铝佐剂干粉疫苗及其制备方法.pdf

本发明公开了铝佐剂干粉疫苗及其制备方法。该铝佐剂干粉疫苗含有保护性抗原和铝佐剂，为干粉。所述铝佐剂疫苗含有赋形剂。所述赋形剂为甘露醇、乳糖、白蛋白或海藻酸钠。所述保护性抗原为F1荚膜抗原、V抗原、rV10抗原、rV270抗原、YscF抗原和YopD抗原。所述保护性抗原、所述铝佐剂和所述赋形剂的质量比为(5-12)∶(34.4-68.8)∶(500-3000)。本发明还公开了制备所述铝佐剂疫苗的方法，是将保护性抗原吸附到铝佐剂中，然后加入赋形剂，干燥获得所述铝佐剂疫苗。

1、  一种铝佐剂疫苗，含有保护性抗原、铝佐剂和赋形剂；所述铝佐剂疫苗为干粉。

2、  根据权利要求1所述的铝佐剂疫苗，其特征在于：所述铝佐剂疫苗由保护性抗原、铝佐剂和赋形剂组成。

3、  根据权利要求1或2所述的铝佐剂疫苗，其特征在于：所述赋形剂为甘露醇、乳糖、白蛋白和海藻酸钠中的任一种或任几种。

4、  根据权利要求3所述的铝佐剂疫苗，其特征在于：所述赋形剂为甘露醇、乳糖、白蛋白或海藻酸钠。

5、  根据权利要求1至4中任一所述的铝佐剂疫苗，其特征在于：所述保护性抗原为对鼠疫具有免疫保护作用的抗原，选自如下至少一种：F1荚膜抗原、V抗原、rV10抗原、rV270抗原、YscF抗原和YopD抗原。

6、  根据权利要求5所述的铝佐剂疫苗，其特征在于：所述保护性抗原为对鼠疫具有免疫保护作用的抗原：F1荚膜抗原、V抗原、rV10抗原、rV270抗原、YscF抗原或YopD抗原。

7、  根据权利要求6所述的铝佐剂疫苗，其特征在于：所述保护性抗原、所述铝佐剂和所述赋形剂的质量比为(5-12)：(34.4-68.8)：(500-3000)。

8、  制备权利要求1至7中任一所述铝佐剂疫苗的方法，是将保护性抗原吸附到铝佐剂中，然后加入赋形剂，干燥获得所述铝佐剂疫苗。

9、  根据权利要求8所述铝佐剂疫苗的方法，其特征在于：所述保护性抗原、所述铝佐剂和所述赋形剂的质量比为(5-12)：(34.4-68.8)：(500-3000)。

