猪胚胎的移植器械及其移植方法 【技术领域】
本发明涉及一种猪胚胎的移植器械及其移植方法，属于胚胎移植领域。
背景技术
猪胚胎移植试验成功最早于1951年由Kvashickii报道。到20世纪60年代，已经基本建立了外科手术方法采集和移植胚胎的技术。到70年代以后，北美和欧洲开始将胚胎移植技术应用于向闭锁猪群引进外血和国际间的引种。80年代转基因动物技术的出现，促进了胚胎移植技术的应用和发展。1985年Hammer等人，首先将人生长激素基因应用显微注射技术注入猪的受精卵，然后应用胚胎移植技术将其移入受体母猪的输卵管，得到转基因猪。这之后，国际上各种转基因的胚胎，包括用显微注射法、精子介导法、体细胞核移植法和其它方法获得的转基因胚胎，通过胚胎移植技术生产出转基因猪；各种胚胎工程获得的胚胎，如体外受精的胚胎、胚胎细胞核移植和体细胞核移植的重构胚胎，通过胚胎移植技术获得“试管猪”和“克隆猪”。
我国最早建立猪胚胎移植技术的是湖北省农科院魏庆信等人，1989年他们将猪的囊胚期胚胎移入受体母猪的子宫角，得到胚胎移植的后代；1992年，将体外受精的胚胎，移植到母猪的输卵管，得到“试管猪”；1997年，将胚胎细胞核移植的重构胚胎，移植到母猪的输卵管，得到“克隆猪”；先后将七种外源基因导入猪的受精卵，通过胚胎移植技术得到了相应整合并表达的转基因猪。中国农科院畜牧研究所冯书堂等人，于1990年建立了猪的胚胎移植技术，并得到胚胎移植的仔猪。进入21世纪以来，中国农业大学、东北农业大学、上海农科院畜牧兽医研究所等单位，先后应用胚胎移植技术，将克隆胚胎或转基因的胚胎移入母猪的生殖道，获得克隆猪或转基因猪。
国内外猪胚胎移植已有技术的特征是：进行输卵管移植时，用移卵管直接从输卵管伞部插入输卵管；进行子宫角移植时，用移卵管直接插入子宫角。该技术的缺陷有三点：
1、移卵管难以插入较深的部位，尤其是进行输卵管移植时，很难插入输卵管的壶腹部，至使胚胎不能移到最合适的部位，从而影响胚胎移植的成功率。
2、移卵管直接从输卵管伞部插入输卵管，或直接插入子宫角，在插入的过程中，由于输卵管内膜或子宫角内膜上粘液的吸附作用，很容易造成胚胎的丢失，从而影响胚胎移植的效率。
3、移卵管直接从输卵管伞部插入输卵管，或直接插入子宫角，在操作的过程中稍有不慎，或受体母猪稍有骚动，由于移卵管为玻璃质地，很容易折断或破碎，从而造成移植失败，严重的还会造成受体母猪生殖道的损伤。
专利CN200520103507.6涉及的是人的胚胎移植，CN200510105236.2涉及的是牛的胚胎移植，但是它们均为非手术移植，其中的外套管只是用来保护其内芯。同时由于各种动物生殖道的形态结构不相同，胚胎移植所用的器械和方法也不相同，如果应用以上两篇专利的技术方案不能进行猪的胚胎移植，也就不能克服已有猪胚胎移植技术的三点缺陷。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种猪胚胎的移植器械及其移植方法，为手术移植，有效地克服了已有猪胚胎移植技术的三点缺陷，大大提高了胚胎移植的成功率，操作方便。
猪胚胎的移植器械，包括移卵管，其特征在于：还包括输卵管移植用外套管或子宫角移植用外套管，移卵管在各外套管内部；输卵管移植用外套管是长65-70mm、管腔直径3-4mm、管壁厚0.1-0.2mm的硬质、有弹性的塑料细管，两端磨平滑；子宫角移植用外套管是长65-70mm、管腔直径3-4mm、管壁厚0.1-0.2mm的硬质、有弹性的塑料细管，其一端剪成15°-20°斜面，另一端磨平滑。
