一种生物芯片的二维编码标记方法 【技术领域】
本发明涉及生物芯片领域，特别是一种生物芯片的二维编码标记方法。
技术背景
生物芯片技术是近年来发展起来的一种新的生物检测技术。其包括基因芯片、蛋白芯片、组织芯片等，具有高速度、高通量、高效率、并行地自动化检测与之杂交的生物样品的特点，与传统的诊断技术相比，芯片技术具有明显的优势，而且，还可以通过在芯片上设计不同的探针阵列使该技术具有多种不同的应用价值。
随着芯片的应用越来越广泛，数量也越来越众多，区分芯片的种类及用途尤为重要。目前对不同芯片通常采用附加外标记的方法进行区分，即在芯片地非检测区进行标记区别，而这种标记不能在芯片显色或显影后扫描同时获得，也不在扫描图像上，这样大量不同芯片同时检测容易产生混乱，同时也影响速度及效率，而且由于于芯片制作是纳升级且高密度分布，扫描图像缺少定位标志，不便于分析。
杂交成功与否是芯片技术的核心，而杂交的动力学是个非常网络化、复杂化、微妙化的多因素的综合，常常会产生非特异性杂交等，导致结果的错误，这也影响到芯片的可靠性。
发明的内容
为解决上述问题，利用现有技术中有的生物芯片上具有阳性、阴性或空白探针对照点，我们采用的二维编码标记方法，不但可以作为芯片区分标志，定位标志，而且还可以对芯片的检测进行质控监测。迄今为止这种标记方法的报道还未见有。我们采用的二维编码标记方法，应用阳性、阴性或空白对照进行质控，同时检测中不但要求做片内比较分析，同时也要求多次检测的片间比较，我们应用阳性对照的结果可以进行片间标准化对比，从而减小片间误差增强检测结果的片间可比性，使质控体系更加完美。而且，这种方法构建简单，不需要特殊设备，使用方便、经济实用，因此，二维编码标记方法具有重要的使用价值和良好的应用前景。
本发明所要解决的技术问题是：提供一种对芯片进行二维编码标记的方法，该方法直接利用芯片的阳性、阴性或空白对照点在检测区对芯片进行符号图案化的标记，在实现在芯片检测质量控制的同时，获得芯片的区分、定位信息，使得芯片检测更加高效、快速，有利于提高检测的自动化程度，也使扫描结果便于分析及结果更加准确。
本发明一种生物芯片的二维编码标记方法，其特征在于包括以下几个步骤：
(1)在芯片上建立检测区和识别区，所述检测区由检测探针点位排列构成，所述识别区由阳性对照探针点和阴性对照探针点，或由阳性对照探针点、阴性对照探针点和空白对照点排列构成；
(2)选定阳性对照物，设计质控的阳性对照、阴性对照探针；
(3)根据检测的目的，分别在检测区的探针点位上固定检测探针，在识别区的点位上以二维图形、符号或其混合形式布置、固定由所述阳性对照和阴性对照探针，或由所述阳性探针、阴性探针和空白点位构成的二维编码，形成识别信息；
(4)将待检样品内掺入上述阳性对照物进行芯片杂交前的处理，然后与所述检测区和识别区的点同时进行杂交；，
(5)对杂交结果显色或显影；
(6)对芯片杂交信号进行自动识别，获得编码信息。
所述识别区可局限于芯片的一个区域，也可以分散于芯片的不同区域；所有识别区内的二维编码形成识别信息，每个芯片上的识别信息由至少一个二维编码构成。
在所述识别区内构成的二维编码包括：
(1)由阳性对照探针点和阴性对照探针点以二维的数字、字母、图形、符号或其混合形式排列组成的二维编码；
(2)或由阳性对照探针点、阴性对照探针点和空白对照点以二维的数字、字母、图形、符号或其混合形式排列组成二维编码。
本发明所使用的术语“生物芯片”是由生物大分子或组织附着于玻璃、陶瓷、金属片或尼龙膜、硝酸纤维素膜等基片物质上构建而成的阵列。生物芯片的实例包括基因(核酸)芯片、细胞芯片、蛋白芯片、抗体芯片或组织芯片等。
本发明所使用的术语“二维编码”，“二维”也就是指一个平面上的，“二维编码”指芯片的一个平面区域上对照探针点、阴性对照探针点或和空白对照点的特定排列组合。这种组合形成类似数字、字母、图形、符号或其混合形式或寓意为数字、字母、图形、符号或其混合形式。
