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本发明公开了一种低温脂肪酶及其编码基因与生产方法。一种低温脂肪酶，是具有序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列的蛋白质或与序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列具有至少80％的同源性且具有与SEQ ID №：2相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。该低温脂肪酶的编码基因是下列核苷酸序列之一：1)序列表中的SEQ ID №：1；2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有80％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。本发明的低温脂肪酶在低温条件具有良好的活性和稳定性，最适作用温度为35℃，作用pH为8，可广泛应用于洗涤剂、生物柴油制备等工业领域。

1、  一种低温脂肪酶，是具有序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列的蛋白质或与序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列具有至少80％的同源性且具有与SEQ ID №：2相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。

2、  根据权利要求1所述的低温脂肪酶，其特征在于：所述低温脂肪酶是具有序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列的蛋白质。

3、  根据权利要求1所述的低温脂肪酶，其特征在于：所述由SEQ ID №：2衍生的蛋白质是将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。

4、  一种低温脂肪酶的编码基因，它是下列核苷酸序列之一：
1)序列表中的SEQ ID №：1；
2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；
3)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有80％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

5、  根据权利要求4所述的基因，其特征在于：所述低温脂肪酶的编码基因是序列表中的SEQ ID №：1。

6、  含有权利要求4所述的基因的表达载体和细胞系。

7、  根据权利要求6所述的表达载体和细胞系，其特征在于：所述表达载体为重组质粒pLIPP；所述细胞系为大肠杆菌DH5αLIPP。

8、  一种制备低温脂肪酶的方法，是通过培养低温微球菌(Micrococcusantarcticus)或含有低温脂肪酶编码基因的工程菌获得低温脂肪酶。

9、  根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述低温微球菌为嗜冷菌(Micrococcus antarcticus)T2。

10、  根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述工程菌为含有低温脂肪酶的编码基因的大肠杆菌或芽孢杆菌。

