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牛膝的三萜类提取物及在抗骨质疏松药物的用途
本发明为申请号03132105，申请日2003-06-27，名称为牛膝的三萜类提取物及在抗骨质疏松药物的用途的分案申请。
一、技术领域
本发明涉及从常用中药牛膝(Achyranthes bidentata Bl.的根)中得到的三萜类(包括三萜苷类)提取物，作为抗骨质疏松药物的应用。
二、背景技术
骨质疏松是一种常见的中，老年人的以骨组织量减少和微观结构退化为特征，致使骨脆性增加并易于发生骨折的疾病。随着人类社会的发展和医药科技的进步，人类寿命的大大提高，使得社会老龄化日益加剧。越来越多的人将受到骨质疏松的折磨。根据美国国家骨质疏松基金会(NOF，National Osteoporosis Foundation)报告，美国现有1000万骨质疏松症患者和1800多万低骨密度患者(未来的骨质疏松患者)，其中80％是妇女。另外超过50岁的女性的二分之一，男性的八分之一，在他们的生涯中都经历过由此病引起的骨折。日本在1995年统计已有100万此症患者，据估计现在已达到1000万，并有继续增加的趋势。21世纪我国亦将步入老龄化社会，据第五次人口普查，65岁以上的人口已占总人口的6.96％。随着我国老龄化社会的到来，骨质疏松及由此引起的骨折已严重威胁我国老年人的健康。骨质疏松症患者的不断增涨，不仅给社会带来巨大的压力，亦造成沉重的经济负担，尤其是高龄骨折患者，生活完全要靠人照顾。据美国1995年的统计，仅用于治疗该疾病的医药费用高达138亿美元(每天约3800万美元)，并且还在持续增加。毫无疑问，骨质疏松症无论现在和将来都是人类社会的流行病，亦是一个巨大的医学及社会课题。
骨组织是一个不断地进行新陈代谢的组织，是由成骨细胞，破骨细胞的偶联所控制。一旦他们之间的平衡遭到破坏，导致成骨细胞的活性降低或破骨细胞的活性增加就会造成骨质疏松症。此病患者的80％为女性，主要是由于女性绝经后，雌激素分泌的急剧下降，造成破骨细胞的活性增加，导致骨组织减少。目前的世界上常用药物主要是抑制破骨细胞的活性。尤其女性骨质疏松症的治疗大部分是使用雌激素补充疗法。但由于其严重的副作用使得许多妇女希望使用副作用小，天然的代替药物。中药，天然药物的宝库几千年来为我国人民的健康繁荣作出了巨大的贡献。从中药中寻找抗骨质疏松药物是新药研发的一条捷径。
牛膝为常用中药，对其化学成分的研究以进行了几十年，大量的化合物被报道，其中主要为三萜类化合物。现有专利申请涉及总甾提取物用于免疫用途，但是对其抗骨质疏松症未见报道。
三、发明内容
本发明的目的在于：提供具有骨质疏松治疗作用而且副作用很小或没有副作用的从中药牛膝中得到的含有的三萜类化合物提取物。
提供从牛膝根中利用适当的溶媒，高效率的提取具有骨质疏松治疗作用而且副作用很小或没有副作用的提取物的方法。
提供牛膝提取物和其中提取的三萜类化合物及其该类化合物在骨质疏松治疗中的应用，如在剂型上的应用，如提供汤剂(口服液)、片剂、胶囊、丸剂等。本发明中使用的牛膝为牛膝(Achyranthes bidentata Bl.，也称怀牛膝)的根。牛膝为中医常用药，具有补肝肾，强筋骨的作用，自古以来用于腰膝酸痛，筋骨无力。其主要用法为汤剂，粉末，丸剂等。在本发明中，和这些用法不同，利用乙醇等溶媒提取，减压浓缩除去提取液中的溶媒，再将浸膏用别的溶媒提取。用这样的提取方法成功地得到了到目前为止没有发现的对骨质疏松具有治疗作用的牛膝提取物，完成了本发明。
本发明的技术方案如下：牛膝的三萜类提取物在抗骨质疏松药物的用途，牛膝(Achyranthes bidentata Bl.)的干燥根粉碎，用乙醇加热回流提取得乙醇浸膏，一般而言，乙醇浸膏提取物经过正己烷、石油醚、酯类溶剂、正丁醇等醇类溶剂、水的递次提取。其顺序是从“轻”溶剂到水，亦可以是从上述顺序中直接选定一种溶剂提取，所得提取物基本相近。例如乙醇浸膏直接经石油醚类溶剂1-4次萃取提取得到石油醚提取液；或者直接用同样的将浸膏蒸馏水混悬液分别用乙酸乙酯等酯类1-4次，再用正丁醇等醇类1-4次提取，得到酯类、醇类提取液，最后用水提取，所得的三萜类提取物用于抗骨质疏松，其中20(11-酮-竹节参皂苷V)，21(2’-去糖-11-酮-竹节参皂苷V)，22(11-酮-牛膝皂苷E)，23(双键^10-11-竹节参皂苷V)，24(11-酮-牛膝皂苷C)是这次发明中得到的新化合物，用于抗骨质疏松药物的用途。
