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用于检测病毒的组合物及使用该组合物检测病毒的方法
技术领域
本发明涉及用于快速简便地检测催化性分子的切割活性的新型组合物。本发明还提供了采用这些组合物的诊断测试和试剂盒。
背景技术
对健康相关因子(无论是疾病或者健康风险的标记，正常和致病过程或者疾病的标记或因子，或者是外来病原体和其副产物的指示)的快速的、特异性的和成本划算的检测有着日益增长的需求。随着诸如HIV、SARS、禽流感、西尼罗河热、耐药性致病菌疾病等席卷全球的传染性疾病的反复传播爆发，使得上述需求更加显著。面对日益增加的流行性和大流行性疾病爆发的威胁，致病因子的早期检测对于充分的关注和预防至关重要。然而，许多目前可供采用的病原体检测和分型方法的成本、复杂性和低效性已迫使执行费时费力极费钱而又低效的政策，诸如隔离、灭绝传病媒介和预防性疫苗接种，而其成功率尚存疑问。此外，已鉴定出疾病和病理过程的大量标记，其中一些包括催化活性诸如在各种癌症中的端粒酶，在白血病中的末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)，在阿尔茨海默氏病中的β-和γ-分泌酶(secretase)。
1918年，世界经历了西班牙流感，在欧洲共导致超过2千5百万人死亡。从此以后对医疗紧急事件的恐惧再次出现。仅在数年前，致命的SARS病毒在世界东方爆发，使整个世界经济有瘫痪的危险。所述SARS的爆发得到减缓并最终受到控制，但这仅是在采取极具破坏性的措施(包括疑似患者仅仅因为发热而与健康人群的长期隔离)之后。目前，禽流感威胁的爆发再次提醒世界人民快速检测危险病原体的改进方法的重要性。
在21世纪，由于航空旅行中感染的极大可能性以及个人、人群日益增加的流动性，使得新型全球性传染疾病传播的危险非常高。目前采用的用于检测病原性因子的方法包括：免疫检测，诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)和免疫荧光测定(IFA)，其依赖于在初次感染后10～20天进行的抗病原体抗体的检测；RT-PCR，其非常费钱费时并常常出现错误；以及组织培养物传染性，同样也是费时费钱。因此，亟需能够在机场和其他公共区域检测受感染的或者潜在传染性个体的快速简单诊断方法。所述方法必须在面对当前病毒因子具有高度可变性特征，能够变异形成高致病性物种的情况下能够进行精确地检测。需要一次检测多种病毒病原体以排除混合交叉感染的可能性以及更强类型病毒的形成。所述病原因子的快速准确分型也是需要优先考虑的。需要在医院机构或在家中快速检测大量病原因子，这将提供用于选择治疗方法的准确数据，并防止不同病原因子的混合和传染，并易于现场监控和治疗方案的细微调整。
许多生物体具有与生长或分化、代谢等的特定阶段相关的特征性催化活性。同样，病理过程常常具有特征性酶活性，能用在所述病理过程的诊断中，诸如癌症标记和心脏酶。基于催化活性的用于诊断和分类而进行检测的方法已公开，例如用于致病细菌的诊断和分类(参见，例如Maiden等，J.Clin.Micro，1996；34：376-84和授予Godsey等的美国专利5,888,760号)，癌形成中的DNA-光解酶(phytolyases)(参见例如Kundu等，ChemBioChem 2002；3：1053-60)，在阿尔茨海默氏病中的β-分泌酶活性(参见Hazuda等的美国专利申请第200302555号)，在活细胞中代谢活性作图(参见Boonacker等，J of Histochem and Cytochem 2001；49：1473-86)，半胱天冬酶和其他与细胞凋亡相关的酶(参见Weber等的美国专利申请第20020150885号)和病毒检测(参见例如授予Kettner等的美国专利第4,952,493号)。
这些催化活性的有效测量和临床应用要求能容易地被检测到的明确的特异性底物。一种潜在的这种诊断性催化活性是病毒感染的特异性蛋白酶活性。
在许多病毒诸如SARS病毒、人免疫缺陷病毒、人乳头状瘤病毒、疱疹病毒、鼻病毒、小RNA病毒、冠状病毒、丙型肝炎病毒等的复制期间，病毒遗传物质转录形成多蛋白，其最终切割为两种或两种以上的生物活性蛋白。所述病毒多蛋白切割为个体蛋白是病毒生命周期中的关键部分。许多病毒，包括腺病毒、杆状病毒、豇豆花叶病毒、小RNA病毒、反转录病毒和披膜病毒家族等的病毒编码蛋白酶，该蛋白酶在一些特定切割位点切割所述病毒多蛋白以形成病毒复制所需的活性蛋白。例如，鸭茅斑驳病毒(菜豆花叶病毒属)的复制期间的多蛋白加工描述在Makinen，K等，J.Gen.Virol.2000；81：2783-89中，其内容在此以参考的方式引入。作为参考，一些病毒蛋白酶和其他酶的已知实例的非穷尽列表在下文中提供。
一些病毒编码的蛋白酶仅切割特定病毒的多蛋白。另一些切割超过一种类型的病毒的多蛋白。蛋白酶作用的特异性源自于所述蛋白酶在所述多蛋白的切割区域中的相互作用性质。此外，在这些位置的切割速率根据所述切割位点周围的多蛋白的肽序列而变化。
