5位-巯基磺酸取代痂囊腔菌素衍生物及其制备方法与应用 【技术领域】
本发明涉及一种5位-巯基磺酸取代痂囊腔菌素衍生物及其制备方法与应用。
背景技术
光动力疗法已发展成为针对多种肿瘤和微血管类疾病的新型临床治疗方法，而光动力药物是当前限制光动力疗法广泛应用的瓶颈问题。微血管类疾病，包括鲜红斑痣、视网膜黄斑变性等，临床医学分类都属于常见病范畴，发病率均在3-5‰，前者90％以上发病于面部，给患者带来极大的精神痛苦(黄雪蕾等，光动力疗法治疗微静脉畸形的研究进展，口腔医学研究，2007，23，582)；后者被认为是老年人致盲的首要原因(马清敏等，年龄相关性黄斑变性的药物治疗进展，河北医科大学学报，2008，29，470)，目前光动力疗法是治疗这些微血管类疾病的临床首选疗法。
微血管类疾病的光动力药物需要静脉注射输入体内、并通过血液循环系统传输到病灶，因此，为保证药物在血液中安全传输、避免自聚集而栓赛毛细血管，药物必须具有亲水性；微血管类疾病的病灶靶体是血管内壁细胞，为了保证对靶体细胞的亲和性和生物光动力活性，药物必须同时具有亲脂性。因此设计具有“优化”脂水双亲性的光敏剂衍生物，在水溶性满足临床给药规范的前提下最大程度地保持亲脂特性，是实现光动力药物临床实用化的可行途径(刘昕，中国科学院化学研究所博士论文，2008，41)。
多年来，光动力疗法主要以抗肿瘤为目标，因此，光动力药物也主要以抗肿瘤功能为主要评价，例如：为了实体肿瘤的治疗效率，规定肿瘤的“光疗窗口”在600-900nm，此波长范围光的组织穿透深(3-10毫米)，利于实体肿瘤的疗效。然而，微血管类疾病的病灶深度小于1毫米，此时用穿透深度更深的长波长光反而有可能造成正常组织的伤害！因此，针对疾病特点研发个性化光动力药物是光动力医疗的新战略。目前，世界上唯一批准上市的用于视网膜黄斑变性的光动力药物苯卟啉衍生物单元酸(BPD-MA)，通用名维替泊芬(Verteporfin)，其最大光吸收波长为690nm，其主吸收光的组织有效穿透深度5毫米，目前市场价格为16000元人民币/10毫克，此外，卟啉类药物的一般特点是在体内代谢慢，且代谢产物原卟啉仍然有光敏活性，会使光敏副作用持续数天乃至数月。
痂囊腔菌素A(elsinochrome A，简称EA)和竹红菌素(包括甲素HA和乙素HB)同是苝醌类衍生物，EA仅是野生竹红菌中一种次要成分。最近，云南大学成功实现苝醌类光敏色素的人工生物合成(李聪等，苝醌化合物的生物合成方法，专利号ZL 200510010612.X)，其中EA是人工合成的主要成分，并可实现批量生产。EA单线态氧量子产率为0.98(Li，C.，etc，Photophysical and photosensitive propertiesof Elsinochrome A，Chin.Sci.Bull，2006，51，1050)，肿瘤细胞实验证明EA的光动力活性是竹红菌乙素的2～3倍(Liu，L.H.etc，Killing efect of elsinochrome A andhypocrellin B-mediated photodynamic therapy on ECV304Cells：a comparative study，Chin.J.Laser.Med.Surg，2006，15，93)。此外，痂囊腔菌素A可抑制格兰氏阳性菌的生长(Zhang，J.etc，Study on the Bacteriostasis Efect of Elsinochrome A in vitro，Lishizhen.Med.Mater.Medica.Res，2006，17，2414)。