本发明的进一步改进是：上述所得的三萜类提取物制成口服液、片剂、胶囊剂等剂型，摄入量为每天20-200mg。
牛膝三萜类提取物的提取方法：牛膝(Achyranthes bidentata Bl.)的干燥根，粉碎，用70％～100％乙醇加热回流，提取1-4次。合并提取液，减压浓缩除去提取液中的溶媒，得乙醇浸膏。将该浸膏混悬于蒸馏水中，用溶剂提取，以石油醚为例：加入石油醚类溶剂1-4次萃取，合并萃取液，得到石油醚提取液。提取物用乙酸乙酯等酯类1-4次，再用正丁醇等醇类1-4次提取，得到酯类，醇类提取液。减压浓缩除去这些提取液中的溶媒，得石油醚类提取物，酯类提取物，醇类提取物，同样得到水提取物。
本发明对抗骨质疏松有良好的效果，尤其女性骨质疏松症无须使用雌激素补充疗法。是一种副作用小的天然代替药物。
四、附图说明
图1为本发明提取物分出的化合物的结构式，编号为1-27，其中11，12，13，14，15，25，26是本发明得到的新化合物。20，21，22，23，24亦然。
五、具体实施方式
下面使用具体的实施例来说明提取方法，以及这些提取物的骨质疏松治疗作用。当然这些提取方法并非只限于下列实施例。
实施例1：
牛膝(Achyranthes bidentata B1.)的干燥根(300g)，粉碎，用70％～100％乙醇(600ml)加热回流，提取3次。合并提取液，减压浓缩除去提取液中的溶媒，得乙醇浸膏(约79.33g，26.44％)。将该浸膏混悬于蒸馏水(500ml)中，加入正己烷(500ml x 3次)萃取，合并萃取液，得到正己烷提取液。
也可在正己烷提取后接着加入石油醚(500ml x 3次)萃取，合并萃取液，得到石油醚提取液。此项提取也可以直接取代正己烷提取，而当使用正己烷提取时，此项提取亦可以忽略。
接着将剩下浸膏蒸馏水混悬液分别用乙酸乙酯(500ml x 3次)，正丁醇(500ml x 3次)和水提取，得到乙酸乙酯，正丁醇提取液。用异丙醇提取可以取代正丁醇的提取。
减压浓缩除去这些提取液中的溶媒，得正己烷提取物(0.99g，0.03％)，乙酸乙酯提取物(1.40g，0.47％)，正丁醇提取物(8.35g，2.79％)和水提取物(50.50g，16.83％)。
正丁醇提取物溶解于适量的水中，上大孔树脂，先以水冲洗，然后以40-90％的乙醇冲洗，收集乙醇冲洗液，浓缩得到三萜类化合物总提取物。
酯类溶剂还包括乙酸丁酯、乙酸甲酯等，醇类溶剂包括异丙醇等，工艺条件分别对应上述。
异丙醇提取可以取代正丁醇的提取。酯类溶剂还包括乙酸丁酯、乙酸甲酯等，提取物的成分无明显差别。
对这些提取物进行了进一步的化学成分研究，鉴定了其中的主要含有化合物，这些化合物的构造将在后面叙述。
下面，说明由实施例1得到的各提取物的体外生物活性试验和体内动物生物试验结果。
实施例2：
用Ham’s F-12培养液将实施例1得到的正己烷提取物配成下表所记述的3种浓度。使用生后2天的乳小鼠，皮下注射45CaCl2(2？Ci)，2天后，摘出头盖骨，用Ham’s F-12培养液，在温度37℃，CO25％的条件下预培养24小时后，更换新培养液，并在此培养液中加入甲状旁腺激素(PTH，Parathyroid Hormone，最终浓度2x10-9M)和正己烷提取物(最终浓度见下表，440；44和4.4微克/毫升)在与预培养相同的条件下继续培养3天，并测定释放到培养液中的45Ca的(测定值1)。更新此培养液，再次在与预培养相同的条件下继续培养3天，同样测定释放到培养液中的45Ca(测定值2)。取出培养液中的头盖骨，用脱钙液[0.01M EDTA-乙酸pH5.5]脱钙，并同样测定脱钙液中的45Ca(测定值3)。按下面的计算公式计算⁴⁵Ca的释放率(％)。

