一种翠云草提取物及其制备方法和用途.pdf

摘要
申请专利号：	CN200910080433.1	申请日：	2009.03.18
公开号：	CN101502535A	公开日：	2009.08.12
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):A61K 36/11申请日:20090318\|\|\|公开
IPC分类号：	A61K36/11; A61P11/10; A61P11/14	主分类号：	A61K36/11
申请人：	北京星昊医药股份有限公司
发明人：	张树祥; 熊国裕
地址：	100176北京市亦庄经济技术开发区中和街18号
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内容摘要

本发明涉及一种翠云草提取物及其制备方法和用途，翠云草通过极性有机溶剂提取、醇沉和柱层析纯化步骤，总酚酸含量可达50％以上，该提取物具有止咳平喘、抗菌作用，可用于止咳平喘的药物制备。

权利要求书

1、  一种翠云草提取物，其特征在于所述提取物以翠云草总酚酸类成分计，提取物中总酚酸含量不低于50％。

2、  根据权利要求1所述的翠云草提取物，其特征在于所述提取物中总酚酸含量为55％-65％。

3、  一种制备权利要求1或2中任一权利要求所述翠云草提取物的方法，其特征在于是通过如下方式制备的：翠云草药材干燥，粉碎成粗粉，以含乙醇为0-70％乙醇水溶液提取2-4次，每次1-3小时，过滤，合并滤液，滤液减压浓缩，浓缩液加95％乙醇使药液含醇量为45％-75％，室温静置12-24小时，过滤或离心，取滤液或上清液，减压浓缩至无醇，浓缩液上已处理好的聚酰胺吸附树脂，先以低于15％的乙醇水溶液洗脱，至洗脱液颜色变淡，改用40％-70％的乙醇洗脱，至酚酸反应呈阴性，合并收集40％-70％的乙醇洗脱部分，减压浓缩，干燥，即得翠云草提取物。

4、  根据权利要求3所述的方法，其特征在于：翠云草药材干燥，粉碎成粗粉，以含乙醇为40％-60％乙醇水溶液提取2-3次，每次1-3小时，过滤，合并滤液，滤液减压浓缩，浓缩液加95％乙醇使药液含醇量为50％-60％，室温静置12-24小时，过滤或离心，取滤液或上清液，减压浓缩至无醇，浓缩液上已处理好的聚酰胺吸附树脂，先以低于15％的乙醇水溶液洗脱，至洗脱液颜色变淡，改用50％-60％的乙醇洗脱，至酚酸反应呈阴性，合并收集50％-60％的乙醇洗脱部分，减压浓缩，干燥，即得翠云草提取物。

