柱层析PEG与干扰素类似物蛋白氮端定点偶联方法及其产物.pdf

本发明公开了一种柱层析PEG与干扰素类似物蛋白氮端定点偶联的方法，是通过离子交换层析将IFNs类似物(IFNs Analogs，IFNs-A)上的赖氨酸epsilon氨基“封闭”而实现PEG-ALD与IFNs-A N-末端蛋氨酸alfa氨基的特异性偶联，并同时实现一步纯化获得单一、定点N-末端偶联PEG-IFNs-A产物。本发明还进一步公开了所述聚乙二醇化重组人干扰素类似物蛋白在制备治疗乙型或丙型病毒性肝炎、多发性硬化症、风湿或类风湿性关节炎、恶性肿瘤、毛白血病和艾滋病卡波氏瘤药物中的应用。

1.  一种柱层析PEG与干扰素类似物蛋白氮端定点偶联的方法，步骤包括：
选择阳离子交换介质，装载于层析色谱柱中，柱床高度为常规推荐高度的上限，并将其连接到液相层析系统上；使用相当于5～6倍柱体积的pH3.5～6.0的20mM醋酸钠缓冲液和质量百分比为0.005％聚山梨醇酯80充分平衡色谱柱；用进料泵，以8～10ml/min的流速，将IFNs-A原液加入层析柱中，上样量为介质实测最大载量的10％～70％；再在13～15ml/min的流速下，用5～6倍柱体积的pH3.5～6.0的20mM醋酸钠缓冲液冲洗柱子，去除不与色谱介质发生静电吸附的物质；按mPEG:IFNs-A的反应量比为5～50mol:1mol的比例，以0.5～3ml/min的流速上样加入分子量范围为26～40kDa的mPEG，所述不同分子量的mPEG投入总量X按公式(1)计算：
(1)X＝5～50×m×MWPEG/MWIFNs-A
式中：X为不同分子量的mPEG投入总量，m为加入的IFNs-A蛋白含量，MWPEG和MWIFNs-A分别为PEG和IFNs-A的分子量；
再按下列公式(2)计算还原剂氰基硼氢化钠的加入量：
(2)NaBH3CN加入量＝10×MW还原剂×X/MWPEG
式中：MW还原剂为还原剂氰基硼氢化钠的分子量，X为不同分子量的mPEG投入总量，MWPEG为mPEG的分子量；
连续上样240±5分钟；反应体系的pH为3.5～6.0；再以13～15ml/min的流速，用5～6倍柱体积的pH3.5～6.0的20mM醋酸钠缓冲液冲洗柱子，去除不与色谱介质发生静电吸附的物质；随后用pH3.5～6.0的20mM醋酸钠缓冲液与0.01M～1M氯化钠的混合液，以洗脱方式0～8％、8％～18％和18％～100％洗脱，持续150±2分钟，获得两个洗脱峰，即P1和P2，其中P1的峰面积占总峰面积的72±1％，为单修饰的PEG-IFNs-A，即聚乙二醇与IFNs-A蛋白N-末端单一、定点特异性偶联化合物；
其中：
上述IFNs-A为通过融合技术将柔性连接链(GlyGlyGlyGlySer)t与IFNs的N-末端融合而获得的融合蛋白：(GlyGlyGlyGlySer)t-N-IFNs；其中t为1～10，IFNs为重组人干扰素alfa或beta，其氨基酸序列应符合SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列公式；
上述mPEG指能与蛋白质氨基偶联的各种活化的单甲基PEG分子，为mPEG-ALD或mPEG-N-羟基琥珀酰亚胺活化酯中的PEG-琥珀酰亚胺α甲基丁酸酯或mPEG-琥珀酰亚胺丙酸酯。

2.  如权利要求1所述柱层析PEG与干扰素类似物蛋白氮端定点偶联的方法，其特征在于：所述阳离子交换介质为MacroCap SP或Sepharose Fast Flow。

3.  如权利要求1所述柱层析PEG与干扰素类似物蛋白氮端定点偶联的方法，其特征在于：所述IFNs-A为通过融合技术将柔性连接链(GlyGlyGlyGlySer)t与IFNs的N-末端融合而获得的融合蛋白：(GlyGlyGlyGlySer)t-N-IFNs；其中t为1～3，IFNs为重组人干扰素alfa-2b(IFN-α2b)、重组人干扰素alfa-2a(IFN-α2a)或重组人干扰素beta-1b(IFN-β1b)；所述IFNs-A采用原核细胞表达体系中的大肠杆菌表达制备，且IFNs-A的唯一特征是，体外活性大于或等于IFNs原蛋白体外活性的70％。

4.  如权利要求1所述柱层析PEG与干扰素类似物蛋白氮端定点偶联的方法，其特征在于：所述IFNs-A的上样量为介质实测最大载量的30-50％。

5.  如权利要求1所述柱层析PEG与干扰素类似物蛋白氮端定点偶联的方法，其特征在于：所述mPEG的分子量选30kDa；mPEG分子选单链；所述mPEG的上样量按mPEG:IFNs-A的反应量比为5～20mol:1mol的比例。

6.  如权利要求1所述柱层析PEG与干扰素类似物蛋白氮端定点偶联的方法，其特征在于：所述柱层析IFNs-A氮端定点偶联mPEG的反应体系的pH为5.0～6.0。

7.  权利要求1所述柱层析PEG与干扰素类似物蛋白氮端定点偶联的方法制得的一类聚乙二醇化重组人干扰素类似物蛋白，由非糖基化的IFNs-A的N-末端氨基与单一、单链的、分子量大于26kDa的PEG分子定点偶联而成；其特征在于：所述聚乙二醇化重组人干扰素类似物蛋白分子式为：CH₃-(CH₂CH₂-O)n-(CH₂)r-NH-(GlyGlyGlyGlySer)t-IFNs，式中n为570～2200，r为0～4，t为1～10；IFNs为重组人干扰素alfa或beta，其氨基酸序列应符合SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列公式；同时所述聚乙二醇化重组人干扰素类似物蛋白还应具备下列特征：
1)IFNs-A与mPEG偶联的分子比例为1：1，偶联位点为IFNs-A分子N-末端氨基；
2)在比活性测定中，以Lowry法测定待测PEG-IFNs-A的蛋白浓度，WISH细胞/结晶紫法测体外活性，计算出每毫克蛋白的活性即得比活性，PEG-IFNs-A的比活性应大于或等于7.0X10E7IU/mg蛋白；
3)PEG-IFNs-A的血浆半衰期比PEG-Intron即12kDa PEG与IFN a-2b的单修饰产物的血浆清除半衰期长50％以上；
4)在免疫原性测定中，PEG-IFNs-A在第12周IFN抗体阳性率应低于50％。

8.  如权利要求7所述的聚乙二醇化重组人干扰素类似物蛋白，其特征在于：所述聚乙二醇化重组人干扰素类似物蛋白分子结构式中n为700±100；r为2～3；t为1～3。

9.  如权利要求8所述的聚乙二醇化重组人干扰素类似物蛋白，其特征在于：所述聚乙二醇化重组人干扰素类似物蛋白分子是PEG-IFNα2bA-N30或PEG-IFNβ1b A-N30。

10.  权利要求7、8或9所述聚乙二醇化重组人干扰素类似物蛋白在制备治疗乙型或丙型病毒性肝炎、多发性硬化症、风湿或类风湿性关节炎、恶性肿瘤、毛白血病和艾滋病卡波氏瘤药物中的应用。