本发明所使用的术语“阳性对照、阴性对照、空白对照”，应用于生物芯片检测质控的“阳性对照、阴性对照”，指在芯片杂交中，无论何种样品的检测一定会发生杂交反应的检测点叫阳性对照，而不发生杂交反应的点叫阴性对照点，而常用于检测亲源性很远的基因即阳性对照物做阳性、阴性对照点探针的设计，如测微生物及动物基因，用植物作阳性对照物来设计阳性、阴性探针，反之亦然，测植物就用动物的基因来设计阳性、阴性探针；而“空白对照”则不进行任何处理。而这种阳性对照物一般在检测样本进行核酸提取之前就参入。
本发明所使用的术语“质控的阳性对照、阴性对照探针”中的“质控”，是指在芯片中的“质控”，指对整个芯片检测系统是否存在问题进行的检测，例如发生阳性对照检测阴性或阴性对照检测阳性的现象，表明整个芯片检测系统存在问题：如果阳性对照检测阴性说明杂交条件过于严密、样品处理存在差错等问题；如果阴性对照检测阳性说明杂交条件过松、样品污染等问题。以上这些概念是本领域的普通技术人员所熟知的。
本发明利用在芯片制作时，对阳性对照探针点、阴性对照探针点，或空白对照点进行一定方式的排列组合，从而形成特定的编码如某些数字、字母、图形、符号或其混合形式，通过多个特定的编码按一定方式的排列组合成特定信息，可用来自动识别芯片包含用途及构成等基本信息用途区分标志及其他检测目标的定位标志。这种编码模式随芯片其他检测点一同杂交，显色后，通过对模式的识别，从而可将所代表的编码信息反应出来。而且这种编码中的阳性点、阴性点或、和空白点还作为芯片的检测质控指标，参与对芯片的检测过程进行的监测。
【附图说明】
附图1是芯片的编码标记实例1芯片点样示意图；
附图2为芯片的编码标记实例1显现的结果示意图；
附图3是芯片的编码标记实例2芯片点样示意图；
附图4为芯片的编码标记实例2显现的结果示意图；
附图5是芯片的编码标记实例3芯片点样示意图；
附图6为芯片的编码标记实例3显现的结果示意图；
附图7是芯片的编码标记实例4芯片点样示意图；
附图8为芯片的编码标记实例4显现的结果示意图。
【具体实施方式】
下面举例用于说明本发明的一些具体实施方案，而不是用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：医学分子生物学实验技术(北京人民卫生出版社，2002)、所购试剂盒的操作手册的条件进行。
实施例1质控的阳性对照物的获取及阳性、阴性探针设计
本实施例生物芯片应用于检测血液中的微生物，因此选择亲源性较远的植物基因作为阳性对照物。
1.作为阳性对照物的植物基因的选取：
因为本实验针对微生物，因此试验选取用一段与微生物和人无任何同源性的植物基因(植物V类及丁酶苦瓜同源性基因(McChi5)的克隆及特征分析，遗传学报，2002)，既植物基因Chi5。
2.将植物基因Chi5构建成质粒：
(1)将获的植物基因Chi5进行PCR扩增。
(2)与Ptrchis2-ToPo质粒连接：采用EcoR I和Nco I双酶切差入植物基因Chi5，重组质粒大小为5.4kb，植物基因Chi5大小为1.1kb。
(3)植物基因Chi5重组质粒转染大肠杆菌及扩增提取：采用采用CaCl2法制备感受态细菌DH5α，抗性培养基筛选，利用质粒提取试剂盒提取、纯化质粒。
3.阳性对照物的获取及参入：纯化提取的植物基因Chi5重组质粒溶液作为阳性对照物，阳性对照物在样本提取核酸时参入到检测的样本中。
4.阳性、阴性探针设计：
根据植物基因Chi5，设计采用和其杂交的探针作为阳性探针，与其不杂交的作为阴性探针。
实施例2一种芯片的编码标记实例1
参见附图1，步骤如下：
一、片醛基修饰，各探针为5’端氨基修饰。按如下方式进行各探针点的布置：
图1中1～12代表各检测区内的探针点，分别如下：
1：金黄色葡萄球菌2：mecA基因3：大肠埃希氏菌4：铜绿假单胞菌5：表皮葡萄球菌6：肠球菌7：白色念珠菌8：伤寒沙门氏菌9：肺炎链球菌10：化脓性链球菌11：脑膜炎双球菌12：乙肝病毒；图1中识别区内：
代表阳性对照点：根据与微生物及人类无任何同源性的植物基因设计的探针，根据植物基因Chi5设计的探针。
