非复制型副粘病毒科病毒载体.pdf

本发明者们成功地制备了从基因组RNA中全部去除RNP构成蛋白的NP、P、L蛋白质基因的非复制型SeV载体，并确认到携带GFP等标记基因的NP/P/L缺失型SeV载体可以提高生产效率和外源基因导入及表达的效率(为获得高表达量，需要高MOI感染)。本发明的载体通过去除L基因或NP、P、L基因等多个基因，可减少宿主细胞内的来源于病毒的蛋白表达量，降低体内给药的免疫原性。

1.  一种载体，其含有复合体，所述复合体包含下述(a)和(b)：
(a)源自副粘病毒科病毒的(-)链单链RNA，其被修饰为不表达从结合副粘病毒科病毒(-)链单链RNA的NP、P及L蛋白质中选择的、至少包括L蛋白质在内的一种或多种蛋白质；和
(b)NP蛋白质、P蛋白质及L蛋白质。

2.  一种载体，其含有复合体，所述复合体包含下述(a)和(b)：
(a)源自副粘病毒科病毒的(-)链单链RNA，其被修饰为不表达从结合副粘病毒科病毒(-)链单链RNA的NP、P及L蛋白质中选择的多种蛋白质；和
(b)NP蛋白质、P蛋白质及L蛋白质。

3.  权利要求1和2所述的载体，其中源自副粘病毒科病毒的(-)链单链RNA被修饰为不表达NP、P及L蛋白质。

4.  权利要求1-3中任一项所述的载体，其中源自副粘病毒科病毒的(-)链单链RNA至少表达一种副粘病毒科病毒包膜蛋白质。

5.  权利要求4所述的载体，其中源自副粘病毒科病毒的(-)链单链RNA被修饰为表达M、F和HN蛋白质，而不表达NP、P和L蛋白质。

6.  权利要求1-5中任一项所述的载体，其中(-)链单链RNA源自仙台病毒。

7.  权利要求1-6中任一项所述的载体，其中(-)链单链RNA还携带外源基因。

8.  一种DNA，其编码权利要求1-7中任一项所述载体中包含的(-)链单链RNA或其互补链。

9.  一种权利要求1所述载体的制备方法，包含以下(a)、(b)步骤：
(a)将编码源自副粘病毒科病毒的(-)链单链RNA或其互补链的DNA导入能够表达NP、P及L蛋白质的细胞的步骤，其中该(-)链单链RNA被修饰为不表达从结合副粘病毒科病毒的(-)链单链RNA的NP、P及L蛋白质中选择的、且至少包括L蛋白质在内的一种或多种蛋白质；和
(b)培养所述细胞，并从该培养上清回收病毒粒子的步骤。

10.  一种权利要求2所述载体的制备方法，包含以下(a)和(b)步骤：
(a)将编码源自副粘病毒科病毒的(-)链单链RNA或其互补链的DNA导入到能够表达NP、P、L蛋白质的细胞中的步骤，该(-)链单链RNA被修饰为不表达从NP、P及L蛋白质中选择的多种蛋白质；和
(b)培养所述细胞，并从该培养上清回收病毒粒子的步骤。

11.  权利要求9和10所述的制备方法，其中能够表达NP、P、L蛋白质的细胞还能够表达具有促进病毒粒子形成和释放功能的蛋白质。

12.  权利要求11所述的方法，其中具有促进病毒粒子形成和释放功能的蛋白质为C蛋白质。

13.  一种权利要求1所述载体的制备方法，包含下述(a)和(b)步骤：
(a)将插入了编码源自副粘病毒科病毒的(-)链单链RNA或其互补链的DNA的载体、NP蛋白质表达载体、P蛋白质表达载体及L蛋白质表达载体导入到能表达这些载体的细胞中的步骤，该(-)链单链RNA被修饰为不表达从结合副粘病毒科病毒的(-)链单链RNA的NP、P及L蛋白质中选择的、至少包括L蛋白质在内的一种或多种蛋白质；和
(b)培养所述细胞，并从该培养上清回收病毒粒子的步骤。

14.  一种权利要求2所述载体的制备方法，包含下述(a)和(b)步骤：
(a)将插入了编码源自副粘病毒科病毒的(-)链单链RNA或其互补链的DNA的载体、NP蛋白质表达载体、P蛋白质表达载体及L蛋白质表达载体导入到细胞的步骤，该(-)链单链RNA被修饰为不表达从NP、P及L蛋白质中选择的多种蛋白质；和
(b)培养所述细胞，并从该培养上清回收病毒粒子的步骤。

15.  一种权利要求1所述载体的制备方法，包含下述(a)和(b)步骤：
(a)将包含源自副粘病毒科病毒的(-)链单链RNA和结合该(-)链单链RNA的蛋白质的复合物导入到表达NP、P、L蛋白质和包膜蛋白质的细胞内的步骤，该源自副粘病毒科病毒(-)链单链RNA被修饰为不表达从结合该(-)链单链RNA的NP、P、L蛋白质中选择的、至少包括L蛋白质在内的一种或多种蛋白质；和
(b)培养所述细胞，并从该培养上清回收病毒粒子的步骤。

16.  一种权利要求2所述载体的制备方法，包含下述(a)和(b)步骤：
(a)将包含源自副粘病毒科病毒的(-)链单链RNA和结合该(-)链单链RNA的蛋白质的复合物导入到表达NP、P、L蛋白质和包膜蛋白质的细胞内的步骤，该源自副粘病毒科病毒(-)链单链RNA被修饰为不表达从结合(-)链单链RNA的NP、P、L蛋白质中选择的多种蛋白质；和
(b)培养所述细胞，并从该培养上清回收病毒粒子的步骤。

17.  一种制备用于在靶细胞中表达外源基因的载体的方法，包含以下(a)和(b)步骤：
(a)将编码源自副粘病毒科病毒的(-)链单链RNA或其互补链的DNA导入到能表达NP、P、L蛋白质的细胞内的步骤，该源自副粘病毒科病毒(-)链单链RNA携带外源基因，并被修饰为不表达从NP、P、L蛋白质中选择的、至少包括L蛋白质在内的一种或多种蛋白质；和
(b)培养所述细胞，并从该培养上清回收病毒粒子的步骤。

18.  一种制备用于在靶细胞中表达外源基因的载体的方法，包含以下(a)和(b)步骤：
(a)将编码源自副粘病毒科病毒(-)链单链RNA或其互补链的DNA导入到能表达NP、P、L蛋白质的细胞内的步骤，该源于副粘病毒科病毒(-)链单链RNA携带外源基因，并被修饰为不表达从NP、P、L蛋白质中选择的多种蛋白质；和
(b)培养所述细胞，并从该培养上清回收病毒粒子的步骤。