痂囊腔菌素A(EA)的吸收光谱与竹红菌素相近，如图1所示，主吸收光(460nm)的组织有效穿透深度不足1毫米，恰好与微血管类疾病的病灶深度相符。微血管类疾病的靶体是病灶区的微血管内壁细胞，微血管疾病是异生微血管密集，血运丰富，静脉注射给药后药物会在病灶区富集；病灶区与血流接触，供氧丰富，对光动力疗法更敏感。因此，光动力疗法现已成为临床治疗此类微血管疾病的“最理想”的方法。
微血管类疾病的光动力药物需要通过血液循环系统输送到病灶区，而痂囊腔菌素是一类强亲脂性有机分子，水溶性极低(微克/毫升)，在血液中会自发聚集而造成毛细血管栓塞！痂囊腔菌素水溶性改造是解决药物实用化问题的有效手段。
痂囊腔菌素是竹红菌素属同系物，结构差别在于竹红菌素的七元环在痂囊腔菌素中为6元环，具有对称的化学结构。实验测得，痂囊腔菌素A的溶解度为1.4μg/mL，比竹红菌素(4.6μg/mL)更难溶于水；前期研究表明痂囊腔菌素A难于制备脂质体制剂，寻求化学修饰方法改善痂囊腔菌素的水溶性是实现药物实用化的可能途径。与竹红菌素相比，痂囊腔菌素的化学修饰工作非常少，目前报道的仅有室温合成溴代痂囊腔菌素A一种(Huang，S.，etc，The bromination of elsinochrome A andphotosensitivity of it s derivatives，J.Yunnan Univ，2003，25，352)。然而，溴代衍生物并不能有效改善痂囊腔菌素的亲水性，且溴可能引入毒性。竹红菌素的化学修饰大多采用热化学方法，反应体系最高温度可达140℃(Song，Y.Z.，ESR studies ofthe photodynamic properties of a long-wavelength and water-soluble hypocrellin Bderivative：photogeneration of semiquinone radical anion and activated oxygen，J.Photochem.Photobiol.A，1999，123，39)。本发明人前期实验发现，温度超过50℃时痂囊腔菌素大部分分解(薄层层析法和质谱检验)，当反应体系温度超过35℃时，痂囊腔菌素A就开始发生分解，产生小分子量的化合物(结果未发表)。
根据本发明人前期提出的“优化”或“定量”脂水兼溶性的概念(刘昕，中国科学院化学研究所博士论文，2008)，即水溶性满足临床光动力药物浓度的前提下最大程度保持亲脂性，以保证细胞摄取率和生物光动力效率！我们利用分子极性理论预测方法(Xie，J.，etc，Prediction on amphiphilicity of hypocrellin derivatives，Sci.China，2002，45，251)，设计、合成了3-巯基-1-磺酸取代的痂囊腔菌素A类衍生物。竹红菌素的七元环破坏了整个分子的对乘性质，因此，竹红菌素5，8位取代的衍生物是不同的化合物；痂囊腔菌素A分子存在C2操作对称性(如式III所示)，因此，5位或8位取代的痂囊腔菌素A衍生物是同一化合物，这为此类衍生物地合成提供了方便。
式III
【发明内容】
本发明的目的是提供一种5位-巯基磺酸取代痂囊腔菌素衍生物及其制备方法与应用。
本发明提供的5位-巯基磺酸取代痂囊腔菌素衍生物，其结构通式如式I所示：
式I
上述式I结构通式中，R为S(CH2)nSO3H，2≤n≤6，优选n为3。
本发明提供的制备5位-巯基磺酸取代痂囊腔菌素衍生物的方法，是在pH值为10-14及避光的条件下，将痂囊腔菌素、式II结构通式(HS(CH2)nSO3H)所示的巯基磺酸及溶剂混匀，反应完毕得到本发明提供的5位-巯基磺酸取代痂囊腔菌素衍生物。