沿所述病毒蛋白的由这些病毒蛋白酶所识别的切割位点已显示含有高度保守的氨基酸序列，这提示了将其包括在诊断和治疗方法中的可能性。
例如，授予Kettner等的美国专利第4,952,493号公开了用于检测病毒特异性蛋白酶活性的肽底物，其根据被病毒蛋白酶所识别的保守切割位点而设计。根据通过病毒多肽的测序确定的病毒特异性切割位点的氨基酸序列，或者根据所述病毒基因组的编码序列确定了这些肽底物的切割位点，并可通过与其他病毒多肽序列的比对来进行比较。某些氨基酸残基与其他生物相似残基进行的保守取代也认为是可以忍受的。
Tan等的美国专利申请第20050214890号公开了用于检测样品中寄生物、原生动物、病毒和其他蛋白酶活性的基质结合重组荧光融合底物的应用，其中所述检测是基于多底物的蛋白酶识别模式。所述切割和/或识别底物的设计源自已知的共有切割和/或结合序列。目标蛋白酶的增强检测则是由于多底物的同时测定。
然而，没有任何一种上述方法描述、建议或提及选择病毒底物从而获得最优化的亲合性而最终实现多样品、多病毒的快速同时分析以及新型株的特异性识别。
通过所述底物切割序列的最优化设计而提高的蛋白酶检测效率将提供检测的优异快捷性、灵敏度和经济性和病毒感染的特征化。此外，底物切割序列的设计方法及其产物将用于抗病毒药物的筛选和开发。
因此存在广泛认可的需求，并且获得最优化底物和方法将是非常有利的，所述最优化底物和方法用于检测催化性分子的切割活性以快速特异性地检测其特征在于切割活性的疾病和感染过程，并且不具有上述缺陷。
发明内容
根据本发明的一个方面，本发明提供了分离肽，所述分离肽含有选自由SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46和47组成的组的氨基酸序列，所述氨基酸序列的长度不超过14个氨基酸。
根据本发明的另一方面，本发明提供了含有病毒蛋白酶的底物的组合物，所述底物与至少一个可检测部分相连并含有所述氨基酸序列。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述至少一个可检测部分是FRET对，而所述底物的切割产生来自于所述FRET对的信号。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述组合物进一步含有分离部分。
根据本发明的再一个方面，本发明提供了通式为X-Y-Z的组合物，
其中：
Y含有病毒蛋白酶的底物，所述底物含有氨基酸序列，X-Y-Z经所述病毒蛋白酶切割形成切割产物X-Y′和Y＂-Z，其中Y′是Y的第一切割产物，Y＂是Y的第二切割产物；
X含有可检测部分；和
Z含有能与两相分离体系的分离相相结合的分离部分；
其中所述X-Y-Z并不形成所述病毒蛋白酶的天然底物的相邻部分。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述可检测部分X含有选自由酶、荧光团、发色团、蛋白、酶原、化学发光物质和放射性同位素组成的组的标记剂。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述分离部分Z选自由免疫结合剂、磁结合部分、肽结合部分、亲合结合部分、核酸部分组成的组。
根据本发明的再一个方面，本发明提供了通式为X-Y-Z的组合物，
其中：
Y含有病毒蛋白酶的底物，所述底物含有氨基酸序列，X-Y-Z经所述病毒蛋白酶切割形成切割产物X-Y′和Y＂-Z，其中Y′是Y的第一切割产物，Y＂是Y的第二切割产物；
X或Z含有标记，或者可检测部分和/或能以适宜的方式分离经切割的或未切割的组合物的分离部分。
其中所述X-Y-Z并不形成所述病毒蛋白酶的天然底物的相邻部分。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，其中所述标记、X或Z部分含有选自由酶、荧光团、发色团、蛋白、化学发光物质、猝灭剂、FRET对、珠子、肽、酶原和放射性同位素、免疫结合剂、磁结合部分、肽结合部分、亲合结合部分、核酸部分组成的组的标记剂。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了检测样品中至少一种病毒的方法，所述方法包括
(a)将样品与所述组合物中的至少一个在能进行所述底物的切割的条件下接触；和
(b)监测所述底物的切割，其中所述底物的切割是所述样品中至少一种病毒存在的指示。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，步骤(a)包括将所述样品与不同病毒蛋白酶的至少两种底物相接触，其中所述至少两种底物中任一种未出现所述切割则指示所述样品中不存在病毒。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述样品选自由粘液、唾液、咽喉清洗液、鼻清洗液、脊髓液、痰、尿、精液、汗液、粪便、血浆、血液、支气管肺泡液(broncheoalveolar fluid)、阴道液、泪液和活组织检查物。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述样品中所述切割活性的检测是对医学状况的诊断。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述监测是采用均相测定(homogeneous assay)实现的。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述监测是采用异相测定(heterogeneous assay)实现的。