19.  一种在靶细胞中表达外源基因的方法，包含以下(a)、(b)步骤：
(a)制备权利要求7所述载体的步骤；和
(b)将权利要求7所述载体导入靶细胞的步骤。

非复制型副粘病毒科病毒载体
技术领域
本发明涉及一种非复制型副粘病毒科病毒载体。
背景技术
仙台病毒载体(SeV载体)为细胞质型病毒载体(表达的整个过程在细胞质内完成的载体)，所以，体内使用也不用担心携带基因整合到宿主染色体产生遗传毒性。另外还具有数项优越的性能，如体外和体内均可获得高效率基因导入和表达的效率，以及体外可长期持续表达。所以，在基因治疗、基因疫苗或抗体生产及机能解析的应用上，SeV作为基因导入载体有望得到更广泛地应用(非专利文献1、2)。
然而，利用仙台病毒载体表达外源基因时，病毒结构蛋白(尤其是转录复制所需的RNP构成蛋白NP、P、L蛋白)也随着携带的外源基因一起表达，所以活体应用有可能招致免疫原性。于是，近年来开发了各种类型的基因缺失型SeV载体。例如，有的是将病毒RNP构成蛋白以外的M、F、HN蛋白质别单独或多数缺失的类型(专利文献1、2)。这些基因缺失型SeV载体虽然降低了免疫原性，但预计仍有残余。
SeV载体的RNP构成蛋白NP、P、L是仙台病毒基因组的转录复制所需要的蛋白质，在SeV载体中本来就是不可缺少的蛋白质。然而，即使在基因组中去除这些蛋白基因，如果通过表达质粒等由外部提供这些缺失的蛋白基因，理论上说重建、扩增这些蛋白病毒载体粒子是可能的。而且，重建的缺失NP、P、L的SeV载体一旦感染到靶细胞，可利用进入到粒子内的NP、P及L蛋白转录基因组上的外源基因的mRNA，使其表达外源基因。由于这种缺失NP、P、L的SeV载体在基因组上缺失了NP、P、L基因，所以不能复制RNP，从而演变为非复制型SeV载体。
如果在基因组上去除NP、P、L中的任一项，便不能复制RNP(或极少复制)，可得到非复制型SeV载体。过去有报告称，为制备非复制型SeV载体，构建了单独缺失NP蛋白基因的载体和单独缺失P蛋白基因的载体(非专利文献3、4)。然而，考虑到L蛋白是RNA聚合酶活性主体，不是从基因组中单独缺失P基因或NP基因，而是通过缺失L基因或包括L基因在内的多个基因，能够使非复制型载体的特征更加明显。此外，缺失包括L基因在内的多个基因，有望可以最大限度地减少病毒蛋白的影响。所以，从降低免疫原性的观点考虑，优选缺失包含L基因在内的多个基因，如所有的NP、P、L基因。另外，L基因约占基因组长的一半左右，所以缺失L基因，便可在基因组中插入更长的目的基因，并且基因组越短，转录效率越高，越可获得更高效率的目的基因的表达量。所以，缺失L基因的SeV载体极为有用。然而，就包含SeV载体的副粘病毒科病毒载体而言，目前还没有报告表明缺失L基因的载体的制备。
【专利文献1】WO00/70070
【专利文献2】WO2003/025570
【非专利文献1】Bitzer M等人，J Gene Med.5(7)：543-553(2003)
【非专利文献2】Griesenbach U等人，Curr Opin Mol Ther.7(4)：346-352.(2005)
【非专利文献3】Molecular Therapy Volume 13，Supplement 1，May 2006，第S185页
【非专利文献4】NSV2006(13th International Conference NegativeStrand Viruses 2006，Salamance，Spain，June 17-22nd，2006)概要集
发明的内容
发明要解决的问题
鉴于以上情况，本发明所要解决的问题为制备低免疫原性的非复制型副粘病毒科病毒载体。
解决问题的手段
为解决上述课题，本发明者们进行了不懈的努力，成功地制备了从基因组RNA中全部缺失RNP构成蛋白NP、P、L蛋白基因的非复制型SeV载体，并确认到携带GFP等标记基因的NP/P/L缺失型SeV载体可提高生产效率(1e7 CIU/ml以上)和外源基因导入及表达的高效率(为获得高表达量，需要高MOI感染)。本发明的载体通过缺失L基因或NP、P、L基因中的多个基因，可以减少宿主细胞内表达的来源于病毒的蛋白量，降低体内给药的免疫原性。本发明的载体尤其在基因治疗领域极为有用。即，本发明涉及缺失L基因的副粘病毒科病毒载体，更具体地说提供如下所述的发明：
(1)一种病毒载体，其含有复合体，所述复合体包含下述(a)和(b)：
(a)源自副粘病毒科病毒的(-)链单链RNA，其被修饰为不表达从结合副粘病毒科病毒(-)链单链RNA的NP、P、L蛋白质中选择的、至少包含L蛋白质在内的一种或多种蛋白质；
(b)NP蛋白质、P蛋白质及L蛋白质。
(2)一种病毒载体，其含有复合体，所述复合体包含下述(a)和(b)：
(a)源自副粘病毒科病毒的(-)链单链RNA，其被修饰为不表达从结合副粘病毒科病毒(-)链单链RNA的NP、P及L蛋白质中选择的多种蛋白质；
(b)NP蛋白质、P蛋白质及L蛋白质。
(3)上述(1)和(2)所述的载体，其中源自副粘病毒科病毒的(-)链单链RNA被修饰为不表达NP、P及L蛋白质。
(4)上述(1)-(3)中任一项所述的载体，其中源自副粘病毒科病毒的(-)链单链RNA至少表达一种副粘病毒科病毒包膜蛋白质。
(5)上述(4)所述的载体，其中源自副粘病毒科病毒的(-)链单链RNA被修饰为表达M、F、HN蛋白质，而不表达NP、P及L蛋白质。
(6)上述(1)-(5)中任一项所述的载体，其中(-)链单链RNA源自仙台病毒。
(7)上述(1)-(6)中任一项所述的载体，其中(-)链单链RNA还携带外源基因。
(8)一种DNA，其编码上述(1)-(7)中任一项所述载体所包含的(-)链单链RNA或其互补链。
(9)一种上述(1)所述载体的制备方法，包含下述(a)和(b)的步骤：
(a)将编码源自副粘病毒科病毒的(-)链单链RNA或其互补链的DNA导入到能表达NP、P及L蛋白质的细胞的步骤，该(-)链单链RNA被修饰为不表达从结合副粘病毒科病毒的(-)链单链RNA的NP、P及L蛋白质中选择的、且至少包括L蛋白质在内的一种和多种蛋白质；和
(b)培养所述细胞，并从该培养上清回收病毒粒子的步骤。
(10)一种上述(2)所述载体的制备方法，包含下述(a)和(b)的步骤：
(a)将编码源自副粘病毒科病毒的(-)链单链RNA或其互补链的DNA导入到能表达NP、P及L蛋白质的细胞中的步骤，该(-)链单链RNA被修饰为不表达从NP、P及L蛋白质中选择的多种蛋白质；和
(b)培养所述细胞，并从该培养上清回收病毒粒子的步骤。
(11)上述(9)或(10)所述的制备方法，其中能表达NP、P及L蛋白质的细胞还能表达具有促进病毒粒子形成和释放功能的蛋白质。
(12)上述(11)所述的方法，其中具有促进病毒粒子形成和释放功能的蛋白质为C蛋白质。
(13)一种上述(1)所述载体的制备方法，包含下述(a)和(b)的步骤：
(a)将插入了编码源自副粘病毒科病毒的(-)链单链RNA或其互补链的DNA的载体、NP蛋白质表达载体、P蛋白质表达载体及L蛋白质表达载体导入到能表达这些载体的细胞中的步骤，该(-)链单链RNA被修饰为不表达从结合源自副粘病毒科病毒(-)链单链RNA的NP、P及L蛋白质中选择的、至少包括L蛋白质在内的1种或多种蛋白质；和
(b)培养所述细胞，并从该培养上清回收病毒粒子的步骤。
(14)一种上述(2)所述载体的制备方法，包含下述(a)和(b)的步骤：
(a)将插入了编码源自副粘病毒科病毒的(-)链单链RNA或编码其互补链的DNA的载体、NP蛋白质表达载体、P蛋白质表达载体及L蛋白质表达载体导入细胞的步骤，该(-)链单链RNA被修饰为不表达从NP、P及L蛋白质中选择的多种蛋白质；和
(b)培养所述细胞，并从该培养上清回收病毒粒子的步骤。
(15)一种上述(1)所述载体的制备方法，包含下述(a)和(b)的步骤：
(a)将包含源自副粘病毒的(-)链单链RNA和结合该(-)链单链RNA的蛋白质的复合体导入到能表达NP、P、L蛋白质及包膜蛋白质的细胞内的步骤，该(-)链单链RNA被修饰为不表达从结合源自副粘病毒科病毒(-)链单链RNA的NP、P及L蛋白质中选择的、至少包含L蛋白质在内的1种或多种蛋白质；和
(b)培养所述细胞，并从该培养上清回收病毒粒子的步骤。
(16)一种上述(2)所述载体的制备方法，包含下述(a)和(b)的步骤：
(a)将包含源自副粘病毒的(-)链单链RNA和结合该(-)链单链RNA的蛋白质的复合体导入到表达NP、P、L蛋白质及包膜蛋白质的细胞中的步骤，该(-)链单链RNA被修饰为不表达从结合源自副粘病毒科病毒(-)链单链RNA蛋白质的NP、P及L蛋白质中选择的多种蛋白质；和
(b)培养所述细胞，并从该培养上清回收病毒粒子的步骤。
(17)一种制备用于在靶细胞中表达外源基因的载体的方法，包含下述(a)和(b)的步骤：
(a)将编码源自副粘病毒科病毒的(-)链单链RNA或其互补链的DNA导入到能表达NP、P及L蛋白质的细胞中的步骤，该(-)链单链RNA被修饰为携带外源基因，且不表达从NP、P及L蛋白质中选择的、至少包括L蛋白质在内的一种或多种蛋白质；和
(b)培养所述细胞，并从该培养上清回收病毒粒子的步骤。
(18)一种制备用于在靶细胞中表达外源基因的载体的方法，包含下述(a)和(b)的步骤：
(a)将编码源自副粘病毒科病毒的(-)链单链RNA或其互补链的DNA导入到能表达NP、P及L蛋白质的细胞中的步骤，该(-)链单链RNA被修饰为携带外源基因，且不表达从NP、P及L蛋白质中选择的多种蛋白质；和
(b)培养所述细胞，并从该培养上清回收病毒粒子的步骤。
(19)在靶细胞中表达外源基因的方法，包含下述(a)和(b)的步骤：
(a)制备(7)所述载体的步骤；和
(b)将(7)所述载体导入靶细胞的步骤。
发明的实施方案
本发明提供一种利用副粘病毒科病毒的新的非复制型载体。
本发明所述的副粘病毒是指属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)的病毒，或其衍生物。副粘病毒科是一组以非分节的负链RNA为其基因组的病毒之一，包括副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)(包括呼吸道病毒属(Respirovirus)(也称为副粘病毒属(Paramyxovirus)、腮腺炎病毒属(Rubulavirus)和麻疹病毒属(Morbillivirus))以及肺病毒亚科(Pneumovirinae)(包括肺病毒属(Pneumovirus)和间质性肺病毒属(Metapneumovirus))。副粘病毒科病毒所包含的病毒具体有仙台病毒(Sendai virus)、新城疫病毒(Newcastle disease virus)、腮腺炎病毒(Mumps virus)、麻疹病毒(Measles virus)、呼吸道合胞病毒(RS病毒)(Respiratory syncytial virus)、牛瘟病毒(rinderpest virus)、瘟热病毒(distempervirus)、猴副流感病毒(SV5)和人副流感病毒1，2，3型等等。更具体地说，包括仙台病毒(SeV)、人副流感病毒(HPIV-1)、人副流感病毒-3(HPIV-3)、猪瘟热病毒(phocine distemper virus)(PDV)、犬瘟热病毒(CDV)、海豚麻疹病毒(dolphin molbillivirus)(DMV)、小反刍动物瘟病毒(peste-des-petits-ruminantsvirus)(PDPR)、麻疹病毒(MV)、牛瘟病毒(RPV)、Hendra病毒(Hendra)、Nipah病毒(Nipah)、人副流感病毒-2(HPIV-2)、猴副流感病毒5(SV5)、人副流感病毒-4a(HPIV-4a)、人副流感病毒-4b(HPIV-4b)、腮腺炎病毒(Mumps)、及新城疫病毒(NDV)等。本发明的病毒优选属于副粘病毒亚科(包括呼吸道病毒属、腮腺炎病毒属和麻疹病毒属)的病毒或其衍生物，更优选属于呼吸道病毒属(genus Respirovirus)(也称副粘病毒属(Paramyxovirus)的病毒或其衍生物。衍生物包含以不破坏病毒基因导入能力的方式改变了病毒基因的病毒以及化学修饰的病毒等。本发明适用的呼吸道病毒属的病毒包括人副流感病毒1型(HPIV-1)、人副流感病毒3型(HPIV-3)、牛副流感病毒3型(BPIV-3)、仙台病毒(Sendai virus，也称鼠副流感病毒1型)、麻疹病毒、猴副流感病毒(SV5)及猴副流感病毒10型(SPIV-10)等。本发明中的副粘病毒最优选仙台病毒。
副粘病毒一般包含包膜内部的RNA和蛋白质构成的复合体(核糖核蛋白体；RNP)。RNP中所含的RNA是副粘病毒的基因组(-)链(负链)单链RNA。该单链RNA与NP、P及L蛋白质结合，形成RNP。该RNP中所含的RNA成为病毒基因组转录及复制的模板(Lamb，R.A.和D.Kolakofsky，1996，Paramyxoviridae：The Viruses and their replication.pp.1177-1204.《Fields Virology》，3rd edn.Fields，B.N.，D.M.Knipe和P.M.Howley等人(ed.)，Raven Press，New York，N.Y.)。
副粘病毒的“NP、P、M、F、HN及L基因”分别指核壳、磷(phospho)、基质(matrix)、融合(fusion)、血凝素-神经氨酸酶及编码大(large)蛋白质的基因。核壳(NP)蛋白结合于基因组RNA，是基因组RNA产生模板活性不可缺少的蛋白质。NP基因一般也表示为“N基因”。磷(P)蛋白质是RNA聚合酶的小亚单位磷酸化蛋白质。基质(M)蛋白质具有从内侧维持病毒粒子结构的机能。融合(F)蛋白质是关系到渗入宿主细胞的膜融合蛋白质，血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白质是关系到宿主细胞结合的蛋白质。大(L)蛋白质是RNA聚合酶的大亚单位。上述各种基因各自持有转录调节单位，由各基因转录单独的mRNA和蛋白质。除P蛋白质以外，从P基因还翻译出(C)非结构蛋白质和(V)蛋白质，(C)非结构蛋白质利用不同的ORF翻译而成，(V)蛋白质通过读取P蛋白质mRNA过程中的RNA编辑而成。属于副粘病毒亚科的各种病毒中的各基因从3′起一般表示如下：
呼吸道病毒NP/C/V M F HN-L
腮腺炎病毒NP/V    M FHN(SH)L
麻疹病毒  NP/C/V  M F H-L