代表阴性对照点：根据与微生物及人类无任何同源性的植物基因设计的探针，根据植物基因Chi5及阳性对照探针而设计的阴性探针。
以下实验应用的阴、阳性探针都是上面的两种探针。
(3)阳性、阴性、空白对照点可以有如下的排列方式及各自所被赋予的数字含义：
比如本芯片布置在四个角的编码先按从左到右，再按从上到下顺序，其所代表的数字含义为：0001，即代表了该12种检测目标的芯片。
二.按如上布置对芯片进行探针点样。
三.在20℃水合1小时、55℃干燥过夜、56℃再水合4小时，再干燥处理等，按醛基修饰芯片制作方法完备芯片的制作处理。
四.按检测要求进行检测目标的样本处理，并掺入阳性、阳性对照的植物基因Chi5重组质粒(见实施例1中)，参入比例根据实际情况而定，本实验比例为样本溶液∶对照物＝10∶1(体积比)。
五.进行芯片杂交。
六.进行芯片显色或定影处理。
七.对芯片的结果进行判读。如检测目标的阳性结果为大肠埃希氏菌，则在该芯片的上显现的结果参见附图2：
图中结果可以判定为：0001号芯片，其检测的阳性目标为大肠埃希氏菌。
同时根据0001的不同分布，可以作为阳性目标的定位标志。
实施例3一种芯片的编码标记实例2
参见附图3：具体步骤如下：
一、按如下方式进行各探针点的布置：
其中图3中质控点编码图形的含义同实施例2，但1-12代表的各检测探针点，则分别如下：
1：枯草芽孢杆菌2：表皮葡萄球菌3：铜绿假单胞菌4：百日咳鲍特氏菌
5：醋酸钙不动杆菌6：淋病奈瑟氏菌7：洋葱假单胞菌8：化脓性链球菌
9：肺炎克雷伯氏菌10：肺炎链球菌11：洛菲氏不动杆菌12：奇异变形杆菌
代表阳性对照点：根据与微生物及人类无任何同源性的植物基因设计的探针
代表阴性对照点：根据与微生物及人类无任何同源性的植物基因设计的探针
本芯片布置在四个角的编码所代表的数字含义为：0002，代表了本12种检测目标的芯片。
二、芯片制作的其他步骤及检测过程同实施例2。
三、对芯片的结果进行判读。如检测目标的阳性结果为铜绿假单胞菌，则该芯片上显现的结果参见附图4：
结果可以判定为：0002号芯片，其检测的阳性目标为铜绿假单胞菌。
因为实施例1与实施例2的阳性对照探针和标记的量相同，而检测的样品中也是掺入阳性对照的植物基因和量相同，而且后续处理相同，这样两个片间阳性目标的菌的显色或显影强度，可以通过与各自的阳性对照显色或显影强度比较而达到片间的比较。
实施例4一种芯片的编码标记实例3
参见附图5，步骤如下：
一、如下方式进行各探针点的布置：
其中图5中1-10代表各检测探针点，分别如下：
1：金黄色葡萄球菌2：mecA基因3：大肠埃希氏菌4：铜绿假单胞菌
5：表皮葡萄球菌6：肠球菌7：白色念珠菌8：伤寒沙门氏菌
9：肺炎链球菌10：化脓性链球菌
代表阳性对照点：根据与微生物及人类无任何同源性的植物基因设计的探针
代表阴性对照点：根据与微生物及人类无任何同源性的植物基因设计的探针
(2)由阳性、阴性对照点组成的排列被赋予的含义为：
二、芯片制作的其他步骤及检测过程同实施例2。
三、对芯片的结果进行判读。如检测目标的阳性结果为白色念珠菌，则该芯片的上显现的结果参见附图6：
结果可以判定为：芯片编码为“+-×÷”，其检测的阳性目标为白色念珠菌。
实施例5一种芯片的编码标记实例4
参见附图7，步骤如下：
一、按如下方式进行各探针点的布置：
其中质控点编码图形的含义同实施例3，图7中1-10代表的各检测探针点，则分别如下：
1：洛菲氏不动杆菌2：奇异变形杆菌3：铜绿假单胞菌4：百日咳鲍特氏菌
5：醋酸钙不动杆菌6：淋病奈瑟氏菌7：洋葱假单胞菌8：化脓性链球菌
9：肺炎克雷伯氏菌10：肺炎链球菌
代表阳性对照点：根据与微生物及人类无任何同源性的植物基因设计的探针
代表阴性对照点：根据与微生物及人类无任何同源性的植物基因设计的探针
二、芯片制作的其他步骤及检测过程同实施例2。
三、对芯片的结果进行判读。如检测目标的阳性结果为化脓性链球菌，则该芯片的上显现的结果参见附图8：
结果可以判定为：芯片编码为“++++”，其检测的阳性目标为化脓性链球菌。