10、  根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述干燥为2-8℃真空干燥12-48小时。

铝佐剂干粉疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种铝佐剂干粉疫苗及其制备方法。
背景技术
鼠疫是由鼠疫耶尔森氏菌引起的烈性传染病。近年来，世界鼠疫疫情呈上升趋势，2000年世界卫生组织将鼠疫列为重新抬头的传染病。另外，鼠疫耶尔森氏菌又是一种标准的生物战剂和生物恐怖剂，美国已将鼠疫耶尔森氏菌列为恐怖分子最有可能使用的6个生物剂之一。
鼠疫灭活疫苗仅对腺鼠疫有一定的保护作用，但保护时间短，因此这类疫苗不适合于大规模的预防接种。美军曾在越战中使用的USP灭活疫苗已于1999年停止生产。EV76疫苗株是最好的减毒活疫苗，能提供早期的保护作用，但减毒活疫苗副作用严重(Russell P，Eley SM，Hibbs SE，Manchee RJ，Stagg AJ，Titball RW：A comparisonof Plague vaccine，USP and EV76 vaccine induced protection against Yersiniapestis in a murine model.Vaccine 1995，13(16)：1551-1556.)。亚单位疫苗能够克服传统疫苗的许多缺陷，不含有感染性组分，无致病性，而且对腺鼠疫和肺鼠疫均具有一定的免疫保护作用。因此，目前鼠疫疫苗的研究多集中在亚单位疫苗。鼠疫耶尔森氏菌的主要保护性抗原是F1(荚膜抗原)(Andrews GP，Heath DG，Anderson GW，Jr.，Welkos SL，Friedlander AM：Fraction 1 capsular antigen(F1)purificationfrom Yersinia pestis CO92 and from an Escherichia coli recombinant strain andefficacy against lethal plague challenge.Infect Immun 1996，64(6)：2180-2187.)和LcrV(V-抗原)(Anderson GW，Jr.，Leary SE，WilliamsonED，Titball RW，Welkos SL，Worsham PL，Friedlander AM：Recombinant V antigenprotects mice against pneumonic and bubonic plague caused byF1-capsule-positive and-negative strains of Yersinia pestis.Infect Immun1996，64(11)：4580-4585.)。F1抗原由鼠疫耶尔森氏菌pMT1质粒上的F1操纵子编码，以多聚体的形式在细胞表面形成荚膜，F1抗体通过阻断F1蛋白的抗吞噬作用从而具有免疫保护作用(Du Y，Rosqvist R，Forsberg A：Role of fraction 1 antigenof Yersinia pestis in inhibition of phagocytosis.Infect Immun 2002，70(3)：1453-1460.)。V抗原是一种多功能蛋白，与鼠疫耶尔森氏菌的抗吞噬能力有关，具有免疫保护和免疫抑制作用(Pettersson J，Holmstrom A，Hill J，Leary S，Frithz-Lindsten E，von Euler-Matell A，Carlsson E，Titball R，Forsberg A，Wolf-Watz H：The V-antigen of Yersinia is surface exposed before target cellcontact and involved in virulence protein translocation.Mol Microbiol 1999，32(5)：961-976.)。最近在V抗原的研究中发现了产生免疫抑制作用的区段，去除产生免疫抑制作用后的部分V抗原(rV10)可有效地降低V抗原的免疫抑制作用而同时保留其免疫保护作用(Overheim KA，Depaolo RW，Debord KL，Morrin EM，AndersonDM，Green NM.LcrV plague vaccine with altered immunomodulatory properties.Infect Immun 2005；73(8)：5152-9)。