例如，仙台病毒的每个基因的碱基序列的数据库登录号分别为：N基因为M29343，M30202，M30203，M30204，M51331，M55565，M69046，X17218，P基因为M30202，M30203，M30204，M55565，M69046，X00583，X17007，X17008，M基因为D11446，K02742，M30202，M30203，M30204，M69046，U31956，X00584，X53056，F基因为D00152，D11446，D17334，D17335，M30202，M30203，M30204，M69046，X00152，X02131，HN基因为D26475，M12397，M30202，M30203，M30204，M69046，X00586，X02808，X56131，L基因为D00053，M30202，M30203，M30204，M69040，X00587，X58886。可以列举的其他病毒编码的病毒基因有：N基因为CDV，AF014953；DMV，X75961；HPIV-1，D01070；HPIV-2，M55320；HPIV-3，D10025；Mapuera，X85128；Mumps，D86172；MV，K01711；NDV，AF064091；PDPR，X74443；PDV，X75717；RPV，X68311；SeV，X00087；SV5，M81442；及Tupaia，AF079780，P基因为CDV，X51869；DMV，Z47758；HPIV-1，M74081；HPIV-3，X04721；HPIV-4a，M55975；HPIV-4b，M55976；Mumps，D86173；MV，M89920；NDV，M20302；PDV，X75960；RPV，X68311；SeV，M30202；SV5，AF052755；及Tupaia，AF079780，C基因为CDV，AF014953；DMV，Z47758；HPIV-1.M74081；HPIV-3，D00047；MV，ABO16162；RPV，X68311；SeV，AB005796；及Tupaia，AF079780，M基因为CDV，M12669；DMV Z30087；HPIV-1，S38067；HPIV-2，M62734；HPIV-3，D00130；HPIV-4a，D10241；HPIV-4b，D10242；Mumps，D86171；MV，AB012948；NDV，AF089819；PDPR，Z47977；PDV，X75717；RPV，M34018；SeV，U31956；及SV5，M32248，F基因为CDV，M21849；DMV，AJ224704；HPN-1，M22347；HPIV-2，M60182；HPIV-3，X05303，HPIV-4a，D49821；HPIV-4b，D49822；Mumps，D86169；MV，AB003178；NDV，AF048763；PDPR，Z37017；PDV，AJ224706；RPV，M21514；SeV，D17334；及SV5，AB021962，HN(H和G)基因为CDV，AF112189；DMV，AJ224705；HPIV-1，U709498；HPIV-2.D000865；HPIV-3，AB012132；HPIV-4A，M34033；HPIV-4B，AB006954；Mumps，X99040；MV，K01711；NDV，AF204872；PDPR，X74443；PDV，Z36979；RPV，AF132934；SeV，U06433；及SV-5，S76876，L基因为CDV，AF014953；DMV，AJ608288；HPIV-1，AF117818；HPIV-2，X57559；HPIV-3，AB012132；Mumps，AB040874；MV，K01711；NDV，AY049766；PDPR，AJ849636；PDV，Y09630；RPV，Z30698；及SV-5，D13868。但是，已知每种基因有多种不同的毒株，除上述序列以外，还存在着其他序列的基因。
本发明的非复制型载体(以下称“本发明的载体”)中(-)链单链RNA被修饰为不表达结合(-)链单链RNA的蛋白质的一部分或全部，从而丧失自我复制能力。本发明所述结合(-)链单链RNA的蛋白质是指能直接及/或间接结合该(-)链单链RNA，与该(-)链单链RNA构成复合体的蛋白质。本发明的复合体包括这样的复合体，其包含源自副粘病毒的(-)链单链RNA及结合该(-)链单链RNA的源自副粘病毒的蛋白质(NP、P、及L蛋白质)。本发明中所述“源自副粘病毒”意为副粘病毒的组分(包括蛋白质、RNA)保留原有状态，或处于被部分修饰的状态。例如，通过修饰副粘病毒的蛋白质或RNA而制备的蛋白质或RNA是“源自副粘病毒”的蛋白质或RNA。本发明载体只要具有上述特征，则种类不限。例如，本发明的载体可以是具有包膜蛋白质(F、HN、M蛋白质)等、采取病毒粒子结构的病毒载体，也可以是没有病毒包膜的RNP本身的RNP载体。
副粘病毒科病毒中的NP、P、L蛋白质结合(-)链单链RNA，在基因组RNA复制及蛋白质表达中发挥着不可缺少的作用(以下有时将NP、P、L蛋白质也称为“基因组RNA结合蛋白质”)。NP蛋白质非常牢固地结合基因组RNA，是赋予基因组RNA模板活性的蛋白质。基因组RNA只有在与NP蛋白质结合的状态下才具有RNA合成的模板活性，在不结合于NP蛋白质的状态下，则完全没有模板活性。P蛋白质作为RNA聚合酶的小亚单位，L蛋白质作为RNA聚合酶的大亚单位，结合基因组RNA。所以，在副粘病毒科病毒中，NP、P、L蛋白质缺一不可，否则不会产生基因组RNA复制。
本发明的载体的第一个实施方案的特征是含有这样的复合体，其包含(a)源自副粘病毒科病毒的(-)链单链RNA，其被修饰为不表达从结合副粘病毒科病毒(-)链单链RNA的NP、P及L蛋白质中选择的、至少包含L蛋白质在内的一种以上的蛋白质；和(b)NP、P及L蛋白质。本发明的载体是一种含有复合体(RNP)的病毒粒子，所述复合体包含被修饰的(-)链单链RNA(基因组RNA)和NP、P、L蛋白质。在第一个实施方案中，本发明的载体所包含的(-)链单链RNA被修饰为至少不表达L蛋白质。本发明的载体感染宿主后，在本发明载体所包含的NP、P、L蛋白质的作用下，从基因组RNA所编码的基因中表达蛋白质。然而，包含L蛋白质在内的基因组结合蛋白基因由于未被编码到本发明载体的基因组RNA中而不表达，所以，不能形成自我复制病毒粒子(包含基因组RNA和NP、P、L蛋白质的粒子)。即，本发明的载体为非复制型病毒载体。将携带外源基因的本发明的载体感染宿主时，外源基因在宿主细胞内进行表达，但不会从本发明载体产生具有自我复制能力的病毒粒子。
所以从没有自我复制能力这一点，可以说本发明载体具有很高的安全性。如果只是使其缺失自我复制能力，可将破坏NP、P、L蛋白质机能的突变导入基因组RNA中的NP、P、L基因，即可达到目的。但是，本发明载体的意义不在于将突变导入基因来表达缺失功能的蛋白质，而是去除蛋白质表达本身。即，从降低免疫原性这一点看，本发明载体是比单纯非复制型载体更为安全性的载体。从这一观点来说，本发明载体中包含的基因组RNA可以只缺失L基因，优选缺失L基因及NP或P基因，最优选缺失所有的NP、P、L基因。
在RNA结合蛋白质基因中尤其是L基因在基因组上缺失，从这一点看，本发明载体的优点如下。由于L基因约占基因组RNA长度的一半，所以，本发明载体的基因组RNA缺失L基因后可大幅度缩短基因组的长度。因此，第一个优点为，与缺失其它基因比，本发明载体能携带更长的外源基因。第二个优点为，基因组变短后，可期待提高转录效率、增加表达量。尤其是用非复制型病毒载体表达外源基因时，不能期待通过病毒载体的自我复制来增加外源基因表达量，因此，为确保蛋白质的高表达量，高转录效率尤为重要。
本发明载体的第二个实施方案的特征为包含这样的复合体，其包含(a)源自副粘病毒科病毒的(-)链单链RNA，其被修饰为不表达从结合副粘病毒科病毒(-)链单链RNA的蛋白质中选择的多种蛋白质；和(b)NP、P及L蛋白质。作为第二个实施方案的病毒载体基因组RNA的范例之一，可以列举的是修饰为编码L基因但不编码NP和P基因的基因组RNA，但并不限于此，修饰为不表达2种或3种基因组RNA结合蛋白质的基因组RNA均包括在内。缺失多种基因比只缺失NP或P中任一基因更能降低来源于病毒的蛋白量。此外，由于基因组RNA的长度进一步缩短，可携带更长的外源基因。
如上所述，本发明载体的基因组RNA缺失基因组RNA结合蛋白质基因的一部分或全部。在第一个实施方案中，基因组RNA至少缺失L基因，优选缺失L基因和NP基因或L基因和P基因，最优选NP、P、L基因全部缺失；在第二个实施方案中，缺失多种基因组RNA结合蛋白质基因。另一方面，基因组RNA所编码的基因可以保持病毒来源的原有基因序列，也可导入其它突变。例如，本领域技术人员可采用已知方法将不破坏各蛋白质机能的轻微突变导入到基因组RNA上的各基因中。例如，利用PCR法及盒式突变法等导入位点特异性突变，用化学试剂及随机核苷酸等导入随机突变。本领域技术人员可以适当选择上述严格的杂交条件。例如，在含有25％甲酰胺、较严格的条件为50％甲酰胺、4×SSC、50mM Hepes pH7.0、10×denhardts溶液、20μg/ml变性鲑精DNA的杂交溶液中，42℃下预杂交过夜后，42℃下过夜杂交。之后在“1xSSC、0.1％SDS、37℃”左右的洗涤液及温度条件下清洗，较严格条件为“0.5xSSC、0.1％SDS、42℃”，更严格条件为“0.2xSSC、0.1％SDS、65℃”。一般情况下，利用这种杂交技术单离的多核苷酸编码的多肽与上述(-)链RNA编码的多肽在氨基酸序列上具有高的同源性。所谓高同源性是指至少40％以上，优选60％以上，更优选80％以上，更优选90％以上，更优选至少95％以上，最优选至少97％以上(例如，98-99％)的序列的同源性。关于氨基酸序列的同一性，例如可以根据Karlin和Altschul的BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268，1990、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877，1993)来确定。用根据这种算法开发的BLASTX(Altschul等.J.Mol.Biol.215：403-410，1990)解析氨基酸序列时，参数可为例如分数(score)＝50、字长(wordlength)＝3。使用BLAST和GappedBLAST程序时，可使用各程序的默认参数。这些具体的解析方法是众所周知的(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
已知在P基因中导入突变，可降低副粘病毒载体的细胞毒性。本发明载体的基因组RNA编码P基因时，也可在基因组上的RNA基因中导入该突变。举例来说，这种突变具体有SeV P蛋白质的第511位的Leu(L511)置换为其它氨基酸，或者是其它(-)链RNA病毒P蛋白质的同源位点的置换。氨基酸突变也可以是置换为所需的其它氨基酸，优选置换为侧链的化学性质不同的氨基酸。例如，氨基酸可分类为碱性氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(如天冬酰胺、谷氨酸)、非带电极性氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)及芳香族氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)等组群，某种氨基酸可以置换为该氨基酸所属组群以外的氨基酸。具体的说，碱性氨基酸可以置换为酸性或中性氨基酸，极性氨基酸可以置换为非极性氨基酸，分子量大于20种天然氨基酸平均分子量的氨基酸可以置换为小于其平均分子量的氨基酸，反之，小于平均分子量的氨基酸可以置换为比其大的氨基酸，但不限于此。具体来说，例如L511置换为Phe(L511F)等。
本发明载体中包含的基因组RNA可编码所有的包膜蛋白基因，也可不编码包膜蛋白基因的一部分或全部。由于被修饰为既不表达基因组RNA结合蛋白质基因，也不表达包膜蛋白质基因，所以，可进一步改善体内给药载体时的免疫原性。基因组RNA所编码的包膜蛋白基因(M、F、HN基因)可以是野生型，也可导入温度敏感性突变。包膜蛋白的温度敏感性突变详述于WO2003/025570。
本发明载体中包含的基因组RNA中至少缺失L基因，或者缺失多种基因组RNA结合蛋白基因，在NP、P、及L蛋白质存在的情况下，可以使该基因组RNA(正链或负链)进行转录，由此制备本发明的RNP。可以在BHK-21或LLC-MK2细胞等中完成RNP的形成。只要不是由病毒载体提供，可通过各种方法提供NP、P、L蛋白质。例如，可以通过将编码各基因的表达载体导入到细胞来供给蛋白质(参照实施例)。各基因还可整合到宿主细胞的染色体中。为形成RNP而表达的NP、P、L基因不需要与载体基因组所编码的NP、P、L基因完全同一。即，这些基因编码的蛋白质的氨基酸序列即使不与RNP基因组编码的蛋白质氨基酸序列完全一致，只要与基因组RNA结合，并在细胞内具有基因组转录复制活性，也可导入突变或用其它病毒的同源基因代替。
在细胞内重建载体时，如果NP、P及L蛋白质在细胞内表达，则这些蛋白质被整合到病毒载体中，可生产携带感染性的病毒载体。这样的载体一旦感染细胞，即使可以通过细胞内RNP由基因组RNA表达蛋白，但由于其本身没有L基因，所以不能再次生产具有与原来相同的复制能力的病毒。尤其在基因治疗等中，这种载体对需要尽量减轻载体影响的对象疾患或应用领域非常有用。
重建本发明病毒载体通常可使用下述制备方法：(a)将编码源自副粘病毒的(-)链单链RNA(其被修饰为不表达从副粘病毒的NP、P及L蛋白质中选择的、包含L蛋白质在内的一种或多种蛋白质)或其互补链的载体DNA导入到表达结合该(-)链单链RNA的、源自副粘病毒的蛋白质的细胞(辅助细胞)并使其表达；(b)培养该细胞，并从其培养上清回收病毒粒子。在上述(a)步骤中，也可以采用“编码修饰为不表达从NP、P、L蛋白质中选择的多种蛋白质的、源于副粘病毒科病毒的(-)链单链RNA或其互补链的DNA”。表达载体DNA时，通过共表达NP、L、及P蛋白质而形成RNP，从而构建本发明的病毒。
在辅助细胞内表达的载体cDNA编码本发明载体中包含的(-)链单链RNA(负链)或其互补链(正链)。例如，将编码(-)链单链RNA或其互补链的DNA连结到T7启动子的下游，通过T7RNA聚合酶转录为RNA。载体cDNA也可克隆到质粒中，使其可以在大肠杆菌(Escherichia coli)中扩增。在细胞内转录的链，可以是病毒的正链或负链，但为了提高重建效率，优选使得正链转录。例如，本发明实施例载体cDNA设计为正链转录(序列号3)。
辅助细胞使用表达NP、L及P蛋白质的细胞。辅助细胞并不限定于表达病毒载体中缺失蛋白质(NP、L、P)的细胞，也可以是表达与该病毒载体缺失的基因所编码的基因组RNA结合蛋白质不同的基因组RNA结合蛋白质的细胞。例如，只要基因组RNA可以复制、转录，也可使用其它副粘病毒的基因组RNA结合蛋白质。
