红甜菜提取物和组合物及其制备方法和应用在制备抑制肿瘤生长的药物.pdf

本发明涉及植物的提取物和组合物及其应用在制备抑制肿瘤生长的药物的技术领域，是一种红甜菜提取物和组合物及其制备方法和应用在制备抑制肿瘤生长的药物。本发明甜菜提取物或/和红甜菜提取物组合物具有不含蔗糖、提高了有效物质浓度的特点，由于采用纳滤而在常温下制备，从而避免提取物降解与变性、有利于环保要求，适合于大规模生产的需要。本发明红甜菜提取物对子宫颈上皮癌细胞系Hela细胞生长具有抑制作用，本发明红甜菜提取物组合物可导致瘤体癌细胞的坏死，本发明红甜菜提取物或/和红甜菜提取物组合物可应用在制备抑制肿瘤生长的药物。并且该红甜菜提取物组合物安全无毒。

权利要求书

红甜菜提取物和组合物及其制备方法和应用在制备抑制肿瘤生长的药物
技术领域
本发明涉及植物的提取物和组合物及其应用在制备抑制肿瘤生长的药物的技术领域，是一种红甜菜提取物和组合物及其制备方法和应用在制备抑制肿瘤生长的药物。
背景技术
藜科的红甜菜(BetaVulgarisL.Var.rubra)为甜菜的一种变种，又称紫菜头，俗称牛皮菜，具通肠下气、开胸膈的功效，并可治吐泻和驱寄生虫；为食用蔬菜，可生食、也可熟食，产量较高，价格便宜，含色素量高，其中所含的红色素为天然食用红色素，主要由红色的甜菜花青和黄色的甜菜黄所组成，而甜菜花青中主要的甜菜苷，占红色素的75％-95％，其主要成分为甜菜红苷，属糖类衍生物，分子式为C₂₄H₂₆N₂O₁₃，分子量550.48。美国从1960年开始允许使用红甜菜浓缩液和脱水甜菜粉作为食用色素，联合国FAO/WHO食品添加剂联合专家委员会在1976年订出了红甜菜色素的标准，日本也做了相应的规定。目前，欧美及日本均在深入研究红甜菜色素及其应用。红甜菜色素着色能力强、无毒、安全，广泛地应用于饮料、冰淇淋、酒、糖果、糕点裱花、罐头等产品的加工，并且有改善肝功能，促进消化吸收的作用(程大友，宾力，刘巧红等.红甜菜的营养和功能.中国甜菜糖业.2006(1)：50-52；VonElbe，J.H.等食品科学，1974，39：334)。
制备红甜菜中所含的红色素通常采用膜分离、微生物发酵法和树脂法。由于红甜菜中所含的红色素是热敏性易氧化色素，加热处理对于色素本身是不利的，而膜分离是在常温下进行的一种新型分离技术，通过设置不同的膜孔径和膜分离参数，可将主要杂质有效地除去；赫崇岩，王晖，冯春生等人采用超滤纳滤两次分离法(甜菜红色素精制、稳定化技术研究.中国食品添加剂.1998(2)：10-13)，有效地对红甜菜中所含的红色素成分分离、精制和浓缩，并应用于生产，产品质量(粉末状)(百分吸收系数E^1％_1cm为8.8)达到国家标准GB8271-87(百分吸收系数E^1％_1cm不低于3)要求，同时研制了复合天然抗氧化剂，明显提高了红色素对光、热的稳定性。用微生物发酵法可以在对红色素影响较小的情况下有效地去除粗提液中的糖、硝酸盐和亚硝酸盐；Drdak用7种啤酒酵母对巴氏杀菌后的甜菜红提取液接种进行发酵，用HPLC监控甜菜苷、类甜菜苷、甜菜配基、类甜菜配基以及糖类的平均含量，发酵40h后，红色素保持理想的水平，而糖的含量则有较大的降低(Drdak.M，Altamirano.R.C，Rajniakova.A，Simko.P，Karovicova.J，Benkovska.D.红甜菜色素成分：不同啤酒酵母菌的发酵作用.食品科学杂志1992，57(4)：935-936.)；Grajek用反硝化细菌进行清除硝酸盐以及亚硝酸的研究表明Paracoccus denitrificans ATCC 19367和Ochrobactrum anthrop i ATCC 21909；
这两种菌株清除硝酸盐、亚硝酸盐的效率较高(Grajek.W，Walkowiak-Tomczak.D，Lewandowska.M，Mueller.A，Stefanski.R.利用反硝化细菌减少红甜菜汁中的硝酸盐.