以上的实验得到了下表的结果：
 

正己烷提取物⁴⁵Ca释放率(％)正常组(无PTH和正己烷提取物)50.81±4.36PTH100.00±5.56PTH+正己烷提取物(440微克/毫升90.63±3.61PTH+正己烷提取物(44微克/毫升)93.71±5.25PTH+正己烷提取物(4.4微克/毫升96.00±5.83
结果清楚的表明实施例1中得到的牛膝的正己烷提取物对由甲状旁腺激素引起的骨吸收亢进无抑制作用。
实施例3：
实施例1中得到的牛膝的乙酸乙酯提取物与实施例2同样配成下表所记述的5种浓度，440；44；4.4；0.88和0.44微克/毫升。
该提取物与实施例2同样检测其抗骨吸收活性，得到以下结果。
 乙酸乙酯提取物⁴⁵Ca释放率(％)正常组(无PTH和乙酸乙酯提取物)50.81±4.36PTH100.00±5.56PTH+乙酸乙酯提取物(440微克/毫升)47.83±1.14PTH+乙酸乙酯提取物(44微克/毫升)48.10±1.56PTH+乙酸乙酯提取物(4.4微克/毫升)65.94±3.58PTH+乙酸乙酯提取物(0.44微克/毫升)79.87±2.31PTH+乙酸乙酯提取物(0.88微克/毫升)92.09±3.58
结果清楚的表明实施例1中得到的牛膝的乙酸乙酯提取物对由甲状旁腺激素引起的骨吸收亢进具有强力的抑制作用。
实施例4：
实施例1中得到的牛膝的乙酸乙酯提取物与实施例2同样配成下表所记述的5种浓度，440；44；4.4；0.88和0.44微克/毫升。
该提取物与实施例2同样检测其抗骨吸收活性，得到以下结果。
 正丁醇提取物⁴⁵Ca释放率(％)正常组(无PTH和正丁醇提取物)50.81±4.36
 PTH100.00±5.56PTH+正丁醇提取物(440微克/毫升52.08±1.56PTH+正丁醇提取物(44微克/毫升)52.70±2.18PTH+正丁醇提取物(4.4微克/毫升62.06±1.57PTH+正丁醇提取物(0.44微克/毫升78.95±4.91PTH+正丁醇提取物(0.88微克/毫升89.84±5.17
结果清楚的表明实施例1中得到的牛膝的正丁醇提取物对由甲状旁腺激素引起的骨吸收亢进具有强力的抑制作用。
实施例5：
实施例1中得到的牛膝的乙酸乙酯提取物与实施例2同样配成下表所记述的3种浓度，440；44和4.4微克/毫升。
该提取物与实施例2同样检测其抗骨吸收活性，得到以下结果。
 水提取物⁴⁵Ca释放率(％)正常组(无PTH和水提取物)50.81±4.36PTH100.00±5.56PTH+水提取物(440微克/毫升)84.05±1.61PTH+水提取物(44微克/毫升)86.77±3.87PTH+水提取物(4.4微克/毫升)96.97±5.04
结果清楚的表明实施例1中得到的牛膝的水提取物对由甲状旁腺激素引起的骨吸收亢进显示了弱的抑制作用。
下面说明实施例1中得到的牛膝的正丁醇提取物的大鼠卵巢摘除动物模型的生物活性。
实施例6：
将8月龄的经产老龄大鼠分成6组，5组卵巢摘除组和1组伪手术组。卵巢摘除组的大鼠在苯巴比妥的麻醉下实施两侧卵巢摘除手术(OVX)。伪手术组的大鼠同样用苯巴比妥麻醉，但不摘两侧除卵巢，只用摄子接触两侧卵巢，实施伪手术(Sham)。将实施例1中得到的牛膝的正丁醇提取物溶解于蒸馏水中配成3个浓度(见下表)，将阳性对照药乙炔基雌二醇(Ethinylestradiol)混悬于蒸馏水中，经口灌胃给前述各个实验样品。对照组和伪手术组直接给同量的蒸馏水。实验持续6周，每周测定大鼠体重，6周后用双能量射线吸收法(DXA，Dual Energy X-rayAbsorptionmetry)测定大鼠的第二腰椎到第四腰椎的平均骨密度(BMD，BoneMineral Density)。另外，摘出大鼠子宫，迅速称重；并断头取血，测定大鼠血液雌二醇含量。
以下为实施例6的结果。
 实验组别体重(g)对照组(OVX+蒸留水)355.43±14.77阳性对照组(OVX+乙炔基雌二醇)303.20±6.02正丁醇提取物组(OVX+25毫克/公斤/天)328.80±7.04正丁醇提取物组(OVX+50毫克/公斤/天)328.00±9.67正丁醇提取物组(OVX+100毫克/公斤/天)328.50±11.85伪手术组(Sham+蒸留水)313.75±11.50