柱层析PEG与干扰素类似物蛋白氮端定点偶联方法及其产物
技术领域
本发明在广义上隶属于蛋白质修饰和水溶性多聚体偶联蛋白、多肽及其突变体或类似物领域；较为具体地表述是，本发明涉及一种利用柱层析实现聚乙二醇与干扰素类似物(Interferons Analogs，IFNs-A)蛋白氮末端点特异性偶联的方法，以及利用该方法所获得的一类聚乙二醇化重组人干扰素类似物蛋白化合物，和所述这一类具药学上长效、高效、低免疫原性特征的重组蛋白质类化合物作为长效制剂类药物的生产与应用。
背景技术
干扰素(Interferon，IFN)是一个细胞因子家族的统称，哺乳类动物的干扰素可分为α、β、γ、ω等数种类型，具有广谱的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用，其中重组人干扰素(Recombiant Human Interferon，rhIFN)α-1b、α-2a、α-2b、β-1b、γ以及α型的consensusIFN(复合干扰素，IFN-con)均已批准上市，用于治疗乙型或丙型病毒性肝炎、多发性硬化症、风湿或类风湿性关节炎、恶性肿瘤(非何杰金氏病、黑色素瘤、乳腺癌等)、毛白血病(HairyCellLeukemia)和艾滋病卡波氏瘤等；2001年和2002年美国FDA又分别批准聚乙二醇化(Polyethylene Glycol，PEG)干扰素α-2b(PEG-Intron)和干扰素α-2a(Pegasys)两种长效制剂上市，与普通干扰素相比，可实现1～2周注射一次的给药方式，取得了更好的方便性、疗效和安全性，现已成为治疗慢性病毒性肝炎和风湿性关节炎的首选药或一线药物；但是，PEG-Intron和Pegasys分子中PEG与IFN的偶联并非点特性(site-specific Pegylation)，这给产品的质量可控性带来了问题与麻烦，也使分子的体外活性显著降低；PEG-Intron由分子量为12kDa的PEG偶联而得，其血浆清除半衰期延长不足，Pegasys由分子量为40kDa的PEG偶联而得，其体内分布过小，使停药后病毒的复发率较高，故长效制剂存在进一步优化和改进的需要。
显然采用点特异性PEG偶联方式，可同时实现PEG-IFN分子在分子量和分子结构上的均一性，也可提高PEG-IFN分子的体外活性。已有多种偶联策略实现PEG-IFN的点特异性偶联，其中包括：1)USP5,985,263公布了一种PEG相对特异性偶联组氨酸(histidine)的方法及其产物，PEG琥珀酰胺碳酸酯(succinimidyl carbonate PEG，SC-PEG)可相对特异性与34位组氨酸(His34)偶联形成PEG-His34-IFN alpha，该位点的偶合物具较高的生物活性；2)WO2006/004959描述了一种利用IFN alpha-1b氨基酸序列中86位自由半胱氨酸(Cys86)特异性偶联PEG马来酰胺(PEG maleimide)的方法及其产物；3)WO2008/074230中公开了一种点突变IFN alfa第85位或86位的酪氨酸(Tyr)为Cys，再利用一种巯基反应的PEG化试剂，如马来酰亚胺-PEG、乙烯砜-PEG、碘代乙酰胺-PEG及正吡啶二硫化物-PEG等，实现点特异性PEG与IFNα-2a，IFNα-2b，IFN-con等的偶联。
另一种重要的点特异性偶联策略是蛋白氮末端(N-末端)点特异性偶联。Wetzel R等〔1〕于1990年提出通过控制pH值实现多肽N-末端alfa氨基的高选择性偶联；Chang TK等〔3〕于1994年发现枯草杆菌酶(subtiligase)具有酶促PEG选择性偶联的作用；GaertnerHF等〔2〕于1996年描述了各种可以选择性偶联蛋白N-末端氨基的PEG活性基团，并在白介素-8、G-CSF等分子上应用；较近也有学者采用重组DNA技术〔4〕，通过表达转谷氨酰胺酶(transglutaminase)介导微生物体内PEG点特异性N-末端偶联目标蛋白。
在上述Wetzel R等1990年提出的通过控制pH值实现多肽N-末端alfa氨基的高选择性偶联的基础上，美国Amgen公司的Kinstler OB和Gabrial等进一步详细描述了通过降低pH值可以使单甲基聚乙二醇醛基(PEG-ALD)特异性偶联rhG-CSF和复合干扰素等N-末端氨基的方法及其产物，详见USP 5,824,784/USP 5,985,265/USP 7,090,835 B2和US2006/0233746 A1以及CN 1896103A等专利；Kinstler等通过降低pH值实现PEG-ALD选择性偶联蛋白N-末端，当pH值为酸性(如pH4.5)的条件下，rhG-CSF或IFN-con分子上N-末端alfa氨基与PEG-ALD的偶联反应机率远高于赖氨酸上的epsilon氨基；故当偶联反应持续较长时间时，将会出现绝大多数PEG-ALD偶联在rhG-CSF或IFN-con分子N-末端alfa氨基上，形成单一、定点的PEG-rhG-CSF或PEG-IFN-con化合物；因此，形成单一、蛋白N-末端高选择性的条件包括低pH值和较长的反应时间，此外还需要相对较低的PEG-ALD投入量。而pH值提高可加速PEG-ALD与蛋白分子氨基的偶联，只是此时会失去PEG-ALD对蛋白N-末端的选择性，形成多修饰PEG-蛋白质的混合物。事实上，在Royer GI等于1977年的美国专利USP 4,002,531和Shaw等在1990年的美国专利USP4,904,584中对此也都已有述及。
Fee CJ(USP 2006/0128945 A1)公布了一种利用凝胶层析进行蛋白质PEG修饰的技术，提出由于蛋白质和PEG化蛋白质在凝胶层析流动相中的速率差异，使用层析柱进行PEG化偶联反应可能更易产生单一的偶联产物，但Fee CJ的方法〔6〕并未涉及需要添加催化剂的PEG化偶联反应，也非蛋白质N-末端的特异性偶联技术。最近Lee BK等〔5〕描述了利用一种固相PEG化技术点特异性修饰重组人干扰素alfa-2a(IFN a-2a)的方法，并获得了与IFNa-2a蛋白N-末端偶联的PEG-IFN，但此方法是通过使用与Kinstler OB等十分相似的催化反应条件才获得了蛋白N-末端高选择性的偶联产物，因此，从本质上讲，通过控制反应体系的pH值而非层析介质或层析条件而使PEG-ALD高选择性偶联蛋白N-末端，且由于反应时间的限制使偶联反应率降低，出现较多的游离IFN a-2a。
早在1982年Miller等〔7〕就发表了关于重组人干扰素alfa的晶体结构分析，后又有研究分析了人干扰素alfa和beta结构与功能〔8)〔9〕，根据上述文献可以获悉，IFNalfa的受体结合区主要包括AB loop(Arg22，Leu26，Phe27，Leu30，Lys31，Arg33，His34)，helixB(Ser68)，helix C(Thr79，Lys83，Tyr85，and Tyr89)，helix D(Arg120，Lys121，Gln124，Lys131，Glu132)和helix E(Arg144，Glu146)。而点突变Arg22，Leu26，Phe27，Leu30，Lys31，Arg33，His34，Phe36，Arg120，Lys121，Gln124，Tyr122，Tyr129，Lys131，Glu132，Arg144或Glu146所获IFN alfa突变体(IFN alfa mutants，IFNαm)生物活性将显著下降5倍以上。干扰素alfa有两个二硫键，分别在Cys1-Cys98和Cys29-Cys138之间；在PEG-Intron(一类PEG-IFN alfa-2b与分子量12kDa的PEG偶联化合物)分子中，在Cys1(N-末端)偶联PEG的PEG-IFN alfa-2b其活性仅为普通IFN alfa-2b的11％〔10〕；而据偶联位点分析，在Pegasys一类PEG-IFN alfa-2a(一类PEG-IFN alfa-2a与分子量40kDa的PEG偶联化合物)分子中没有与Cys1(N-末端)偶联的PEG-IFN alfa-2a，说明N-末端并非天然IFN alfa理想的偶联位点〔11〕，而Lys或His位点也非合适的偶联位点。
柔性连接链(Flexiblelinker)(GlyGlyGlyGlySer)n用于两个不同活性蛋白的融合和连接已有二十年以上的历史〔12〕，且临床应用未见其易被酶解或具免疫原性。
综上所述，体外PEG蛋白N-末端点特异性偶联反应有多种，其主要策略是通过提高PEG活化基团对N-末端alfa氨基的选择性而实现。然而，经检索，通过离子交换层析将IFNs类似物(IFNs Analogs，IFNs-A)上的赖氨酸epsilon氨基“封闭”而实现PEG-ALD与IFNs-AN-末端蛋氨酸alfa氨基的特异性偶联，并同时实现一步纯化获得单一、定点N-末端偶联PEG-IFNs-A产物的研究文献和专利至今还未见报道。
参考文献：
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发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种利用柱层析实现聚乙二醇与干扰素类似物(Interferons Analogs，IFNs-A)蛋白氮末端点特异性偶联的方法，以及利用该方法所获得的一类聚乙二醇化重组人干扰素类似物蛋白化合物。本发明方法获得的PEG化干扰素类似物蛋白偶联化合物具药学上具长效、高效和低免疫原性的特征，在制备长效制剂类药物中具有重要意义。
发明概述(Summary of The Invention)
本发明方法是通过离子交换层析将IFNs类似物(IFNs Analogs，IFNs-A)上的赖氨酸epsilon氨基“封闭”而实现PEG-ALD与IFNs-A N-末端蛋氨酸alfa氨基的特异性偶联，并同时实现一步纯化获得单一、定点N-末端偶联PEG-IFNs-A产物。
上述IFNs-A是通过融合技术将柔性连接链(GlyGlyGlyGlySer)n与IFNs或其IFNs的突变体(IFNs Mutants，IFNs-M)的N-末端融合获得的融合蛋白：(GlyGlyGlyGlySer)n-N-IFNs和(GlyGlyGlyGly Ser)n-N-IFNs-M，即为IFNs类似物(IFNs-A)，该类IFNs-A令人意外地发现，可显著提高大分子PEG与IFNs蛋白N-末端的偶联反应率，同时也可显著降低偶联Cys1位点对于IFNs蛋白生物活性的影响。因此，本发明拟以特异的、可控制的方式直接影响IFNs蛋白的药学和药理学性质，并开发与PEG-Intron和Pegasys相比，同时具备长效、高效和低免疫原性特征的新的长效制剂。
本发明公开了PEG与干扰素类似物(Interferons Analogs，IFNs-A)蛋白N-末端点特异性偶联的方法，即通过离子交换层析同时实现PEG与IFNs-A蛋白N-末端点特异性偶联及其同步实现单一、定点PEG-IFNs-A化合物的纯化。
其中所述偶联方法中对PEG的选择条件是：
1)可与蛋白质氨基偶联的各种活化的单甲基PEG(mPEG)分子，其中包括mPEG-ALD、PEG-琥珀酰亚胺α甲基丁酸酯(mPEG-Succinimidyl α-methylbutanoate，mPEG-SMB)、mPEG-琥珀酰亚胺丙酸酯(mPEG-Succinimidyl Propionate，mPEG-SPA)等各种mPEG-N-羟基琥珀酰亚胺活化酯(mPEG-N-Hydroxy succinimide act ive esters，mPEG-NHS ester)；
2)所述mPEG的分子量大于25kDa，优选26～40kDa，最优选30kDa；
3)所述mPEG分子可为单链、双链或多链，优选单链；
其中：所述mPEG分子优选mPEG-ALD；其分子式为mPEG-(CH2)r-CHO，其中r为1～3，r的更适范围为2～3，即mPEG-丙醛和mPEG-丁醛。
所述偶联方法中对IFNs-A的选择条件是：
1)所述IFNs-A(IFNs类似物)为通过融合技术将柔性连接链(GlyGlyGlyGlySer)t与IFNs的N-末端融合，而获得的融合蛋白：(GlyGlyGlyGlySer)t-N-IFNs，即为IFNs类似物(IFNs-A)，其中t为1～10，优选1～3，IFNs-A的唯一特征是，体外活性大于或等于IFNs原蛋白体外活性的70％；