Przemysl Spozywczy.1997，51(7)：40-43；Grajek.W，Walkowiak-Tomczak.D.影响反硝化细菌红甜菜汁脱硝酸盐速率的因素.农业与食品化学杂志.1997，45(5)：1963-1966)；但是，Czap ski研究认为用反硝化细菌发酵对红色素是不利的，而黄色素基本不受影响，同时对色素的气味也有一定的影响(Czapski.J，Maksymiuk.M，Grajek.W.用应答表面法分析红甜菜汁的生物脱硝酸盐的条件.农业与食品化学杂志.1998，46(11)4702-4705.)。将色素粗提取液经大孔树脂处理去杂，经盐酸化乙醇交换和浓缩可制得色素纯品(龚敏，陈清西.大孔吸附树脂浓缩火龙果色素的研究.厦门大学学报(自然科学版).2004(43)：44-46.)。
目前尚无有关红甜菜及其提取物抑制肿瘤生长作用的细胞学或实验动物的研究资料或数据公开报道过。
发明内容
本发明提供了一种红甜菜提取物和组合物及其制备方法和应用在制备抑制肿瘤生长的药物，克服了上述现有技术的不足，提高了有效物质浓度，其红甜菜提取物和组合物具有抑制肿瘤生长的作用。
本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种红甜菜提取物，采用紫外可见分光光度法对该红甜菜提取物液体进行测定，其吸收峰为535nm，以固形物计(固形物为红甜菜提取物溶液105℃烘干所得干燥物)，其百分吸收系数E^1％_1cm为45～55，而测定所用稀释液为pH5.4的乙酸乙酸钠缓冲液；其中，该红甜菜提取物液体是通过以下方法得到的：经过红甜菜洗净、破碎榨汁、过滤、加入稳定剂、树脂层析纯化、水洗除杂(用水洗树脂层析柱，祛除杂质)、洗脱、洗脱液纳滤浓缩后得到红甜菜提取物液体。
本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种红甜菜提取物的制备方法，其特征在于按下述方法进行：经过红甜菜洗净、破碎榨汁、过滤、加入稳定剂、树脂层析纯化、水洗除杂、洗脱、洗脱液纳滤浓缩后得到红甜菜提取物液体，对该红甜菜提取物液体采用紫外可见分光光度法进行测定，其吸收峰为535nm，以固形物计，其百分吸收系数E^1％_1cm为45～55，其中测定所用稀释液为pH5.4的乙酸-乙酸钠缓冲液。
针对本发明的技术方案之一或技术方案之二还可进一步作如下的优化或选择：
上述稳定剂可为维生素C、苯甲酸钠、硫代硫酸钠、亚硫酸钠、D-异维生素钠中的一种或一种以上，用量为每100ml红甜菜汁滤液中加入稳定剂5mg至50mg。
上述树脂选用阴离子型交换树脂或大孔树脂，洗脱剂为0.1-1％(W/V)的盐酸、1-10％(W/V)的醋酸、10-50％(W/V)的柠檬酸的水溶液，或以上酸的10-50％(V/V)的乙醇溶液；
上述洗脱液采用100至500分子量的膜，在室温条件下进行纳滤浓缩。