一种低温脂肪酶及其编码基因与生产方法
技术领域
本发明涉及酶基因工程和酶工程领域中一种脂肪酶及其编码基因与生产方法，特别涉及一种低温脂肪酶及其编码基因与生产方法。
背景技术
脂肪酶(Lipase，EC 3.1.1.3，甘油酯水解酶)是一种特殊的水解酶，可分解脂肪、催化分解三酸甘油酯，产生甘油酯、游离脂肪酸和甘油。由于具有不需要辅酶就能催化正逆反应的优点，近些年来，脂肪酶作为类脂化合物合成分解和酯交换的催化剂，已广泛应用于油脂水解、食品风味和香味的改进、皮革绢纺脱脂、生物柴油制备及添加于洗涤剂中以提高去污能力等[陈清馥，生物技术，2：42-44，1992；Arnold等，乳品科学杂志(Jour of Dairy Science)58：1127，1975；Carasik：德国专利German patent 2：109-119，1970；Suzuki，美国专利US Patent 6,306,813，2001年10月23日]。
生物柴油是由动植物油脂与一些短链醇发生转酯反应生成的脂肪酸酯类物质，是一种新型的无环境污染的可再生能源。生物柴油的生产方法有化学法和生物法，化学法使用的催化剂包括酸催化剂和碱催化剂，容易造成二次污染，而生物法利用酶催化，具有反应条件温和、对环境友好、反应过程简单易控等优点；因此酶法生产生物柴油的研究已受到广泛的关注。由于酶法合成生物柴油一般是在有机溶剂中进行，考虑到反应底物和产物的易挥发性，在低温条件下进行酶反应更加有利，并且也可同时改善生物柴油的特性(Juan等，EP1331260，2003)。
在洗涤行业，我国的洗涤方法是以低温洗涤为主，近来为了节省能源，欧美国家也出现了洗涤温度低温化的倾向，中温脂肪酶由于在低温条件下酶活低，效率差，达不到最佳应用效果，只有增加用量才能达到最佳应用效果。因此理想的洗涤剂用脂肪酶是在低温下也能充分发挥作用的脂肪酶。
低温脂肪酶的最适酶活温度一般在40℃以下，它具有最适酶活温度低，在低温下具有更高的催化效率等特点。因而在洗涤剂、生物柴油制备等工业上应用有着中温脂肪酶无法取代的优越性。
脂肪酶已从多种不同的微生物中分离(Jaeger等，FEMS Microbiol.Rev.15：29-63，1994)，已有一些来自细菌的低温脂肪酶，如嗜冷菌Psychrobacterimmobilis产生的脂肪酶，最适温度为55℃[Arpigny等，Biochim.Biophys.Acta1171：331-333，1993]；假单胞菌Pseudomonas sp.B11产生的脂肪酶最适温度为45℃(Choo等，Appl Environ Microbiol 64：486-491，1998.)；嗜冷菌Moraxella TA144.产生的脂肪酶最适温度为35℃[Feller等，Gene 102：111-115，1991]；但目前报道的低温脂肪酶热稳定性较差。
关于脂肪酶基因已有专利和文献报道。如：Rey等报道了Fusarium venenatum的脂肪酶基因(美国专利US Patent 6,432,898，2002年8月13日)；Lin等报道了Pseudomonas pseudoalcaligenes的脂肪酶基因(美国专利US Patent 5,766,913，1998年6月16日)；CLAUDIA等报道了Candida rugosa的脂肪酶基因(欧洲专利WO9914338，1999年3月25日)；HARUMI等报道了Pseudomonas sp.的脂肪酶基因(欧洲专利，EP0812910，1997年12月17日)；YUJI等报道了Geotrichumcandidum的脂肪酶基因(日本专利，JP2174680，1990年6月6日)。
发明创造内容
本发明的目的是提供一种在低温条件下具有良好的活性和稳定性的低温脂肪酶及其编码基因。
一种低温脂肪酶，是具有序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列的蛋白质或与序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列具有至少80％同源性且具有与SEQ ID №：2相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。
所述SEQ ID №：2来源于低温微球菌(Micrococcus antarcticus)T2(AS1.2372)，由404个氨基酸残基组成。
所述由SEQ ID №：2衍生的蛋白质为将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质，优选为与SEQ ID №：2具有至少90％同源性的蛋白质。
低温脂肪酶的编码基因，是下列核苷酸序列之一：
1)序列表中的SEQ ID №：1；
2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；
3)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有80％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列，其中，优选为与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中的SEQ ID №：1的DNA序列由1215个碱基组成，该基因的开放阅读框架(ORF)为自5’端第1到第1212位碱基。
含有本发明基因的表达载体和细胞系均属于本发明的保护范围，利用现有分子生物学的方法可以得到不同的表达载体和细胞系，如重组质粒pLIPP(物理图谱如图5所示)和工程菌大肠杆菌DH5αLIPP。
本发明的另一个目的是提供一种制备低温脂肪酶的方法。
本发明所提供的制备低温脂肪酶的方法，是通过培养低温微球菌(Micrococcusantarcticus)或含有本发明的低温脂肪酶编码基因的工程菌获得低温脂肪酶。
所述低温微球菌可为Micrococcus antarcticus中的不同低温微球菌菌株，优选为菌株Micrococcus antarcticus T2(AS1.2372)。所述工程菌为含有本发明低温脂肪酶编码基因的大肠杆菌或芽孢杆菌，优选为大肠杆菌DH5αLIPP。