痂囊腔菌素为痂囊腔菌素A(其结构式如式III所示)，巯基磺酸为2-巯基-乙磺酸、3-巯基-1-丙磺酸、4-巯基-1-丁磺酸、5-巯基-1-戊磺酸或6-巯基-1-己磺酸；巯基磺酸与痂囊腔菌素的摩尔比≥10∶1，优选10-20∶1。溶剂为组分A与组分B的混合液；其中，组分A为二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、吡啶、环己烷或二氧六环，组分B为三乙胺、氢氧化钠的水溶液或四甲基氢氧化氨的水溶液。
该反应中，反应体系的pH值为11-14。反应温度为≤35℃，优选15-35℃；反应时间为≥2小时，优选2-10小时。在反应完毕后，可对该反应体系作如下分离纯化：加入反应体系50倍(体积比)的水，加入酸使将磺酸阴离子衍生物变成磺酸衍生物。反复用二氯甲烷萃取，提取有机相；减压蒸馏法或旋转蒸发除去有机溶剂；固体剩余物用甲醇溶解，以二氯甲烷∶甲醇(体积比＝5∶1)或乙酸乙酯∶甲醇(体积比＝3∶1)为展开液，以硅胶为填料柱层析或薄层层析分离、纯化，得到5位-巯基磺酸取代的痂囊腔菌素衍生物。
上述制备方法中，痂囊腔菌素A与巯基化合物的反应机制为巯基负离子进攻痂囊腔菌素A的5位，属Michael型亲核加成反应。碱性溶剂(pH值≥10)使3-巯基-1-丙磺酸形成巯基负离子，使Michael反应得以进行。痂囊腔菌素A与3-巯基-1-丙磺酸的摩尔比大于等于10∶1反应开始发生，至20∶1时产率最大；温度小于等于35℃是防止痂囊腔菌素A产生热分解；反应时间至4小时衍生物产率最大；避光是为了防止痂囊腔菌素A产生自敏光氧化。利用衍生物在脂相中分布大的特点，反复萃取，使衍生物全部进入有机相后再分离纯化。
本发明以实现痂囊腔菌素临床实用型静脉注射针剂为目标，提供了一种5位-巯基磺酸取代的痂囊腔菌素A衍生物及在室温以下化学合成该衍生物的方法及其应用。该衍生物在缓冲溶液或生理盐水中溶解度达5.1mg/mL，满足静脉注射给药和血液中安全传输的要求；在此前提下保持了衍生物的优势亲脂性(脂水分配系数约为7)。生物实验证明该衍生物对人肺癌细胞(A549)的杀伤率相当于母体痂囊腔菌素的60％；鉴于痂囊腔菌素超高的光动力活性，该衍生物的光动力活性足以满足临床要求。结论：该衍生物无须进一步制剂、可直接用于静脉注射的临床光动力药物。
【附图说明】
图1为EA和SEA的吸收光谱。
图2为通过ESR检测的SEA产生的半醌阴离子。
图3为通过ESR检测的SEA产生的单重态氧(1O2)信号。
图4为通过ESR检测的SEA产生的超氧负离子自由基(O2·-)信号。
图5为通过ESR检测的SEA产生的羟基自由基(·OH)信号。
图6为通过9，10-DPA漂白法检测的用470-900nm光激发的SEA与EA的单重态氧量子产率。
图7为三种光敏剂对A549细胞的杀伤率。
【具体实施方式】
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1、制备5位-巯基磺酸取代痂囊腔菌素衍生物
痂囊腔菌素A(EA)50毫克(0.92×10-4摩尔)，250毫克的3-巯基-1-丙磺酸钠(1.6×10-3摩尔)和50毫升体积比为1∶1的二甲基亚砜与三乙胺，pH＝11，放入100毫升三颈圆底烧瓶中，常温电磁搅拌4小时。水洗后反复用二氯甲烷萃取，加入盐酸使衍生物从水相进入有机相。减压蒸去有机溶剂，剩余物用适量甲醇溶解，用硅胶板薄层层析分离，展开液为二氯甲烷∶甲醇，体积比＝5∶1。收集Rf值0.52处的棕红色产物组分，进一步用此法层析纯化，得到5位-3-巯基-1-丙磺酸取代的痂囊腔菌素A衍生物，产率40％。