本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的：上述红甜菜提取物的组合物，其在上述红甜菜提取物液体中加入乳糖、淀粉、糊精、麦芽糊精、环糊精、甘露醇、木糖醇、蛋白糖、安赛蜜、三氯蔗糖、甲基纤维素、阿拉伯胶中的一种或一种以上，总用量为每100ml红甜菜提取物液体中加入2g至10g，进行减压真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥，得红甜菜提取物组合物，采用紫外-可见分光光度法对红甜菜提取物组合物进行测定，其吸收峰为535nm，百分吸收系数E^1％_1cm为15～35，而测定所用稀释液为pH5.4的乙酸-乙酸钠缓冲液。
本发明的技术方案之四是通过以下措施来实现的：上述红甜菜提取物的组合物的制备方法，其按下述步骤进行：在红甜菜提取物液体中加入乳糖、淀粉、糊精、麦芽糊精、环糊精、甘露醇、木糖醇、蛋白糖、安赛蜜、三氯蔗糖、甲基纤维素、阿拉伯胶中的一种或一种以上，总用量为每100ml红甜菜提取物液体中加入2g至10g，进行减压真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥，得红甜菜提取物组合物，采用紫外-可见分光光度法对红甜菜提取物组合物进行测定，其吸收峰为535nm，百分吸收系数E^1％_1cm为15～35，而测定所用稀释液为pH5.4的乙酸乙酸钠缓冲液。
本发明的技术方案之五是通过以下措施来实现的：上述红甜菜提取物应用在制备抑制肿瘤生长的药物。
本发明的技术方案之六是通过以下措施来实现的：上述红甜菜提取物的组合物应用在制备抑制肿瘤生长的药物。
本发明甜菜提取物或/和红甜菜提取物组合物具有不含蔗糖、提高了有效物质浓度的特点，由于采用纳滤而在常温下制备，从而避免提取物降解与变性、有利于环保要求，适合于大规模生产的需要。本发明红甜菜提取物对子宫颈上皮癌细胞系Hela细胞生长具有抑制作用，本发明红甜菜提取物组合物可导致瘤体癌细胞的坏死，本发明红甜菜提取物或/和红甜菜提取物组合物可应用在制备抑制肿瘤生长的药物。并且该红甜菜提取物组合物安全无毒。
附图说明
附图1为本发明的荷Hela细胞瘤裸鼠肿瘤细胞学试验(对照组)的照片1。
附图2为本发明的荷Hela细胞瘤裸鼠肿瘤细胞学试验(13mg/日剂量组)的照片2。
附图3为本发明的荷Hela细胞瘤裸鼠肿瘤细胞学试验(26mg/日剂量组)的照片3。
具体实施方式
本发明不受下述实施例的限制，可依据本发明的技术方案和实际情况来确定具体的实施方式。
一、红甜菜提取物(液)及其制备方法
实施例1：红甜菜，清洗，破碎榨汁，滤纸粗滤，每100ml红甜菜汁滤液中加入5mg的亚硫酸钠，通过AB-8型弱极性大孔树脂层析纯化，用8-15倍柱体积的纯化水，水洗除杂，8-12倍柱体积的0.5％盐酸-30％的乙醇溶液洗脱，洗脱液采用能通过100分子量的膜纳滤浓缩，得红甜菜提取物(液)。
实施例2：红甜菜，清洗，破碎榨汁，滤纸粗滤，每100ml红甜菜汁滤液中加入6mg的硫代硫酸钠，通过AB-8型弱极性大孔树脂层析纯化，用8-15倍柱体积的纯化水，水洗除杂，8-12倍柱体积的5％醋酸-20％乙醇溶液洗脱，洗脱液采用能通过200分子量的膜纳滤浓缩，得红甜菜提取物(液)。
实施例3：红甜菜，清洗，破碎榨汁，板框过滤，每100ml红甜菜汁滤液中加入5mg维生素C，通过二乙基氨基乙基纤维素(DEAE-25)树脂层析纯化，用10-20倍柱体积的纯化水，水洗除杂，8-12倍柱体积的20％的柠檬酸洗脱，洗脱液采用能通过500分子量的膜纳滤浓缩，得红甜菜提取物(液)。