根据本发明的再一个方面，本发明提供了用于检测样品中至少一种病毒的诊断试剂盒，所述试剂盒含有至少一种组合物，和用于检测所述底物的切割的试剂。
根据本发明的再一个方面，本发明提供了含有包装材料和用于检测多种病毒存在的多种组合物的诊断试剂盒，其中每种所述组合物的通式为，
X-Y-Z
其中：
Y含有病毒蛋白酶的底物，X-Y-Z经所述病毒蛋白酶切割形成切割产物X-Y′和Y＂-Z，其中Y′是Y的第一切割产物，Y＂是Y的第二切割产物；
X或Z含有标记，或者可检测部分和/或能以适宜的方式分离经切割的或未切割的组合物的分离部分，
其中所述X-Y-Z并不形成所述病毒蛋白酶的天然底物的相邻部分，
其中所述X或Z中的每一个包含至少一个特殊可检测部分，而所述包装材料包括标签或包装插页以指示所述试剂盒用于检测样品中的多种病毒。
根据本发明的再一个方面，本发明提供了含有包装材料和用于检测多种病毒存在的多种组合物的诊断试剂盒，其中每种所述组合物的通式为，
X-Y-Z
其中：
Y含有病毒蛋白酶的底物，X-Y-Z经所述病毒蛋白酶切割形成切割产物X-Y′和Y＂-Z，其中Y′是Y的第一切割产物，Y＂是Y的第二切割产物；
X含有可检测部分；和
Z含有能与两相分离体系的分离相相结合的分离部分；
其中所述X-Y-Z并不形成所述病毒蛋白酶的天然底物的相邻部分，
其中所述X中的每一个是特殊可检测的，而所述包装材料包括标签或包装插页以指示所述试剂盒用于检测样品中的多种病毒。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述多种组合物与单个固体支持物相连。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述特殊的检测是通过在所述单个固体支持物上的可寻址定位实现的。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述特殊的检测是通过不同的可检测部分实现的。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述多种组合物中的每一种与固体支持物相连。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述固体支持物成形为珠子。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述珠子选自由有色珠子、磁性珠子、标签珠子和荧光珠子组成的组。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，是呼吸试剂盒，含有选自由冠状病毒、SARS、HMPV(人类间质肺病毒)、流感病毒A+B、禽流感病毒、腺病毒、RSV(呼吸道合胞病毒)、鼻病毒、副流感病毒组成的组的至少两种病毒。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，是含有汉他病毒和拉克罗斯脑炎病毒(La Crosse Encephalitis)的呼吸试剂盒。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，是胃肠试剂盒，含有选自由轮状病毒、腺病毒40/41、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、杯状病毒和CMV(巨细胞病毒)组成的组的至少两种病毒。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述诊断试剂盒是脑膜炎试剂盒，含有选自由肠道病毒(1-～80)、西尼罗病毒、单纯疱疹病毒1、2和6组成的组的至少两种病毒。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述诊断试剂盒是脑膜炎试剂盒，含有选自由披膜病毒、黄病毒和狂犬病毒组成的组的至少两种病毒。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述诊断试剂盒是性传播疾病试剂盒，含有选自由HIV病毒株、单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、HSV-1、HSV-2、HPV(人乳头状瘤病毒)和HTLV-1组成的组的至少两种病毒。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述诊断试剂盒是旅行者试剂盒，含有选自由甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HIV、疱疹病毒1和2组成的组的至少两种病毒。