只要不通过病毒载体，这些基因可以利用各种方法在辅助细胞内表达。例如，可以将表达缺失L基因或包含L基因在内的多个基因的重组仙台病毒载体基因组的质粒，与NP、P/C及L蛋白质的表达载体一起转染到宿主细胞，重建病毒载体。例如，可以使用L基因整合到染色体的宿主细胞进行重建。由病毒基因组以外供给的这些蛋白质群组的氨基酸序列即使和病毒原有序列不完全一致，只要在核酸导入中的活性与天然型相同或超过天然型，则可以导入突变，或用其它病毒的同源基因代替。
辅助细胞还可以是具有促进病毒粒子形成和释放功能的蛋白质。例如，可以是表达C蛋白质的细胞。若采用C蛋白质，为了提高本发明病毒载体的生产效率，优选在辅助细胞中对C蛋白质进行表达。仙台病毒的C蛋白质有4种，即C’、C、Y1、Y2，它们在同一个读码框上分别通过不同的起始密码子翻译。对于重建本发明的病毒载体时在辅助细胞中表达的C蛋白质，只要上述4种蛋白质中的任何一种或多种蛋白进行表达即可。作为用于重建本发明病毒载体的细胞，优选C’、C、Y1、Y2的4种蛋白全部表达的辅助细胞。本发明的病毒载体从基因组RNA中去除了P基因时，也会去除与P基因读码框不同的C基因。基因组RNA上缺失C基因时，可以将编码C基因的表达载体导入到辅助细胞，使C基因在辅助细胞内表达。不过，作为在辅助细胞中表达C蛋白质的方法，已知C蛋白质的持续表达细胞株中载体基因组的复制受到抑制(Kato A等人，J Virol.78，7443-54(2004))，可能难以提供持续表达，具体可参照后述的实施例。
如果形成RNP或病毒，将该RNP或病毒再次导入到上述辅助细胞进行培养，可以扩增本发明的载体。这个过程包含如下步骤，(a)将包含源自副粘病毒的(-)链单链RNA和结合该(-)链单链RNA的蛋白质的复合体导入到表达包膜蛋白质的细胞的步骤，该(-)链单链RNA被修饰为不表达从结合副粘病毒科病毒(-)链单链RNA的NP、P、L蛋白质中选择的、至少包括L蛋白质在内的一种以上的蛋白质；和(b)培养该细胞，并从其培养上清回收病毒粒子。或者包含如下步骤，(a)将包含源自副粘病毒的(-)链单链RNA和结合该(-)链单链RNA的蛋白质的复合体导入到NP、P、L蛋白质及包膜蛋白质的表达细胞，该(-)链单链RNA被修饰为不表达从结合副粘病毒科病毒(-)链单链RNA的NP、P及L蛋白质中选择的多种蛋白质；和(b)培养该细胞，并从其培养上清回收病毒粒子。
为了将RNP导入到细胞，例如，可以与脂转染胺(lipofectamine)、聚阳离子脂质体(polycationic liposome)等形成复合体，然后导入到细胞。具体可以使用各种转染试剂。例如，DOTMA(Boehringer)、Superfect(QIAGEN#301305)、DOTAP、DOPE、DOSPER(Boehringer#1811169)、Lipofectamine2000(Invitrogen)等等。为了防止在内体中降解，还可加入氯喹(Calos，M.P.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：3015)
包膜蛋白除病毒包膜蛋白外，例如可以使用嵌合蛋白等，其细胞外区域携带能够粘附于特定细胞的源自粘附因子、配体、受体等的多肽、细胞内区域携带源自病毒包膜的多肽。由此能够制备以特定组织为靶标的载体。例如，为了降低免疫原性或提高RNA转录效率及复制效率，本发明的病毒载体中所含的病毒基因可以是修饰后的病毒基因。
本发明的载体在(-)链单链RNA中可包含编码外源基因的RNA。外源基因可使用期望在靶细胞中表达的所需基因。例如，以基因治疗等为目的时，可将对象疾患的治疗用基因插入到该病毒载体基因中。向病毒载体基因导入外源基因时，例如，导入仙台病毒载体基因中时，有必要考虑在转录起始(S)序列和转录终止(E)序列之间等插入序列，使基因组的总碱基数为6的倍数(Journal of Virology，Vol.67，No.8，1993，p.4822-4830)。外源基因可插到病毒各基因的前面或后面(参照实施例)。为避免妨碍前后基因的表达，在外源基因前面或后面适当插入E-I-S序列(转录起始序列-插入序列-转录终止序列)或其部分。对于插入的外源基因的表达量，可通过附加在外源基因上游的转录起始序列的种类来调节，也可通过基因插入位置及基因前后的碱基序列进行调节。例如，仙台病毒中的插入位置越靠近(-)链RNA的3′端(从野生型病毒基因组的基因排布上说，为越靠近NP基因)，所插入的基因的表达量越高。为提高外源基因的表达效率，优选将外源基因插入负链基因组的上游区域(负链3′侧)。反之，插入位置越靠近负链RNA的5′端(从野生型病毒基因组的基因排布上说，为越靠近L基因)，所插入基因的表达量越低。为了控制外源基因低表达，例如，将外源基因插到负链的最靠近5′侧，即野生型病毒基因组的L基因下游(负链中L基因的5′邻接部位)或L基因的上游(负链中L基因的3′邻接部位)。另外，也可将一个或多个基因组启动子与外源基因一起插入。本发明中的基因组启动子没有特别限制，例如采用RNA聚合酶I启动子。将细胞内表达RNA聚合酶I的细胞作为生产细胞时，不需要由外源载体供给RNA聚合酶I，可节省其供给成本。由此，可与T7系同样实现基因的高表达效率。为便于外源基因的插入，可在插入部位设计克隆位点。克隆位点可作为例如限制酶的识别序列。可将外源基因片段插入编码基因组的载体DNA的该限制酶部位。克隆位点也可作为有多个限制酶识别序列的所谓多克隆位点。这样，本发明的载体可以携带外源基因。
携带外源基因的重组仙台病毒载体，例如可依Kato，A等人，1997，EMBO J.16：578-587及Yu，D.等人，1997，Genes Cells 2：457-466的记载，采用如下方法构建。
首先，制备包含所需外源基因的cDNA碱基序列的DNA试液。所述DNA试液优选在至少25ng/μl的浓度下可以通过电泳确认为单一质粒。下面以利用NotI位点将外源基因插入编码病毒基因组的DNA为例进行说明。如果目的cDNA碱基序列包含NotI识别位点，则优选采用位点特异性突变插入法等，修饰碱基序列而除去该NotI识别位点，但维持所编码的氨基酸序列不变。采用PCR方法，从所述DNA试液中扩增回收所需基因片段。作为包含NotI限制性酶切位点序列、转录终止序列(E)、插入序列(I)和转录起始序列(S)以及部分目的基因序列的引物对，设计正向合成DNA序列(有义链)和反向合成DNA序列(反义链)，使扩增片段的两个末端都带有NotI位点，并在其一个末端添加仙台病毒转录终止序列(E)、插入序列(I)和转录起始序列(S)(EIS序列)的拷贝。
例如，正向合成DNA序列中，为保证用NotI切断，在其5′-侧选择2个或更多个任意核苷酸(优选4个碱基，但不包括源自NotI识别位点的GCG和GCC等序列；更优选ACTT)，在其3′-侧添加NotI识别位点gcggccgc，再在其3′-侧添加任意9个碱基或9加6的倍数个碱基作为间隔序列，再在其3′-侧附加所需cDNA的ORF的约25个碱基的相应序列(从起始密码子ATG开始，含其在内)。为了使最后一个碱基以G或者C结束，优选从所需cDNA选择约25个碱基，以此作为正向合成寡DNA的3′-末端。
反向合成DNA序列中，从5′-端选择2个或更多个任意核苷酸(优选4个碱基，但不包含源自NotI识别位点的GCG、GCC等序列，更优选ACTT)，在其3′-侧添加NotI识别位点gcggccgc，再在其3′-侧添加用于调节长度的插入片段寡DNA。设计这些寡DNA的长度时，其碱基数应使仙台病毒基因组的碱基总数为6的倍数(所谓“6位规则(rule of six)”；Kolakofski，D.等人，J.Virol.72：891-899，1998)。进而，在插入片段的3′-侧添加仙台病毒的S序列的互补链序列，优选5′-CTTTCACCCT-3′(序列号8)；I序列，更优选5′-AAG-3′；E序列的互补链序列，更优选5′-TTTTTCTTACTACGG-3′(序列号9)，再在其3′-侧添加所需cDNA序列从终止密码子起倒数约25个碱基的互补链，并选择其长度使得最后一个碱基为G或C，以此作为反向合成寡DNA的3′-末端。
PCR可采用ExTaq聚合酶(宝酒造)的常规方法。优选使用Vent聚合酶(NEB)，扩增的所需片段用NotI消化后，插入质粒载体pBluescript的NotI位点。用测序仪确认所得PCR产物的碱基序列，选出正确序列的质粒。用NotI从该质粒切割插入片段，克隆到包含缺失包膜基因的基因组cDNA的质粒的NotI位点。不经过质粒载体pBluescript的介导，直接插入NotI位点，便可得到重组仙台病毒cDNA。
可将本发明的病毒载体cDNA在试管内或细胞内转录，使其与另行表达的L、P、NP蛋白质相结合，重建RNP，生成包含该RNP的病毒载体。从编码修饰为不表达部分病毒来源蛋白的(-)链单链RNA或其互补链的病毒载体cDNA中重建病毒粒子，可参考已知方法予以实施(WO97/16539号；WO97/16538号；Durbin，A.P.等人，1997，Virology 235：323-332；Whelan，S.P.等人，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：8388-8392；Schnell.M.J.等人，1994，EMBO J.13：4195-4203；Radecke，F.等人，1995，EMBO J.14：5773-5784；Lawson，N.D.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：4477-4481；Garcin，D.等人，1995，EMBO J.14：6087-6094；Kato，A.等人，1996，Genes Cells 1：569-579；Baron，M.D.和Barrett，T.，1997，J.Virol.71：1265-1271；Bridgen，A.和Elliott，R.M.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：15400-15404)。特别是改良后的方法更能有效地发挥作用(WO2005/071092)。对于本发明的病毒载体cDNA所缺失的基因，可另行将该缺失的基因导入宿主细胞并使其表达。如果利用本发明的病毒载体cDNA或被其它表达载体编码的基因构建RNP，表达包膜蛋白、重建病毒粒子，则可维持该病毒粒子的感染性。
另外，将RNP复合体本身作为RNA载体导入细胞时，也可利用上述方法，与脂转染胺及聚阳离子脂质体一起形成复合体，导入细胞。
将病毒载体cDNA导入细胞的方法有，(i)制备可被目的细胞摄入的DNA沉淀的方法；(ii)制备复合体的方法，所述复合体适于被目的细胞摄入，且包含具有较低细胞毒性的正电特性的DNA；(iii)利用电脉冲在目的细胞膜上瞬时开孔的方法，孔的大小仅足以使DNA分子通过。
方法(ii)可以使用各种转染试剂，例如DOTMA(Boehringer)、Superfect(QIAGEN#301305)、DOTAP、DOPE、DOSPER(Boehringer#1811169)、Lipofectamine 2000(Invitrogen)等。方法(i)可以用磷酸钙进行转染，用这种方法导入细胞的DNA被吞噬体摄入，但已知细胞核中能够摄入足量的DNA(Graham，F.L.和Van Der Eb，J.，1973，Virology 52：456；Wigler，M.和Silverstein，S.，1977，Cell 11：223)。Chen和Okayama研究了导入技术的最佳条件，他们的报告称：(1)细胞和共沉淀物的温育条件为：2～4％CO₂，35℃，15～24hr；(2)环状DNA比线性DNA活性更高；(3)当沉淀混合液中的DNA浓度为20～30μg/ml时，可形成最佳沉淀(Chen，C.和Okayama，H.，1987，Mol.Cell.Biol.7：2745)。方法(ii)适于瞬时转染。已知更早的方法是按所需的DNA浓度比配制DEAE-葡聚糖(Sigma#D-9885M.W.5×105)混合液进行转染。由于大多数复合体在内体中降解，可以加入氯喹来提高转染效力(Calos，M.P.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：3015)。方法(iii)被称为电穿孔方法，由于没有细胞选择性，它比方法(i)和(ii)应用更广。据称在最佳的脉冲电流持续时间、脉冲形式、电场强度(电极间的差、电压)、缓冲液的导电率、DNA浓度和细胞密度的条件下，效率较好。
在上述三种方法中，方法(ii)操作简单，并且能用大量的细胞检测多个样品。适用于本发明的转染试剂有Lipofectamine 2000(Invitrogen)、Superfect Transfection Ragent(QIAGEN，Cat No.301305)、DOSPERLiposomal Transfection Reagent(Boehringer Mannheim，Cat No.1811169)。
回收的病毒的滴度可通过测定CIU(Cell-Infected Unit：细胞感染单位)或红细胞凝集活性(HA)来确定(WO00/70070；Kato，A.等人，1996，GenesCells 1：569-579；Yonemitsu，Y.&Kaneda，Y.，Hemaggulutinating virus ofJapan-liposome-mediated gene delivery to vascular cells.Ed.by Baker AH.Molecular Biology of Vascular Diseases.Method in Molecular Medicine：Humana Press：pp.295-306，1999)。关于携带GFP(绿色荧光蛋白)等标记基因的载体，可以将所述标记作为指标，直接计数受感染的细胞来定量滴度(例如，GFP-CIU)。如此测定的滴度可与CIU进行等同处理(WO 00/70070)。
回收的病毒载体可以纯化至基本纯。纯化方法可利用过滤、离心分离和柱纯化等公认的纯化分离方法或上述方法的组合方法。“基本纯”是指病毒载体在其样品中占主要成分。一般来说，当样品中所含的全部蛋白(作为承运体和稳定剂加入的蛋白除外)中，源自病毒载体的蛋白比例为10％以上，优选20％以上，更优选50％以上，更优选70％以上，更优选80％以上，进一步优选90％以上时，可以确认为基本纯的病毒载体。副粘病毒的具体纯化方法包括，例如，采用纤维素硫酸酯或交联多糖硫酸酯的方法(特公昭JP62-30752、特公昭JP62-33879和特公昭JP62-30753)以及吸附于含有硫酸岩藻糖的多糖及/或其分解产物上的方法(WO 97/32010)。