实施例4：红甜菜，清洗，破碎榨汁，滤纸粗滤，每100ml红甜菜汁滤液中加入10mg的亚硫酸钠，通过S-8型极性大孔树脂层析纯化，用8-10倍柱体积的纯化水，水洗除杂，8-12倍柱体积的0.1％盐酸-40％的乙醇溶液洗脱，洗脱液采用能通过200分子量的膜纳滤浓缩，得红甜菜提取物(液)。
实施例5：红甜菜，清洗，破碎榨汁，纱布粗滤，每100ml红甜菜汁滤液中加入10mg的硫代硫酸钠，通过二乙基氨基乙基纤维素(DEAE-52)树脂层析纯化，用10-20倍柱体积的纯化水，水洗除杂，8-12倍柱体积的1％盐酸洗脱，洗脱液采用能通过250分子量的膜纳滤浓缩，得红甜菜提取物(液)。
实施例6：红甜菜，清洗，破碎榨汁，滤纸粗滤，每100ml红甜菜汁滤液中加入40mg的维生素C，通过S-8型大孔树脂层析纯化，用8-10倍柱体积的纯化水，水洗除杂，8-12倍柱体积的20％柠檬酸-20％的乙醇溶液洗脱，洗脱液采用能通过300分子量的膜纳滤浓缩，得红甜菜提取物(液)。
实施例7：红甜菜，清洗，破碎榨汁，滤纸粗滤，每100ml红甜菜汁滤液中加入10mg的苯甲酸钠，通过X-5型极性大孔树脂层析纯化，用8-10倍柱体积的纯化水，水洗除杂，8-12倍柱体积的0.2％盐酸-30％的乙醇溶液洗脱，洗脱液采用能通过350分子量的膜纳滤浓缩，得红甜菜提取物(液)。
实施例8：红甜菜，清洗，破碎榨汁，滤纸粗滤，每100ml红甜菜汁滤液中加入20mg的维生素C，通过S-8型极性大孔树脂层析纯化，用8-10倍柱体积的纯化水，水洗除杂，8-12倍柱体积的40％柠檬酸-20％的乙醇溶液洗脱，洗脱液采用能通过400分子量的膜纳滤浓缩，得红甜菜提取物(液)。
以上红甜菜提取物(液)及其制备方法的实施例所得红甜菜提取物(液)，采用紫外-可见分光光度法进行测定，其吸收峰为535nm，以固形物计，其百分吸收系数E^1％_1cm为45-55(测定所用稀释液为pH5.4的乙酸-乙酸钠缓冲液)，该红甜菜提取物的有效物质浓度明显高于国家标准GB8271-87(百分吸收系数E^1％_1cm不低于3)及文献报道(百分吸收系数E^1％_1cm为8.8)(赫崇岩，王晖，冯春生等.甜菜红色素精制、稳定化技术研究.中国食品添加剂.1998(2)：10-13)。
二、红甜菜提取物组合物
实施例1：以上实施例所得红甜菜提取物(液)，每100ml中加入2-8g的麦芽糊精及0.05-0.5g蛋白糖，喷雾干燥得红甜菜提取物干燥粉末。
实施例2：以上实施例所得红甜菜提取物(液)，每100ml中加入0.2-2g的淀粉及3-7g的乳糖及0.05-0.5g安赛蜜，冷冻干燥得红甜菜提取物组合物。
实施例3：以上实施例所得红甜菜提取物(液)，每100ml中加入2-5g的麦芽糊精、0.5-3g的β-环糊精、0.05-0.5g的甲基纤维素、0.05-0.5g的阿拉伯胶及0.05-0.5g的安赛蜜，喷雾干燥得红甜菜提取物干燥粉末。
实施例3：以上实施例所得红甜菜提取物(液)，每100ml中加入0.2-2g的淀粉、3-6g的乳糖、0.05-0.5g的安赛蜜、1-10mg的三氯蔗糖，喷雾干燥得红甜菜提取物组合物。