其中所述IFNs为重组人干扰素alfa或beta，优选重组人干扰素alfa-2b(IFN-α2b)、重组人干扰素alfa-2a(IFN-α2a)或重组人干扰素beta-1b(IFN-βlb)，其氨基酸序列应符合SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列公式；
2)所述IFNs-A可以分为重组人干扰素alfa类似物即IFNs-α-A，也可以是重组人干扰素beta类似物IFNs-β-A；
3)所述IFNs-A也可以是(GlyGlyGlyGlySer)t与各种IFNs突变体(IFNsMutants，IFNs-M)融合所获的融合蛋白，IFNs-M的特征是，体外活性不低于IFNs原蛋白的体外活性的70％，且低免疫原性或无免疫原性；
4)所述IFNs-A优先采用原核细胞表达体系即大肠杆菌高效表达；尚包括人工合成和各种其他原核细胞、真核细胞、昆虫、植物或动物表达体系。
所述偶联方法中对层析介质、柱及条件的选择条件是：
1)层析介质可选用各种离子交换、疏水性、凝胶和亲和等层析介质，其中优选阳离子交换介质，如MacroCap SP、Sepharose Fast Flow等；
2)层析柱柱床高度优选推荐柱高的上限；
3)IFNs-A蛋白的上样量为介质实测最大载量的10-70％；优选30-50％；
4)以较低的上样流速(小于3ml/min)、较长的上样时间(3～5小时)、较高反应率的pH值的条件下，上样活化的mPEG，以获得更适宜的PEG化反应条件；
5)活化的mPEG的上样量按活化的mPEG与IFNs-A的反应量比为5～50mol:1mol，优选5～20mol:1mol，以利于单修饰的PEG-IFNs-A的生成；
6)以0.01M～1M氯化钠盐溶液梯度洗脱，以利各反应产物的有效分离，如图1所示。
以上述方法及其所选条件而获得的单修饰PEG-IFNs-A洗脱峰样品经液质联用色谱胰蛋白酶酶解肽图分析，重要而出乎意外地发现：活化的PEG的偶联位点为IFNs-A的N-末端，如30kDa PEG-ALD、40kDa PEG-ALD或20kDa PEG-ALD与IFNs-A蛋白N-末端单一、定点特异性偶联产物，即IFNsA-N-30、IFNsA-N-40和IFNsA-N-20(详见实施例3)；且单修饰PEG-IFNsA洗脱峰样品的纯度经高效凝胶色谱(SEC)和高效液相色谱(HPLC)测定证实其纯度大于95％，如图3，图4所示。
采用同样的层析与PEG化条件，比较IFNs-α与IFNs-α-A层析柱PEG化的结果，大大意外地发现：融合蛋白IFNs-α-A所获N-末端定点修饰的PEG-IFNs-α-A的收率显著大于未融合柔性连接链的PEG-IFNs-α，且PEG-IFNs-α-A的体外活性也明显高于PEG-IFNs-α(详见表1和表4)，说明融合柔性连接链(GlyGlyGlyGlySer)t可明显提高N-末端定点偶联率，同时因偶联位点远离IFNs-α的活性位点，也使PEG化对IFNs-α-A的体外活性的影响显著降低(详见表4)。
本发明还证实(如表3所示)，仅将上述反应体系的pH值下调到4.0，使用mPEG-ALD可使单修饰PEG-IFNs-α-A洗脱峰面积占总洗脱峰面积显著降低至50％，未反应IFNs-α-A洗脱峰占总洗脱峰面积可显著增加达50％，多修饰PEG-IFNs-α-A洗脱峰消失；单修饰PEG-IFNs-α-A洗脱峰的样品经液质联用胰蛋白酶酶解肽图分析确定PEG-ALD的偶联位点仍为IFNs-α-A的N-末端；提示在上述离子交换层析条件下，酸性pH值条件并非PEG-ALD选择性偶联IFNs-α-A N-末端的主要因素。
本发明还发现，选用可与蛋白质氨酸反应的PEG-NHS ester(聚乙二醇N-羟基琥珀酰亚胺活化酯)修饰剂，采用上述阳离子交换层析，反应体系的pH值在6.0～7.0，可获得峰面积大于70％的PEG与IFNs-α-A的N-末端单一、定点偶联产物(如图5所示)；同样的反应条件，采用凝胶层析，也可获得峰面积大于70％的PEG与IFNs-α-A的N-末端单一、定点偶联产物(如图6所示)。
在液相中，若采用与上述层析柱PEG化反应相同的反应物比例、条件和持续时间，mPEG-ALD和mPEG-SPA与IFNs-α-A的偶联反应产物，经高效凝胶测定表明，通常仅有约23％～48％的PEG-IFNs-α-A为单修饰的PEG-IFNs-α-A，其余37％～64％为多修饰PEG-IFNs-α-A化合物；13～14％未反应的IFNs-α-A，与层析柱上PEG化偶联反应产物比例明显不同(如图7，8所示)。
采用与上述IFNs-α和IFNs-α-A相同的策略与方法，分析IFNs-β和IFNs-β-A可获得与上述IFNs-α和IFNs-α-A相似的结论(如表1所示)。
本发明还发现并证实：在一定条件下，阳离子交换介质吸附IFNs-A蛋白，并可“封闭”IFNs-A位于分子表面的赖氨酸epsilon氨基，从而使PEG-ALD或PEG-NHS特异性偶联IFNs-A分子N-末端蛋氨酸的alfa氨基，形成单一、N-末端定点PEG-IFNs-A，如IFNsA-N-30等(30kDa PEG-ALD与IFNs-A蛋白N-末端单一、定点特异性偶联产物)，这种PEG-ALD对蛋白N-末端的特异性选择并非因pH值的降低或为酸性所致；而N-末端融合柔性连接链(GlyGlyGlyGlySer)t可明显提高N-末端定点偶联率；与此同时，所收集到的单一、N-末端定点PEG-IFNs-A化合物的纯度大于95％以上(如图2，图3所示)；说明层析柱PEG化反应可同步实现特异性IFNs-A N-末端单一、定点偶联，以及PEG-IFNs-A偶联化合物的纯化。
进一步的实验更令人惊奇，在层析(包括离子交换和凝胶层析)或传统液相反应体系中，干扰素融合蛋白IFNs-A与PEG-ALD或PEG-NHS的偶联反应所获N-末端单一、定点的PEG-IFNs-A的收率均显著高于普通干扰素蛋白IFNs，IFNα和IFNβ与PEG的反应趋势基本一致。
另一个重要的发现是，PEG-IFNs-A的体外生物活性显著高于同分子量的PEG-IFNs，说明IFNs N-末端融合柔性多肽链(GlyGlyGlyGlySer)t还可使PEG的偶联位点远离IFNs的活性位点，从而明显降低了PEG分子对IFNs活性的影响(详见表4)；另外，PEG-IFNα2b-A-N30的体外活性甚或显著高于IFNα-2b-A和IFNα-2b，这一结果令人意外，因为，通常认为大分子PEG的偶联会显著降低IFNs-A或IFNs的活性，显然，这一发现具有潜在而重要的临床应用价值；随着偶联PEG分子量的增大PEG-IFNs-N10～40或PEG-IFNs-A-N10～40的体外活性逐次降低，但在PEG-IFNs-N40或PEG-IFNs-A-N40处，体外活性的降低尤为显著，出现明显的活性降低的“拐点”；而偶联两个20kDa PEG的diPEG-IFNs-N40或diPEG-IFNs-A-N40其体外活性显著低于同等分子量的PEG-IFNs-N40或PEG-IFNs-A-N40，这同时提示，双链PEG或双位点偶联对体外活性的影响大于单链PEG或单一位点；因此，本发明确认，首选单链PEG-ALD偶联IFNs-A的N-末端氨基。
综合所获得的各种理化性质、生物活性、药代和免疫原性试验数据及结果，本发明首次证实并确认：作为长效、高效和低免疫原性制剂，PEG-IFNα2bA-N30或PEG-IFNβ1bA-N30较PEG-IFNα2bA-N10、PEG-IFNα2bA-N20、PEG-IFNα2bA-N40、PEG-IFNβ1bA-N10、PEG-IFNβ1bA-N20或PEG-IFNβ1b A-N40更具优势，应是最优选。因此，本发明所述的聚乙二醇化重组人干扰素类似物蛋白首选30kDa PEG-ALD与IFNs-A N-末端单一、定点偶联的聚乙二醇衍生物，即PEG-IFNsA-N30。
发明详述(Detailed Description of The Invention)
本发明所述柱层析PEG与干扰素类似物蛋白氮端定点偶联的方法，步骤包括：
选择阳离子交换介质，装载于层析色谱柱中，柱床高度为常规推荐高度的上限，并将其连接到液相层析系统上；使用相当于5～6倍柱体积的pH3.5～6.0的20mM醋酸钠缓冲液和质量百分比为0.005％聚山梨醇酯80充分平衡色谱柱；用进料泵，以8～10ml/min的流速，将IFNs-A原液加入层析柱中，上样量为介质实测最大载量的10％～70％；再在13～15ml/min的流速下，用5～6倍柱体积的pH3.5～6.0的20mM醋酸钠缓冲液冲洗柱子，去除不与色谱介质发生静电吸附的物质；按mPEG：IFNs-A的反应量比为5～50mol:1mol的比例，以0.5～3ml/min的流速上样加入分子量范围为26～40kDa的mPEG，所述不同分子量的mPEG投入总量X按公式(1)计算：
(1)X＝5～50×m×MW_PEG/MW_IFNs-A
式中：X为不同分子量的mPEG投入总量，m为加入的IFNs-A蛋白含量，MW_PEG和MW_IFNs-A分别为PEG和IFNs-A的分子量；
再按下列公式(2)计算还原剂氰基硼氢化钠的加入量：
(2)NaBH3CN加入量＝10×MW_还原剂×X/MW_PEG
式中：MW还原剂为还原剂氰基硼氢化钠的分子量，X为不同分子量的mPEG投入总量，MWPEG为mPEG的分子量；
连续上样240±5分钟；反应体系的pH为3.5～6.0；再以13～15ml/min的流速，用5～6倍柱体积的pH3.5～6.0的20mM醋酸钠缓冲液冲洗柱子，去除不与色谱介质发生静电吸附的物质；随后用pH3.5～6.0的20mM醋酸钠缓冲液与0.01M～1M氯化钠的混合液，以洗脱方式0～8％、8％～18％和18％～100％洗脱，持续150±2分钟，获得两个洗脱峰，即P1和P2，其中P1的峰面积占总峰面积的72±1％，为单修饰的PEG-IFNs-A，即聚乙二醇与IFNs-A蛋白N-末端单一、定点特异性偶联化合物；
其中：
上述IFNs-A为通过融合技术将柔性连接链(GlyGlyGlyGlySer)t与IFNs的N-末端融合而获得的融合蛋白：(GlyGlyGlyGlySer)t-N-IFNs；其中t为1～10，IFNs为重组人干扰素alfa或beta，其氨基酸序列应符合SEQ ID NO.1(其中23位为Arg，为Interferon alfa-2b，若23位为Lys即为Interferon alfa-2a)或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列公式；
上述mPEG指能与蛋白质氨基偶联的各种活化的单甲基PEG分子，为mPEG-ALD或mPEG-N-羟基琥珀酰亚胺活化酯中的PEG-琥珀酰亚胺α甲基丁酸酯或mPEG-琥珀酰亚胺丙酸酯。
进一步的，上述柱层析PEG与干扰素类似物蛋白氮端定点偶联的方法优选的实施方式是：
所述阳离子交换介质优选MacroCap SP或Sepharose Fast Flow。
所述IFNs-A为通过融合技术将柔性连接链(GlyGlyGlyGlySer)t与IFNs的N-末端融合而获得的融合蛋白：(GlyGlyGlyGlySer)t-N-IFNs；其中t为1～3，IFNs为重组人干扰素alfa-2b(IFN-α2b)、重组人干扰素alfa-2a(IFN-α2a)或重组人干扰素beta-1b(IFN-β1b)；
所述IFNs-A优选采用原核细胞表达体系中的大肠杆菌表达制备，尚包括人工合成和各种其他原核细胞、真核细胞、昆虫、植物或动物表达体系。
由大肠杆菌表达的Interferon beta1b的氨基酸序列与人天然Interferon beta 1b氨基酸序列相比，N-末端增加了Met(蛋氨酸)和Cys17Ser(17位Cys变为Ser)，而人Interferonbeta 1a由CHO细胞表达的糖蛋白，与人天然Interferon beta 1b氨基酸序列相同。
所述IFNs-A的唯一特征是，体外活性大于或等于IFNs原蛋白体外活性的70％。
所述IFNs-A的上样量优选为介质实测最大载量的30-50％。
所述mPEG的分子量优选30kDa；mPEG分子优选单链；所述mPEG的上样量按mPEG：IFNs-A的反应量比优选为5～20mol:1mol的比例。
所述mPEG优选mPEG-ALD；其分子式为mPEG-(CH₂)r-CHO，其中r选2～3，即mPEG-丙醛或mPEG-丁醛；
其中mPEG-丙醛的分子结构式如下所示；