本发明的载体为L蛋白质等不表达的非复制型载体，整体来说可大幅度降低病毒源蛋白质的表达，是具有很高安全性的载体。尤其在用于基因治疗时，载体的免疫原性越高，越限制载体的反复给药，而本发明的载体为低免疫原性，可期待扩大病毒载体基因治疗的应用范围。
本发明的载体可以根据需要制备成组合物。在制备包含载体的组合物时，可根据需要将该载体与药学上可接受的承运体或赋形剂组合使用。“药学上可接受的承运体或赋形剂”是指可以与本发明载体一起给药，不明显抑制该载体的基因导入活性的材料。例如，可以用生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)等适当稀释该载体，制成组合物。包含载体的组合物可以含有去离子水和5％葡萄糖水溶液等承运体或赋形剂。除此以外，还可以含有植物油、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂和杀生物剂等。另外，可以添加防腐剂或其它添加剂。包含本发明载体的组合物可以用作试剂或药物。
如果使用疾患治疗用基因作为外源基因来制备载体，可给药该载体，进行基因治疗。本发明的病毒载体用于基因治疗时，无论使用直接给药、间接(回体(ex vivo))给药的任一基因表达方法，都可以表达有望获得治疗效果的外源基因或患者体内供给不足的内在基因等。对外源基因没有特别限制，除编码蛋白质的核酸外，例如，也可以是反义链或核酶等不编码蛋白质的核酸。
如果使用编码感染相关的细菌或病毒抗原的基因作为外源基因，可给药到动物，诱导该动物体内的免疫，即用作疫苗。
用作疫苗时，本发明的载体可适用于肿瘤、感染及其它的一般疾患。例如，在治疗肿瘤时，本发明的载体可用于肿瘤细胞或DC细胞等抗原提示细胞(APC)，以使具有疗效的基因进行表达。这样的基因有癌抗原Muc-1或Muc-1样粘蛋白串联重复肽链(美国专利第5,744,144号)、黑素瘤gp100抗原等。这些基因治疗可广泛应用到乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌等。还可以与细胞因子类组合，提高佐剂效果。例如，i)IL-2和单链IL-12的组合(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(15)：8591-8596，1999)；ii)IL-2和干扰素-γ(美国专利第5,798,100号)；iii)单独使用的粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)；iv)以脑肿瘤为治疗对象的GM-CSF和IL-4的组合(J.Neurosurgery 90(6)，1115-1124(1999))等。
在感染的治疗上，用于流感治疗的有例如强毒株H5N1型包膜；用于日本脑炎治疗的有例如包膜嵌合体(Vaccine，vol.17，No.15-16，1869-1882(1999))；用于艾滋病治疗的有例如HIV gag或SIV gag蛋白质(J.Immunology(2000)vol.164，4968-4978)；口服HIV包膜蛋白的免疫接种治疗，包封在聚乳酸-甘醇共聚物后给药(Kaneko，H.等人，Virology 267：8-16(2000))；用于霍乱治疗的有霍乱毒素B亚单位(CTB)(Arakawa T，等人，NatureBiotechnology(1998)16(10)：934-8、Arakawa T，等人，Nature Biotechnology(1998)16(3)：292-7)；用于狂犬病治疗的有狂犬病病毒的糖蛋白(Lodmell DL等人，1998，Nature Medicine 4(8)：949-52)；用于宫颈癌治疗的有人类乳头瘤病毒6型的衣壳蛋白L1(J.Med.Virol，60，200-204(2000))等。
载体的给药量视疾病、患者的体重、年龄、性别、症状、给药目的、给药组合物的形态、给药方法和导入基因类型等而异，如果是本领域技术人员，可以适当决定。给药途径可以适当选择，例如经皮、鼻腔内、经支气管、肌肉内、腹腔内、静脉内、关节内、脊髓腔内及皮下给药，但不限于此。鼻腔内给药为优选给药途径之一。也可局部给药或全身给药。给药载体优选约10⁵CIU/ml-约10¹¹CIU/ml的范围内的给药量，更优选约10⁷CIU/ml-约10⁹CIU/ml，最优选约1×10⁸CIU/ml-约5×10⁸CIU/ml，并在药学上可接受的承运体中给药。对人的一次给药量优选2×10⁵CIU～2×10¹⁰CIU，给药次数可为一次给药，或者视其临床上可容许副作用的范围而多次给药。1日给药次数也可依此调整。如果是使用本发明载体制备的蛋白质制剂，蛋白质的给药量例如可在10ng/kg-100μg/kg的范围内，优选100ng/kg-50μg/kg，更优选1μg/kg-5μg/kg。对人类以外的动物给药时，例如可根据目的动物与人的体重比或给药靶部位的容积比(例如平均值)换算剂量给药。含有本发明载体的组合物的给药对象为包括人、猴、小鼠、大鼠、兔、绵羊、牛和狗等所有的哺乳动物。
本说明书中所引用的现有技术文献作为参考纳入本说明书中。
附图说明
【图1】pMiniSeV/M/F/HN和pMiniSeV/GFP/M/F/HN的构建过程。
【图2】pCI-4C/P(-)的构建过程。
【图3】SeV的C蛋白质对MiniSeV/GFP/M/F/HN生产效率的影响。(A)向导入了pCAGGS-NP(Z)、pCAGGS-P(Z)/4C(-)、pCAGGS-L(TDK)和pCI对照或pCI-4C/P(-)的BHK-21细胞中，感染MiniSeV/GFP/M/F/HN后，第4天生产细胞的GFP荧光照片。(B)将(A)的第4天培养上清感染LLC-MK2细胞后，第3天的GFP荧光照片。
【图4】(A)感染后第1～7天的MiniSeV/GFP/M/F/HN生产效率的GFP照片。(B)第1～7天回收的培养上清的MiniSeV/GFP/M/F/HN滴度的曲线图。
【图5】MiniSeV/GFP/M/F/HN的体外的GFP表达的荧光照片。
【图6】pMiniSeV_SP/GFP和pMiniSeV_SP/萤光素酶的构建过程。
【图7】pMiniSeV_DP/GFP和pMiniSeV_DP/萤光素酶的构建过程。
【图8】基因组启动子对MiniSeV载体表达量的影响。
【图9】MiniSeV_SP/GFP的GFP表达的荧光照片。
实施例
下面通过实施例对本发明进行详细说明，但本发明不限于这些实施例。
〔材料和方法〕
1构建质粒
1.1pMiniSeV/M/F/HN(也可表记为pSeV/ΔNP/ΔP/ΔL)
首先，以pSeV(+18)为模板，采用引物为M/Not I-F(5’-aagtggcggccgcacggcgcaatggcagatatc、33mer(序列号：1))和HN/Sac II-R(5’-ggtaccgcggagcttcgatcgttctgcacgatagggactaattattaagactcggccttgcataatttag、70mer(序列号：2))的PCR方法，得到Not I-M/F/HN-Sac II片段(图1)。然后，将该片段用NotI和SacII处理、纯化后，作为插入片段插到同样用NotI和Sac II处理并去除包括SeV的NP/P/M/F/HN/L序列在内的片段的pSeV(+18)载体中，得到pMiniSeV/M/F/HN(序列号：3)。
1.2pMiniSeV/GFP/M/F/HN(也可表记为pSeV/GFP/ΔNP/ΔP/ΔL)
将pSeV/GFP/ΔF进行Not I处理，对GFP-EIS/Not I片段(序列号：4)进行分离、纯化后，插到同样经Not I处理的pMiniSeV/M/F/HN载体中，得到pMiniSeV/GFP/M/F/HN(图1)。携带其它目的基因(GOI)时，也参照了GFP-EIS/Not I片段的序列。用PCR扩增GOI-EIS/Not I片段，经Not I处理、纯化后，插入到同样用Not I处理的pMiniSeV/M/F/HN载体中，得到pMiniSeV/GOI/M/F/HN。
1.3pCI-4C/P(-)
首先，以pSeV(+18)为模板，采用引物为EcoR I-4C/P(-)-F(5’-acttgaattcacggcttcggctacacttaccgcctggatcaagatgccttcattc、55mer(序列号：5))和EcoR I-4C/P(-)-R(5’-cgaggcggccgcttactcttgcactatgtg、30mer(序列号：6))的PCR方法，得到EcoR I-4C/P(-)-EcoRI片段(序列号：7)(图3)。然后，将该片段用EcoR I处理并纯化后，作为插入序列，插到同样经EcoR I处理、纯化的pCI-neo载体中，得到了pCI-4C/P(-)。
2MiniSeV/GFP/M/F/HN(也表记为SeV/GFP/ΔNP/ΔP/ΔL)的重建
2.1准备
1)细胞：前一天～8e5 BHK-21细胞/孔(6孔板)
2)20％FBS/opti-MEM[目录号31985-070，批号1183337，Invitrogen公司](P&S无添加)
3)opti-MEM(原液)
2.2准备转染液
1)DNA溶液(每孔)
opti-MEM(无添加原液)                    300μl
pCAGGS-NP(Z)，1μg/μl                  0.5μl
pCAGGS-P(Z)/4C(-)，1μg/μl             0.5μl
pCAGGS-L(TDK)，1μg/μl                 2.0μl
pCAGGS-T7，1μg/μl                     1.0μl
pMiniSeV/GFP/M/F/HN cDNA，1μg/μl      5μl
2)LipofectAMINE 2000试剂[目录号11668-019，批号1188609，Invitrogen公司]溶液(每孔)
opti-MEM(无添加原液)                    300μl
LipofectAMINE2000                       18μl
3)准备好LipofectAMINE 2000试剂溶液2)，5分钟后与1)的DNA溶液混合，室温下放置20-30分钟。
2.3用opti-MEM(原液)洗涤一次，添加0.6ml/孔的20％FBS/opti-MEM，然后，将0.5ml/孔的上述转染液加到细胞中。
2.4在37℃下培养6小时后，添加1.2ml/孔的10％FBS/G-MEM。第二天，用VP-SFM洗涤一次后，加入2.5μg/ml胰蛋白酶/VP-SFM进行培养。以后每天更换培养液。回收第4-6天的上清(P0病毒溶液)，感染到生产细胞(P0-P1的病毒传代)中，进行病毒生产。生产细胞使用了前一天导入了pCAGGS-NP(Z)、pCAGGS-P(Z)/4C(-)、pCAGGS-L(TDK)、pCI-4C/P(-)的BHK-21细胞。
3pMiniSeV_SP/GFP和pMiniSeV_SP/萤光素酶的构建
构建了在GFP基因或萤光素酶基因的上游添加一个启动子的pMiniSeV_SP/GFP和pMiniSeV_SP/萤光素酶。
SP：单-启动子的cDNA序列：
5′-accaaacaagagaaaaaacatgtatgggatatgtaatgaagttatacaggattttagggtcaaagtatccaccctgaggagcaggttccagaccct，(96nt)(序列号：20)
如图6-A所示，以市场销售的GFP质粒为模板，采用引物为Not I-GFP-N(5’-agttcacgcggccgcagatcttcacgatggtgagcaagggcgaggagctg，50mer(序列号：10))和GFP-Sac II-C(5’-caggtaccgcggagcttcgatcgttctgcacgatagggactaattacttgtacagctcgtccatg，65mer(序列号：11))的PCR方法，得到Not I-GFP-Sac II片段。然后，将该片段用Not I和Sac II处理、纯化后，作为GFP插入片段，插到同样用Not I和SacII处理并去除了包括SeV的NP、P、L、M、F、HN序列在内的片段的pSeV(TDK)载体中，得到pMiniSeV_SP/GFP(序列号：12)。
另一方面，如图6-B所示，采用引物为Not I-萤光素酶N(5’-atccatcgcggccgcagatcttcacgatggaagacgccaaaaacataaag，50mer(序列号：13))和萤光素酶Sac II-C
(5’-acttactccgcggttcgatcgttctgcacgatagggactaattacacggcgatctttccgcccttc，66mer(序列号：14))的PCR方法，在萤光素酶的两侧添加Not I和Sac II限制酶位点，用其替换pMiniSeV_SP/GFP的Not I-GFP-Sac II序列，得到pMiniSeV_SP/萤光素酶(序列号：15)。
4pMiniSeV_DP/GFP和pMiniSeV_DP/萤光素酶的构建
构建了在GFP基因或萤光素酶基因的上游添加2个启动子的pMiniSeV_DP/GFP和pMiniSeV_DP/萤光素酶。
DP：双-启动子的cDNA序列：
accaaacaagagaaaaaacatgtatgggatatgtaatgaagttatacaggattttagtgtcaaagtaTccaccctgaggagcaggttccagaccct/aaaaaacatgtatgggatatgtaatgaagttatacaggattttagggtcaaagtatccaccctgaggagcaggttccagaccct，(GP58A(96nt)+GPd12(84nt))(序列号：21)
如图7-A所示，以pMiniSeV_SP/GFP为模板，分别采用224N(5’-ataccgcatcaggcgccattcg，22mer(序列号：16))和(GP58A-GPd12)R(5’-gttttttagggtctggaacctgctcctcagggtggatactttgacactaaaatcctg，57mer(序列号：17))为引物进行PCR得到片段，及采用(GP58A-GPd12)F(5’-ggttccagaccctaaaaaacatgtatgggatatg，34mer(序列号：18))和GFP-Sac II-C(序列号：11)作为引物进行PCR得到片段，并分别进行纯化。以这些片段为模板，进而采用引物为224N和GFP-Sac II-C的PCR方法，得到片段。将这个片段用Kas I和Sac II处理、纯化后，作为插入片段，插到同样经Kas I和Sac II处理并去除包括单启动子(Single-promoter)序列在内的pMiniSeV_SP/GFP载体中，得到了pMiniSeV_DP/GFP(序列号：19)。