实施例4：以上实施例所得红甜菜提取物(液)，每100ml中加入2-6g的木糖醇、0.2-2g的淀粉、0.05-0.5g的蛋白糖，冷冻干燥得红甜菜提取物组合物。
实施例5：以上实施例所得红甜菜提取物(液)，每100ml中加入0.3-2g的甘露醇、0.2-2g的淀粉、3-5g的麦芽糊精、0.05-0.5g的阿拉伯胶及0.05-0.5g的安赛蜜，冷冻干燥得红甜菜提取物组合物。
实施例6：以上实施例所得红甜菜提取物(液)，每100ml中加入1-2g的糊精、2-6g的木糖醇及0.05-0.5g的甲基纤维素，冷冻干燥得红甜菜提取物组合物。
实施例7：以上实施例所得红甜菜提取物(液)，每100ml中加入3-7g的乳糖、0.05-0.5g的安赛蜜，喷雾干燥得红甜菜提取物组合物。
实施例8：以上实施例所得红甜菜提取物(液)，每100ml中加入2-10g的木糖醇，冷冻干燥得红甜菜提取物组合物。
以上实施例所得红甜菜提取物组合物，采用紫外可见分光光度法进行测定，其吸收峰为535nm，百分吸收系数E^1％_1cm为15-35(测定所用稀释液为pH5.4的乙酸-乙酸钠缓冲液)，该红甜菜提取物组合物的有效物质浓度明显高于国家标准GB8271-87(百分吸收系数E^1％_1cm不低于3)及文献报道(百分吸收系数E^1％_1cm为8.8)(赫崇岩，王晖，冯春生等.甜菜红色素精制、稳定化技术研究.中国食品添加剂.1998(2)：10-13)。
三、红甜菜提取物(液)及组合物的检测方法
1、红甜菜提取物(液)的检测方法
红甜菜提取物(液)为紫红色液体，可用紫外-可见分光光度仪进行检测，其吸收峰为535nm。具体检测方法为：精密吸取1ml红甜菜提取物(液)，用pH5.4的乙酸-乙酸钠缓冲液稀释至200ml，用紫外-可见分光光度仪测定在535nm处的吸光度值(A)，计算红甜菜提取物(液)在535nm处的百分吸收系数(指在一定波长时，溶液质量浓度为1％(W/V)，厚度为1cm的吸光度，用E^1％_1cm表示)。
折合到红甜菜提取物(液)中的固形物，即以固形物计，红甜菜提取物(液)在535nm处的百分吸收系数E^1％_1cm的计算公式为：
E^1％_1cm＝A/(C×L)
A------535nm处的吸光度值
C------测定液的百分浓度(g/100ml)
L------为比色杯溶液厚度
红甜菜提取物(液)中的固形物的测定方法：取红甜菜提取物(液)10ml，105℃干燥，恒重，称干燥物重量，计算红甜菜提取物(液)的固形物含量(W/V)。
2、红甜菜提取物组合物的检测方法
红甜菜提取物组合物为紫红色固体粉末或颗粒，可用紫外-可见分光光度仪进行检测，其吸收峰为535nm。具体检测方法为：精密称取0.2000g红甜菜提取物组合物，用pH5.4的乙酸-乙酸钠缓冲液溶解并稀释至100ml，混匀后再稀释10倍，然后用紫外-可见分光光度仪测定在535nm处的吸光度值(A)，计算红甜菜提取物组合物在535nm处的百分吸收系数(E^1％_1cm)。计算公式为：
E^1％_1cm＝A/(C×L)
A------535nm处的吸光度值