生产本发明低温脂肪酶的培养基，可采用包括碳源、氮源和无机盐在内的通常用于培养细菌的培养基；培养条件也应该是培养工程菌的出发菌的条件，即只要是适合于产生本发明的低温脂肪酶即可，通常情况下，培养温度为10-40℃，pH为5-10，培养时间为8-80小时，其中优选的条件是培养温度为20-35℃，pH为6-9，培养时间36-72小时。由此产生的脂肪酶分泌在发酵液中，通过分离、精制等常规获得酶的方法，从上述的培养液中收集低温脂肪酶，即：通过离心或过滤法获得发酵上清液，通过盐析、柱层析等方法纯化酶制品。
本发明低温脂肪酶的分子量为41000道尔顿，一级结构与已知地脂肪酶不同，与其它已报道的脂肪酶的氨基酸序列相比，相似性小于45％；利用已知的蛋白质化学标准方法测定本发明低温脂肪酶的基本特性，证实其在低温条件下具有良好的活性和稳定性，最适作用温度为35℃，pH为8，可广泛应用于洗涤剂、生物柴油制备等工业领域。
图1为低温脂肪酶的最适酶活温度曲线
图2为低温脂肪酶的最适pH曲线
图3为低温脂肪酶的热稳定性曲线
图4为低温脂肪酶的pH稳定性曲线
图5为重组质粒pLIPP的物理图谱
实施例1、低温脂肪酶基因的克隆
(1)低温微球菌(Micrococcus antarcticus)T2(AS1.2372)总DNA的提取
采用从南极分离的低温微球菌(Micrococcus antarcticus)T2(AS1.2372)(刘洪灿等，系统与环境微生物国际杂志IJSEM，50：715-719，2000)，取其新鲜湿菌体20克，悬于10毫升50mM Tris缓冲液中(pH 8.0)，加入少量溶菌酶和8毫升0.25mM EDTA(pH 8.0)，混匀后于37℃放置20min，之后加入2毫升10％SDS，55℃放置5min，分别用等体积酚、氯仿各抽提一次，取最后一次的上清溶液，加入2倍体积乙醇，回收DNA，分别用70％和无水乙醇洗，沉淀溶于0.5毫升TE缓冲液(pH 8.0，10mM Tris，1mMEDTA)，加入10mg/ml RNase3μl，37℃保温1小时，分别用等体积酚、氯仿各抽提一次，上清液加入2倍体积乙醇，回收DNA，分别用70％和无水乙醇洗，真空干燥，用去离子水溶解。DNA溶液的紫外分光光度计测定结果为A260/A280＝1.98，A260/A230＝2.18。
(2)低温脂肪酶基因的克隆
取上述总DNA溶液10μl(约50μgDNA)，用限制酶Sau3AI部分酶切，经琼脂糖凝胶电泳，电洗脱回收2-6kbDNA片段。取2μl(5μg)Sau3AI酶解DNA片段与1μl(1μg)经BamHI酶解并脱磷酸化的质粒pUC18 DNA在20μl连接体系进行连接反应，其中含2μl(10×连接缓冲液)，1μl T4DNA连接酶，14μl水。连接体系在16℃反应16小时，转化感受态大肠杆菌DH5α后，涂于含50ug/ml Amp(氨苄青霉素)，三丁酸甘油酯(Tributyrin)的LB固体培养基上。25℃培养36-48小时，菌落周围有透明圈的即为阳性克隆。阳性克隆在Amp-LB培养基中25℃培养36小时，经活性测试具有低温脂肪酶活性。对阳性菌落用碱法提取重组质粒，用各种限制酶水解重组质粒，根据电泳结果证实有DNA片段插入质粒，其大小约为4.0kb。含该DNA片段的重组质粒称为pLIPP，含此重组质粒pLIPP的重组大肠杆菌称为大肠杆菌DH5αLIPP。
实验证明此重组质粒pLIPP可高频转化大肠杆菌表达低温脂肪酶活性和抗氨苄性能。将重组质粒中的DNA插入片段用地高辛DNA标记检测试剂盒标记，与低温微球菌(Micrococcus antarcticus)T2的染色体DNA进行Southern blot DNA杂交实验，证实重组质粒pLIPP中插入的DNA片段来自低温微球菌(Micrococcusantarcticus)T2(AS1.2372)的染色体DNA。
采用Sanger双脱氧法对此DNA片段进行了测序。测序结果显示插入片段含有一个长1215bp的开放阅读框架(ORF)，编码一个由404个氨基酸组成的蛋白质。最高相似性同Pseudomonas sp.的脂肪酶基因(45％)。
实施例2、培养低温微球菌(Micrococcus antarcticus)T2(AS1.2372)生产低温脂肪酶
(1)低温脂肪酶的发酵制备
于250ml三角烧瓶中，加入100ml液体发酵培养基，2％(v/v)接种量接入低温微球菌(Micrococcus antarcticus)T2(AS1.2372)，置20℃、220rpm旋转摇床振荡培养48小时。以稀释的培养液在550nm下的OD值测定菌体的生长，并测定酶活力。产酶发酵培养基(g/L)：蛋白胨，5；酵母提取物，2.5；NaCl，10；K₂HPO₄，1；CaCl₂，0.7；MgSO₄，0.2；橄榄油，10；pH7.0-7.2。实验结果表明，该菌株最适生长温度为17℃，适合于在温度较低的环境中生长。
(2)低温脂肪酶的纯化
①粗酶液的制备
将步骤(1)中的1升发酵液于5000×g条件下离心15分钟，弃掉沉淀，上清液中加入硫酸铵使其达到65％的饱和度，不断搅拌在4℃过夜，之后，12000×g的条件下离心20分钟。弃掉上清，沉淀溶于缓冲液A中(50mM K₂HPO₄-KH₂PO₄，pH 7.0)，并在缓冲液A中透析过夜，用于进一步的酶纯化过程。
②DEAE-纤维素层析
透析过的酶液被加到预先用缓冲液A平衡好的DEAE-纤维素柱(2.5×50cm)。然后用500ml 0.2-1M的线性KCl梯度洗脱DEAE-纤维素柱，以5ml每管收集流出液。合并活性部分，然后用蔗糖浓缩。最后，浓缩液用缓冲液B(50mM K₂HPO₄-KH₂PO₄，pH 6.6，5mM 2-mercaptoethanol，1mM PMSF，2.5M KCl)透析过夜。
③Sephadex G200柱层析
浓缩酶液加至预先用缓冲液A平衡过的Sephadex G200层析柱(1.5cm×100cm)上，用平衡缓冲液洗脱并分部收集，流速12ml/h。
粗酶液经盐析，DEAE柱层析，分子筛柱层析后，比活力由原来的11.06U/mg提高到682U/mg，纯化了62倍。
(3)低温脂肪酶的特性
用底物p-硝基苯丁酸酯(p-nitrophenylbutyrate)测定酶活力，酶的活力测定通过在25℃下，酶水解p-硝基苯丁酸酯(p-nitrophenylbutyrate)为底物释放出的p-硝基酚(p-nitrophenol)量来确定。反应缓冲体系为0.1M磷酸纳缓冲液(pH7.25)，并含有0.1MNaCl，酶活力单位定义为：每分钟释放1umol p-硝基酚(p-nitrophenol)所需的酶量。