利用光谱、核磁、质谱等方法对该化合物进行成分、结构分析，结果如下：
紫外光谱λmax：482nm，580nm；
红外光谱vmax：1610cm-1，1710cm-1，2936cm-1，3406cm-1；
核磁共振
δ(1H)：6.91(s)，5.19(d)，4.19(s)，3.67(s)，2.14(s)，1.17(s)ppm；
质谱分析(ESI)：697(M-1)-。
实施例2、制备5位-巯基磺酸取代痂囊腔菌素衍生物
痂囊腔菌素A(EA)50毫克(0.92×10-4摩尔)，500毫克的3-巯基-1-丙磺酸钠(3.2×10-3摩尔)和60毫升体积比为2∶1的N，N-二甲基甲酰胺与为25％的四甲基氢氧化氨水溶液，pH＝14，放入100毫升三颈圆底烧瓶中，常温电磁搅拌8小时。水洗后反复用二氯甲烷萃取，加入盐酸使衍生物从水相进入有机相。减压蒸去有机溶剂，剩余物用适量甲醇溶解，用硅胶板薄层层析分离，展开液为二氯甲烷∶甲醇，体积比＝5∶1。收集Rf值0.52处的棕红色产物组分，进一步用此法层析纯化，得到5位-3-巯基-1-丙磺酸取代的痂囊腔菌素A衍生物，产率28％。
利用光谱、核磁、质谱等方法对该化合物进行成分、结构分析，结果如下：
紫外光谱λmax：482nm，580nm；
红外光谱vmax：1610cm-1，1710cm-1，2936cm-1，3406cm-1；
核磁共振
δ(1H)：6.91(s)，5.19(d)，4.19(s)，3.67(s)，2.14(s)，1.17(s)ppm；
质谱分析(ESI)：697(M-1)-。
实施例3、制备5位-巯基磺酸取代痂囊腔菌素衍生物
痂囊腔菌素A(EA)50毫克(0.92×10-4摩尔)，250毫克的3-巯基-1-丙磺酸钠(1.6×10-3摩尔)和30毫升调节pH值为10的N，N-二甲基甲酰胺与氢氧化钠水溶液，(N，N-二甲基甲酰胺与氢氧化钠的体积比为1∶1，8％的氢氧化钠水溶液)，放入100毫升三颈圆底烧瓶中，常温电磁搅拌10小时。水洗后反复用二氯甲烷萃取，加入醋酸使衍生物从水相进入有机相。减压蒸去有机溶剂，剩余物用适量甲醇溶解，用硅胶板薄层层析分离，展开液为二氯甲烷∶甲醇，体积比＝5∶1。收集Rf值0.52处的棕红色产物组分，进一步用此法层析纯化，得到5位-3-巯基-1-丙磺酸取代的痂囊腔菌素A衍生物，产率23％。
利用光谱、核磁、质谱等方法对该化合物进行成分、结构分析，结果如下：
紫外光谱λmax：482nm，580nm；
红外光谱vmax：1610cm-1，1710cm-1，2936cm-1，3406cm-1；
核磁共振
δ(1H)：6.91(s)，5.19(d)，4.19(s)，3.67(s)，2.14(s)，1.17(s)ppm；
质谱分析(ESI)：697(M-1)-。
实施例4、制备5位-巯基磺酸取代痂囊腔菌素衍生物
痂囊腔菌素A(EA)100毫克(1.84×10-4摩尔)，500毫克的3-巯基-1-丙磺酸钠(3.2×10-3摩尔)和60毫升体积比为1∶1的二甲基亚砜与氢氧化钠水溶液(2M)，pH＝14，放入100毫升三颈圆底烧瓶中，常温电磁搅拌4小时。水洗后反复用氯仿萃取，加入醋酸使衍生物从水相进入有机相。减压蒸去有机溶剂，剩余物用适量甲醇溶解，用硅胶柱分离，洗脱液为乙酸乙酯∶甲醇，体积比＝5∶1。收集棕红色产物组分，进一步用硅胶板薄层层析纯化，展开液为二氯甲烷∶甲醇＝5∶1，得到5位-3-巯基-1-丙磺酸取代的痂囊腔菌素A衍生物，产率17％。
利用光谱、核磁、质谱等方法对该化合物进行成分、结构分析，结果如下：
紫外光谱λmax：482nm，580nm；