为了研制鼠疫亚单位疫苗，依据已知的V抗原基因核苷酸序列，避开产生免疫抑制作用的区段(271-300氨基酸)，制备了含1-270氨基酸的部分V抗原(rV270)(王棠，祁芝珍，吴本传等.鼠疫耶尔森氏菌rV270抗原的克隆、表达及其免疫保护作用评价.生物技术通讯2008；19(5)：663-66)。虽然亚单位疫苗对腺鼠疫和肺鼠疫均有效并且副作用小，但是亚单位疫苗需要用免疫佐剂或投递系统加强免疫。目前，铝佐剂仍然是可用于人的唯一佐剂(Rinella JV，Workman RF，Hermodson MA，White JL and Hem SL：Elutability of Proteins fromAluminum-Containing Vaccine Adjuvants by Treatment with Surfactants.JColloid Interface Sci 1998，197：48-56.)。然而，铝佐剂疫苗通常是胶体状态，不能冻存(Maa YF，Zhao L，Payne LG and Chen D.Stabilization of alum-adjuvantedvaccine dry powder formulations：mechanism and application.J Pharm Sci2003；92：319-32)，通常保存于2-8℃。
发明内容
本发明的目的是提供一种铝佐剂干粉疫苗及其制备方法。
本发明所提供的铝佐剂疫苗，含有保护性抗原和铝佐剂，所述铝佐剂疫苗为干粉。
其中，所述铝佐剂疫苗含有赋形剂。所述赋形剂可为甘露醇、乳糖、白蛋白和海藻酸钠中的任一种或任几种。当然，所述赋形剂也可仅为甘露醇、乳糖、白蛋白或海藻酸钠。
所述保护性抗原可根据目的不同选择不同的保护性抗原，如对鼠疫具有免疫保护作用的抗原蛋白F1荚膜抗原、V抗原、rV10抗原、rV270抗原、YscF抗原或YopD抗原等，铝佐剂鼠疫疫苗中的保护抗原可选自如下至少一种：F1荚膜抗原、V抗原、rV10抗原、rV270抗原、YscF抗原或YopD抗原。所述保护性抗原、所述铝佐剂和所述赋形剂的质量比为(5-12)：(34.4-68.8)：(500-3000)。
所述铝佐剂干粉疫苗可经肌注、皮下、滴鼻等途径进行免疫，免疫剂量一般为5-40μg，免疫方式及免疫剂量可根据实际情况进行调整。
本发明的另一个目的是提供一种制备所述铝佐剂疫苗的方法。
本发明所提供的制备所述铝佐剂疫苗的方法，是将保护性抗原吸附到铝佐剂中，然后加入赋形剂，干燥获得所述铝佐剂疫苗。
其中，所述干燥为2-8℃真空干燥12-48小时。
本发明的铝佐剂干粉疫苗是将具有免疫原性的抗原蛋白吸附到铝佐剂中，然后加入赋形剂，真空干燥制备干粉疫苗。本发明采用先将抗原蛋白吸附到铝佐剂中，然后加赋形剂真空干燥制备干粉疫苗的方法，不仅简便，而且该制剂具有较高的稳定性，可在室温保存；此外，制备工艺简单，便于大规模生产。以铝佐剂鼠疫疫苗为例，动物实验的结果表明，本发明的铝佐剂干粉鼠疫疫苗对鼠疫具有较高的免疫保护作用，该疫苗可经肌注、皮下、滴鼻等途径免疫，对鼠疫具有较好的免疫保护作用，可作为一种鼠疫亚单位疫苗的新剂型用于鼠疫的防护。基于上述特点，本发明提供了一种干粉铝佐剂疫苗的新剂型，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为F1-抗原蛋白铝佐剂干粉疫苗抗体滴度。
图2为rV270-抗原蛋白的铝佐剂干粉疫苗抗体滴度。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、F1-抗原蛋白的铝佐剂干粉疫苗制备及其免疫保护作用评价
一.F1抗原铝佐剂干粉疫苗的制备
(Tang Wang，Zhizhen Qi，Benchuan Wu，Ziwen Zhu，Yonghai Yang，BaizhongGui，Ruixia Dai，Qingwen Zhang，Yefeng Qiu，Zuyun Wang，Hu Wang，ZhaobiaoGuo，Xiaoyi Wang，Ruifu Yang.Protein Expression and Purification 2008；61：7-12)。
1.F1抗原的制备