结果清楚的表明大鼠实施两侧卵巢摘除手术体重明显增加，而实施例1中得到的牛膝的水提取物对由此引起的体重增加有显著的抑制作用。
 实验组别平均骨密度(g/cm²)对照组(OVX+蒸留水)0.147±0.006阳性对照组(OVX+乙炔基雌二醇)0.163±0.004止丁醇提取物组(OVX+25毫克/公斤/天)0.154±0.002止丁醇提取物组(OVX+50毫克/公斤/天)0.157±0.002正丁醇提取物组(OVX+100毫克/公斤/天)0.158±0.003伪手术组(Sham+蒸留水)0.162±0.003
结果清楚的表明大鼠实施两侧卵巢摘除手术后骨密度显著降低，而实施例1中得到的牛膝的水提取物对由此引起的骨密度降低有明显的抑制作用。
 实验组别子宫重量(mg)对照组(OVX+蒸留水)243.15±26.68阳性对照组(OVX+乙炔基雌二醇)715.58±37.50正丁醇提取物组(OVX+25毫克/公斤/天)214.76±31.33正丁醇提取物组(OVX+50毫克/公斤/天)190.54±19.27正丁醇提取物组(OVX+100毫克/公斤/天)231.74±38.72伪手术组(Sham+蒸留水)601.23±63.77
结果清楚的表明实施两侧卵巢摘除手术给乙炔基雌二醇的大鼠的子宫重量明显增大，而实施例1中得到的牛膝的水提取物没有引起子宫重量增加，无趋子宫作用的。
 实验组别血液雌二醇含量(pg/ml)对照组(OVX+蒸留水)24.29±3.93阳性对照组(OVX+乙炔基雌二醇)43.25±10.76
 正丁醇提取物组(OVX+25毫克/公斤/天)18.63±2.59正丁醇提取物组(OVX+50毫克/公斤/天)29.43±2.03正丁醇提取物组(OVX+100毫克/公斤/天)17.88±2.69伪手术组(Sham+蒸留水)33.50±6.25
结果清楚的表明实施两侧卵巢摘除手术给乙炔基雌二醇大鼠的血液雌二醇含量，而实施例1中得到的牛膝的水提取物没有引起大鼠的血液雌二醇含量增高。
以上实施例6的结果表明从实施例1中得到的牛膝的正丁醇提取物对骨质疏松症具有预防和治疗作用，而无雌激素样副作用。
实施例7：
对从实施例1中得到的牛膝的正丁醇提取物的成分用各种方法进行了分离精制，得到并鉴定了多15个化合物(化合物1-15)：allantoin(尿囊素，1)，chikusetusaponin IV a(竹节参皂苷IV a，2)，chikusetusaponin IVa butylester(竹节参皂苷IVa正丁酯，3)，chikusetusaponin IV a methyl ester(竹节参皂苷IVa甲酯，4)，chikusetusaponin Va butyl ester，(竹节参皂苷Va正丁酯，5)，momordin IIa(木鳖子皂苷IIa，6)，achyranthoside A trimethylester(牛膝皂苷A三甲酯，7)，achyranthoside E trimethylester(牛膝皂苷E三甲酯，8)，achyranthoside D trimethylester(牛膝皂苷D三甲酯，9)，momordin IIb(木鳖子皂苷IIb，10)，Oleanolic acid(齐墩果酸，27)，其中11(牛膝皂苷Y)，12(牛膝皂苷C二甲酯正丁酯)，13(牛膝皂苷C二甲酯)，14(牛膝皂苷E二甲酯)，15(牛膝皂苷E甲酯正丁酯)，25(牛膝皂苷D二甲酯)，26(28-去葡萄糖牛膝皂苷E二甲酯)是这次发明中得到的新化合物。
新化合物的性状：
11(牛膝皂苷Y)：PositiveFAB-MASm/z：993(M+Na)⁺，Negative ion HR-FAB-MSm/z：969.5060(M-H)^-(C₄₉H₇₇O₁₉，cal969.5059)，807.4531(M-Glc-H)-，(C₄₃H₆₇O₁₄，cal 807.4531).