mPEG-丁醛的分子式

所述柱层析IFNs-A氮端定点偶联mPEG的反应体系的pH优选为5.0～6.0。
本发明所述柱层析PEG与干扰素类似物蛋白氮端定点偶联的方法制得的一类聚乙二醇化重组人干扰素类似物蛋白，由非糖基化的IFNs-A的N-末端氨基与单一、单链的、分子量大于26kDa的PEG分子定点偶联而成；其特征在于：所述聚乙二醇化重组人干扰素类似物蛋白分子式为：CH₃-(CH₂CH₂-O)n-(CH₂)r-NH-(GlyGlyGlyGlySer)t-IFNs，式中n为570～2200，r为0～4，t为1～10；IFNs为重组人干扰素alfa或beta，其氨基酸序列应符合SEQID NO.1(其中23位为Arg，为Interferon alfa-2b，若23位为Lys即为Interferonalfa-2a)或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列公式；同时所述聚乙二醇化重组人干扰素类似物蛋白还应具备下列特征：
1)IFNs-A与mPEG偶联的分子比例为1∶1，偶联位点为IFNs-A分子N-末端氨基；
2)在比活性测定中，以Lowry法测定待测PEG-IFNs-A的蛋白浓度，WISH细胞/结晶紫法测体外活性，计算出每毫克蛋白的活性即得比活性，PEG-IFNs-A的比活性应大于或等于7.0X10E7 IU/mg蛋白；
3)PEG-IFNs-A的血浆半衰期比PEG-Intron即12kDa PEG与IFN a-2b的单修饰产物的血浆清除半衰期长50％以上；
4)在免疫原性测定中，PEG-IFNs-A在第12周IFN抗体阳性率应低于50％。
其中：上述聚乙二醇化重组人干扰素类似物蛋白分子结构式中n的更适范围为570～1000，n最佳值为700±100；r为1～3，r的更适范围为2～3；t为1～3；上述IFNs为重组人干扰素alfa-2b(IFN-α2b)、重组人干扰素alfa-2a(IFN-α2a)或重组人干扰素beta-1b(IFN-β1b)；
本发明所述一类聚乙二醇化重组人干扰素类似物蛋白同时具备分子量和分子结构上的均一性，是单链、单一大分子PEG与IFNs-A N-末端定点偶联产物；其中较优选的偶联产物是PEG-IFNsA-N30、PEG-IFNsA-N10、PEG-IFNsA-N20和PEG-IFNsA-N40。
本发明所述一类聚乙二醇化重组人干扰素类似物蛋白首选分子量30kDa PEG-ALD与IFNs-A N-末端定点偶联产物，即PEG-IFNsA-N30分子，具体优选PEG-IFNα2bA-N30或PEG-IFNβ1b A-N30。
本发明所述一类聚乙二醇化重组人干扰素类似物蛋白，在热稳定性和抗酶解性稳定性上明显优于普通IFNs-A，在体外细胞活性上大于或等于7.0X10E7 IU/mg蛋白；在体内应用时，与所述PEG-Intron相比，具有血浆半衰期明显延长、体内活性明显增高和免疫原性降低等长效制剂药代动力学与药效学特征；与所述Pegasys相比，具有体外活性明显提高和体内分布显著增加等特点。基于此，本发明所述一类聚乙二醇化重组人干扰素类似物蛋白，如PEG-IFNsA-N30(30kDa PEG-ALD与IFNs-A蛋白N-末端定点偶联产物)，是同时具备长效、高效和低免疫原性特征的长效制剂。
本发明所述聚乙二醇化重组人干扰素类似物蛋白在制备治疗乙型或丙型病毒性肝炎、多发性硬化症、风湿或类风湿性关节炎、恶性肿瘤、毛白血病和艾滋病卡波氏瘤药物中的应用。
进一步提供的，用于治疗乙型或丙型病毒性肝炎、多发性硬化症、风湿或类风湿性关节炎、恶性肿瘤、毛白血病和艾滋病卡波氏瘤等的胃肠外制剂，其中含有治疗有效量的本发明所述聚乙二醇化重组人干扰素类似物蛋白和药学上可接受的载体；更进一步的，所述制剂含有治疗有效量的本发明所述PEG-IFNα2bA-N30或PEG-IFNβ1b A-N30和药学上可接受的载体。
由治疗有效量的PEG-IFNs-A分子组成的胃肠外长效制剂，可实现1-4周注射一次；根据应用指征与治疗目的的不同，一次PEG-IFNs-A应用的剂量在0.1ug～300ug/kg体重/1天～4周，优选应用剂量范围在0.3ug-100ug/kg体重/1天～4周。
采用原核细胞表达体系(大肠杆菌)的表达制备IFNs和IFNs-A：
IFNs和IFNs-A基因克隆与高效表达
IFNs和IFNs-A基因克隆
本发明公开了构建高效表达重组人干扰素及其类似物(IFNs和IFNs-A)的大肠杆菌重组菌株的方法，由下述步骤组成；
重组人干扰素(IFNs)基因的合成以已知的IFNs(IFN-α2b，IFN-α2a，IFN-β1b)蛋白氨基酸序列为基础，对IFNs碱基序列进行重新设计，将密码子全部换为大肠杆菌喜好的密码子，同时考虑到DNA二级结构及GC含量做适当的修改，使整个基因不含有稀有密码子。将基因分别命名为IFN-a2b，IFN-α2a，IFN-β1b，并构建在pMD18-T载体上，进一步载体转化到Top10菌株中保存。
IFNs表达重组质粒的构建以合成的IFNs基因为模板，通过设计引物PCR体外扩增，克隆到大肠杆菌表达质粒上，获得IFNs表达重组质粒。根据修改后的IFNs基因序列，设计引物为：
IFN-α_F：5’-ATTAATCATATG TGCGATCTGC CGCAGACCCA-3
IFN-α_R：5’-ACTTGCCTCGAGTCATTCTTTGCTACGCAG-3
IFN-β1b_F：5’-ATTAATCATATGTCTTACAACCTGCTGGGT-3
IFN-β1b_R：5’-CGCCTCGAG TTA TTA GTT ACG CAG GTA ACC CGT-3’
以合成的基因为模板，利用PCR(聚合酶链式反应)体外扩增IFNs基因。基因经过Nde I和Xho I酶切，克隆入大肠杆菌表达载体，验证质粒的正确性，重组质粒命名为vector-IFN s。
IFNs-A表达重组质粒的构建以合成的IFNs基因为模板，通过设计引物PCR体外扩增，并在引物上加上(GlyGlyGlyGlySer)n，将产物克隆到大肠杆菌表达质粒上，获得IFN a-2b表达重组质粒。
IFN-a-A_F：5’-ATTAATCATATG(GGTGGAGGCGGTTCA)n TGCGATCTGCCGCAGACCCA-3(其中n为1～10，优选1～3)
IFN-α-A_R：5’-ACTTGCCTCGAGTCATTCTTTGCTACGCAG-3
IFN-β1b-A_F：5’-TAATCATATG(GGTGGAGGCGGTTCA)n TCTTACAACCTGCTGGGT-3(其中n为1～10，优选1～3)
IFN-β1b-A_R：5’-CGCCTCGAG TTA TTA GTT ACG CAG GTA ACC CGT-3’
以合成的基因为模板，利用PCR体外扩增IFNs-A基因。基因经过Nde I和Xho I酶切，克隆入大肠杆菌表达载体，并验证质粒的正确性，重组质粒命名为vector-IFN s-A。
高效表达IFNs及IFNs-A
将重组质粒vector-IFNs或vector-IFNs-A从活化后的DH5α菌株中提取出来转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。筛选高效表达菌株。
将表达重组质粒vector-IFNs或vector-IFNs-A转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。挑取LB平板中筛选后的阳性克隆，在无菌条件下用接种环接1～2环于5ml并加有终浓度为50～150微克/毫升的氨苄青霉素的发酵培养基中，30～40℃条件下，150～300转/分钟摇床振荡培养8～16小时，制得种子液；以1％～5％的接种量转接入装有50ml培养基的300ml三角瓶中。37℃剧烈振荡培养3h，使细菌处于对数生长中期，OD₆₀₀值约为0.8。从50ml对数生长期菌液中取1mL做对照，向其余菌液中加入1mol/L IPTG溶液，使其最终浓度为1mmol/L。加入IPTG后菌液继续培养1～4h，12000rpm离心10min，取上清与沉淀分别保存待用，最后离心收获细菌，检测目的蛋白的表达，选取表达量最高的菌株进行保存。
在上述方法中，大肠杆菌载体优选具有强启动子的载体，如T7或T5之一，且优选具有Nde I，Nco I酶切位点的大肠杆菌表达质粒，如pET22b、pET15b、pET28a之一；上述用于质粒扩增的宿主菌优选Top10、DH5α、JM109之一；上述用于表达的宿主菌优选BL21、BL21(DE3)pLysS之一。
IFNs或IFNs-A的制备
应用IFNs或IFNs-A大肠杆菌工程菌株经高密度发酵培养、发酵后处理、蛋白包涵体洗涤、复性及分离纯化等工艺(详见实施例1)，获得高纯度的IFNs蛋白。
从液氮罐中取出IFNs或IFNs-A菌种，37℃水浴速融；在严格无菌操作下，将IFNs或IFNs-A大肠杆菌工程菌接种于LB/Amp，置37℃培养箱培养12-15小时，选取单一菌落，转接在含LB/Amp培养管中，37℃250rpm振荡培养12-14小时；取10ml发酵液转接在1000mlLB/Amp发酵液中摇瓶培养(37℃，250rpm振荡)8-15小时，当菌液浓度达OD₆₀01.5～2.5时；再接种于15升发酵罐中培养，设发酵参数为温度37℃、pH7.0、溶氧35％及搅拌转速与溶氧联动。当OD₆₀₀值达20时，为工程菌对数增长的中期，加入IPTG诱导，持续2小时后终止发酵。冷却发酵液，使其降温至4-8℃。采用低温冷冻低速离心机离心(4000rpm，30分钟)收集细菌。
向收集的工程菌菌体沉淀中加入工程菌破碎缓冲液(50mM Tris，1mM EDTA，pH7.5缓冲液)。经高压匀浆机10000psi压力下破碎菌体。破菌后液体经高速冷冻离心机11000rpm转速离心(4℃，20分钟)获得包涵体(IB)粗品。使用包涵体洗涤液(50mM Tris，1mM EDTA，pH7.5，2.5％曲拉通×100，0.15M NaCl)反复洗涤三遍，即将包涵体洗涤液与包涵体经高速液体搅拌机充分混合，再在4℃10000g高速离心50-55分钟收集包涵体，，完成包涵体洗涤与纯化。将已纯化的包涵体按10克湿重比500毫升的比例溶解于包涵体溶解变性液中(50mM Tris，1mM EDTA，8M盐酸胍，1mM二巯基赤藓醇)，置4℃，12小时，获得包涵体溶解变性液，再经4℃10000g高速离心40-45分钟(Sorvall RC5B，11,000rpm)，收取上清。
按1∶100体积比将包涵体溶解变性液缓慢加入20mM醋酸钠缓冲液(pH6.0)，150mM氯化钠，3M尿素，0.005％聚山利醇酯80(polysorbate80)复性溶液中，4℃静置24小时，经0.45μm孔径滤膜过滤后，进行蛋白质提纯。
IFNs或IFNs-A蛋白复性液经过离子交换层析，平衡缓冲液为20mM醋酸钠缓冲液(pH4.5)，150mM氯化钠，0.005％聚山梨醇酯80；60ml/分钟上样，用0～1M氯化钠梯度洗脱，分离结果如图3所示，收集A280蛋白洗脱峰液。用上述平衡缓冲液平衡凝胶层析柱(层析柱BPG100，层析介质Superdex 75 prep grade)，按30ml/分钟的流速上样，每次上样持续5分钟(上样量约150ml)，上样120分钟后，收集出现的A280蛋白吸收峰，即为IFNs或IFNs-A原液。
以PEG-丙醛与IFNs-A蛋白N-末端特异性定点偶联方法为优选例，描述PEG化IFNs-A蛋白及其制备工艺
选择MacroCap SP或Sepharose FF阳离子交换介质，装载层析色谱柱，柱床高度达推荐高度的上限，并将其连接到AKTA Explorer 100液相层析系统(AmershamBioscience，Sweden)上，使用相当于5倍柱体积的20mM醋酸钠缓冲液pH3.5～6.0(缓冲液A)和0.005％聚山梨醇酯80充分平衡色谱柱；用进料泵，以10ml/min的流速，将IFNs-A原液加入色谱柱中，上样量为介质实测最大载量的10％～70％，更适范围为30-50％；再在15ml/min的流速下，用大约5倍柱体积的缓冲液A冲洗柱子，去除不与色谱介质发生静电吸附的物质；以0.5～3ml/min的流速，加入0.22mM～2.2mM30kDa的PEG丙醛(PEG-propionaldehyde)和2.2mM～22mM NaBH3CN溶液250ml～1500ml，连续上样约240分钟；反应体系的pH为3.5～6.0，更适为pH5.0～6.0；再以15ml/min的流速，用大约5倍柱体积的缓冲液A冲洗柱子，去除不与色谱介质发生静电吸附的物质；随后用缓冲液B(即缓冲液A+1mol氯化钠)，以洗脱方式0～8％、8％～18％和18％～100％洗脱，持续约150分钟，即可记录到如图1所示的离子交换层析谱图。图1显示，共可获得峰-1和峰-2两个洗脱峰，即P1和P2，其中P1的峰面积占总峰面积的72％；P1经还原型SDS-PAGE、高效凝胶色谱(SEC)和高效液相色谱(HPLC)纯度分析为单修饰PEG-IFNα2b-A，纯度大于95％(如图2，3，4所示)，该产物通过液质联用胰蛋白酶酶解肽图分析，确定是30kDa分子量的PEG-ALD与IFNs-A N-末端的定点偶联，偶联产物即PEG-IFNα2bA-N30。
同法可得PEG-IFNsA-N10、PEG-IFNsA-N20和PEG-IFNsA-N40等。
类似的，以PEG-NHS(聚乙二醇N-羟基琥珀酰亚胺)与IFNs-A蛋白N-末端特异性定点偶联方法为例，描述PEG化IFNs-A蛋白及其制备工艺：
选择MacroCap SP或Sepharose FF阳离子交换介质，装载层析色谱柱，柱床高度达推荐高度的上限，并将其连接到AKTA Explorer 100液相层析系统(AmershamBioscience，Sweden)上，使用相当于5倍柱体积的20mM醋酸钠缓冲液pH3.5～6.0(缓冲液A)和0.005％聚山梨醇酯80充分平衡色谱柱；用进料泵，以10ml/min的流速，将IFNs-A蛋白原液加入色谱柱中，上样量为介质实测最大载量的10％～70％，更适范围为30-50％；再在15ml/min的流速下，用大约5倍柱体积的缓冲液A冲洗柱子，去除不与色谱介质发生静电吸附的物质；以0.5～3ml/min的流速，加入0.22mM～2.2mM30kDa的PEG-NHS(聚乙二醇N-羟基琥珀酰亚胺)溶液250ml～1500ml，连续上样约240分钟；反应体系的pH为4.5～7.0，更适为pH6.0～7.0；再以15ml/min的流速，用大约5倍柱体积的缓冲液A冲洗柱子，去除不与色谱介质发生静电吸附的物质；随后用缓冲液B(即缓冲液A+1mol氯化钠)，以洗脱方式0～8％、8％～18％和18％～100％洗脱，持续约150分钟，即可记录到如图5所示的离子交换层析谱图。图5显示，单修饰PEG-IFNs-A的峰面积占79％的总峰面积，经液质联用胰蛋白酶酶解肽图分析确定为30kDa分子量PEG-NHS与IFNs-A蛋白的N-末端单一、定点偶联产物。
同法可得PEG-IFNsA-N10、PEG-IFNsA-N20和PEG-IFNsA-N40等。
类似的，以在凝胶层析柱上PEG-NHS(聚乙二醇N-羟基琥珀酰亚胺)与IFNs-A蛋白N-末端特异性定点偶联方法为例，描述PEG化IFNs-A蛋白及其制备工艺：
选择Superdex200凝胶层析介质，装载层析色谱柱(2.6/60cm)，并将其连接到AKTAExplorer100液相层析系统(Amersham Bioscience，Sweden)上，使用20mM醋酸钠缓冲液pH3.5～6.0(缓冲液A)和0.005％聚山梨醇酯80充分平衡色谱柱；用进料泵，将2～5mg/ml浓度的IFNs-A蛋白原液，按30ml/分钟的流速上样，每次上样量为1/10～20柱体积；以10～30ml/min的流速，加入0.22mM～2.2mM 30kDa的PEG-NHS(聚乙二醇N-羟基琥珀酰亚胺)溶液250ml～1500ml，连续上样约120分钟；反应体系的pH为3.5～6.0，更适为pH5.0～6.0；收集出现的A280蛋白吸收峰，可记录到如图6所示的凝胶交换层析谱图。由图6可以看到：主峰即为蛋白N-末端、30kDaPEG单一修饰的偶联产物PEG-IFNs-A(简称PEG-IFNsA-N30)。单修饰PEG-IFNs-A的峰面积占76％的总峰面积，经液质联用胰蛋白酶酶解肽图分析确定为30kDa分子量PEG-NHS与IFNs-A蛋白的N-末端单一、定点偶联产物。
同法可得PEG-IFNsA-N10、PEG-IFNsA-N20和PEG-IFNsA-N40等。
在液相反应体系中，以PEG-丙醛与IFNs-A蛋白N-末端特异性定点偶联方法为例，描述PEG-ALD与IFNs-A蛋白氨基特异性偶联：
取上述IFNs-A蛋白原液经超滤浓缩使蛋白浓度达2mg/ml，按8～40mol:1mol比例将分子量为30kDa的PEG丙醛(PEG-propionaldehyde)溶解于2mg/ml的IFNs-A蛋白原液；较适的比例是30kDa的PEG-ALD与IFNs-A原液摩尔比例为8～20mol:1mol；反应液为20mM～50mM醋酸钠缓冲液，pH5.0～6.0；再按1:1～5(w/w)比例加入浓度为7.5mg/ml的氰基硼氢化钠(NaBH3CN)，反应液于4℃～25℃下，静置4小时，按1：100(v/v)比例加入1mM稀盐酸溶液(pH3.5)终止反应，得PEG-IFNs-A。
用缓冲液20mM～50mM醋酸钠缓冲液，pH3.5～9.0，150mM～500mM氯化钠和0.005％聚山梨醇酯80溶液平衡Sepharose Fast Flow离子交换层析柱，按50ml/分钟流速连续上样PEG-IFNs-A反应液，经0～1M氯化钠溶液梯度洗脱，收集A280蛋白洗脱峰；获得三个洗脱峰，分别为多修饰PEG-IFNs-A、单修饰的PEG-IFNs-A和IFNs-A的洗脱峰。经计算，仅有约48％的PEG-IFNs-A为单修饰的PEG-IFNs-A，另37％为多修饰PEG-IFNs-A化合物；余14％为未反应的IFNs-A，如图7所示。
在液相反应体系中，描述以mPEG-SPA与IFNs-A蛋白N-末端特异性定点偶联：
取上述IFNs-A蛋白原液经超滤浓缩使蛋白浓度达1～2mg/ml。
按5～50mol:1mol比例将分子量为30kDa的mPEG-SPA(mPEG-琥珀酰亚胺丙酸酯)溶解于2mg/ml的IFNs-A原液；反应液为20mM～50mM PBS缓冲液，pH6.0～9.0；反应液于4℃～25℃下，静置15～180分钟，得PEG-IFNs-A。
用缓冲液20mM～50mM PBS缓冲液，pH4.5～7.0和0.005％聚山梨醇酯80溶液，平衡Sepharose Fast Flow离子交换层析柱，按50ml/分钟流速连续上样PEG-IFNs-A反应液，经0～1M氯化钠溶液梯度洗脱，收集A280蛋白洗脱峰；获得三个洗脱峰，分别为多修饰PEG-IFNs-A、单修饰的PEG-IFNs-A和IFNs-A的洗脱峰。经计算，仅有约23％的PEG-IFNs-A为单修饰的PEG-IFNs-A，另64％为多修饰PEG-IFNs-A化合物；余13％为未反应的IFNs-A，如图8所示。
本发明首次公开了在层析柱与传统液相反应体系中，干扰素融合蛋白与普通干扰素蛋白的聚乙二醇化反应产物收率的比较数据，如表1所示，在相同的反应条件下，其反应产物明显不同；这些结果显示，在层析(包括离子交换和凝胶层析)或传统液相反应体系中，干扰素融合蛋白IFNs-A与PEG-ALD或PEG-NHS的偶联反应所获N-末端单一、定点的PEG-IFNs-A的收率均显著高于普通干扰素蛋白IFNs，IFNα和IFNβ与PEG的反应趋势基本一致，只是IFNα所获单修饰N-末端PEG化产物即PEG-IFNα-A的相对收率增幅较大。
表1  层析与液相、干扰素融合蛋白与干扰素蛋白PEG化单修饰产物比较(X±SD，n＝8)