①最适酶活温度
标准反应条件下，在给定的温度条件下测定酶活性，结果如图1所示，表明该酶最适温度为35℃，50℃的酶活力为最适酶活的20％。
②最适pH
在标准反应条件下(25℃)，以0.5mmoL p-硝基苯丁酸酯(p-nitrophenylbutyrate)为底物，于50mmoL/L不同缓冲液的条件下测定酶活性，结果如图2所示，表明该酶最适pH为8.0，在pH6.6-pH9范围内，该酶保持其最高酶活力的60％以上。
③热稳定性
将酶液分别在不同温度下如，10℃，20℃，30℃，40℃，50℃，60℃，保温30min，测定酶活力。结果如图3所示，表明该酶在30℃下保持很稳定，而在40℃活力开始下降，50℃酶失活较快，在60℃，30min后，丧失全部酶活。
④pH稳定性
将酶液与pH4.0-12.0的缓冲液混合，25℃放置30min，测定酶活力，结果如图4所示，表明酶在pH5.0-10.5的范围内比较稳定。
实施例3、重组菌E.coli DH5αLIPP生产的低温脂肪酶的特性
重组菌E.coli DH5αLIPP的菌体悬于50mM磷酸缓冲液(pH7)中，利用超声波破碎细胞，离心上清液为低温脂肪酶的粗酶液。上清酶液经离子交换柱层析，羟基磷灰石吸附柱层析和PAGE制备电泳等步骤进行纯化。利用已知的蛋白质化学标准方法测定此低温脂肪酶的基本特性，结果表明该低温脂肪酶的特性与嗜冷菌Micrococcus antarcticus T2生产的低温脂肪酶的特性一致，最适作用温度为35℃，作用pH为8，可水解脂肪产生脂肪酸和甘油。用SDS-PAGE测得的该低温脂肪酶的分子量为41000道尔顿，与理论上推算的分子量(43800道尔顿)相似。
                                序列表
<160>2
<210>1
<211>1215
<212>DNA
<213>Micrococcus antarcticus
<400>1
atggtgttta tcgtcaatct tttctcctgc accttatctg aaaccacggt tagctcaata      60
aaatctgaag ctacggttag ctcaacattt actgccgtca cggccctgca attggtggct     120
gagggtaagt tgcagtcggc gaagggtttc ggtggtggta cgattcacta cccaaccctc     180
gcggccgaag caccctggtg gacgccgggc caaggccatg gttacgaggc gatcacctac     240
ggctggctgg tcggcgaact gctgcgccgc gccgatgggc gtgggcctgg tctgttaggc     300
gctattgccg tggttcctgg ttacgtttct tacgagaact ctatcaagtg gtggggaccg     360
cgtctggctt cttggggctt tgtcgttgca cggccgttgg gcctggactt tcatgtgggc     420
ctggcggatg aagagtttta tcgtgttgcc catatagcgc gcagcaaagc caatgcagca     480
ctagataaca ttgctgatga caccgtcggc agtatagatc ctaagcggtt gggcgctatt     540
ggctggtcag gtggcggcgg cgcgcttaaa ctggcaacgg agcgcagcac agtacgagcc     600
attttgacca gtactaataa acctgaatgg cgacgcttcg ataaattctt atgtgcctgc     660
gaggatgacc ggattgctga gactaagaaa tatgccaacg cgttttataa aaatgccgac     720
atgctcgaag agttgacccg tgaacacagt atcgggccgg ataaaacatt attgacacaa     780
actcggtttg gcttggggtg cttggatcaa ccgcaagcag gggttaaaat tcattttgaa     840
gagtaccttg atcaaaccca tggatttatc aatttgacgc cagtttcaca taaggcgaga     900
gcaaatctga ttcagatgcc taatgccaca ttcggccttg gcccgcgtgc ttttgggcat     960
cctggtgcag gtggatcggt aggttttgcc gaccccgaac acgatgtagc gtttggtttc    1020
gtgactaata cattggggcc ttatgtagtt gagtttaaaa gccgtcatcc ctcattttat    1080
gcatataaag atggattggt gctgactgga aatgacgtcg actatgtgac tgattactat    1140
gcaacaaagc atgctgtaca tttagatgat ccacgtgcac agaagttggt cggaatattg    1200
gccggttgtc tgtaa                                                     1215
<210>2
<211>404
<212>PRT
<213>Micrococcus antarcticus
<400>2
Met Val Phe Ile Val Asn Leu Phe Ser Cys Thr Leu Ser Glu Thr Thr
1               5                   10                  15
Val Ser Ser Ile Lys Ser Glu Ala Thr Val Ser Ser Thr Phe Thr Ala
            20                  25                  30
Val Thr Ala Leu Gln Leu Val Ala Glu Gly Lys Leu Gln Ser Ala Lys