将鼠疫菌EV76疫苗株(兰州生物制品研究所)接种到5mL脑心浸液培养基中(培养基中加0.2％木糖)，37℃培养24h，然后取300μl菌液，接种到2L脑心浸液培养基中(培养基中加0.2％木糖)，加50-60g高压灭菌的玻璃珠(直径0.2-0.5mm)，37℃培养72h。离心培养物(4000rpm，30min)，收集上清，弃掉沉淀。上清用40％(质量百分含量)饱和硫酸铵沉淀，然后置4℃冰箱中盐析12h，离心(8000rpm，30min)，弃掉上清。将沉淀重新溶于200ml0.01M PBS缓冲液(pH7.2)中，25％(质量百分含量)饱和硫酸铵沉淀，4℃盐析12h，离心(8000rpm，30min)弃掉沉淀，上清用5％饱和硫酸铵(质量百分含量)沉淀，离心(8000rpm，30min)弃掉上清，将沉淀重新溶于10-20ml的0.01M的PBS缓冲液(pH7.2)中，用0.01M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)平衡Sephacryl S-200HR凝胶柱，然后用0.01M PBS(pH8.0)缓冲液洗柱，收集蛋白溶液。将蛋白溶液置于透析袋中，于2000ml PBS透析液(0.01M)中透析12h得F1-抗原蛋白溶液。
2.F1-抗原蛋白铝佐剂干粉疫苗的制备
将上述F1抗原蛋白用PBS稀释到0.5mg/ml，与25％(体积百分含量)的铝佐剂按体积比为1：1混合，4℃振荡吸附12h，然后向此混合液中加入50mg/ml甘露醇，待甘露醇全部溶解后，4℃真空干燥12h，获得F1-抗原蛋白铝佐剂干粉疫苗A，F1-抗原蛋白铝佐剂干粉疫苗A中F1-抗原蛋白、铝佐剂和甘露醇的质量比为5：34.4：500。
将上述提取的天然F1抗原蛋白用PBS稀释到1.2mg/ml，与50％(体积百分含量)的铝佐剂按体积比为1：1混合，4℃振荡吸附24h，然后向此混合液中加入300mg/ml乳糖，待乳糖全部溶解后，4℃真空干燥48h，F1-抗原蛋白铝佐剂干粉疫苗B，F1-抗原蛋白铝佐剂干粉疫苗B中F1-抗原蛋白、铝佐剂和乳糖的质量比为12：68.8：3000。
3.F1-抗原蛋白铝佐剂液体疫苗的制备
用PBS将F1抗原蛋白稀释至0.4mg/ml，与50％(体积)铝佐剂按体积比为1：1混合，4℃振荡吸附12h，F1-抗原蛋白铝佐剂液体疫苗。
二.动物免疫
40只6-8周雌性BALB/c小鼠随机分为4组，包括2个实验组和2个对照组，每组10只小鼠。免疫动物前向F1-抗原蛋白铝佐剂干粉疫苗A和F1-抗原蛋白铝佐剂干粉疫苗B中分别加入等体积的无菌蒸馏水溶解干粉疫苗.
实验组1：小鼠每只后腿肌肉免疫100μl F1-抗原蛋白铝佐剂干粉疫苗A(含20μgF1抗原蛋白)；
实验组2：小鼠每只后腿肌肉免疫100μl F1-抗原蛋白铝佐剂干粉疫苗B(含20μgF1抗原蛋白)；
对照组1：小鼠每只后腿肌肉免疫100μlF1-抗原蛋白铝佐剂液体疫苗A(含20μg的F1抗原蛋白)；
对照2：小鼠每只后腿肌肉免疫100μl等量的25％(体积百分含量)铝佐剂。
三.抗体滴度测定
1.血清抗体滴度测定
初次免疫后，4组动物分别于第8周尾静脉采血，用ELISA法(所用的ELISA法为常规方法，具体步骤可参见：《Short Protocols in Molecular Biology》(FrederickM.Ausubel et al.，3^rdedition，John Wiley & Sons，Inc.，1995)。)测定抗体滴度。其主要过程为：包被F1抗原，每孔50ng(100μl)，置4℃过夜(10-12小时)。然后用0.1％(质量百分含量)干酪素溶液封闭(200μl/孔)，置37℃孵箱2小时。以对照组2小鼠血清作阴性对照，分别加系列稀释(10倍数稀释)的实验组和对照组1的小鼠血清(100μl/孔)，置37℃孵箱内湿盒中30分钟。取出用洗液(吐温-20溶于0.01MPBS中组成洗液，吐温-20含量为0.05ml/100ml)洗5遍后加入对应的二抗(辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG)，37℃置湿盒中20分钟。加显色液(TMB溶液、底物溶液和30％过氧化氢按体积比100：900：1组成；TMB溶液：1mg TMB溶于1ml DMSO；底物溶液：1.02g柠檬酸和3.68g NaHPO₄·12H₂O混合溶于100ml水中)(50μl/孔)，置湿盒中37℃放10分钟，取出直接加入终止液(2M硫酸)(50μl/孔)，用光电比色测定抗体效价。
血清抗体滴度测定结果如图1所示，实验组1、2和对照1均产生较高的F1抗体滴度，统计分析结果表明抗体滴度在2组之间无显著差异，而对照组2不产生针对F1抗原的抗体，表明本发明的干粉末铝佐剂疫苗具有与常规的液体铝佐剂疫苗相似的作用，可作为一种鼠疫亚单位疫苗的新剂型。
2.免疫保护测定
初次免疫后第8周，用3×10³倍LD50(3×10³×3.3个)鼠疫菌201株(青海省地方病预防控制所)对所有免疫组小鼠进行皮下攻毒，然后观察14天。
观察结果如表1所示，实验组小鼠和对照组1小鼠全部存活，而且健康状况良好，而对照组2的小鼠全部死亡，表明本发明的铝佐剂干粉疫苗具有良好的免疫保护作用，与常规的铝佐剂液体疫苗的免疫保护效果相当。
表1.免疫保护效果