*与普通干扰素的PEG化单修饰产物收率比差别显著，P<0.01或P<0.05
PEG-IFNs和PEG-IFNs-A的理化性质和生物活性
本发明公开了PEG-IFNsA-N30、PEG-IFNsA-N40、PEG-IFNsA-N20和PEG-IFNsA-N10等的体外理化性质和生物活性数据，详见实施例3。
本发明发现，分子量为30kDa的大分子PEG与IFNs-A N-末端偶联后显著提高了PFG-IFNs-A的热稳定性和抗酶解稳定性等，这是此类分子具有体内外生物活性的基础之一(如表2所示)。
表2  PEG-IFNα2b-A-N30原液理化性质
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        项目                        结果
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HPLC纯度(高压液相色谱)               98％
SEC纯度(高效凝胶色谱)                98％
体外活性(IU/mg)                      7.5±0.38×10E7
分子量(MALDI-TOF)                    50.664kDa
热稳定性                             明显优于IFN-α-2b-A
体外抗酶解稳定性                     按1:25加入胰蛋白酶4h后，残留50％
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本发明重要而意外地发现(详见表4所示)，PEG化干扰素融合蛋白即PEG-IFNs-A的体外生物活性显著高于同分子量的PEG-IFNs，说明IFNs N-末端融合柔性多肽链(GlyGlyGlyGlySer)t可使PEG的偶联位点远离IFNs的活性位点，从而明显降低了PEG分子对IFNs活性的影响；另外，PEG-IFNα2b-A-N10的体外活性显著高于IFNα-2b-A和IFNα-2b，这一结果令人意外，因为，通常认为PEG大分子的偶联会显著降低IFNs-A或IFNs的活性，显然，这一发现具有潜在而重要的临床应用价值；IFNs或IFNs-A蛋白氮末端偶联PEG丙醛所获得的PEG-IFNs-N10～40或PEG-IFNs-A-N10～40其体外活性随着偶联PEG分子量的增大而逐步梯次降低，但在PEG-IFNs-N40或PEG-IFNs-A-N40处，体外活性的降低尤为显著，出现明显的活性“拐点”；此外，偶联两个20kDa PEG的diPEG-IFNs-N40或diPEG-IFNs-A-N40其体外活性显著低于同等分子量的PEG-IFNs-N40或PEG-IFNs-A-N40。这同时提示，双链PEG(如40kDa PEG-ALD为双链结构)或双位点偶联对体外活性的影响大于单连PEG(如30kDa PEG-ALD为单链结构)或单一位点。因此，本发明确认，首选单链PEG-ALD偶联IFNs-A的N-末端氨基。
PEG-IFNs-A的药代动力学试验
比较健康大鼠尾静脉注射PEG-IFNα2bA-N10、PEG-IFNα2bA-N20、PEG-IFNα2bA-N30和PEG-IFNα2bA-N40的血浆清除半衰期(t1/2)(详见表5所示)，发现随着PEG分子量的增大，PEG-IFNα2bA-N10～40的血浆清除半衰期显著延长，但在PEG-IFNα2bA-N40的血浆半衰期再次出现“拐点”，即在此点PEG分子量的增加带来的血浆半衰期的增长幅度明显降低，如PEG的分子量从10kDa增到20kDa和从20kDa增到30kDa，PEG-IFNα2bA-N20或PEG-IFNα2bA-N30的血浆半衰期都增加了约50％左右，而PEG的分子量从30kDa增到40kDa，PEG-IFNα2bA-N40的血浆半衰期却仅增加了约10％；与PEG-IFNα2bA-N40相比，PEG-IFNα2bA-N30的血浆半衰期和最大血药浓度的差别虽不显著，但其分布体积却明显高于PEG-IFNα2bA-N40近四倍，这可能与PEG-IFNα2bA-N40的皮下吸收明显降低有关，同时也具潜在的临床治疗学意义。
进一步的药物代谢试验意外发现(如图18所示)，大鼠尾静脉注射超大剂量PEG或PEG-IFNs-A，采用ELISA法测定尿液中的PEG含量，注射PEG20和PEG-IFNα2bA-N20组可以测到相当数量的PEG经尿液排除，而注射PEG30、PEG40、PEG-IFNα2bA-N30和PEG-IFNα2bA-N40组可检测到的PEG含量明显降低。这样的结果超出了人们以往的认识和实验结果，因为，通常认为：肾小球毛细血管壁分子过滤孔径为60-70kDa或3-5nm，而PEG分子拥有较球蛋白大得多的流体动力体积(hydrodynamic volume)，20kDa分子量的PEG的分子尺度(molecular size)可达7nm，远大于前述肾小球毛细血管壁分子过滤孔径，理论上注射PEG20和PEG-IFNα2bA-N20不应从肾脏清除，但采用敏感的抗PEG抗体ELISA法监测尿液中PEG的含量，却可检测到相当量的PEG从尿液排除；这同时可能是上述血浆清除半衰期出现“拐点”现象的解释。显然，这一发现对于开发长效制剂尤其具有意义和价值。
PEG-IFNs-A的免疫原性试验
本发明还公开了上述PEG-IFNs和IFNs免疫原性的试验资料，在正常大鼠上，采用1次/周、连续应用12周的给药方式，结果表明，PEG-IFNα2bA-N20、PEG-IFNα2bA-N30和PEG-IFNα2bA-N40的免疫原性均低于IFN-α2b-A，而PEG-IFNα2bA-N30和PEG-IFNα2bA-N40的免疫原性均低于PEG-IFNα2bA-N20，如表6所示。
以上述同样方法对PEG-IFNβ1bA-N10、PEG-IFNβ1bA-N20、PEG-IFNβ1bA-N30和PEG-IFNβ1b A-N40进行试验，结果表明，PEG-IFNβ1bA-N30的各项指标更优。
综合所获得的各种理化性质、生物活性、药代和免疫原性试验数据及结果，本发明首次证实并确认：作为长效、高效和低免疫原性制剂，PEG-IFNα2bA-N30或PEG-IFNβ1bA-N30较PEG-IFNα2bA-N10、PEG-IFNα2bA-N20、PEG-IFNα2bA-N40、PEG-IFNβ1bA-N10、PEG-IFNβ1bA-N20或PEG-IFNβ1b A-N40更具优势，应是最优选。因此，本发明所述的聚乙二醇化重组人干扰素类似物蛋白首选30kDa PEG-ALD与IFNs-A N-末端单一、定点偶联的聚乙二醇衍生物，即PEG-IFNsA-N30。
本发明中的IFNs和IFNs-A还可有多种来源，除上述特别列举的大肠杆菌表达体系外，尚包括人工合成和各种其他原核细胞、真核细胞、昆虫、植物或动物表达体系；同时IFNs和IFNs-A可以是全部的氨基酸序列组成的蛋白，也可以是经过突变的IFNs和IFNs-A序列组成的IFNs和IFNs-A变异体，或是改变部分氨基酸序列组成的IFNs类似物，以及在所述IFNs-A的分子N-末端突变蛋氨酸(Met)为半胱氨酸(Cys)即M1C；但其特征是：体外活性与其原IFNs蛋白相当或不低于其活性的70％，且低免疫原性或无免疫原性；上述各种IFNs蛋白均在本发明所涉及的范围之内。
本发明所涉及的PEG-IFNs-A分子为临床药用制剂的有效成分，该制剂中还可能包括：稀释剂(diluents)、稳定剂(stabilizers)、防腐剂(preservatives)、溶解剂(solubilizers)、乳化剂(emulsifiers)、佐剂(adjuvants)和载体(carriers)等。例如：1)稀释液：Tris-HCL、磷酸、醋酸等缓冲液；2)pH值和离子强度；3)去污剂和溶解剂：聚山梨醇酯20，聚山梨醇酯80；4)充填剂(bulking substances)：乳糖、甘露醇。详见Remington’s Pharmaceutical Science，18^th Ed(1990，Mack PublishingCo.，Easton，Pa.18042)Pages 1435：1712。有效成分的有效剂量是指考虑体重、年龄等因素的有效的治疗或预防剂量。本发明所涉及的PEG-IFNs-A其有效剂量范围在0.1ug-300ug/kg体重/1天～4周，较适合的有效剂量范围在0.3ug-100ug/kg体重/1天～4周。
本发明所涉及的PEG-IFNs-A临床药用制剂，为长效、高效、低免疫原性制剂，通常可达每1-4周注射一针的长效效果；PEG-IFNs-A临床药用制剂的应用间隔设计还与应用的指征和病人的实际情况有关。PEG-IFNs-A临床药用制剂，可皮下、肌肉、静脉和腹腔内注射；也可经吸入、舌下或透皮给药。
本发明可应用于治疗各种严重的病毒感染和恶性肿瘤，常见的指征包括：治疗乙型或丙型病毒性肝炎、多发性硬化症、风湿或类风湿性关节炎、恶性肿瘤(非何杰金氏病、黑色素瘤、乳腺癌等)、毛白血病(Hairy Cell Leukemia)和艾滋病卡波氏瘤等。
本发明所提供的资料和方法同样适用于其他细胞因子和抗体片段Fab’，scFv和Fc聚乙二醇化与长效、高效、低免疫原性制剂的开发，如重组人粒细胞集落刺激因子、重组人红细胞生成素、重组人肿瘤坏死因子受体蛋白等等。
附图说明
图1PEG-ALD与IFNs-A N-末端特异性定点偶联离子交换层析谱图
其中：P1为单修饰PEG-IFNα2b-A，P2为未反应的IFNα2b-A。
图2SDS-PAGE PG-N-30分子量测定(银染)
显示PEG-IFNα2bA-N30的分子量为66.2kDa，为单修饰PEG-IFNα2bA-N30。
图3高效凝胶色谱(SEC)测定PEG-IFNsA-N30纯度
显示主峰面积大于95％，经检定为单修饰PEG-IFNα2bA-N30，其前的小峰为多修饰PEG-IFNα2bA-N30。
图4高效液相色谱(RT-HPLC)测定PEG-IFNsA-N30纯度
显示主峰面积大于98％以上，经检定为单修饰PEG-IFNα2bA-N30。
图5PEG-NHS与IFNs-A N-末端特异性定点偶联离子交换层析谱图
其中：P1为单修饰PEG-IFNs-A占总峰面积的79％，P2为未反应的IFNs-A占总峰面积的28％。
图6PEG-NHS与IFNs-A N-末端特异性定点偶联凝胶层析谱图
其中：峰1为多修饰PEG-IFNs-A占总峰面积的10％，，峰2为单修饰PEG-IFNs-A占总峰面积的76％，峰3为未反应的IFNs-A占总峰面积的14％。
图7高效凝胶色谱分析液相PEG-ALD与IFNs-A偶联反应产物
其中：峰-1为多修饰PEG-IFNs-A，占总峰面积的33.90％，峰-2为二修饰PEG-IFNs-A，占总峰面积的3.14％，峰-3为单修饰PEG-IFNs-A，占总峰面积的48.47％，峰-4为未反应IFNs-A，占总峰面积的14.49％。
图8高效凝胶色谱分析液相mPEG-SPA与IFNs-A偶联反应产物
其中：峰-1为多修饰PEG-IFNs-A，占总峰面积的63.81％，峰-2为单修饰PEG-IFNs-A，占总峰面积的22.50％，峰-3为未反应IFNs-A，占总峰面积的13.69％。
图9IFNs及IFNs-A原核表达系统质粒构建图。
图10SDS-PAGE rhG-CSF的表达量分析。
图11还原型SDS-PAGE测定IFNs-A分子量
其中：IFNα2a-A，IFNα2b-A和IFNβ1b-A的分子量均在18kDa。
图12高效液相色谱(HPLC)法测定IFNα2b-A原液纯度。
图13高效凝胶色谱法(SEC)测定IFNα2b-A原液的纯度。
图14-1PEG-ALD(30kDa)的MALDI-TOF-MS分子量测定结果。
图14-2实施例2峰1MALDI-TOF-MS分子量测定结果。
图15-1PEG-IFNα2bA-N30(1mg/mL/支)在37℃条件下静置1个月后，经过高效凝胶检测结果
其中：峰1为PEG-IFNα2bA-N30多聚体占0.5％，峰2为PEG-IFNα2bA-N30二聚体1.1％，峰3为单修饰PEG-IFNα2bA-N30占98.4％。
图15-2IFN-α-2b-A(1mg/mL/支)在37℃条件下静置1周后，经过高效凝胶检测结果
其中：峰1为IFN-α-2b-A占38.4％，峰2为IFN-α-2b-A聚集体占61.6％。
图16IFN-α2b-A和PEG-IFNα2bA-N30体外酶解反应图。
图17PEG-IFNα2bA-N10～40化合物分子量与血浆半衰期的关系。
图18ELISA法动物尿液PEG含量测定结果
图中PEG-IFNsA-N20为PEG-IFNα2bA-N20。
*与PEG30，PEG40，PEG-IFNα2bA-N30和PEG-IFNα2bA-N40各组值相比差别显著(P<0.05或P<0.01)。
具体实施方式
下面的实施范例有助于进一步阐述本发明，但本发明所涉及的内容与范围不仅限于这些范例所述。
实施例1  表达与制备IFNs和IFNs-A
1-1：表达IFNs和IFNs-A
构建原核表达系统pET22b-IFNs及pET22b-IFNs-A高效表达IFNs及IFNs-A，所用菌株为大肠杆菌DH5α(E.coli DH5αLacZΔM15 hsdR recA)，大肠杆菌BL21(DE3)(E.coliBL21(DE3))和大肠杆菌BL21(DE3)/pLysS(E.coli BL21(DE3)/pLys)；所用质粒为pET22b；以上菌株和质粒均购自Novagen公司。所用分子克隆用酶和试剂包括：限制性内切酶Nde I、Xho I；Pfu DNA聚合酶(购自上海博亚生物试剂公司)、Agarose Gel DNAPurification Kit，T4连接酶，DNA Fragment Purification Kit(购自OMEGA Ltd.)、核酸分子量标准1Kb Marker(购自BioLab)和蛋白分子量标准(14.4-97.OkDa)(购自上海生化所)。
合成人干扰素(IFNs)基因
IFNs为重组人干扰素alfa和beta，优选重组人干扰素alfa-2b(IFN-α2b)、重组人干扰素alfa-2a(IFN-α2a)和重组人干扰素beta-1b(IFN-β1b)，其氨基酸序列应符合SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列公式。碱基序列进行重新设计，将它们的密码子全部换为大肠杆菌喜好的密码子，同时考虑到DNA二级结构及GC含量做适当的修改，使整个基因不含有稀有密码子。密码替换前序列如SEQ ID NO.3(其中67-69位为AGA即为Interferon alfa-2b，若67-69位为aag即为Interferon alfa-2a)和SEQ ID NO.4所示，替换后合成的编码序列如SEQ ID NO.5和SEQID NO.6(其中67-69位为AGC即为Interferonalfa-2b，若67-69位为aag即为Interferon alfa-2a)。产物均为共165个氨基酸，蛋白的一级结构没有其他变化。只是重组表达的产物在N-末端会比天然产物多了一个Met。合成的基因构建在pMD18-T载体上，载体转化到Top10菌株中保存。
