分别为：7.12mg/mL、6.98mg/mL。
12、用猪伪狂犬病病毒抗原做皮试检测，有弱的阳性反应，说明本品具有良好的转移活性和特异性。
通过上述实施例，我们发现所提取的鸡脾脏转移因子含量高，生产工序简单，生产效率高。同时所生产转移因子原液符合国家法典的标准规定。因此本发明所采用的生产方法可以进行大规模的生产推广。
实施例3：本转移因子对在狗上的应用
对实施例1所述工艺制备的转移因子，按照农业部公告第442号发布的兽用生物制品临床试验研究资料要求进行以下研究：
1、试验动物：45日龄健康小狗6只，均断奶，常规方式饲喂。
2、攻毒：对6只小狗攻等量犬细小病毒弱毒，均致发病。
3、试验方法：待症状出现，立即进行临床治疗试验。随机分为3组，每组2只。低剂量组肌注转移因子溶液剂量为0.3ml/kg；中剂量组肌注转移因子溶液剂量为0.6ml/kg；高剂量肌注转移因子溶液剂量为1.0ml/kg。均一日一次，连续3天。
4、试验结果：低剂量组症状减轻，精神、食欲等均好转；中剂量组跟高剂量组均恢复健康，精神、食欲等恢复正常。
通过上述实施例，我们发现所提取的鸡脾脏转移因子对于犬的病毒病起到治疗作用。因此本发明可以进行大规模的生产推广。