猪胚胎的移植方法，受体母猪麻醉保定后手术切口，将输卵管和卵巢引出切口之外或将子宫角引出切口之外；其特征在于：(1)输卵管移植方法步骤如下：先将输卵管移植用外套管从输卵管伞口插入输卵管，用手将输卵管沿外套管向前捋，直至壶腹部；然后将吸有胚胎的移卵管插入外套管，直至用手能感觉到移卵管已穿过外套管，再将外套管退出1-2公分；最后将移卵管内的胚胎和培养液移入输卵管内；移植完毕，小心将移卵管和外套管退出，复原输卵管伞，按常规缝合创口；(2)子宫角移植方法步骤如下：先将子宫角移植用外套管15°-20°斜面端从子宫角的合适部位避开血管插入子宫角内腔，外套管进入子宫角内腔的深度4-5公分，用手感确认外套管在子宫腔内；然后将吸有胚胎的移卵管插入外套管，直至用手能感觉到移卵管已穿过外套管0.5-1公分；最后将移卵管内的胚胎和培养液移入子宫角内；移植完毕，小心将移卵管和外套管退出，复原子宫角，按常规缝合创口。
如上所述猪胚胎的移植方法，其特征在于：所述的胚胎，包括猪地体内受精的胚胎、体外受精的胚胎、胚胎细胞核移植或体细胞核移植所形成的重构胚胎、转基因的胚胎或囊胚注射所形成的嵌合胚胎。
本发明的有益效果是：本发明有效地克服了已有猪胚胎移植技术的三点缺陷：
(1)由于外套管为塑料质地，可以将其捋进输卵管很深的部位，使胚胎能移到最合适的部位，从而大大提高胚胎移植的成功率。
(2)由于移卵管是通过外套管插入移植部位，移卵管在插入的过程中不与输卵管内膜或子宫角内膜接触，从而克服了输卵管内膜或子宫角内膜上的粘液对移卵管内胚胎的吸附作用，不会造成胚胎的丢失，有效提高了胚胎移植的效率。
(3)由于外套管为塑料质地，在插入输卵管或子宫角的过程中，即使操作者有些许不慎、或受体母猪有骚动，也不会造成外套管的折断或破碎，不会因此造成的移植失败或受体母猪生殖道的损伤。
【附图说明】
图1为本发明实施例输卵管移植用外套管示意图。
图2为本发明实施例子宫角移植用外套管示意图。
【具体实施方式】
以下结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。
猪胚胎的移植器械包括移卵管、输卵管移植用外套管或子宫角移植用外套管，移卵管在各外套管内部；输卵管移植用外套管是长65-70mm、管腔直径3-4mm、管壁厚0.1-0.2mm的硬质、有弹性的塑料细管，两端磨平滑；子宫角移植用外套管是长65-70mm、管腔直径3-4mm、管壁厚0.1-0.2mm的硬质、有弹性的塑料细管，在其一端用剪刀剪成15°-20°斜面，另一端磨平滑。外套管冲洗干净后自然干燥，用前在紫外灯下灭菌。
用于1-4细胞期胚胎的移植时，首先将本发明实施例的输卵管移植用外套管插入受体母猪输卵管的壶腹部；用于4细胞期以上胚胎的移植时，首先将本发明实施例的子宫角移植用外套管插入受体母猪子宫角的合适部位；然后将吸有胚胎的移卵管，通过外套管插入到受体母猪输卵管的壶腹部或子宫角的合适部位，再实施移植。
具体步骤如下：
(1)输卵管移植方法：受体母猪麻醉保定后手术切口，将输卵管和卵巢引出切口之外；先将输卵管移植用外套管从输卵管伞口插入输卵管，用手将输卵管沿外套管向前捋，直至壶腹部；然后将吸有胚胎的移卵管插入外套管，直至用手能感觉到移卵管已穿过外套管，再将外套管退出1-2公分；最后将移卵管内的胚胎和培养液移入输卵管内；移植完毕，小心将移卵管和外套管退出，复原输卵管伞，按常规缝合创口；
(2)子宫角移植方法：受体母猪麻醉保定后手术切口，将子宫角引出切口之外；先将子宫角移植用外套管15°-20°斜面端从子宫角的合适部位避开血管插入子宫角内腔，外套管进入子宫角内腔的深度4-5公分，用手感确认外套管在子宫腔内；然后将吸有胚胎的移卵管插入外套管，直至用手能感觉到移卵管已穿过外套管0.5-1公分；最后将移卵管内的胚胎和培养液移入子宫角内；移植完毕，小心将移卵管和外套管退出，复原子宫角，按常规缝合创口。