如图7-B所示，采用引物为Not I-萤光素酶-N和萤光素酶-Sac II-C的PCR方法，在萤光素酶的两侧添加Not I和Sac II限制酶位点，用其替换pMiniSeV_DP/GFP的Not I-GFP-Sac II序列，得到了pMiniSeV_DP/萤光素酶。
5MiniSeV载体(MiniSeV_SP/GFP，MiniSeV_SP/萤光素酶，MiniSeV_DP/GFP，MiniSeV_DP/萤光素酶)的重建及生产
5.1准备
1)细胞：前一天～8e5 BHK-21细胞/孔(6孔板)
2)20％FBS/opti-MEM[目录号31985-070，批号1183337，Invitrogen公司](P&S无添加)
3)opti-MEM(原液)
5.2准备转染液
1)DNA溶液(每孔)
opti-MEM(无添加原液)           300μl
pCAGGS-NP(Z)，1μg/μl         0.5μl
pCAGGS-P(Z)/4C(-)，1μg/μl    0.5μl
pCAGGS-L(TDK)，1μg/μl        2.0μl
pCAGGS-M(Z)，1μg/μl          1.0μl
pCAGGS-F5R，1μg/μl           1.0μl
pCAGGS-HN(Z)，1μg/μl         1.0μl
pCAGGS-T7，1μg/μl            1.0μl
MiniSeV载体cDNA，1μg/μl      5μl
2)LipofectAMINE 2000试剂[目录号11668-019，批号1188609，Invitrogen社]溶液(每孔)
opti-MEM(无添加原液)           300μl
LipofectAMINE2000              21μl
3)准备好2)的LipofectAMINE 2000试剂液5分钟后，与1)的DNA溶液混合，在室温下放置20-30分钟。
5.3用opti-MEM(原液)洗涤一次，添加0.6ml/孔的20％FBS/opti-MEM后，将0.5ml/孔的上述转染液加入细胞中。
5.4上述细胞在37℃下培养6小时后，添加了1.2ml/孔的10％FBS/G-MEM。第二天，用VP-SFM洗涤一次后，加入2.5μg/ml胰蛋白酶/VP-SFM进行培养。以后每天更换培养基。回收第3-6天的上清(P0病毒溶液)，感染到生产细胞(P0-P1的病毒传代)中，进行病毒生产。生产细胞使用的是病毒感染的前一天导入了pCAGGS-NP(Z)、pCAGGS-P(Z)/4C(-)、pCAGGS-L(TDK)、pCI-4C/P(-)、pCAGGS-M(Z)、pCAGGS-F5R、pCAGGS-HN(Z)的BHK-21细胞。
〔实施例1〕SeV的C蛋白质对MiniSeV/GFP/M/F/HN生产效率的影响
使用Lipofectamine 2000试剂，将pCAGGS-NP(Z)、pCAGGS-P(Z)/4C(-)、pCAGGS-L(TDK)和pCI对照或pCI-4C/P(-)导入到前一天用2e5细胞/孔(12-孔胶原包被平板，IWAKI)接种的BHK-21细胞中。第二天将MiniSeV/GFP/M/F/HN作为病毒种进行感染后，用含有胰蛋白酶(最终浓度2.5μg/ml)的VP-SFM培养液进行病毒生产。感染后第4天拍摄了生产细胞的GFP荧光照片。回收第4天的培养上清，并感染到新鲜的LLC-MK2细胞(24-孔平板)中，3天后拍摄了GFP荧光照片。
与导入不表达C蛋白质的对照质粒[pCI-neo]的条件相比，在导入C蛋白质表达质粒[pCI-4C/P(-)]的条件下，获得了更高的病毒生产效率(图3)。很显然，为得到高生产效率有必要表达适量的C蛋白。
〔实施例2〕MiniSeV/GFP/M/F/HN的生产
用Lipofectamine 2000试剂，将pCAGGS-NP(Z)、P(Z)/4C(-)、L(TDK)和pCI-4C/P(-)导入到前一天用8e5细胞/孔(6-孔胶原包被平板，IWAKI)接种的BHK-21细胞中。第二天将MiniSeV/GFP/M/F/HN作为病毒种进行感染后，用含有胰蛋白酶(最终浓度2.5μg/ml)的VP-SFM培养液进行病毒生产。感染后第1～7天，每天拍摄GFP荧光照片，回收培养上清，更换培养液。对第1～7天回收的培养上清进行CIU测定。
如图4所示，从第3-6天的培养上清回收了1e7GFP-CIU/ml以上滴度很高的MiniSeV/GFP/M/F/HN。
〔实施例3〕MiniSeV/GFP/M/F/HN的体外表达
将MiniSeV/GFP/M/F/HN以MOI＝100、10、1感染到当天用3e5细胞/孔(12-孔胶原包被平板，IWAKI)接种的HeLa细胞中。并将MiniSeV/GFP/M/F/HN以MOI＝1和SeVagp55/dF以MOI＝5进行共感染。拍摄了感染后第1、2天的GFP照片。
如图5所示，MiniSeV/GFP/M/F/HN单独用MOI＝1感染时，只观察到微弱的GFP表达，用MOI＝100感染时，确认到了接近于Helper-SeV(SeVagp55/ΔF)共感染(相当于复制型SeV)水平的GFP表达。
〔实施例4〕基因组启动子对MiniSeV载体表达量的影响
将MiniSeV_SP/萤光素酶和MiniSeV_DP/萤光素酶单独感染(n＝3)或分别与Helper-SeV(MOI10)共感染(n＝3)到前一天用2e5细胞/孔(12-孔胶原包被平板，IWAKI)接种的LLC-MK₂细胞中。感染后的第2天，回收单独感染孔的细胞，测定了萤光素酶活性。用抗萤光素酶抗体将与Helper-SeV共感染的孔进行免疫染色，计数了每孔的萤光素酶阳性细胞数。用萤光素酶活性的平均值除萤光素酶阳性细胞数的平均值，可算出每个细胞的萤光素酶活性。如图8所示，与具有双启动子(Double-promoter)的MiniSeV_DP/萤光素酶相比，具有单启动子(Single-promoter)的MiniSeV_SP/萤光素酶载体每个细胞的蛋白表达量(萤光素酶活性)约高1.5倍。
〔实施例5〕MiniSeV_SP/GFP的GFP表达
将MiniSeV_SP/GFP单独感染或与Helper-SeV(MOI10)共感染到前一天用2e5细胞/孔(12-孔胶原包被平板，IWAKI)接种的LLC-MK₂细胞中，第2天观察GFP荧光，并进行了拍照。如图9所示，与Helper-SeV共感染相比，虽然MiniSeV载体单独感染的GFP表达较弱，但单独感染时也能观察到明显的GFP表达细胞。
产业实用性
本发明者们开发的非复制型SeV载体具有高导入效率和低免疫原性，所以可期待应用于抗体制作、蛋白机能解析、基因治疗、基因疫苗等广泛领域。
序列表
<110>生物载体株式会社(DNAVEC CORPORATION)
<120>非复制型副粘病毒科病毒载体
<130>D4-A0602P
<140>PCT/JP2007/063305
<141>2007-07-03
<150>JP 2006193433
<151>2006-07-13
<160>21
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>1
aagt ggcggc cgcacggcgc aatggcagat atc                                 33
<210>2
<211>70
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>2
ggtaccgcgg agcttcgatc gttctgcacg atagggacta attattaaga ctcggccttg     60
cataatttag                                                            70
<210>3
<211>5028
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的载体序列
<400>3
accaaacaag agaaaaaaca tgtatgggat atgtaatgaa gttatacagg attttagggt     60
caaagtatcc accctgagga gcaggttcca gaccctttgc tttgctgcca aagttcacgc    120
ggccgcacgg cgcaatggca gatatctata gattccctaa gttctcatat gaggataacg    180
gtactgtgga gcccctgcct ctgagaactg gtccggataa gaaagccatc ccccacatca    240
ggattgtcaa ggtaggagac cctcctaaac atggagtgag atacctagat ttattgctct    300
tgggtttctt tgagacaccg aaacaaacaa ccaatctagg gagcgtatct gacttgacag    360
agccgaccag ctactcaata tgcggctccg ggtcgttacc cataggtgtg gccaaatact    420
acgggactga tcaggaactc ttaaaggcct gcaccgatct cagaattacg gtgaggagga    480
ctgttcgagc aggagagatg atcgtataca tggtggattc gattggtgct ccactcctac    540
catggtcagg caggctgaga cagggaatga tatttaatgc aaacaaggtc gcactagctc    600
cccaatgcct ccctgtggac aaggacataa gactcagagt ggtgtttgtc aatgggacat     660
ctctaggggc aatcaccata gccaagatcc caaagaccct tgcagacctt gcattgccca     720
actctatatc tgttaattta ctggtgacac tcaagaccgg gatctccaca gaacaaaagg     780
gggtactccc agtacttgat gatcaagggg agaaaaagct caattttatg gtgcacctcg     840
ggttgatcag gagaaaggtc gggaagatat actctgttga gtactgcaag agcaagattg     900
agagaatgcg gctgattttc tcacttgggt taatcggcgg tataagcttc catgttcagg     960
ttaatgggac actatctaag acattcatga gtcagctcgc atggaagagg gcagtctgct    1020
tcccattaat ggatgtgaat ccccatatga acatggtgat ttgggcggca tctgtagaaa    1080
tcacaggcgt cgatgcggtg ttccaaccgg ccatccctcg tgatttccgc tactacccta    1140
atgttgtggc taagaacatc ggaaggatca gaaagctgta aatgtgcacc catcagagac    1200
ctgcgacaat gccccaagca gacaccacct ggcagtcgga gccaccgggt cactccttgt    1260
cttaaataag aaaaacttag ggataaagtc ccttgtgagt gcttggttgc aaaactctcc    1320
ccttgggaaa catgacagca tatatccaga gatcacagtg catctcaaca tcactactgg    1380
ttgttctcac cacattggtc tcgtgtcaga ttcccaggga taggctctct aacatagggg    1440
tcatagtcga tgaagggaaa tcactgaaga tagctggatc ccacgaatcg aggtacatag    1500
tactgagtct agttccgggg gtagactttg agaatgggtg cggaacagcc caggttatcc    1560
agtacaagag cctactgaac aggctgttaa tcccattgag ggatgcctta gatcttcagg    1620
aggctctgat aactgtcacc aatgatacga cacaaaatgc cggtgctccc cagtcgagat    1680
tcttcggtgc tgtgattggt actatcgcac ttggagtggc gacatcagca caaatcaccg    1740
cagggattgc actagccgaa gcgagggagg ccaaaagaga catagcgctc atcaaagaat    1800
cgatgacaaa aacacacaag tctatagaac tgctgcaaaa cgctgtgggg gaacaaattc    1860
ttgctctaaa gacactccag gatttcgtga atgatgagat caaacccgca ataagcgaat    1920
taggctgtga gactgctgcc ttaagactgg gtataaaatt gacacagcat tactccgagc    1980
tgttaactgc gttcggctcg aatttcggaa ccatcggaga gaagagcctc acgctgcagg    2040
cgctgtcttc actttactct gctaacatta ctgagattat gaccacaatc aggacagggc    2100
agtctaacat ctatgatgtc atttatacag aacagatcaa aggaacggtg atagatgtgg    2160
atctagagag atacatggtc accctgtctg tgaagatccc tattctttct gaagtcccag    2220