实施例2.rV270-抗原蛋白的铝佐剂干粉疫苗制备及其免疫保护作用评价
一.rV270抗原干粉铝佐剂疫苗的制备
(王棠，祁芝珍，吴本传，朱紫雯，杨永海，催百忠，戴瑞霞，张青雯，邱业峰，王祖郧，王虎，郭兆彪，杨瑞馥，王效义.鼠疫耶尔森氏菌rV270抗原的克隆、表达及其免疫保护作用评价.生物技术通讯2008；19(5)：663-666)
1.rV270抗原的制备
依据鼠疫菌LcrV基因的核苷酸序列，设计合成带有凝血酶酶切位点的一对寡核苷酸引物，用于扩增LcrV基因全长序列的第1-270位氨基酸(简称rV270抗原)。
上游引物为：GGAATTCCATATGATTAGAGCCTACGAAC(划线部分为NdeI酶切位点)；
下游引物为：CCCAAGCTTAGAACCGCGTGGCACCAGGGCAAAGTGAGATAATTC(划线部分为HindIII酶切位点)。
以鼠疫菌EV76株(兰州生物制品研究所)DNA为模板，用上述引物扩增rV270基因。扩增产物用DNA纯化回收试剂盒纯化PCR产物。用NdeI和HindIII进行双酶切纯化后的PCR产物与同样双酶切的pET24a载体连接，于4℃连接过夜，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂于含卡那霉素的LB培养基平板上，37℃培养过夜。随机挑取单菌落，接种于5ml含卡那霉素LB液体培养基中，37℃培养过夜，取5μl菌液，置沸水中煮沸5min，用上清作模板进行PCR扩增筛选出正确的阳性克隆，送交奥科生物制品有限公司测序，测序结果用DNAStar软件进行分析。
将鉴定正确的阳性克隆接种于含卡那霉素的LB培养基中，37℃培养至OD600为0.6～0.8时，加入终浓度为1mmoL/mL的IPTG溶液诱导培养4h，离心收集菌体，经超声波破碎后离心收集上清，用0.05M Tris-HCl缓冲液稀释至200mL，加入0.5M NaCl，调节PH值至7.2，过Co²⁺亲和层析柱(Novagen公司，71659)(用0.05M Tris-HCl缓冲液平衡)。先用200mL wash buffer(50Mm磷酸二氢钠，500mM氯化钠，20mMimidizole)洗柱，再用含0.5M NaCl的0.01M PBS缓冲液洗柱。用0.01M PBS溶解凝血酶，上样充分与柱中的蛋白结合，4℃反应24h，然后用含0.3M NaCl的0.05M PBS缓冲液洗脱，收集出现目的吸收峰的流出液。收集的蛋白样品过经0.01M PBS(PH值7.2)平衡后的Sephacryl S-200HR丙烯葡聚糖凝胶柱，继续用0.01M PBS(PH值7.2)洗脱柱子，待检测到rV270蛋白紫外吸收峰时收集蛋白溶液。用0.01M PBS(PH值7.2)将蛋白溶液透析12h得rV270-抗原蛋白溶液。
2.rV270-抗原蛋白铝佐剂干粉疫苗的制备
将上述表达的rV270抗原蛋白用PBS稀释到0.5mg/ml，与25％(体积百分含量)的铝佐剂按体积比为1：1混合，4℃振荡吸附12h，然后向此混合液中加入50mg/ml白蛋白，待白蛋白全部溶解后，4℃真空干燥12h，获得rV270-抗原蛋白铝佐剂干粉疫苗A，rV270-抗原蛋白铝佐剂干粉疫苗A中rV270抗原蛋白、铝佐剂和白蛋白的质量比为5：34.4：500。
将上述表达的rV270抗原蛋白用PBS稀释到1.2mg/ml，与50％(体积百分含量)的铝佐剂按体积比为1：1混合，4℃振荡吸附24h，然后向此混合液中加入300mg/ml海藻酸钠，待海藻酸钠全部溶解后，4℃真空干燥48h，获得rV270-抗原蛋白铝佐剂干粉疫苗B，rV270-抗原蛋白铝佐剂干粉疫苗B中rV270抗原蛋白、铝佐剂和海藻酸钠的质量比为12：68.8：3000。
3、rV270-抗原蛋白铝佐剂液体疫苗的制备