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述诊断试剂盒是兽医试剂盒，含有选自由狂犬病毒和犬瘟热病毒组成的组的至少两种病毒。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述至少一种样品包括多种样品。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述至少一种病毒包括多种病毒。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述病毒是腺病毒而所述底物含有SEQ ID NO：1或2。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述病毒是α病毒而所述底物含有SEQ ID NO：3。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述病毒是风疹病毒而所述底物含有SEQ ID NO：4。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述病毒是HIV而所述底物含有SEQ ID NO：5。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述病毒是HTLV而所述底物含有SEQ ID NO：6、7或8。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述病毒是动脉炎病毒而所述底物含有SEQ ID NO：9。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述病毒是冠状病毒而所述底物含有SEQ ID NO：10。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述病毒是SARS冠状病毒而所述底物含有SEQ ID NO：11或12。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述病毒是环状病毒而所述底物含有SEQ ID NO：13。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述病毒是CMV病毒而所述底物含有SEQ ID NO：14或15。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述病毒是疱疹病毒而所述底物含有SEQ ID NO：16。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述病毒是黄病毒而所述底物含有SEQ ID NO：17。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述病毒是登革病毒而所述底物含有SEQ ID NO：18、19或20。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述病毒是西尼罗病毒而所述底物含有SEQ ID NO：21、22或23。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述病毒是黄热病病毒而所述底物含有SEQ ID NO：24、25或26。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述病毒是日本脑炎病毒而所述底物含有SEQ ID NO：27、28或29。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，其中所述病毒是蜱传病毒(Tick bone virus)而所述底物含有SEQ ID NO：30、31或32。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述病毒是丙型肝炎病毒而所述底物含有SEQ ID NO：33、34或35。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述病毒是瘟病毒而所述底物含有SEQ ID NO：36。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述病毒是甲型肝炎病毒而所述底物含有SEQ ID NO：37或38。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述病毒是HRV而所述底物含有SEQ ID NO：39或40。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述病毒是肠道病毒而所述底物含有SEQ ID NO：41、42、43、44、45、46或47。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述病毒是HRV病毒而所述底物含有SEQ ID NO：143～151。