        35                  40                  45
Gly Phe Gly Gly Gly Thr Ile His Tyr Pro Thr Leu Ala Ala Glu Ala
    50                  55                  60
Pro Trp Trp Thr Pro Gly Gln Gly His Gly Tyr Glu Ala Ile Thr Tyr
65                  70                  75                  80
Gly Trp Leu Val Gly Glu Leu Leu Arg Arg Ala Asp Gly Arg Gly Pro
                85                  90                  95
Gly Leu Leu Gly Ala Ile Ala Val Val Pro Gly Tyr Val Ser Tyr Glu
            100                 105                 110
Asn Ser Ile Lys Trp Trp Gly Pro Arg Leu Ala Ser Trp Gly Phe Val
        115                 120                 125
Val Ala Arg Pro Leu Gly Leu Asp Phe His Val Gly Leu Ala Asp Glu
    130                 135                 140
Glu Phe Tyr Arg Val Ala His Ile Ala Arg Ser Lys Ala Asn Ala Ala
145                 150                 155                 160
Leu Asp Asn Ile Ala Asp Asp Thr Val Gly Ser Ile Asp Pro Lys Arg
                165                 170                 175
Leu Gly Ala Ile Gly Trp Ser Gly Gly Gly Gly Ala Leu Lys Leu Ala
            180                 185                 190
Thr Glu Arg Ser Thr Val Arg Ala Ile Leu Thr Ser Thr Asn Lys Pro
        195                 200                 205
Glu Trp Arg Arg Phe Asp Lys Phe Leu Cys Ala Cys Glu Asp Asp Arg
    210                 215                 220
Ile Ala Glu Thr Lys Lys Tyr Ala Asn Ala Phe Tyr Lys Asn Ala Asp
225                 230                 235                 240
Met Leu Glu Glu Leu Thr Arg Glu His Ser Ile Gly Pro Asp Lys Thr
                245                 250                 255
Leu Leu Thr Gln Thr Arg Phe Gly Leu Gly Cys Leu Asp Gln Pro Gln
            260                 265                 270
Ala Gly Val Lys Ile His Phe Glu Glu Tyr Leu Asp Gln Thr His Gly
        275                 280                 285
Phe Ile Asn Leu Thr Pro Val Ser His Lys Ala Arg Ala Asn Leu Ile
    290                 295                 300
Gln Met Pro Asn Ala Thr Phe Gly Leu Gly Pro Arg Ala Phe Gly His
305                 310                 315                 320
Pro Gly Ala Gly Gly Ser Val Gly Phe Ala Asp Pro Glu His Asp Val
                325                 330                 335
Ala Phe Gly Phe Val Thr Asn Thr Leu Gly Pro Tyr Val Val Glu Phe
            340                 345                 350
Lys Ser Arg His Pro Ser Phe Tyr Ala Tyr Lys Asp Gly Leu Val Leu
        355                 360                 365
Thr Gly Asn Asp Val Asp Tyr Val Thr Asp Tyr Tyr Ala Thr Lys His
    370                 375                 380
Ala Val His Leu Asp Asp Pro Arg Ala Gln Lys Leu Val Gly Ile Leu
385                 390                 395                 400
Ala Gly Cys Leu
            404