C------测定液的百分浓度(g/100ml)
L------为比色杯溶液厚度
四、红甜菜提取物中蔗糖的鉴别实验
取红甜菜提取物(液)，加0.05mol/L硫酸溶液，煮沸后，用0.1mol/L氢氧化钠溶液中和，再加碱性酒石酸铜试液(取硫酸铜结晶6.93g，加水溶解成100ml；取酒石酸钾钠结晶34.6g与氢氧化钠10g，加水使溶解成100ml；用时将两液等量混合，即得)，加热，未见氧化亚铜的红色沉淀生成，说明红甜菜提取物(液)中不含蔗糖。
五、红甜菜提取物及其组合物抑制肿瘤生长作用的细胞学和实验动物试验
关于红甜菜及其提取物，目前尚无有关抑制肿瘤生长作用的细胞学或实验动物的研究资料或数据。下面对上述实施例所得红甜菜提取物及其组合物进行药效学试验，如下：
1、红甜菜提取物(液)对体外Hela细胞抑制作用试验结果
将人子宫颈上皮癌细胞系Hela细胞用含10％新生犊牛血清的1640培养液于96孔板在37℃、5％CO₂条件下培养，贴壁2小时后加入经0.2μm过滤的不同浓度的红甜菜提取物继续培养24和48小时，红甜菜提取物对Hela细胞生长计数的影响见表1。红甜菜提取物对Hela细胞生长的抑制作用随浓度增加而逐渐增强，在500ppm浓度，红甜菜提取物在24小时期间对Hela细胞生长的平均抑制率为87％，在48小时期间为70％，对Hela细胞生长抑制率的计算公式为：
抑制率＝((对照组孔细胞数-试验组孔细胞数)/(对照组孔细胞数-0时对照组孔细胞数))×100％
2、红甜菜提取物组合物对接种Hela细胞裸鼠瘤体抑制作用试验结果
①对接种Hela细胞裸鼠肿瘤生长的影响
将培养的Hela细胞用胰蛋白酶消化后，用1640培养基(含新生小牛10％血清)将细胞稀释到1×10⁶/ml，然后注射于裸鼠右侧肩胛与颈部皮下0.2ml/日。随机分为A、B和C三组，每天分别喂给红甜菜提取物组合物0mg，13mg和26mg。测定口服红甜菜提取物组合物8周时接种Hela细胞裸鼠肿瘤的体积，并将动物处死后取瘤体称重，结果表明，瘤体的大小与重量与裸鼠口服红甜菜提取物的剂量有关，在26mg/日时，其瘤体体积比对照组小40％(P<0.05)，重量低29％(P<0.05)，而在13mg/日时差异不显著(表2)。
②荷Hela细胞瘤裸鼠肿瘤细胞学观察
喂给红甜菜提取物组合物对瘤体的细胞学影像见照片1、2和3。照片1为A组(对照组)荷Hela细胞瘤裸鼠瘤体的细胞学切片，具有比较典型的肿瘤细胞特征，即细胞为卵圆形，胞浆少，细胞核多为卵圆形，部分核内可见小核仁，部分核深染，呈圆形、不规则形，说明肿瘤细胞生长未受到抑制；照片2为给B组裸鼠饲喂13mg/日红甜菜提取物组合物，荷Hela细胞瘤裸鼠瘤体的细胞学切片，细胞切片可见细胞边界模糊，部分细胞结构不清，提示有肿瘤细胞发生坏死；照片3为给C组裸鼠饲喂26mg/日红甜菜提取物组合物，荷Hela细胞瘤裸鼠瘤体的细胞学切片，细胞切片可见细胞核消失，细胞结构不清，提示有大片肿瘤细胞坏死。以上结果表明红甜菜提取物组合物可导致瘤体癌细胞的坏死，并且其作用的程度与剂量有关。
照片1：对照组接种Hela细胞荷瘤裸鼠瘤体的细胞切片，HE染色，400倍。可见细胞为卵圆形，胞浆少，细胞核多为卵圆形，部分核内可见小核仁，部分核深染，呈圆形、不规则形。核浆比例失调。并可见核分裂像。说明肿瘤细胞生长良好。