红外光谱vmax：1610cm-1，1710cm-1，2936cm-1，3406cm-1；
核磁共振
δ(1H)：6.91(s)，5.19(d)，4.19(s)，3.67(s)，2.14(s)，1.17(s)ppm；
质谱分析(ESI)：697(M-1)-。
实施例5、制备5位-巯基磺酸取代痂囊腔菌素衍生物
痂囊腔菌素A(EA)100毫克(1.84×10-4摩尔)，1.45克的3-巯基-1-丙磺酸钠(9.28×10-3摩尔)和60毫升体积比为1∶1的二甲基亚砜与25％四甲基氢氧化氨水溶液，pH＝14，放入100毫升三颈圆底烧瓶中，常温电磁搅拌7小时。用水洗后反复用氯仿萃取，加入盐酸使衍生物从水相进入有机相。减压蒸去有机溶剂，剩余物用甲醇溶解后用硅胶板薄层层析分离，展开液为乙酸乙酯∶甲醇，体积比＝3∶1。收集Rf值0.3处的棕红色产物组分，进一步用此法层析纯化，得到5位-3-巯基-1-丙磺酸取代的痂囊腔菌素A衍生物，产率21％。
利用光谱、核磁、质谱等方法对该化合物进行成分、结构分析，结果如下：
紫外光谱λmax：482nm，580nm；
红外光谱vmax：1610cm-1，1710cm-1，2936cm-1，3406cm-1；
核磁共振
δ(1H)：6.91(s)，5.19(d)，4.19(s)，3.67(s)，2.14(s)，1.17(s)ppm；
质谱分析(ESI)：697(M-1)-。
实施例6、制备5位-巯基磺酸取代痂囊腔菌素衍生物
痂囊腔菌素A(EA)50毫克(0.92×10-4摩尔)，500毫克的3-巯基-1-丙磺酸钠(3.2×10-3摩尔)和30毫升体积比为1∶1的吡啶与25％的四甲基氢氧化氨水溶液放入50毫升三颈圆底烧瓶中，加热100℃，机械搅拌8小时。水洗后反复用氯仿萃取，加入醋酸使衍生物从水相进入有机相。减压蒸去有机溶剂，剩余物用适量甲醇溶解，用硅胶柱分离，洗脱液为乙酸乙酯∶甲醇，体积比＝5∶1。收集棕红色产物组分，进一步用硅胶板薄层层析纯化，展开液为二氯甲烷∶甲醇＝5∶1，得到5位-3-巯基-1-丙磺酸取代的痂囊腔菌素A衍生物，产率15％。
利用光谱、核磁、质谱等方法对该化合物进行成分、结构分析，结果如下：
紫外光谱λmax：482nm，580nm；
红外光谱vmax：1610cm-1，1710cm-1，2936cm-1，3406cm-1；
核磁共振
δ(1H)：6.91(s)，5.19(d)，4.19(s)，3.67(s)，2.14(s)，1.17(s)ppm；
质谱分析(ESI)：697(M-1)-。
实施例7、5位-巯基磺酸取代痂囊腔菌素衍生物的脂水双亲性实验
脂水分配比实验在正辛醇和缓冲液(PBS)体系中进行：将2mg光敏剂加入到2毫升正辛醇中，然后加入2毫升PBS(pH＝7.4)。将混合溶液置于超声波中振荡20分钟，然后在每分钟4000转的速度下离心10分钟，使两相分离。测量两相中光敏剂的吸收光谱。
根据Lambert-beer定律光敏剂的脂水分配比(PC)如下计算：PC＝εPBSAOCT/εOCTAPBS，
其中，εPBS和εOCT为光敏剂在PBS和正辛醇中的摩尔消光系数；APBS和AOCT为光敏剂在PBS和正辛醇中的最大吸收值。
按照上述方法对5位-3-巯基-1-丙磺酸取代的痂囊腔菌素A衍生物在正辛醇和磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)中脂水分配系数和在PBS(pH＝7.4)中最大溶解度进行测定，其结果均列于表1中。
表15位-3-巯基-1-丙磺酸取代的痂囊腔菌素A衍生物脂水双亲性评价表