IFNs基因的克隆
根据修改后的IFNs基因序列，设计引物：
IFN-α_F：5’-ATTAATCATATG TGCGATCTGC CGCAGACCCA-3
IFN-α_R：5’-ACTTGCCTCGAGTCATTCTTTGCTACGCAG-3
IFN-β1b_F：5’-ATTAATCATATGTCTTACAACCTGCTGGGT-3
IFN-β1b_R：5’-CGCC TCGAG TTA TTA GTT ACG CAG GTA ACC CGT-3’
以pMD18-T/IFNs为模板，利用PCR(聚合酶链式反应)体外扩增IFNs序列。
PCR反应体系组成为：(引物浓度为20μmol/L)10×缓冲液5μl，25mmol/L MgCl24μl，10mmol/L，四种dNTP混合液1μl；上下游引物各1μl；TaqDNA聚合酶0.5μl；模板DNA1μl，加水补至50μl。设PCR反应条件：97℃预变性10分钟，94℃变性60秒，56℃退火60秒，72℃延伸60秒，30个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。电泳检测片段的大小。琼脂糖浓度为0.8％。
IFNs-A基因的克隆
根据修改后的IFNs基因序列，设计引物，并在引物上加上(GlyGlyGlyGlySer)n：
IFN-a-A_F：5’-ATTAATCATATG(GGTGGAGGCGGTTCA)n TGCGATCTGCCGCAGACCCA-3(其中n为1～5，优选1～3)
IFN-a-A_R：5’-ACTTGCCTCGAGTCATTCTTTGCTACGCAG-3
IFN-β1b-A_F：5’-TAATCATATG(GGTGGAGGCGGTTCA)n TCTTACAACCTGCTGGGT-3(其中n为1～5，优选1～3)
IFN-β1b-A_R：5’-CGC CTCGAG TTA TTA GTT ACG CAG GTA ACC CGT-3’
以pMD18-T/IFNs为模板，利用PCR(聚合酶链式反应)体外扩增IFNs序列。PCR反应体系同上。
构建IFNs及IFNs-A表达重组质粒将PCR得到片断和pET22b质粒利用Nde I、XhoI核酸内切酶进行双酶切消化。然后利用PCR产物回收试剂盒(购自OMEGA公司)回收纯化酶切的片段。利用T4连接酶(购买于MBI公司)连接，反应组成体系为：
IFNa-2b基因片段6μl，pET22b片断2μl，连接液缓冲液(10X)1μl，T4连接酶1μl，连接反应在22℃下进行，反应时间为4小时，反应体系为10μl。经连接后得到重组环境诱导型表达质粒pET22b-IFNs及pET22b-IFNs-A。
IFNs及IFNs-A表达重组质粒的验证扩增
将含有重组质粒pET22b-IFNs或pET22b-IFNs-A转化进入大肠杆菌DH5α。将单菌落挑取转入含有100微克/毫升的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，225转/分钟下培养过夜。利用质粒试剂盒提取重组质粒pET22b-IFNs和pET22b-IFNs-A，验证质粒的大小。并用NdeI、Xho I核酸内切酶双酶切分析，筛选含有IFNs或IFNs-A基因片段的重组质粒转化子。重组质粒图谱见图9。
IFNs及IFNs-A基因在大肠杆菌中表达
将经过验证的重组质粒pET22b-IFNs或pET22b-IFNs-A转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。挑取LB平板中筛选后的阳性克隆，在无菌条件下用接种环接1～2环于5ml并加有终浓度为50～150微克/毫升的氨苄青霉素的发酵培养基中，30～40℃条件下，150～300转/分钟摇床振荡培养8～16小时，制得种子液；以1％～5％的接种量转接入装有50ml培养基的300ml三角瓶中。37℃剧烈振荡培养3h，使细菌处于对数生长中期，OD₆₀₀值约为0.8。从50ml对数生长期菌液中取1mL做对照，向其余菌液中加入1mol/L IPTG溶液，使其最终浓度为1mmol/L。加入IPTG后菌液继续培养1～4h，12000rpm离心10min，取上清与沉淀分别保存待用，最后离心收获细菌，检测目的蛋白的表达。
目的蛋白检测
取1.5mL诱导的培养物，12000rpm离心30秒，弃上清；沉淀用PBS洗一次，加50μL灭菌双蒸水和50μL2×SDS加样缓冲液，重悬沉淀，煮沸5-10分钟，10000rpm离心10min，取上清备用；在浓缩胶进行8V/cm稳压电泳，当溴酚兰指示剂进入分离胶后改为15V/cm稳压电泳至溴酚兰带迁移至离凝胶底部1cm，取出凝胶用考马斯亮兰染色液染色4小时以上，随后转入脱色液中，脱色至背景清晰。SDS-PAGE结果见图10，产物表达量占菌体总蛋白的25％左右。
1-2：制备IFNs和IFNs-A
从液氮罐中取出IFNs或IFNs-A菌种，37℃水浴速融；在严格无菌操作下，将IFNs或IFNs-A大肠杆菌工程菌接种于LB/Amp(配方组成为100ml中含胰蛋白胨1克、酵母浸膏0.5克、氯化钠0.5克、氢氧化钠4毫克、琼脂粉1.5克和氨苄青霉素5毫克)，置37℃培养箱(SANYO MCO-17AIC)培养12-15小时，选取单一菌落，转接在12ml LB/Amp(配方组成为100ml中含胰蛋白胨1克、酵母浸膏0.5克、氯化钠0.5克、氢氧化钠4毫克和氨苄青霉素5毫克)培养管中，37℃250rpm振荡培养(HWY111恒温摇床)12小时；取10ml发酵液转接在1000ml LB/Amp发酵液中摇瓶培养(37℃，250rpm振荡)8-12小时，当菌液浓度达OD₆₀₀ 1.5～2.5时；再接种于15升发酵罐(B.Braun BIOSTAT C)中培养，每升发酵液含胰蛋白胨12克、酵母浸膏24克、磷酸二氢钾3.8克、磷酸氢二钾12.5克、硫酸镁0.5克、甘油6.3克、纯水0.9升、葡萄糖20克和氨苄青霉素0.1克；设发酵参数为温度37℃、pH7.0、溶氧35％及搅拌转速与溶氧联动。当OD₆₀₀值达20时，为工程菌对数增长的中期，加入IPTG诱导，持续2小时后终止发酵。冷却发酵液，使其降温至4-8℃。采用Sorvall大容量低温冷冻低速离心机(Sorvall RC3B)离心(4000rpm，30分钟)收集细菌。
向收集的工程菌菌体沉淀中加入工程菌破碎缓冲液(50mM Tris，1mM EDTA，pH7.5缓冲液)。经APV高压匀浆机(APV 2000)10000psi压力下破碎菌体。破菌后液体经高速冷冻离心机(Sorvall RC5B)SLA-3000转头11000rpm转速离心(4℃，20分钟)获得包涵体(IB)粗品。使用包涵体洗涤液(50mM Tris，1mM EDTA，pH7.5，2.5％曲拉通×100，0.15M NaCl)反复洗涤三遍，即将包涵体洗涤液与包涵体经高速液体搅拌机充分混合，再经低温(4℃)高速离心(Sorvall RC5B，11000rpm，50分钟)收集包涵体，完成包涵体洗涤与纯化。将已纯化的包涵体按10克湿重比500毫升的比例溶解于包涵体溶解变性液中(50mM Tris，1mMEDTA，8M盐酸胍，1mM二巯基赤藓醇)，置4℃，12小时，获得包涵体溶解变性液，再经4℃10000g高速离心40分钟(Sorvall RC5B，11,000rpm)，收取上清。
按1∶100体积比将包涵体溶解变性液缓慢加入20mM醋酸钠缓冲液(pH6.0)，150mM氯化钠，3M尿素，0.005％聚山利醇酯80(polysorbate80)复性溶液中，4℃静置24小时，经0.45μm孔径滤膜过滤后，进行蛋白质提纯。
IFNs或IFNs-A蛋白复性液经过离子交换层析(层析设备AKTA purifier，层析柱INdEX200/500，层析介质Sepharose big bead)，平衡缓冲液为20mM醋酸钠缓冲液(pH4.5)，150mM氯化钠，0.005％聚山梨醇酯80；60ml/分钟上样，用0～1M氯化钠梯度洗脱，收集A280蛋白洗脱峰液。用上述平衡缓冲液平衡凝胶层析柱(层析柱BPG100，层析介质Superdex75 prep grade)，按30ml/分钟的流速上样，每次上样持续5分钟(上样量约150ml)，上样120分钟后，收集出现的A280蛋白吸收峰，即为IFNs或IFNs-A原液。
还原型SDS-PAGE银染测定IFNs-A分子量(如图11)，以及高效液相色谱(HPLC)法和高效凝胶色谱法(SEC)测定IFNα2b-A原液，结果如图12和图13所示，方法同实施例3所述方法相同。结果表明IFNs-A的分子量约为18kDa；而IFNα2b-A原液HPLC和SEC纯度均大于98％。
实施例2  PEG-ALD与IFNs-A N-末端定点偶联制PEG-IFNs-A
装载MacroCap SP强阳离子交换色谱柱(2.6cmX20cm)，并将其连接到AKTA Explorer 100液相层析系统(Amersham Bioscience，Sweden)上，使用20mM醋酸钠缓冲液pH5.0(缓冲液A)和0.005％聚山梨醇酯80 500ml充分平衡色谱柱；用进料泵，以10ml/min的流速，将IFNs-A原液0.5mg/ml 1500ml加入色谱柱中；再在15ml/min的流速下，用大约500ml缓冲液A冲洗柱子，去除不与色谱介质发生静电吸附的物质；以3ml/min的流速，加入5mg/ml30kDa的PEG丙醛(PEG-propionaldehyde)和0.1mg/ml NaBH₃CN溶液1500ml，连续上样约240分钟；反应体系的pH为5.0；再以15ml/min的流速，用大约500ml缓冲液A冲洗柱子，去除不与色谱介质发生静电吸附的物质；随后用缓冲液B(即缓冲液A+1mol氯化钠)，以洗脱方式0～8％、8％～18％和18％～100％洗脱，持续约150分钟，即可记录到如图1所示的离子交换层析谱图。
图1显示，共可获得峰1和峰2两个洗脱峰，即P1和P2，其中P1的峰面积约占总峰面积的72％；P2占总峰面积的28％。P1经还原型SDS-PAGE、高效凝胶色谱(SEC)和高效液相色谱(HPLC)纯度分析为单修饰的PEG-IFNα2b-A，纯度大于95％(如图2，3，4所示)。该产物通过液质联用胰蛋白酶酶解肽图分析确定30kDa分子量PEG-ALD的偶联位点为IFNa2b-A的N-末端，即PEG-IFNa2bA-N30。
同样方法，PEG-ALD与IFNs N-末端定点偶联可制PEG-IFNs。
在上述层析柱PEG蛋白N-末端定点偶联法中，若仅改变反应体系的pH值，如在pH4.0、pH5.0和pH6.0下(详见表3)，洗脱峰的组成和比例将会改变，但单修饰PEG-IFNα2b-A经液质联用胰蛋白酶酶解肽图分析鉴定仍是30kDa分子量的PEG-ALD与IFNα2b-A N-末端的定点偶联，即PEG-IFNα2bA-N30。提示这种PEG-ALD对蛋白N-末端的特异性选择并非因pH值的降低或酸性所致。
表3  反应体系pH值的改变对层析柱PEG蛋白N-末端定点偶联的影响
-------------------------------------------------------
                    pH＝4.0    pH＝5.0   pH＝6.0
-------------------------------------------------------
单修饰PEG-IFNa2b-A  50％       72％      58％
多修饰PEG-IFNa2b-A  0          0％       28％
未反应IFNa2b-A      50％       28％      14％
-------------------------------------------------------
实施例3  PEG-IFNα-A的理化性质与体外活性
1)MALDI-TOF-MS分子量测定
在基质辅助激光解析-电离时间飞行质谱仪Bruker Daltonics Autoflex 3(BrukerDaltonics Billerica公司，美国)上，按操作程序进行MALDI靶的清洗和晾干，采用Zip TipC4(Millipore公司，美国)枪头脱盐、浓缩待测样品；吸取10ul待测样品和标准品点靶；设仪器操作程序条件为：延迟提取时间(Delayed extraction)190ns、检测模式为Linearion mode/positive ion mode、激光频率(Laser frequency)50Hz、加速电压(AceceleratingVoltage)20KV、图形叠加(sum shots)400次、校正模式为External calibration；通过标准样品的校正，进行样品测定，并对数据处理可获MALDI-TOF-MS分子量测定图谱；如图14-1和图14-2所示。图14-1为实施例2中所用修饰剂PEG-ALD(30kDa)的MALDI-TOF-MS分子量测定结果，为32439.3道尔顿，结果表明MALDI-TOF-MS法测定PEG-ALD(30kDa)的分子量与其标记分子量接近；图14-2所示为上述实施例2中所获峰1测定结果，PEG-IFNα2bA-N30的分子量为50664.679道尔顿，说明为单修饰PEG-IFNaA。
2)高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)蛋白度测定
在Agilent 1100色谱仪(美国安捷伦公司生产)上，选用碳4Vydac C4蛋白色谱柱(公司)，以A相三氟乙酸水溶液(取1.0ml三氟乙酸加水致1000ml)和B相三氟乙酸乙腈溶液(取1.0ml三氟乙酸加入色谱纯乙腈致1000ml)为流动相；在室温下，设流速为1ml/min、压力为76bar，进行梯度洗脱(0～70％B相)；待测样品上样体积20ul，上样量不低于30ug，于波长280nm检测。按面积归一化法计算各峰面积。如图4，图12所示。
3)高效凝胶色谱(Size Exclusion Chromatography，SEC)蛋白纯度测定
在Agilent1100色谱仪(美国安捷伦公司生产)上，选用凝胶过滤色谱柱Superdex^TM200，HR10/30(GE Healthcare Biosciences公司)，流动相为50mM的磷酸钠缓冲液(内含有0.1M的硫酸钠)，pH6.7；设流速为0.5ml/min、压力为16bar、温度：为25℃；检测波长280nm，波宽4nm；参比波长360nm，波宽100nm；待测样品上样量不低于20ug；采用面积归一法进行计算各峰面积。如图3，图7，图8，图13，图15-1，15-2所示。
4)IFNs体外活性
采用体外WISH细胞/结晶紫法测定并比较了IFNs和各种PEG-IFNs-A的体外活性，结果如表4所示。