gtgtgctcat acacaaggca tcatctattt cttacaacat agacggggag gaatggtatg    2280
tgactgtccc cagccatata ctcagtcgtg cttctttctt agggggtgca gacataaccg    2340
attgtgttga gtccagattg acctatatat gccccaggga tcccgcacaa ctgatacctg    2400
acagccagca aaagtgtatc ctgggggaca caacaaggtg tcctgtcaca aaagttgtgg    2460
acagccttat ccccaagttt gcttttgtga atgggggcgt tgttgctaac tgcatagcat    2520
ccacatgtac ctgcgggaca ggccgaagac caatcagtca ggatcgctct aaaggtgtag    2580
tattcctaac ccatgacaac tgtggtctta taggtgtcaa tggggtagaa ttgtatgcta    2640
accggagagg gcacgatgcc acttgggggg tccagaactt gacagtcggt cctgcaattg    2700
ctatcagacc cgttgatatt tctctcaacc ttgctgatgc tacgaatttc ttgcaagact    2760
ctaaggctga gcttgagaaa gcacggaaaa tcctctcgga ggtaggtaga tggtacaact    2820
caagagagac tgtgattacg atcatagtag ttatggtcgt aatattggtg gtcattatag    2880
tgatcatcat cgtgctttat agactcagaa ggtcaatgct aatgggtaat ccagatgacc    2940
gtataccgag ggacacatac acattagagc cgaagatcag acatatgtac acaaacggtg    3000
ggtttgatgc aatggctgag aaaagatgat cacgaccatt atcagatgtc ttgtaaagca    3060
ggcatagtat ccgttgagat ctgtatataa taagaaaaac ttagggtgaa agtgaggtcg    3120
cgcggtactt tagctttcac ctcaaacaag cacagatcat ggatggtgat aggggcaaac    3180
gtgactcgta ctggtctact tctcctagtg gtagcaccac aaaaccagca tcaggttggg    3240
agaggtcaag taaagccgac acatggttgc tgattctctc attcacccag tgggctttgt    3300
caattgccac agtgatcatc tgtatcataa tttctgctag acaagggtat agtatgaaag    3360
agtactcaat gactgtagag gcattgaaca tgagcagcag ggaggtgaaa gagtcactta    3420
ccagtctaat aaggcaagag gttatagcaa gggctgtcaa cattcagagc tctgtgcaaa    3480
ccggaatccc agtcttgttg aacaaaaaca gcagggatgt catccagatg attgataagt    3540
cgtgcagcag acaagagctc actcagcact gtgagagtac gatcgcagtc caccatgccg    3600
atggaattgc cccacttgag ccacatagtt tctggagatg ccctgtcgga gaaccgtatc    3660
ttagctcaga tcctgaaatc tcattgctgc ctggtccgag cttgttatct ggttctacaa    3720
cgatctctgg atgtgttagg ctcccttcac tctcaattgg cgaggcaatc tatgcctatt    3780
catcaaatct cattacacaa ggttgtgctg acatagggaa atcatatcag gtcctgcagc    3840
tagggtacat atcactcaat tcagatatgt tccctgatct taaccccgta gtgtcccaca    3900
cttatgacat caacgacaat cggaaatcat gctctgtggt ggcaaccggg actaggggtt    3960
atcagctttg ctccatgccg actgtagacg aaagaaccga ctactctagt gatggtattg    4020
aggatctggt ccttgatgtc ctggatctca aagggagaac taagtctcac cggtatcgca    4080
acagcgaggt agatcttgat cacccgttct ctgcactata ccccagtgta ggcaacggca    4140
ttgcaacaga aggctcattg atatttcttg ggtatggtgg actaaccacc cctctgcagg    4200
gtgatacaaa atgtaggacc caaggatgcc aacaggtgtc gcaagacaca tgcaatgagg    4260
ctctgaaaat tacatggcta ggagggaaac aggtggtcag cgtgatcatc caggtcaatg    4320
actatctctc agagaggcca aagataagag tcacaaccat tccaatcact caaaactatc    4380
tcggggcgga aggtagatta ttaaaattgg gtgatcgggt gtacatctat acaagatcat    4440
caggctggca ctctcaactg cagataggag tacttgatgt cagccaccct ttgactatca    4500
actggacacc tcatgaagcc ttgtctagac caggaaataa agagtgcaat tggtacaata    4560
agtgtccgaa ggaatgcata tcaggcgtat acactgatgc ttatccattg tcccctgatg    4620
cagctaacgt cgctaccgtc acgctatatg ccaatacatc gcgtgtcaac ccaacaatca    4680
tgtattctaa cactactaac attataaata tgttaaggat aaaggatgtt caattagagg    4740
ctgcatatac cacgacatcg tgtatcacgc attttggtaa aggctactgc tttcacatca    4800
tcgagatcaa tcagaagagc ctgaatacct tacagccgat gctctttaag actagcatcc    4860
ctaaattatg caaggccgag tcttaataat tagtccctat cgtgcagaac gatcgaagct    4920
ccgcggtacc tggaagtctt ggacttgtcc atatgacaat agtaagaaaa acttacaaga    4980
agacaagaaa atttaaaagg atacatatct cttaaactct tgtctggt                 5028
<210>4
<211>788
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的核苷酸序列
<400>4
gcggccgccg tacggccatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca     60
tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg    120
agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc    180
ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct    240
accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc    300
aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt    360
tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg    420
gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg    480
ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg    540
gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc    600
tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga    660
agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg    720
acgagctgta caagtaaagc tccgaagtaa gaaaaactta gggtgaaagt tcatcgtacg    780
gcggccgc                                                             788
<210>5
<211>55
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>5
acttgaattc acggcttcgg ctacacttac cgcctggatc aagatgcctt catt c       55
<210>6
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>6
cgaggcggcc gcttactctt gcactatgtg                                    30
<210>7
<211>662
<212>DNA
<213>人工的
<223>人工合成的核苷酸序列
<400>7
gaattcacgg cttcggctac acttaccgcc tggatcaaga tgccttcatt cttaaagaag     60
attctgaagt tgagagggag gcgccaggag gacgagagtc gctctcggat gttatcggat    120
tcctcgatgc tgtcctgtcg agtgaaccaa ctgacatcgg aggggacaga agctggctcc    180
acaacaccat caacactccc caaggaccag gctctgctca tagagccaaa agtgagggcg    240
aaggagaagt ctcaacaccg tcgacccaag ataatcgatc aggtgaggag agtagagtct    300
ctgggagaac aagcaagcca gaggcagaag cacatgctgg aaaccttgat aaacaaaata    360
tacaccgggc ctttggggga agaactggta caaactctgt atctcaggat ctgggcgatg    420
gaggagactc cggaatcctt gaaaatcctc caaatgagag aggatatccg agatcaggta    480
ttgaagatga aaacagagag atggctgcgc accctgataa gaggggagaa gaccaagctg    540
aaggacttcc agaagaggta cgaggaagta catccctacc tgatgaagga gaaggtggag    600
caagtaataa tggaagaagc atggagcctg gcagctcaca tagtgcaaga gtaagcggcc    660
gc                                                                   662
<210>8
<211>10
<212>DNA
<213>仙台病毒(Sendai virus)
<400>8
ctttcaccct                                                            10
<210>9
<211>15
<212>DNA
<213>仙台病毒(Sendai virus)
<400>9
tttttcttac tacgg                                                      15
<210>10
<211>50
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>10
agttcacgcg gccgcagatc ttcacgatgg tgagcaaggg cgaggagctg               50
<210>11
<211>65
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>11
caggtaccgc ggagcttcga tcgttctgca cgatagggac taattacttg tacagctcgt    60