根据本发明的再一个方面，本发明提供了设计动力学最优化的病毒蛋白酶底物的方法，所述方法包括：
(a)在至少一种所述病毒株的多蛋白的多个切割序列中，鉴别显示出所述蛋白酶最快切割动力学的切割序列，和
(b)鉴别显示出最快切割动力学的家族范围共有切割序列，所述家族范围共有切割序列用于设计动力学最优化的所述蛋白酶底物。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述病毒蛋白酶是病毒编码的蛋白酶。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述病毒选自由DNA病毒和RNA病毒组成的组。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述病毒选自由覆盖层病毒科(Tectiviridae)、乳多空病毒科(Papovaviridae)、圆环病毒科(Circoviridae)、细小病毒科(Parvoviridae)和嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、囊状病毒科(Cystoviridae)、双RNA病毒科(Birnaviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)、动脉炎病毒(Arterivirus)、星状病毒科(Astroviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)、小RNA病毒科(Picornaviridae)、马铃薯Y病毒科(Potyviridae)、反转录病毒科(Retroviridae)、正粘液病毒科(Orthomyxoviridae)、丝状病毒科(Filoviridae)、副粘液病毒科(Paramyxoviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)和布尼安病毒科(Bunyaviridae)、腺病毒科(Adenoviridea)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、小RNA病毒科(Picornaviridae)组成的组。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述病毒蛋白酶选自由丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、3C蛋白酶、PA转录酶、腺嘌呤蛋白酶、2A蛋白酶、胰凝乳蛋白酶(chimotrypsin)或胰蛋白酶，例如NS3、NS2、NS-pro半胱氨酸蛋白酶、nsP2半胱氨酸蛋白酶、nsP23pro、C蛋白蛋白酶、SFV NS、HIV天冬氨酸蛋白酶、nsp4动脉炎病毒蛋白酶、HCMV蛋白酶，NS2-3、NS3-4Ap蛋白酶、HTLV-1PR组成的组。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述的方法进一步包括以下步骤：
(c)设计含有所述家族范围共有切割序列的多个切割序列；和
(d)在所述多个切割序列中鉴别具有所述蛋白酶最快切割动力学的切割序列。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，所述设计包括设计具有最佳溶解度、温度敏感性和/或pH敏感性的所述切割序列。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，步骤(a)的所述鉴别包括经验性实验。
根据以下描述的本发明的优选实施方式中的再一个特征，步骤(a)的所述鉴别包括数据挖掘。
根据本发明的再一个方面，本发明提供了一种分离肽，所述分离肽含有选自由SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46和47组成的组的氨基酸序列，所述氨基酸序列的长度不超过14个氨基酸，且含有抑制相应病毒蛋白酶活性的模拟物。
根据本发明的再一个方面，本发明提供了所述肽在经鉴别用于治疗病毒感染的药物的制造中的用途。
根据本发明的再一个方面，本发明提供了包含所述分离肽作为活性成分的药物组合物。
本发明通过提供用于检测病毒的组合物和方法成功地克服了现有方案的缺点。
除非另外指明，在此使用的技术和科技术语具有与本发明所属领域的普通技术人员所普遍理解的相同的含义。虽然与此处所描述的相似或相当的方法和材料能用于本发明的实践和测试，以下描述了合适的方法和材料。在冲突的情况下，以本发明说明书，包括定义，为主。此外，所述材料、方法和实施例仅是描述性的，并非旨在用于进行限定。
附图说明