¹H-NMR：3.28(1H，dd，J＝12.4，4.5Hz，H-3)，3.20(1H，dd，J＝12.4，4.0Hz，H-18)，3.73(3H，s，OMe of GluA methyl ester)，4.96(1H，d，J＝7.7Hz，anomeric H of GluAmethyl ester)，5.35(1H，d，J＝7.9Hz，anomeric H of Glc)，542(1H，brs，H-12)，6.34(1H，d，J＝7.9Hz，anomeric H of Glc).
12(牛膝皂苷C二甲酯正丁酯)：Negative ion HR-FAB-MSm/z：1039.5487(M-H)^-(C₅₃H₈₃O₂₀，cal 1039.5478).
¹H-NMR：3.34(1H，dd，J＝12.0，4.0Hz，H-3)，3.20(1H，dd，J＝12.9，3.9Hz，H-18)，3.52(3H，s，OMe of 1”-OMe)，3.71(3H，s，OMe of 5”-OMe)，4.71，5.31(2H，ABq，J＝16.3Hz，H-4”)，4.91(1H，d，J＝7.1Hz，anomeric H of GlcA)，5.21(1H，d，J＝2.1Hz，H-2”)，6.04(1H，d，J＝2.5Hz，H-3”)，5.41(1H，brs，H-12)，6.32(1H，d，J＝7.8Hz，anomeric H of Glc).
13(牛膝皂苷C二甲酯)：Negative ion HR-FAB-MSm/z：983.4845(M-H)^-(C₄₉H₇₅O₂₀，cal983.4852).
¹H-NMR：3.34(1H，dd，J＝11.6，3.9Hz，H-3)，3.19(1H，dd，J＝13.1，3.6Hz，H-18)，3.52(3H，s，OMe of 1”-OMe)，3.71(3H，s，OMe of 5”-OMe)，4.74，5.30(2H，ABq，J＝16.3Hz，H-4”)，4.92(1H，d，J＝7.8Hz，anomeric H of Glc Amethyl ester)，5.19(1H，d，J＝2.4Hz，H-2”)，6.04(1H，d，J＝2.4Hz，H-3”)，5.41(1H，brs，H-12)，6.31(1H，d，J＝7.8Hz，anomeric H of Glc).
14(牛膝皂苷E二甲酯)：Positive ion FAB-MSm/z：977(M+Na)⁺，Negative ionFAB-MSm/z：953(M-H)^-.Negative ion HR-FAB-MSm/z：953.4760(M-H)^-(C₄₈H₇₃O₁₉，cal 953.4746).
¹H-NMR：3.32(1H，dd，J＝11.8，4.3Hz，H-3)，3.18(1H，dd，J＝14.7，4.1Hz，H-18)，3.57(3H，s，OMe of 5”-OMe)，3.58(3H，s，OMe of 2”-OMe)，4.98，5.18(2H，ABq，J＝16.4Hz，H-4”)，4.90(1H，d，J＝7.7Hz，anomeric H of GluA)，5.41(1H，brs，H-12)，6.32(1H，d，J＝8.1Hz，anomeric H of Glc).
15(牛膝皂苷E甲酯正丁酯)：Positive ion FAB-MSm/z：1019(M+Na)⁺，Negative ion FAB-MS m/z：995(M-H)-.Negative ion HR-FAB-MS m/z：995.5244(M-H)^-(C₅₁H₇₉O₁₉，cal995.5244).