用PBS将rV270抗原蛋白稀释至0.4mg/ml，与50％(体积)铝佐剂按体积比为1：1混合，4℃振荡吸附12h，获得rV270-抗原蛋白铝佐剂液体疫苗。
二.动物免疫
40只6-8周雌性BALB/c小鼠随机分为4组，包括2个实验组和2个对照组，每组10只小鼠。免疫动物前向rV270-抗原蛋白铝佐剂干粉疫苗A和rV270-抗原蛋白铝佐剂干粉疫苗B中加入等体积的无菌蒸馏水。
实验组1：小鼠每只后腿肌肉免疫100μl rV270-抗原蛋白铝佐剂干粉疫苗A(含20μgrV270-抗原蛋白)；
实验组2：小鼠每只后腿肌肉免疫100μl rV270-抗原蛋白铝佐剂干粉疫苗B(含20μgrV270-抗原蛋白)；
对照组1：小鼠每只后腿肌肉免疫100μl rV270-抗原蛋白铝佐剂液体疫苗(含20μg的rV270-抗原蛋白)；
对照2：小鼠每只后腿肌肉免疫100μl等量的25％(体积百分含量)铝佐剂。
三.抗体滴度测定
1.血清抗体滴度测定
初次免疫后，4组动物分别于第8周尾静脉采血，用ELISA法(所用的ELISA法为常规方法，具体步骤可参见：《Short Protocols in Molecular Biology》(FrederickM.Ausubel et al.，3^rdedition，John Wiley & Sons，Inc.，1995)。)测定抗体滴度。其主要过程为：包被rV270抗原蛋白，每孔50ng(100μl)，置4℃过夜(10-12小时)。然后用0.1％(质量百分含量)干酪素溶液封闭(200μl/孔)，置37℃孵箱2小时。以对照组2小鼠血清作阴性对照，加系列稀释(10倍数稀释)的实验组和对照组小鼠血清(100μl/孔)，置37℃孵箱内湿盒中30分钟。取出用洗液(吐温-20溶于0.01M PBS中组成洗液，吐温-20含量为0.05ml/100ml)洗5遍后加入对应的二抗(辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG)，37℃置湿盒中20分钟。加显色液(TMB溶液、底物溶液和30％过氧化氢按体积比100：900：1组成；TMB溶液：1mg TMB溶于1ml DMSO；底物溶液：1.02g柠檬酸和3.68g NaHPO₄·12H₂O混合溶于100ml水中)(50μl/孔)，置湿盒中37℃放10分钟，取出直接加入终止液(2M硫酸)(50μl/孔)，用光电比色测定抗体效价。
血清抗体滴度测定结果结果如图2所示，实验组1、2和对照1均产生较高的rV270抗体滴度，统计分析结果表明抗体滴度在2组之间无显著差异，而对照组2不产生针对rV270抗原的抗体，表明本发明的干粉末铝佐剂疫苗具有与常规的液体铝佐剂疫苗相似的作用，可作为一种鼠疫亚单位疫苗的新剂型。
2.免疫保护测定
初次免疫后第8周，用3×10³倍LD50(3×10³×3.3个)鼠疫菌201株(青海省地方病预防控制所)对所有免疫组小鼠进行皮下攻毒，然后观察14天。
观察结果如表2所示，实验组小鼠和对照组1小鼠全部存活，而且健康状况良好，而对照组2的小鼠全部死亡，表明本发明的铝佐剂干粉疫苗具有良好的免疫保护作用，与常规的铝佐剂液体疫苗的免疫保护效果相当。
表2.免疫保护效果

序列表
<110>中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所
<120>铝佐剂干粉疫苗及其制备方法
<160>2
<210>1
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<230>
<400>1

<210>2
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<230>
<400>2