照片2：饲喂红甜菜提取物组合物(13mg/日/鼠)时荷瘤裸鼠瘤体的细胞切片，HE染色，400倍。可见细胞边界模糊，部分细胞结构不清。结果提示有肿瘤细胞发生坏死。
照片3：饲喂红甜菜提取物组合物(26mg/日/鼠)时荷瘤裸鼠瘤体的细胞切片，HE染色，400倍。可见细胞核消失，细胞结构不清。结果提示有大片肿瘤细胞坏死。
由以上试验结果可以认为，红甜菜提取物组合物可导致瘤体癌细胞的坏死，并且其作用的程度与剂量有关。
红甜菜提取物组合物对接种Hela细胞裸鼠瘤体抑制作用试验结果表明：接种Hela细胞裸鼠，在喂给26mg/日时，具有明显的抑制肿瘤生长的作用(P<0.05)。依据以上裸鼠的有效剂量，按文献方法(徐叔云等主编.药理学实验方法学.人民卫生出版社，2005年)推算，相当于成人用量为10g/日(26×387.9/1000＝10g/日)。
六、红甜菜提取物组合物急性毒性实验
1、实验目的观察小鼠口服红甜菜提取物组合物后的急性毒性反应
2、实验材料昆明种小鼠，雌雄各半，体重20±2g，由新疆医学实验动物供应中心提供，红甜菜提取物组合物，红色粉末，依据红甜菜提取物组合物对接种Hela细胞裸鼠瘤体抑制作用试验结果所得裸鼠有效剂量，推算到成人用量相当于10g/日。保存条件：常温。临用前用纯净水溶解配制成所需浓度。
3、实验方法与结果：
①预实验：选取小鼠10只，体重20.32±0.71g，禁食不禁水12小时，红甜菜提取物组合物配制成最大浓度(50％)，以0.4ml/10g容量灌胃，观察24小时，均未见死亡，且精神与活动状态亦无异常。因0.4ml/10g为小鼠最大灌胃容量，未见异常反应，进一步进行最大耐受量(MTD)实验。
②最大耐受量(MTD)的测定：选取健康小鼠60只，雌雄各半，体重20.58±0.76g，依体重均衡随机分为对照组、红甜菜提取物组合物小剂量给药组、红甜菜提取物组合物大剂量给药组三组，每组20只动物，雌雄各半，小鼠禁食不禁水12小时。对照组(纯净水)，按0.4ml/10g容量灌胃两次(间隔6小时)；红甜菜提取物组合物小剂量给药组20g/kg(相当于成人每日每公斤用量的120倍)，以最大浓度(50％)，按0.4ml/10g容量灌胃；红甜菜提取物组合物大剂量给药组40g/kg(相当于成人每日每公斤用量的240倍)，以最大浓度(50％)，按0.4ml/10g容量灌胃两次(间隔6小时)。给药后每天给予小鼠一定量的水和食物，并且连续观察7天(即d)，记录动物的反应情况，饮食，体重变化及死亡情况，死亡动物及时尸检，7天(即d)后存活动物断头处死，取心、肝、脾、肾、脑、睾丸、卵巢称重，计算脏器系数。
结果未见小鼠死亡，且精神与活动状态亦无异常。实验结束时小鼠平均体重为27.88±2.30g。故小鼠口服红甜菜提取物组合物的最大耐受量为40.0g/kg，相当于成人每天每公斤用量的240倍。脏器尸检及组织学检查未见异常，脏器系数组间比较未见差异。详见表3、4。这证明该红甜菜提取物组合物安全无毒。
表1 红甜菜提取物(液)对Hela细胞生长计数的影响(万细胞/毫升，6次试验平均值)