¹H-NMR：3.32(1H，dd，J＝11.6，4.6Hz，H-3)，3.19(1H，dd，J＝14.2，4.1Hz，H-18)，3.57(3H，s，OMe of 5”-OMe)，3.58(3H，s，OMe of 2”-OMe)，4.99，5.23(2H，ABq，J＝16.8Hz，H-4”)，4.93(1H，d，J＝7.7Hz，anomeric H of GluA)，5.46(1H，brs，H-12)，6.34(1H，d，J＝8.0Hz，anomeric H ofGlc).
20：Positive ion HR-FAB-MS m/z：993.4656(M+Na)⁺，(C₄₈H₇₄O₂₀Na，cal993.4671)；Negative ion HR-FAB-MSm/z：969.4680(M-H)^-，(C₄₈H₇₃O₂₀，cal 969.4695).
¹H-NMR：0.79，0.89，1.11，1.12，1.21，1.25，1.41，(3H each，alls，30，29，24，25，26，23，27-CH₃)，2.45(1H，s)，3.33(1H，dd，J＝11.7，3.4Hz，H-3)，3.20(1H，dd，J＝13.9，3.0Hz，H-18)，5.91(1H，s).
20(11-酮-竹节参皂苷V)：Positive ion HR-FAB-MSm/z：993.4656(M+Na)⁺，(C₄₈H₇₄O₂₀Na，cal993.4671)；Negative ion HR-FAB-MS m/z：969.4680(M-H)^-，(C₄₈H₇₃O₂₀，cal969.4695).
¹H-NMR：0.79，0.89，1.11，1.12，1.21，1.25，1.41(3H each，alls，30，29，24，25，26，23，27-CH₃)，2.45(1H，s)，3.33(1H，dd，J＝11.7，3.4Hz，H-3)，3.20(1H，dd，J＝13.9，3.0Hz，H-18)，5.91(1H，s).
21(2’-去糖-11-酮-竹节参皂苷V)：Positive ion HR-FAB-MSm/z：809.4323(M+H)⁺，(C₄₂H₆₅O₁₅，cal809.4323)；Negativeion HR-FAB-MS m/z：807.4172(M-H)^-，(C₄₂H₆₃O₁₅，cal807.4167).
¹H-NMR：0.80，0.90，0.96，1.21，1.25，1.32，1.44(3H each，all s，30，29，24，25，26，23，27-CH3)，2.49(1H，s)，3.42(1H，dd，J＝11.7，3.4Hz，H-3)，3.21(1H，dd，J＝13.9，3.0Hz，H-18)，5.92(1H，s).
22(11-酮-牛膝皂苷E)：Positive ion HR-FAB-MSm/z：979.3958(M+K)⁺，(C₄₆H₆₈O₂₀K，cal979.3941)；Negative ion HR-FAB-MSm/z：939.4227(M-H)^-，(C₄₆H₆₇O₂₀，cal939.4226).
¹H-NMR：0.84，0.98，0.98，1.10，1.14，1.29，1.39(3H each，alls，30，29，24，25，26，23，27-CH₃)，2.44(1H，s)，3.48(1H，dd，J＝11.7，3.4Hz，H-3)，3.18(1H，dd，J＝13.9，3.0Hz，H-18)，5.90(1H，s).
23(双键^10-11-竹节参皂苷V)：Positive ion HR-FAB-MSm/z：977.4712(M+Na)⁺，(C₄₈H₇₄O₁₉Na，cal 977.4722)；Negative ion HR-FAB-MSm/z：953.4746(M-H)^-，(C₄₈H₇₃O₁₉，cal953.4746).
¹H-NMR：0.85，0.87，1.12，1.12，1.18，1.29，1.38(3H each，all s，30，29，24，25，26，23，27-CH₃)，2.44(1H，s)，3.36(2H，overlapped H-3，H-18)，5.62(1H，d，J＝5.6Hz)，5.69(1H，d，J＝5.7Hz).
24(11-酮-牛膝皂苷C)：Negative ion FAB-MSm/z：1131(M-H)^-：Negative ionHR-FAB-MSm/z：1131.4857(M-H)^-(C₅₃H₇₉O₂₁，cal1131.4860).Negative ionFAB-MS/MS(selectedm/z：1131)m/z：969(M-Glc-H)^-or(M-functional group).