WISH细胞/结晶紫法：详细方法见中华人民共和国药典2005年版三部附录XC。WISH细胞和水泡性口炎病毒(VSV)购自中国药品生物制品检定所；37℃、5％二氧化碳条件下，使WISH细胞在含10％新生牛血清的RPMI 1640培养基(含青霉素10E5IU/L和链霉素10E5IU/L)中贴壁生长，按1：4传代，每周2～3次；弃去培养液，用PBS缓冲液清洗细胞2次，收集细胞，再用上述培养基配成每1ml含2.5×10E5～3.5×10E5个细胞的细胞悬液，继续培养4～6小时；在加有标准品溶液和供试品溶液的96孔细胞培养液板中每孔加入细胞悬液100μl，于37℃、5％二氧化碳培养18-24小时；弃去培养孔中的上清液，每孔加入100μl攻毒培养液(3％新生牛血清的RPMI 1640培养基中含VSV 100CCID50)，继续培养24小时；镜检确认标准品溶液的50％病变点在1IU/ml后，弃去培养孔中的上清液，每孔加入结晶紫染色液50μl(结晶紫50mg溶于20ml无水乙醇中，加水至100ml)，置室温下30分钟后，用流水小心冲去染液，并吸干残留水分，每孔加入脱色液100μl(无水乙醇50ml、乙酸0.1ml加水至100ml)，室温放置3～5分钟；混匀后，放入酶标仪(Bio-Tek公司，USA)，以630nm为参比波长，于波长570nm处测定吸光度值。
表4  IFNs体外活性测定结果
---------------------------------------------------------------------------
IFNs                                 PEG-IFNs             PEG-IFNs-A^＊
---------------------------------------------------------------------------
IFN-α2b           1.5±0.45×10E8
IFN-α2b-A         1.4±0.38×10E8
IFN-α2a           1.0±0.41×10E8
IFN-α2a-A         1.2±0.49×10E8
PEG-IFNα2b-N10                       1.8±0.35×10E7      1.8±0.63×10E8_△
PEG-IFNα2b-N20                       3.5±0.42×10E6      1.1±0.59×10E8_△
PEG-IFNα2b-N30                       1.9±0.36×10E6      7.5±0.38×10E7_△
PEG-IFNα2b-N40                       1.3±0.35×10E6      2.5±0.33×10E7_△
diPEG-IFNα2b-N40                     4.4±0.41×10E5      1.1±0.37×10E6_△
IFN-β1b           1.1±0.39×10E8
IFN-β1b-A         1.0±0.51×10E8
PEG-IFNβ1b-N10                       1.0±0.43×10E8      1.0±0.49×10E8
PEG-IFNβ1b-N20                       6.8±0.42×10E7      5.5±0.40×10E7
PEG-IFNβ1b-N30                       4.9±0.34×10E7      4.4±0.35×10E7
PEG-IFNβ1b-N40                       2.5±0.33×10E6      7.5±0.45×10E6_△
diPEG-IFNβ1b-N40                     8.5±0.53×10E5      2.2±0.37×10E6_△
-----------------------------------------------------------------------------
^＊PEG-IFNs-A为PEG化干扰素融合(GlyGlyGlyGly Ser)3蛋白；
_△PEG-IFNs-A与偶联相同分子量PEG的PEG-IFNs相比差异显著，P<0.01；
PEG-IFNα2a-N10～40体外活性的变化趋势与PEG-IFNα2b-N10～40相似，具体数据未显示。
从表4中可以看出：PEG-IFNs-A的体外生物活性显著高于同分子量的PEG-IFNs，说明IFNs N-末端融合柔性多肽(Gly Gly Gly Gly Ser)3可显著改善PEG分子对IFNs分子活性的影响；PEG-IFNα2b-A-N30比IFNα-2b-A和IFNα-2b的体外活性明显为高；IFNs或IFNs-A蛋白氮末端偶联PEG丙醛所获得的PEG-IFNs-N10～40或PEG-IFNs-A-N10～40其体外活性随着偶联PEG分子量的增大，体外活性逐步梯次降低，但在PEG-IFNs-N40或PEG-IFNs-A-N40处，体外活性的降低尤为显著，出现明显的活性“拐点”；偶联两个20kDaPEG的diPEG-IFNs-N40或diPEG-IFNs-A-N40其体外活性显著低于同等分子量的PEG-IFNs-N40或PEG-IFNs-A-N40。
5)PEG-I FNα2bA-N30制剂的热稳定性
在10mM醋酸钠缓冲液(pH4.5)、0.005％聚山梨醇酯80、5％山梨醇的溶液中，蛋白浓度为1mg/ml PEG-IFNα2bA-N30，在37℃下保持1个月，经SEC测定未发现蛋白聚集或降解(如图15-1所示)，而IFN-α2b-A此条件下保存1周即出现少量蛋白聚集，为可溶性聚集体(如图15-2所示)；说明PEG化IFN-α2b-A明显增加了蛋白的热稳定性。
6)PEG-IFNα2bA-N30体外抗酶解稳定性
用超纯水透析待测样品24小时，冻干(冷冻干燥机，Alphal-2，Matin Christ，USA)待测样品后，用1％碳酸氢铵水溶液溶解致1.5mg/ml，按1：25(w/w)加入TPCK处理过的胰蛋白酶(TPCK treated TRYPSIN，Sigma，USA)与待测样品，PEG-IFNα2bA-N30和IFN-α2b-A在37℃恒温下共同孵育，分别在15、30、60、120和240分钟取样，SDS-PAGE法测原蛋白酶解百分比，结果如图16所示，结果表明，PEG-IFNα2bA-N30酶解4小时后，尚有50％未被酶解，而IFN-α2b-A在1小时即被酶解约50％。说明PEG-IFNα2bA-N30的抗酶解稳定性远远高于普通IFN-α2b-A。
实施例4　PEG-IFNs-A药代动力学试验
4-1：选健康SD大鼠进行药代动力学试验，经尾静脉注射100ug/kg的IFNs、PEG-Intron(佩乐能，上海先灵葆雅公司)、PEGASyS(派罗欣，上海罗氏制药公司)和各种PEG-IFNs-A，在0，15min，30min，1，3，5，8，24，48，72，96，120小时取血，每种化合物每一取血时间点同时取三只动物，ELISA法(美国R&D公司，晶美公司分装)测定血药浓度，每种待测样品在动物试验前均应行敏感度、精确性和线性范围的体外测试，并作出相应的标准曲线，测定结果经计算获得血浆清除半衰期值，如表5所示。
表5  大鼠注射各种PEG-IFNs-A的药代动力学参数
---------------------------------------------------------------------------------------
IFNs化合物            route  Tmax(h)   t_1/2(h)  Cmax(ng/ml)  CL(ml/h/kg)  Vss(ml/kg)
---------------------------------------------------------------------------------------
IFNα2b-A              iv     --        1.1      --          190           205
IFNα2a-A              iv     --        1.3      --          195           180
PEG-Int ron           iv     --        15.3     --          105           130
PEGASYS               iv     --        32.8     --          15            23
PEG-IFNα2bA-N10       iv     --        13.2     --          85            110
PEG-IFNα2bA-N20       iv     --        20.7     --          20            55
PEG-IFNα2bA-N30       iv     --        29.3     --          17            46
PEG-IFNα2bA-N40       iv     --        32.5     --          12            10
diPEG-IFNα2bA-N40     iv     --        47.2     --          12            18
PEG-IFNα2bA-N10       sc     10        17.2     15.9        --            --
PEG-IFNα2bA-N20       sc     24        27.8     20.7        --            --
PEG-IFNα2bA-N30       sc     32        43.9     28.9        --            --
PEG-IFNα2bA-N40       sc     48        48.8     33.3        --            --
IFNβ1b-A              iv     --        0.98     --          180           180
PEG-IFNβ1bA-N10       iv     --        11.3     --          110           125
PEG-IFNβ1bA-N20       iv     --        17.7     --          76            83
PEG-IFNβ1bA-N30       iv     --        25.4     --          33            51
PEG-IFNβ1bA-N40       iv     --        27.6     --          23            13
---------------------------------------------------------------------------------------
Route为给药途径，Tmax(h)为达峰时间，t1/2(h)为血浆清除半衰期，Cmax(ng/ml)为峰浓度，
CL(ml/h/kg)为清除率，Vss(ml/kg)为分布体积。
比较健康大鼠尾静脉注射PEG-IFNα2bA-N10、PEG-IFNα2bA-N20、PEG-IFNα2bA-N30和PEG-IFNα2bA-N40的血浆清除半衰期(t_1/2)，发现随着PEG分子量的增大，PEG-IFNα2bA的血浆清除半衰期显著延长，但在PEG-IFNα2bA-N40的血浆半衰期出现“拐点”(见图17)，即在此点PEG分子量的增加带来的血浆半衰期的增长幅度明显降低，如PEG的分子量从10kDa增到20kDa和从20kDa增到30kDa，PEG-IFNα2bA-N20或PEG-IFNα2bA-N30的血浆半衰期都增加约50％左右，而PEG的分子量从30kDa增到40kDa，PEG-IFNα2bA-N40的血浆半衰期却仅增加了约10％，但PEG-IFNα2bA-N40的分布体积(Vss)却明显降低近四倍(如表5所示)，同时与PEG-IFNα2bA-N30相比，皮下注射(sc)PEG-IFNα2bA-N40的血浆半衰期和最大血药浓度增加不多，这可能与PEG-IFNα2bA-N40皮下吸收较慢有关。
4-2：选健康Wistar大鼠36只，随机分为6组，尾静脉分别缓慢注射PEG20，PEG30，PEG40，PEG-IFNα2bA-N20、PEG-IFNα2bA-N30和PEG-IFNα2bA-N404,000ug/kg，每隔6小时收取动物尿液，-20℃保存，使用抗PEG ELISA试剂盒(Epitomics公司，美国)测定尿液中的PEG含量，结果图18所示。抗PEG ELISA试剂对上述各种PEGs和PG-Ns的检测敏感度大于1ng/ml，在500ng/ml～1ng/ml之内，PEG浓度对数与吸光值对数呈直线相关。
图18的结果提示，当PEG的分子量大于30kDa以上后，PEGs和PEG-IFNs-A从肾小球毛细血管壁的通透性显著降低，因此PEG-IFNα2bA-N30出现药代动力学血浆清除半衰期参数的“拐点”。
实施例5  PEG-rhG-CSF的免疫原性试验
在健康SD大鼠上，受试化合物(每组15只大鼠)按每周皮下注射一次、每次50μg/kg的给药模式，连续给药、观察12周，于第1周和第8，10，12周抽血测定抗PEG-IFNs抗体；采用间接ELISA法测定PEG-IFNs抗体(美国R&D公司，即将PEG-IFNs(抗原)用pH9.6的Na2C03-NaHC03溶液稀释成10μg/ml浓度，包被于96孔酶标板上，每孔100μl，4℃过夜。用2％BSA封闭液37℃封闭2h后，各孔加入100μl用样品稀释液稀释的待检血清样品，同时设阳性和阴性对照孔，37℃孵育1h。洗涤后每孔加100μl辣根过氧化物酶标记的羊抗大鼠IgG(1:6万)，37℃再孵育1h。洗涤后各孔加100μl酶反应底物TMB，37℃反应20min。用50μl终止液终止反应，在酶标微板读数仪上读取各孔450nm处的OD值。抗体阳性率的判断：以同期赋形剂对照组动物血清标本所测得OD值的2.1倍作为产生抗体的阈值，凡给药后血清标本测得的OD值大于或等于阈值者，判定为阳性。结果表明(如表6所示)：PEG-IFNα2bA-N20、PEG-IFNα2bA-N30和PEG-IFNα2bA-N40的免疫原性均低于IFN-α2b-A，而PEG-IFNα2bA-N30和PEG-IFNα2bA-N40的免疫原性均低于PEG-IFNα2bA-N20。
表6  大鼠连续应用各种PEG-IFNs-A的免疫原性比较

