L-抗坏血酸不饱和脂肪酸酯酶催合成方法 【技术领域】
本发明涉及一种L-抗坏血酸不饱和脂肪酸酯的制备方法，具体涉及一种L-抗坏血酸不饱和脂肪酸酯酶催合成方法。
技术背景
L-抗坏血酸(Vc)是一种广泛应用的天然抗氧化物，是人类不可缺少的营养要素之一。它是生物体内活性氧化物质(reactive oxygen species，ROS)的抑制剂，而ROS与各种疾病的产生密切相关。
不饱和脂肪酸如花生四烯酸AA、亚麻酸ALA、二十碳五烯酸EPA和二十二碳六烯酸DHA等人体内不能合成，需要从食物中摄取，所以是人类的必需脂肪酸，它们在机体内具有较广泛的生理功能和生物学效应，而且双键愈多，不饱和程度愈高，营养价值也愈高，不饱和脂肪酸具有维护生物膜的结构和功能、治疗心血管疾病、抗炎、抗癌以及促进大脑发育、减肥、增加动物的产仔率和成活率等生理功能。
对于L-抗坏血酸棕榈酰酯功能，特别是抗氧化作用的研究，近年来研究很多，Jian-Wen Liu等人报道该种物质因其抗氧化作用，从而抑制癌细胞的转移。
相对于L-抗坏血酸棕榈酰酯，L-抗坏血酸不饱和脂肪酸酯非水相酶催合成研究在国内外极少。不饱和脂肪酸在化妆品、医药、食品中广泛应用，其本身就有氧化保护的性质，如果其与Vc连接，将赋予新的分子更加优良的性质，较之抗L-坏血酸棕榈酰酯，L-抗坏血酸不饱和脂肪酸酯更容易透过细胞膜，更容易在脂质层中分布，对ROS有更强的抑制作用，前期的研究表明，L-抗坏血酸不饱和脂肪酸酯具有非常好地两相溶解性、强的抗氧化保护作用等。又因为不饱和脂肪酸与棕榈酸在溶解性等物理化学性质等方面差别较大，因此其合成机理与工艺同L-抗坏血酸棕榈酰酯的酶催合成有很大的差别，L-抗坏血酸棕榈酰酯的酶催合成方法不能用于L-抗坏血酸不饱和脂肪酸酯。
非水相酶催化是一迅速发展的研究领域，自从1984年Zaks andKlibanov研究报道在非水相中可进行酶的催化反应以来，对非水相酶催化反应的研究取得了大量的进展，脂肪酶是非水相酶催化研究中应用最为广泛的一种酶，脂肪酶种类很多，不同来源不同微生物产生的脂肪酶其功能不同，其催化的转酯及酯合成反应各有特点。
目前，L-抗坏血酸不饱和脂肪酸酯的合成方法一般采用如Journal ofMolecular Catalysis B：Enzymatic，5(1998)19-23文献公开的方法，该方法反应脂肪酸转化率不足20％，因此不能满足有关方面的需要。
【发明内容】
本发明需要解决的技术问题是公开一种L-抗坏血酸不饱和脂肪酸酯酶催合成方法，以克服现有技术存在的上述缺陷，满足有关领域发展的需要。
本发明是通过酶催化反应将不饱和脂肪酸和L-抗坏血酸反应合成相应的酯，使该酯能够稳定溶于水，从而能够在水溶性饮品和食品中加入不饱和脂肪酸这类人体重要的营养物质。
所说的L-抗坏血酸不饱和脂肪酸酯的结构通式如下：
R代表C17H33、C17H31、C17H29、C19H31、C19H29或C21H31。
本发明的方法包括如下步骤：
将L-抗坏血酸与不饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸酯，在反应介质中，以固定化脂肪酶为催化剂，反应体系中，以重量计水含量为0.01～0.06％，40～60℃反应1～16小时，然后采用常规的方法从反应产物中收集L-抗坏血酸不饱和脂肪酸酯。
本发明优选的方法包括如下步骤：
将L-抗坏血酸与不饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸酯，在反应介质中，以固定化脂肪酶为催化剂，反应体系中，以重量计水含量为0.04％-0.06％，40～60℃反应1～3小时，然后再在水含量为0.01～0.04％的条件下反应8-16小时，采用常规的方法从反应产物中收集L-抗坏血酸不饱和脂肪酸酯。
水含量的控制可通过在反应体系中加入分子筛实现，以L-抗坏血酸与不饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸酯的总重量计，分子筛的加入量为5～20wt％；
或采用减压蒸发干燥回流控制体系中的水分含量。