5、  权利要求1或2所述提取物在制备具有止咳化痰作用的药物中的应用。

说明书

一种翠云草提取物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种翠云草提取物，提取物中总酚酸含量不低于50％，为天然药物提取制备领域。
背景技术
翠云草Selaginella uncinata(Desv.)spring又名蓝地柏、绿绒草，原产我国中部、南部及西南部各省区，喜湿润和半阴环境，常生长在林下阴湿岩石上，山坡或溪谷丛林中，怕强烈日光直射，为伏地蔓生草本，叶密生，有蓝绿色荧光，十分秀丽。翠云草为卷柏科植物，性味微苦、寒，功能清热利湿、解毒、消瘀血、止血。《湖南植物志》记载其有“化痰止咳”的功效。其主要成分有黄酮、黄酮苷、双黄酮、酚类化合物等，黄酮和酚类化合物为其主要活性成分。
中国专利CN101357144A公开了一种制备翠云草非黄酮和黄酮类成分的方法，其制备仅仅是简单地将翠云草粗提物分为两部分，而一些有活性成分的分类成分会在非黄酮和黄酮部分中均含有，而若在制备药剂时将两部分提取物合并，成分又会变得非常复杂，而且，采用大孔树脂，对酚性成分富集的选择性不强。
对于翠云草中酚类成分的富集研究工艺，在现有文献中还未涉及，而酚类、黄酮类成分作为翠云草抗菌、消瘀、止咳的主要成分，有必要对其活性成分进行提取加工，以减少制成药剂时的服用剂量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种翠云草提取物，该提取物中以总酚酸计，提取物中总酚酸含量不低于50％，更优选为55％-65％。
本发明所述的提取物可以通过如下方法制备得到：翠云草药材干燥，粉碎成粗粉，以含乙醇为0-70％乙醇水溶液提取2-4次，每次1-3小时，过滤，合并滤液，滤液减压浓缩，浓缩液加95％乙醇使药液含醇量为45％-75％，室温静置12-24小时，过滤或离心，取滤液或上清液，减压浓缩至无醇，浓缩液上已处理好的聚酰胺吸附树脂，先以低于15％的乙醇水溶液洗脱，至洗脱液颜色变淡，改用40％-70％的乙醇洗脱，至酚酸反应呈阴性，合并收集40％-70％的乙醇洗脱部分，减压浓缩，干燥，即得翠云草提取物。
优选地，本发明提取物的制备方法为：翠云草药材干燥，粉碎成粗粉，以含乙醇为40％-60％乙醇水溶液提取2-3次，每次1-3小时，过滤，合并滤液，滤液减压浓缩，浓缩液加95％乙醇使药液含醇量为50％-60％，室温静置12-24小时，过滤或离心，取滤液或上清液，减压浓缩至无醇，浓缩液上已处理好的聚酰胺吸附树脂，先以低于15％的乙醇水溶液洗脱，至洗脱液颜色变淡，改用50％-60％的乙醇洗脱，至酚酸反应呈阴性，合并收集50％-60％的乙醇洗脱部分，减压浓缩，干燥，即得翠云草提取物。
对比用聚酰胺和大孔树脂富集酚酸类化合物，我们发现，采用聚酰胺富集翠云草总酚酸类化合物，所得提取物中酚酸类成分含量更高。
经醇沉后所得的翠云草提取物，我们分别采用了大孔吸附树脂和聚酰胺吸附树脂进行酚酸精制试验：
大孔树脂：醇沉后的提取物浓缩液上AB-8型大孔吸附树脂柱，先以10％的乙醇洗脱至洗脱液颜色变淡，改用60％的乙醇洗脱，收集60％的乙醇洗脱部分，浓缩，干燥，得酚酸精制提取物I，所得酚酸精制提取物I经紫外可见分光光度法检测，其总酚酸含量为38.2％；
聚酰胺：醇沉后的提取物浓缩液上聚酰胺吸附树脂柱，先以10％的乙醇洗脱至洗脱液颜色变淡，改用60％的乙醇洗脱，收集60％的乙醇洗脱部分，浓缩，干燥，得酚酸精制提取物II，所得提取物用紫外可见分光光度法测其总酚酸含量为56.9％。
本发明翠云草总酚酸提取物具有抗炎、祛痰止咳的作用，可用于治疗咳嗽痰多的症状。
本发明提取物对的止咳化痰药理作用研究
1、对小白鼠的止咳作用
小白鼠氨水引咳法取小白鼠50只，随机分为5组，分别为空白对照组、翠云草提取物低剂量组、中剂量组、高剂量组和阳性对照组(磷酸可待因)，每组10只，各组给药剂量见表1.各小鼠每天按0.2ml/10g体重灌胃给药1次，连续7天。末次给药后1小时，将小鼠逐一放入钟罩内，均匀地喷入氨水的气雾，持续30秒，把小属移置罩外，立即进行观察，记录各小鼠的咳嗽潜伏期及3min内咳嗽次数(注：小鼠咳嗽的判断以剧烈收缩腹肌并张嘴为准，时可听到轻微咳嗽声，潜伏期指从开始喷雾到产生咳嗽的时间)。结果见表1
表1翠云草提取物对小白鼠的止咳作用(x±s)

组别n剂量(g/kg)咳嗽潜伏期(s)3min内咳嗽次数(次)空白对照组10—38.33±10.337.1±8.9低剂量组10543.2±15.534.8±8.7中剂量组101055.6±17.6^*23.5±8.4^**高剂量组101571.3±22.3^**15.9±8.0^**磷酸可待因组100.003109.4±28.2^**9.2±3.5^**

与空白对照组相比：^*P<0.05，^**P<0.01
结果显示，翠云草总酚酸提取物中、高剂量组及阳性对照组对小鼠咳嗽模型均有一定的抑制作用，能够明显延长小鼠咳嗽潜伏期，减少咳嗽次数，与空白对照组相比，差别有统计学意义。
2、翠云草总酚酸提取物对豚鼠的止咳作用
豚鼠枸橼酸引咳法去豚鼠70只，分别放入连有超声雾化器的钟罩中，喷入17.5％的枸橼酸，喷雾1min，喷雾后5min内咳嗽次数少于10次者不用，筛选出50只合格豚鼠，随机分成5组，分别为空白对照组、翠云草低剂量组、中剂量组、高剂量组和阳性对照组(磷酸可待因)，每组10只，各组给药剂量见表2，各豚鼠按0.2ml/10g体重灌胃给药1次，连续7天，末次给药后1小时，喷入17.5％的枸橼酸，喷雾1min，观察咳嗽潜伏期，并记录5min内的咳嗽次数，结果见表2。
表2 翠云草提取物对豚鼠的止咳作用(x±s)
组别n剂量(g/kg)咳嗽潜伏期(s)3min内咳嗽次数(次)空白对照组10—38.7±9.227.1±7.6低剂量组10544.9±12.123.3±6.7中剂量组101070.6±15.3^*17.5±7.4^*高剂量组101598.3±22.7^**12.9±6.0^**磷酸可待因组100.003127.4±27.2^**6.3±2.4^**