所述的胚胎，包括猪的体内受精的胚胎、体外受精的胚胎、胚胎细胞核移植或体细胞核移植所形成的重构胚胎、转基因的胚胎或囊胚注射所形成的嵌合胚胎。
实施例1优良种猪的胚胎移植
以优良纯种母猪做供体，以不能做种用的杂交母猪做受体，将供体母猪的胚胎移植给杂交母猪受体，目的在于用杂交母猪生产优良纯种猪。其操作步骤如下：
1、供体母猪的超数排卵和配种
在供体母猪发情周期的第15-18天，肌肉注射孕马血清促性腺激素PMSG 1000IU，72小时后注射绒毛膜促性腺激素HCG 800IU，做超数排卵处理。发情后用本品种公猪配种。
2、受体母猪的同期发情
在受体母猪发情周期的第15-18天，在供体母猪超数排卵处理的同时，肌肉注射PMSG 800IU，72小时后注射HCG 600IU。
或者在大群内选择与供体母猪同一天发情的母猪做受体。
3、供体母猪胚胎的采集
在供体母猪配种后的第3-6天，采集胚胎。
(1)供体猪的麻醉和保定
供体猪上腭牵拉，限制活动，按20-30mg/kg(每公斤体重毫克)戊巴比妥钠(2.5％)耳静脉注射，进行全身麻醉。
麻醉到位后仰放在手术保定架上，四肢固定。为防止手术过程中，猪的挣扎、弹动，要用绳索将四肢和头部捆绑牢靠。为使腹腔内脏向前倾斜，方便手术，手术台要前低(头低)后高(尾高)。手术过程根据需要肌肉或静脉滴注适量的盐酸氯胺酮。
(2)手术部位及其消毒
用肥皂水和毛刷洗刷腹部和大腿内侧部，水洗后用毛巾揩干净。手术部位一般选择在倒数第2、3个乳头之间，先用电剪或毛剪在术部剪毛，应剪净毛茬，用清水清洗净术部，然后涂以2-4％的碘酒，待干后再用70％-75％的酒精棉脱碘，消毒程序是：碘酊棉球→酒精棉球，由内向外；盖创巾于术部，使预定的切口暴露在创巾开口的中部。
(3)手术方法
沿腹中线，尽量避开血管，切开皮肤5-8cm左右，沿着切口左右钝性分离脂肪和肌肉层，使腹膜露出后，用钝头剪刀剪开腹膜。切开腹膜应避免损伤腹内脏器，先用镊子提起腹膜，在提起部位作一切口，然后用另一只手的食指深入腹膜引导手术刀(向外切口)或用外科剪把腹膜切开或剪开。术者将食指及中指由切口伸人腹腔，在与骨盆腔交界的前后位置触摸子宫或子宫角，摸到后用二指夹持，牵引至创口的表面。
(4)采集胚胎
根据冲卵时间的不同，或近或远，在距子宫-输卵管接合部30-70cm的子宫角背面没有血管的部位用眼科剪剪个小孔，插入子宫角冲卵管，开口向宫管结合部方向，另一端开口接表面皿或平皿。用注射器从宫管结合部向子宫角注入30-50ml冲卵液。冲卵液流经子宫角，将胚胎带入接卵的表面皿或平皿。
再将另一侧子宫角引出切口之外，用同样的方法冲取胚胎。
4、胚胎的收集及质量检查
将接卵的表面皿置于实体显微镜下，用低倍镜的大视野在冲卵液中找到胚胎。猪胚胎直径为150μm左右，肉眼观察只有针尖大小，为一球形体，在镜下呈圆形，其外层是透明带，它在冲卵液内的折光性比其他不规则组织碎片折光性强，色调为灰色。拣卵管先吸入少许磷酸缓冲液PBS再吸人卵，在表面皿的不同位置冲洗卵3-5次。依次在第二个表面皿内重复冲洗，然后把全部卵集中到一个表面皿，一只供体的卵放在一个皿内。操作室温为20-25℃。
将体视镜的放大倍数调至80-100倍，观察胚胎的形态、卵裂球大小与均匀度、色泽、细胞密度、与透明带间隙以及细胞变性等情况。正常发育的胚胎，其卵裂球一般外形整齐清晰，大小一致，分布均匀而紧密，发育速度与胚胎日龄相一致。对发育正常的胚胎供移植，淘汰未受精卵及发育异常的胚胎。
冲卵的方法分为手术法和非手术法两种。非手术法目前只应用于牛，且在胚胎进入子宫角后收集。而猪、羊等中小家畜和小鼠、大鼠、兔等实验动物仍然使用手术法。