术语“减压蒸发干燥回流”指的是反应器内压力减小，反应溶剂夹带水分蒸发，经过冷凝，流回时经过干燥剂干燥，水分被吸收。可抽真空，将体系的压力控制在真空度0.08～0.1Mpa，使体系中的水分蒸发，冷凝后干燥，溶剂部分回流，以达到控制体系中水含量的目的。
L-抗坏血酸与不饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸酯的摩尔比为1∶1～5；
所说的反应反应介质包括叔戊醇、乙腈或四氢呋喃中的一种；
所说的不饱和脂肪酸包括油酸、亚油酸、共厄亚油酸、花生四烯酸、α-亚麻酸、二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸(DHA)等中的一种；
所说的不饱和脂肪酸酯包括油酸甲酯、油酸乙酯、亚油酸甲酯、亚油酸乙酯、二十碳五烯酸乙酯、二十二碳六烯酸乙酯等中的一种；
所说的固定化脂肪酶选自来源于假丝酵母的脂肪酶，可采用Journal ofMolecular Catalysis B：Enzymatic，18(2002)261-266.文献公开的方法进行制备，或采用市售产品，如诺维信公司生产的牌号为Novozym 435的固定化脂肪酶，该酶是Candida antarctica的B型脂肪酶固定在丙烯型大孔树脂上。
在非水相酶催化中，水分是一个非常重要的因素，酶分子维持其活性构型需要一定的水分，另外，在相同的水活度下却又因反应溶剂和载体的极性或亲水性不同，酶分子的微环境中水活度也不同。在L-抗坏血酸亚油酸酯的酶法合成中，我们发现，不管是在转酯还是在酯合成反应中，水活度对产率的影响都非常大，当反应体系中含有一定量的水分时，转酯反应中水活度不仅影响脂肪酶的活性，而且对底物亚油酸甲酯的水解、产物的水解及合成都有影响，水分对整个反应会产生复杂的影响。
发明人经过大量的试验，发现，反应体系中水分的含量对转化率和反应效率的影响十分显著，对反应体系中不同的水分含量，如分别为0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％等进行试验，测定反应的初速度和达到平衡后的转化率。结果表明：水分含量在0.04％-0.06％时初速度最大，而小于0.03％时转化率最大。
因此，反应时，在前两个小时水分控制在0.04％-0.06％，而两小时后控制在0.03％以下，这样可以在减少反应周期的情况下得到最大转化率
采用本发明的方法，以不饱和脂肪酸计，转化率为35％以上，反应时间可缩短为16小时以下。
由此可见，本发明的方法，能在较短的反应时间内获得高的转化率，为一种具有工业化实施前景的制备L-抗坏血酸不饱和脂肪酸酯的方法。
【附图说明】
图1为反应体系中水分含量对反应初速度和产率的影响。
图2为不同水分含量对产物合成的影响。
【具体实施方式】
实施例1
取50ml的具塞三角瓶，在瓶中称取大约0.3g的维生素C，称取0.6g亚油酸甲酯。加入10ml叔戊醇，加入分子筛1.0g。密封。将三角瓶放入高温摇床中预热30分钟(高温摇床温度50℃、200rps)，加入诺维信公司生产的牌号为Novozym 435固定化脂肪酶0.3g，整个体系水分含量控制在0.06％，反应2小时后，加入分子筛3g，整个体系水分含量控制在0.03％，反应10小时，反应完毕，柱层析分离，得到0.15g纯度92％的亚油酸Vc酯。
实施例2
取50ml的具塞三角瓶，在瓶中称取大约0.3g的维生素C，称取0.6g油酸。加入10ml乙腈，加入分子筛2g。密封。将三角瓶放入高温摇床中预热30分钟(高温摇床温度60℃、200rps)，加入诺维信公司生产的牌号为Novozym 435固定化脂肪酶0.3g，整个体系水分含量控制在0.05％，反应3小时后，加入分子筛1.5g，整个体系水分含量控制在0.02％，反应8小时，反应完毕，柱层析分离，得到0.12g纯度92％以上油酸Vc酯。
实施例3
取50ml的反应器，称取大约0.3g的维生素C，称取0.6gDHA(纯度85％以上)。加入15ml四氢呋喃，40℃、200转/分钟搅拌，30分钟，加入诺维信公司生产的牌号为Novozym 435固定化脂肪酶0.3g，利用减压蒸发干燥回流控制水分，体系的压力为真空度0.08～0.1Mpa，使体系水分含量控制在0.02％，反应16小时，反应完毕，柱层析分离，得到0.1g纯度92％以上DHAVc酯。