与空白对照组相比：^*P<0.05，^**P<0.01
结果表明，与空白对照组比较，翠云草总酚酸提取物中、高剂量组及阳性对照组均能够明显延长豚鼠咳嗽潜伏期，减少咳嗽次数，并且，其作用岁浓度增加而加强。
3、翠云草总酚酸提取物的祛痰试验
祛痰试验(小鼠气管酚红法)取小鼠50只，随机分为5组，分别为空白对照组、翠云草总酚酸提取物低剂量组、中剂量组、高剂量组和阳性对照组(氯化铵)，每组10只，各组给药剂量见表3。各小鼠每天按0.2ml/10g体重灌胃给药1次，连续7天，末次给药0.5h后各小鼠腹腔注射酚红溶液0.1ml(5mg)/10g体重，30min后处死动物，剥离气管周围组织，剪下自甲状软骨至气管分支处的一段气管，放入2ml生理盐水试管中，再加入0.1ml氢氧化钠溶液，用721型风光光度计于546nm处测OD值。用酚红作一标准曲线，根据曲线计算酚红含量(ug/ml)。结果见表3。
表3 翠云草总酚酸提取物对小鼠气管酚红排泄量的影响(x±s)
组别n剂量(g/kg)酚红排泄量(ug/ml)空白对照组10—0.12±0.03低剂量组1050.15±0.04中剂量组10100.37±0.11^**高剂量组10150.72±0.21^**氯化铵组100.51.22±0.37^**

与空白对照组相比，^**P<0.01
结果表明，与空白对照组相比较，翠云草酚酸提取物中、高剂量组及阳性对照组均能明显促进小鼠气管纤毛对酚红的分泌排出，显示有较好的排痰作用，与空白对照组比较均有显著性差异。
具体实施例
实施例1
翠云草药材1000g，干燥，粉碎成粗粉，以含水煎煮提取4次，每次1小时，过滤，合并滤液，滤液减压浓缩，浓缩液加95％乙醇使药液含醇量为45％，室温静置12小时，离心，取上清液，减压浓缩至无醇，浓缩液上已处理好的聚酰胺吸附树脂，先以低于水洗脱，至洗脱液颜色变淡，改用40％的乙醇洗脱，至酚酸反应呈阴性，合并收集40％的乙醇洗脱部分，减压浓缩，干燥，即得翠云草提取物8.7g，提取物中总酚酸含量为51.7％。
实施例2
翠云草药材1000g，干燥，粉碎成粗粉，以70％乙醇水溶液提取2次，每次3小时，过滤，合并滤液，滤液减压浓缩，浓缩液加95％乙醇使药液含醇量为75％，室温静置24小时，过滤，取滤液，减压浓缩至无醇，浓缩液上已处理好的聚酰胺吸附树脂，先以15％的乙醇水溶液洗脱，至洗脱液颜色变淡，改用70％的乙醇洗脱，至酚酸反应呈阴性，合并收集70％的乙醇洗脱部分，减压浓缩，干燥，即得翠云草提取物10.5g，提取物中总酚酸含量为58.9％。
实施例3
翠云草药材干燥，粉碎成粗粉，以40％乙醇水溶液提取3次，每次2小时，过滤，合并滤液，滤液减压浓缩，浓缩液加95％乙醇使药液含醇量为60％，室温静置12小时，离心，取上清液，减压浓缩至无醇，浓缩液上已处理好的聚酰胺吸附树脂，先以低于10％的乙醇水溶液洗脱，至洗脱液颜色变淡，改用60％的乙醇洗脱，至酚酸反应呈阴性，合并收集60％的乙醇洗脱部分，减压浓缩，干燥，即得翠云草提取物8.6g，提取物中总酚酸含量为64.1％。
实施例4
翠云草药材干燥，粉碎成粗粉，以50％乙醇水溶液提取3次，每次2小时，过滤，合并滤液，滤液减压浓缩，浓缩液加95％乙醇使药液含醇量为50％，室温静置20小时，过滤或离心，取滤液或上清液，减压浓缩至无醇，浓缩液上已处理好的聚酰胺吸附树脂，先以低于8％的乙醇水溶液洗脱，至洗脱液颜色变淡，改用50％的乙醇洗脱，至酚酸反应呈阴性，合并收集50％的乙醇洗脱部分，减压浓缩，干燥，即得翠云草提取物9.5，总酚酸含量为59.7％。