注：*与IFNα2b-A相差异显著P<0.05；△与PEG-IFNα2bA-N20相比差异显著P<0.05。
序列表
<110>天津派格生物技术有限公司
<120>柱层析PEG与干扰素类似物蛋白氮端定点偶联方法及其产物
<141>2008-12-28
<160>6
<210>1
<211>165
<212>PRT
<213>人干扰素(Interferon)
<221>人干扰素alfa氨基酸序列
<222>(1)…(165)
<400>1

<210>2
<211>166
<212>PRT
<213>人干扰素(Interferon)
<221>人干扰素beta氨基酸序列
<222>(1)…(166)
<400>2
Met(Gly Gly Gly Gly Ser)t

<210>3
<211>498
<212>DNA
<213>人干扰素(Interferon)
<221>天然编码人干扰素(IFNa)基因
<222>(1)…(498)
<400>3

<210>4
<211>498
<212>DNA
<213>人干扰素(Interferon)
<221>天然编码人干扰素beta-1b(IFN-β1b)基因
<222>(1)…(498)
<400>4

<210>5
<211>498
<212>DNA
<213>人干扰素(Interferon)
<221>重新合成的人干扰素a-2b基因
<222>(1)…(498)
<400>5

<210>6
<211>498
<212>DNA
<213>人干扰素(Interferon)
<221>重新合成的人干扰素β1b(IFN-ββ1b)基因
<222>(1)…(498)
<400>6