参考附图，仅通过实施例方式在此处对本发明进行描述。现在详细地具体参考所述附图，需要强调的是所显示的细节是通过实施例方式并且仅仅是为了本发明的优选实施方式的描述性讨论的目的，以及是为了据认为是本发明的原理和概念性方面的最有用的和最容易理解的描述而进行陈述的。在这点上，没有进行任何试图以显示出比展现本发明的基本理解所必需的结构细节更详细的本发明的结构细节，所述附图所附带的描述使得本领域技术人员清楚地理解本发明的多种形式是如何体现在实践中的。
在所述附图中：
图1a～b是分别含有HRV 163C和SARS 3C1蛋白酶的质粒pMND1(1a)和pMND2(1b)的图示说明。
图2是来自大肠杆菌E.coli中的SARS和HRV的重组3C蛋白酶的表达的时间进程。用0.4mM IPTG诱导转化的克隆，在Bioanalyzer 2100lab-on-chip上采用Protein 200 plus chip kit(蛋白质200加上芯片试剂盒)(Agilent Technologies，Inc，Palo Alto CA)通过电泳分析全细胞溶解产物。泳道1—MW梯度；泳道2～4—分别为在诱导后0、1和6小时的pMND-2；泳道4～6—分别为在诱导后0、1和6小时的pMND-1。注意到SARS3CL和HRV 16 3C蛋白酶表达随时间增长的稳定增加。
图3是与自然切割位点(Ori 2)相比，经设计的PEP1底物的优异底物特性的图形描述。反应含有5μM荧光底物和500nM重组3C蛋白酶，由荧光仪在340/490±15nm进行监测。酶浓度为500pM～1μM Pep-1—实心椭圆；Ori 2—实心菱形；Pep1对照—实心矩形；Ori 2对照—实心三角。注意到Pep 1时的优异底物切割。
图4是HRV 3C蛋白酶(250nM)与合成Pep 1底物在3nM～4μM的底物浓度下的优异反应动力学的图形描述。
图5是所述合成Pep 1底物由HRV 3C蛋白酶切割的特异性的图形描述。荧光Pep 1底物与E.coli溶解产物(实心方块)、重组SARS 3CL溶解产物(实心圆)、重组HRV 3C溶解产物(实心三角)和对照(无溶解产物)(实心菱形)进行温育。注意到Pep 1对HRV 3C蛋白酶的绝对特异性。
图6是Pep 1底物由HRV 3C蛋白酶在鼻清洗液条件下的有效切割的图形描述。荧光Pep 1底物与重组HRV 3C在没有50体积％鼻清洗液存在下(实心方块)和有50体积％鼻清洗液(样品E0052)存在下(实心圆)进行反应。对照为仅有鼻清洗液(E0052)(实心菱形)。注意到不存在所述鼻清洗液对底物切割的作用。
图7是能用于切割事件检测的本发明的组合物的示意图。
图8是显示所述系统基本事件的示意图，所述系统采用在上述图7中所描述的组合物。
图9是显示多种病毒的分离机理的示意性代表图。
图10是同时检测进行三种类型的切割反应的三种分子的示意性代表图。
图11是描述NS3蛋白酶对丙型肝炎病毒多蛋白的连续水解的示意图。
具体实施方式
本发明涉及用于检测病毒的组合物及使用该组合物检测病毒的方法。
参考所述附图及所附说明可更好地理解本发明的原理和操作。
在详细解释本发明的至少一个实施方式前，应当理解并非将本发明应用局限于以下描述中阐述的或者在实施例中举例说明的细节。本发明可具有其他实施方式或者能以多种方式进行实施或者执行。同样，还应当理解此处所采用的短语和术语仅为描述性目的而不应当作为限制性的。
用于检测急性感染的诊断化验领域快速变化，从抗体检测变至病原体检测，由基于临床实验室变至基于护理点，由单个分析物检测变至多分析物检测，并且更着眼于采用较少侵入性收集生物样品进行检测的策略。新型测定通常比传统测定更加灵敏，并能提供更多的信息而对所述病原体或者所述宿主对病原体的应答进行表征。从公共健康角度，能根据独特的基因序列或抗原属性对病原体进行跟踪的分子流行病学的出现已革命性的改变了流行病学家如何调查和评估流行病和评价区域性疾病。此外，治疗点(POC)设备的使用可对感染检测和监视产生影响，并将提高我们精确判定致病原因的能力。
通过鉴别病毒酶活性检测病毒，之前已得到提议，诸如授予DoritArad的美国专利第4,952,493号和美国专利申请第20050048473号。这些基于酶活性的诊断测定远比分子分析诸如聚合酶链式反应(PCR)化验优异，这是因为后者非常麻烦，通常需要进行数个小时，并且成本昂贵。此外，目前提供的PCR方法给出40％的假阳性结果和阴性结果(由于它们也鉴别失活的病毒)使得所述方法效率低下并且也不安全。通常，活体样品中病毒蛋白酶的检测结果指示出身体中活的和具有活性的病毒感染的存在。这与可以检测与活病毒无关的DNA或RNA序列的PCR分析，检测抗病毒的身体免疫反应性的存在的抗体检测测定形成鲜明对比。相反，能检测病毒抗原的抗体测定并非始终代表活病毒的存在，这是因为病毒抗原甚至会在一个疾病生命周期内为特定抗体而发生改变和变异。
当构思本发明时，本发明人假设用于蛋白酶活性测定的最佳底物将是多蛋白(即所述蛋白酶的天然底物)的共有切割位点，其切割动力学是最快的。符合该序列的底物将偶发性地用在酶诊断测试中以快速广泛地鉴别诸多共享同一蛋白酶的病毒。