其中，SEA为本发明提供的5位-3-巯基-1-丙磺酸取代的痂囊腔菌素A衍生物；EA为母体痂囊腔菌素A，HB为竹红菌乙素。从表1可知，SEA溶解度达到5mg/mL，满足临床药物浓度要求；其脂水分配比接近7，保持了优势的脂相分布。细胞摄取率和光敏化活性是光敏剂的生物光动力活性的两个必要条件，而优势的脂相分布表征光敏剂的亲脂性特征，是细胞摄取的先决条件。
实施例8、5位-3-巯基-1-丙磺酸取代痂囊腔菌素A衍生物的光敏化活性实验
光照氩气饱和的1mM 5位-3-巯基-1-丙磺酸取代痂囊腔菌素A的DMSO溶液可以产生一个EPR信号(g＝2.0051)(如图2)，信号与HB产生的半醌阴离子自由基信号相似，此信号归属为5位-3-巯基-1-丙磺酸取代痂囊腔菌素A的半醌阴离子自由基信号；TEMP自旋捕获单重态氧定量形成TEMPO，后者可由EPR检测。光照充氧的1mM 5位-3-巯基-1-丙磺酸取代痂囊腔菌素A和50mM TEMP的DMSO溶液，可以观察到一个等强度的三重峰EPR信号(如图3)，其g因子和裂分常数(g＝2.0056，αN＝16.3G)；超氧阴离子自由基被DMPO捕获后由EPR检测，如图4所示，光照充氧的5位-3-巯基-1-丙磺酸取代痂囊腔菌素A与50mM DMPO的DMSO溶液，产生自由基信号的参数为g＝2.0056，αN＝13.0G，αβH＝10.3G and αγH＝1.5G，这些参数与DMPO-O2·-加合物相同；光照充氧的1mM 5位-3-巯基-1-丙磺酸取代痂囊腔菌素A和50mM DMPO的PBS(pH＝7.4)溶液时，可以观察到DMPO-·OH加合物的信号(αN＝αγH＝14.9G，峰强比为1∶2∶2∶1)如图5所示；样品的单重态氧量子产率用DPA漂白方法测定(如图6)，光源是450W中压钠灯，用滤光片截去小于470nm的光。各化合物在470-800nm光密度值的积分面积被调整到一致。
本发明合成的5位-3-巯基-1-丙磺酸取代痂囊腔菌素A衍生物可以光敏化产生半醌阴离子，1O2，O2·-和·OH自由基，如图2-图6所示。可知，本发明提供的5位-3-巯基-1-丙磺酸取代痂囊腔菌素A衍生物可有效产生半醌阴离子(如图2所示)、单重态氧(1O2)(如图3所示)、超氧负离子自由基(O2·-)(如图4所示)、羟基自由基(·OH)(如图5所示)，单重态氧量子产率为0.53(衍生物与母体在470-800nm光吸收量调至相等条件下激发，如图6所示)。
实施例9、5位-3-巯基-1-丙磺酸取代痂囊腔菌素A衍生物的生物光动力活性实验
5位-3-巯基-1-丙磺酸取代痂囊腔菌素A衍生物光动力活性以细胞实验结果表征：体外培养的人肺癌细胞(A549)，按5.0×104个/ml的细胞密度接种于96孔细胞培养板，孵育24小时后，加入光敏剂，继续孵育肺癌细胞4小时后，采用波长为532nm激光照射，能量密度为20J/cm2(功率密度为20mw/cm2)，照射时间为1000秒，其后采用四唑盐比色试验(MTT法)，测定各孔的光密度值，计算细胞杀伤率。所有测试均在超净工作台内无菌且避光的条件下完成。其中，各个光敏剂取相同浓度点(0.18μM，在pH值为7.4的PBS溶液中)测量，利用以下公式求其细胞杀伤率：
细胞杀伤率(％)＝1-细胞存活率
所得杀伤率结果均列于表2中。
表25位-3-巯基-1-丙磺酸取代的痂囊腔菌素A衍生物对细胞的杀伤率
细胞实验表明，5位-3-巯基-1-丙磺酸取代的痂囊腔菌素A(SEA)的细胞杀伤率是母体痂囊腔菌素A(EA)的60％和竹红菌乙素(HB)的70％，如图7所示。由于痂囊腔菌素A和竹红菌素光动力活性高的特点，该衍生物保持了母体的大部分光动力活性，足以成为一种高活性的临床光动力药物，且由于水溶性满足临床用药浓度，无须制剂，可以方便地配制静脉注射药物。