5、胚胎移植
按照与供体母猪同样的方法，对同步发情的受体母猪进行麻醉、保定、实施手术，并将子宫角引出创口之外。先将用于子宫角移植的外套管斜面端，从子宫角的合适部位避开血管插入子宫角内腔，外套管进入子宫角内腔的深度4公分，用手感确认外套管在子宫腔内；然后将吸有胚胎的移卵管插入外套管，直至用手能感觉到移卵管已穿过外套管1公分；最后将移卵管内的胚胎和培养液移入子宫角内。移植完毕，小心将移卵管和外套管退出，复原子宫角，按常规缝合创口。子宫角移植用外套管是长65mm、管腔直径3mm、管壁厚0.1mm的硬质、有弹性的聚氯乙烯塑料细管，其一端剪成15°斜面，另一端磨平滑。
6、受体母猪的管理
移植后的受体母猪，最初几天，要注意每天两次注射抗菌素，防止创口感染。同时，要单栏饲养，以防止猪只之间打架，弄破伤口或流产。受体母猪的营养水平，按育种场怀孕母猪的日粮配合即可。怀孕中后期，注意补充青饲料，做好观察，待产。实施例2转ω-3脂肪酸基因猪胚胎的移植
1、ω-3脂肪酸基因的准备
将构建好的ω-3脂肪酸基因质粒酶切成线性，用TE稀释液稀释为5μg/ml的基因溶液备用。
2、胚胎的采集
用实施例1同样的方法，对母猪进行超数排卵处理，发情后配种；在最后一次配种之后的24小时，进行手术，麻醉、保定、腹部开口，其过程同实施例1。术者将食指及中指由切口伸人腹腔，在与骨盆腔交界的前后位置触摸子宫或子宫角，摸到后用二指夹持，牵引至创口的表面，循一侧子宫角导出输卵管，在输卵管末端转弯处找到该侧卵巢。不可用力牵拉卵巢，不能直接用手捏卵巢，更不能触摸排卵点和充血的卵泡。观察卵巢表面排卵点和卵泡发育，详细记录。
将冲卵管一端由输卵管伞部的喇叭口插入，约1-2cm深，用大拇指和食指握成环行固定，另一端接集卵皿。用注射器吸取37℃的冲卵液15-20ml，在子宫角靠近输卵管的部位，将针头朝输卵管方向刺入，一只手的手指在针头后方捏紧子宫角.另一只手推注射器，冲卵液由宫管结合部流入输卵管，经输卵管流至集卵皿。再将另一侧输卵管引出切口之外，用同样的方法采集胚胎。
3、胚胎的收集及质量检查
方法同实施例1。收集1细胞期的原核胚。
4、基因的显微注射
原核胚以10000-15000r/min离心3-5min，能清楚地辨认原核。离心后的原核胚和准备好的ω-3脂肪酸基因溶液置于显微操作仪下，将吸有基因的注射针快速刺入原核中，注射2pl基因溶液，迅速退出注射针。每次注射15-20枚卵，培养，待移植。
5、注射基因胚胎的移植
采用自体移植的方式，即：从哪一头母猪采集的胚胎，经基因注射后又移回该母猪的输卵管内。
该头母猪采集胚胎之后，仍置于手术台上，耳静脉点滴戊巴比妥钠(2.5％)或盐酸氯氨酮维持其麻醉状态。
移植时，将输卵管和卵巢引出切口之外。先将外套管从输卵管伞口插入输卵管，用手将输卵管沿外套管向前捋，直至壶腹部；然后将吸有胚胎的移卵管插入外套管，直至用手能感觉到移卵管已穿过外套管，再将外套管退出1公分；最后将移卵管内的胚胎和培养液移入输卵管内。移植完毕，小心将移卵管和外套管退出，复原输卵管伞，按常规缝合创口。输卵管移植用外套管是长70mm、管腔直径4mm、管壁厚0.2mm的硬质、有弹性的聚氯乙烯塑料细管，两端磨平滑。
6、移植后母猪的管理
移植后的母猪，最初几天，要注意每天两次注射抗菌素，防止创口感染。同时，要单栏饲养，以防止猪只之间打架，弄破伤口或流产。受体母猪的营养水平，按育种场怀孕母猪的日粮配合即可。怀孕中后期，注意补充青饲料，做好观察，待产。
7、转基因猪的整合检测
新生仔猪剪耳号取样，用酚氯仿法提取DNA，PCR检测，三次有与阳性对照一致大小的带者，初步确定为转基因仔猪。