25(牛膝皂苷D二甲酯)：Negative ion FAB-MSm/z：1145(M-H)^-：Negative ionHR-FAB-MS m/z：1145.5380(M-H)^-，(C₅₅H₈₅O₂₅，cal1145.5380).
¹H-NMR：3.43(2H，overlapped H-3，H-18)，4.76，5.03(2H，ABq，J＝16.6Hz，H-1”)，4.79(1H，d，J＝7.7Hz，anomeric H of GluA)，5.37(1H，brs，H-2’)，5.41(1H，brs，H-12)，5.65(1H，d，J＝7.7Hz，anomeric H of GluA2-Glc)，6.30(1H，brs，H-1’)，6.33(1H，d，J＝7.7Hz，anomeric H of 28-Glc).
26(28-去葡萄糖牛膝皂苷E二甲酯)：Negative ion FAB-MSm/z：791(M-H)^-：Negative ion HR-FAB-MSm/z：791.4245(M-H)^-，(C₄₂H₆₃O₁₄，cal791.4218).
¹H-NMR：3.32(2H，overlapped H-3，H-18)，3.58(3H，s，OMe-2”)，3.59(3H，s，OMe-2’)，4.91(1H，d，J＝7.4Hz，anomeric H of GluA)，4.98，5.19(2H，ABq，J＝16.6Hz，H-1”)，5.37(1H，brs，H-2’)，5.46(1H，brs，H-12)，5.65(1H，d，J＝7.7Hz，anomeric H ofGluA2-Glc)，6.30(1H，brs，H-1’).
实施例8：
用成骨细胞和破骨细胞的共存培养法离体检测了实施例7得到的化合物1-23，27的对破骨细胞形成的抑制作用。
骨髓细胞的调制：将6-9周的小鼠用70％的乙醇消毒后，摘出胫骨，切除两端，用25G的注射器和1mlα-MEM吹出骨髓液。将骨髓液离心，收集细胞，将细胞悬浮于含有10％FBS的α-MEM液中并调整至每0.1ml10⁵个细胞的浓度。
成骨细胞样细胞的调制：将生后2天的乳小鼠用70％的乙醇消毒后摘出头盖骨，用含有10％FBS的α-MEM液洗净后，头盖骨用酶溶液()37℃消化10分钟，丢舍浮游部分，加入新酶溶液37℃消化10分钟并重复4次，合并细胞浮游液，用含有10％FBS的α-MEM液中并调整至每孔5 x 10⁶个细胞的浓度，培养3天，回收细胞，在零下70度冻结保存。
将冻结保存的成骨细胞样细胞(10⁴/0.5ml)和骨髓细胞(10⁵/0.1ml)进行共存培养法，培养液中加入PTH(100ng/ml)或1α，25(OH)₂VD₃(10^-8M)和被检化合物(20μM)，每2天交换培养液，共培养6天。
培养终了后，除去培养液，用10％福尔马林固定细胞(10分钟)，再用乙醇—丙酮脱水后，自然干燥。加入0.5ml二甲基酰胺—重氮盐染色液，放置12分钟后，用2ml蒸留水细净，自然干燥。显维镜下对具有3个核以上的TRAP阳性破骨细胞计数。
以由α，25(OH)₂VD₃(10^-8M)诱发的TRAP阳性破骨细胞为100％，计算被检化合物对破骨细胞形成的抑制作用。
以下为实施例8的结果。
 化合物TRAP阳性破骨细胞数量(％)        化合物TRAP阳性破骨细胞数量(％)        正常组20.1±5.3122.3±0.0对照组100.0±42.2135.0±1.5Elcatonin(2U/m29.0±9.1141.1±0.0192.8±32.8151.1±0.0214.2±2.41653.7±12.930.4±0.0170.0±0.0448.0±6.1185.7±2.2531.7±8.31974.7±13.1619.2±3.320117.9±19.2714.8±5.02149.8±19.4822.9±10.92265.5±6.899.2±8.72370.5±17.5106.6±0.12370.5±17.5114.4±0.12769.9±11.0
结果清楚的表明实施例8中得到的牛膝的三萜类化合物(20μM)2-15，17-18对用成骨细胞和破骨细胞的共存培养法中对破骨细胞形成的具有明显的抑制作用。其中以化合物3，12，14，15，17尤为强烈。