ccatg                                                                65
<210>12
<211>996
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的载体序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(138)..(857)
<223>GFP的可读框序列
<400>12
accaaacaag agaaaaaaca tgtatgggat atgtaatgaa gttatacagg attttagggt   60
caaagtatcc accctgagga gcaggttcca gaccctttgc tttgctgcca aagttcacgc  120
ggccgcagat cttcacgatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca  180
tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg  240
agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc  300
ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct  360
accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc  420
aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt  480
tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg  540
gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg  600
ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg  660
gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc  720
tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga  780
agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg  840
acgagctgta caagtaatta gtccctatcg tgcagaacga tcgaagctcc gcggtacctg  900
gaagtcttgg acttgtccat atgacaatag taagaaaaac ttacaagaag acaagaaaat  960
ttaaaaggat acatatctct taaactcttg tctggt                            996
<210>13
<211>50
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>13
atccatcgcg gccgcagatc ttcacgatgg aagacgccaa aaacataaag            50
<210>14
<211>66
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>14
acttactccg cggttcgatc gttctgcacg atagggacta attacacggc gatctttccg    60
cccttc                                                               66
<210>15
<211>1706
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的载体序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(20)..(1672)
<223>萤光素酶的可读框序列
<400>15
gcggccgcag atcttcacga tggaagacgc caaaaacata aagaaaggcc cggcgccatt     60
ctatccgctg gaagatggaa ccgctggaga gcaactgcat aaggctatga agagatacgc    120
cctggttcct ggaacaattg cttttacaga tgcacatatc gaggtggaca tcacttacgc    180
tgagtacttc gaaatgtccg ttcggttggc agaagctatg aaacgatatg ggctgaatac    240
aaatcacaga atcgtcgtat gcagtgaaaa ctctcttcaa ttctttatgc cggtgttggg    300
cgcgttattt atcggagttg cagttgcgcc cgcgaacgac atttataatg aacgtgaatt    360
gctcaacagt atgggcattt cgcagcctac cgtggtgttc gtttccaaaa aggggttgca    420
aaaaattttg aacgtgcaaa aaaagctccc aatcatccaa aaaattatta tcatggattc    480
taaaacggat taccagggat ttcagtcgat gtacacgttc gtcacatctc atctacctcc    540
cggttttaat gaatacgatt ttgtgccaga gtccttcgat agggacaaga caattgcact    600
gatcatgaac tcctctggat ctactggtct gcctaaaggt gtcgctctgc ctcatagaac    660
tgcctgcgtg agattctcgc atgccagaga tcctattttt ggcaatcaaa tcattccgga    720
tactgcgatt ttaagtgttg ttccattcca tcacggtttt ggaatgttta ctacactcgg    780
atatttgata tgtggatttc gagtcgtctt aatgtataga tttgaagaag agctgtttct    840
gaggagcctt caggattaca agattcaaag tgcgctgctg gtgccaaccc tattctcctt    900
cttcgccaaa agcactctga ttgacaaata cgatttatct aatttacacg aaattgcttc    960
tggtggcgct cccctctcta aggaagtcgg ggaagcggtt gccaagaggt tccatctgcc   1020
aggtatcagg caaggatatg ggctcactga gactacatca gctattctga ttacacccga   1080
gggggatgat aaaccgggcg cggtcggtaa agttgttcca ttttttgaag cgaaggttgt   1140
ggatctggat accgggaaaa cgctgggcgt taatcaaaga ggcgaactgt gtgtgagagg   1200
tcctatgatt atgtccggtt atgtaaacaa tccggaagcg accaacgcct tgattgacaa   1260
ggatggatgg ctacattctg gagacatagc ttactgggac gaagacgaac acttcttcat   1320
cgttgaccgc ctgaagtctc tgattaagta caaaggctat caggtggctc ccgctgaatt   1380
ggaatccatc ttgctccaac accccaacat cttcgacgca ggtgtcgcag gtcttcccga   1440
cgatgacgcc ggtgaacttc ccgccgccgt tgttgttttg gagcacggaa agacgatgac   1500
ggaaaaagag atcgtggatt acgtcgccag tcaagtaaca accgcgaaaa agttgcgcgg   1560
aggagttgtg tttgtggacg aagtaccgaa aggtcttacc ggaaaactcg acgcaagaaa  1620
aatcagagag atcctcataa aggccaagaa gggcggaaag atcgccgtgt aattagtccc  1680
tatcgtgcag aacgatcgaa ccgcgg                                       1706
<210>16
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>16
ataccgcatc aggcgccatt cg                                           22
<210>17
<211>57
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>17
gttttttagg gtctggaacc tgctcctcag ggtggatact ttgacactaa aatcctg    57
<210>18
<211>34
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>18
ggttccagac cctaaaaaac atgtatggga tatg                             34
<210>19
<211>1080
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的载体序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(222)..(941)
<223>GFP的可读框序列
<400>19
accaaacaag agaaaaaaca tgtatgggat atgtaatgaa gttatacagg attttagtgt   60
caaagtatcc accctgagga gcaggttcca gaccctaaaa aacatgtatg ggatatgtaa  120
tgaagttata caggatttta gggtcaaagt atccaccctg aggagcaggt tccagaccct  180
ttgctttgct gccaaagttc acgcggccgc agatcttcac gatggtgagc aagggcgagg  240
agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca  300
agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt  360
tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct  420
acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt   480
ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact   540
acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga   600
agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca   660
acagccacaa cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca   720
agatccgcca caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca   780
cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg   840
ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg   900
ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaagta attagtccct atcgtgcaga   960
acgatcgaag ctccgcggta cctggaagtc ttggacttgt ccatatgaca atagtaagaa  1020
aaacttacaa gaagacaaga aaatttaaaa ggatacatat ctcttaaact cttgtctggt  1080
<210>20
<211>96
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的启动子序列
<400>20
accaaacaag agaaaaaaca tgtatgggat atgtaatgaa gttatacagg attttagggt    60
caaagtatcc accctgagga gcaggttcca gaccct                              96
<210>21
<211>180
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的启动子序列
<400>21
accaaacaag agaaaaaaca tgtatgggat atgtaatgaa gttatacagg attttagtgt    60
caaagtatcc accctgagga gcaggttcca gaccctaaaa aacatgtatg ggatatgtaa   120
tgaagttata caggatttta gggtcaaagt atccaccctg aggagcaggt tccagaccct   180