如下文所描述(并在丙型肝炎NS3蛋白酶的实施例1中详细举例说明)，本发明人鉴定了大量病毒家族(即DNA和RNA病毒，参见实施例2)的这些动力学优化底物。如此鉴定的HRV和肠道病毒的底物能用于成功地检测在鼻液和脑脊液(CSF)样品中的相应病毒并与RT-PCR分析(参见实施例4和5)的结果进行比较。然而，正如所提到的，RT-PCR检测的准确性是令人怀疑的，而本发明的蛋白酶检测相比RT-PCR检测具有明显优势，如上文所述。
因此，根据本发明的一个方面，本发明提供了病毒蛋白酶的动力学最优底物的设计方法。
如此处所使用的短语“动力学最优底物”指相应于能最快速地被所述蛋白酶切割(由K(1M)，k(cat)和k(cat)/K(m)所定义，并假定所述酶遵守Michaelis-Menten动力学)的天然切割位点的保守氨基酸序列。
所述底物可以是氨基酸底物(即，含有氨基酸序列)或其模拟物。
此处所使用的短语“病毒蛋白酶”指病毒编码的蛋白酶(以下提供了蛋白酶的实例)。所述病毒可以是表达蛋白水解酶(优选为不表现出宿主蛋白酶切割特异性)的任何病毒。
本发明的这个方面的方法如下实现：(a)在至少一种病毒株的多蛋白的多个切割序列(参见图11)中鉴别出表现出所述蛋白酶最快切割动力学的切割序列，和(b)鉴别出显示出最快切割动力学的家族范围共有切割序列，所述家族范围共有切割序列能用于设计所述病毒蛋白酶的动力学最优底物。
采用本领域任何已知方法能实现经验性动力学表征，通常包括通过重组或合成方法制备可溶性荧光底物(例如基于HPLC的测定)。作为另外一种选择，也可以使用肽底物的细胞库[例如，参见Boulware和Daugherty2006 PNAS 103：20-7583：7588]。还可参见Orr D.C.等“Hydrolysis of a seriesof synthetic peptide substrates by the human rhinovirus 14 3C proteinase，cloned and expressed in E.coli”，J.Gen.Vir.卷70，页2931-42(1989)，其内容在此以参考的方式引入。
可采用替代性的或者附加性的文献数据挖掘来描述表现出最快切割动力学的切割序列，如在以下实施例部分的实施例1中的详细描述。
一旦获得表现出最快切割动力学的切割序列，则可以鉴别出表现出最快切割动力学的家族范围共有切割序列。
此处所使用的“家族范围共有”指在相应于属于同一病毒家族的多蛋白的最快切割序列的经比对的序列系列的每个位置上最常见的氨基酸。
这是通过使用常见的生物信息学工具采用序列比对算法诸如BLAST(Basic Local Alignment Search Tool(基础区域比对搜寻工具)，通过www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST获得)或者Smith-Waterman算法(参见以下实施例部分的实施例1)而实现的。
一旦鉴别出所述家族范围共有序列，可以设计含有该共有序列的肽，如果需要，可使其序列适应于表现出令人感兴趣的生物化学性质。实例包括最佳溶解度、温度稳定性和pH稳定性。这些肽被认为是本发明的底物。
此处使用的术语“肽”包括天然肽(或者是降解产物、合成方式合成的肽或重组肽)和拟肽(通常为合成方式合成的肽)，以及作为肽类似物的类肽和半类肽，其具有例如使所述肽在身体中更稳定或者更能穿透进入细胞等修饰。这些修饰包括但并不局限于N端修饰、C端修饰、肽键修饰(包括但不局限于CH₂-NH、CH₂-S、CH₂-S＝O、O＝C-NH、CH₂-O、CH₂-CH₂、S＝C-NH、CH＝CH或CF＝CH)、骨架修饰和残基修饰。制备拟肽化合物的方法在本领域内熟知，并在例如Quantitative Drug Design，CA.Ramsden Gd.，Chapter 17.2，F.Choplin Pergamon出版社(1992)中详细说明，将其在此以参考的方式引入如同在此进行完全详细说明。此方面的更多细节在以下进行提供。
所述肽中的肽键(-CO-NH-)可例如被N-甲基化键(-N(CH₃)-CO-)、酯键(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)、酮亚甲基键(-CO-CH₂-)、α-氮杂键(-NH-N(R)-CO-)所取代，其中R是任何烷基例如甲基、carba键(-CH₂-NH-)、羟基亚乙基键(-CH(OH)-CH₂-)、硫代酰胺键(-CS-NH-)、烯类双键(-CH＝CH-)、反式酰胺键(-NH-CO-)、肽衍生物(-N(R)-CH₂-CO-)，其中R是“正常”侧链，天然存在于所述碳原子上。
这些修饰可以发生在沿所述肽链的任意键上并且甚至同时在多处(2～3)发生。
天然芳香氨基酸，Trp、Tyr和Phe，可由合成非天然氨基酸诸如苯基甘氨酸、Tic、萘基丙氨酸(Nal)、苯基异丝氨酸、苏氨醇、Phe的环-甲基化衍生物、Phe的卤代衍生物或邻甲基-Tyr所取代。
除上述之外，本发明的肽还可包括一个或多个经修饰的氨基酸或一个或多个非氨基酸单体(例如脂肪酸、复合碳水化合物等)。
在本说明书和以下权利要求部分中使用的术语“氨基酸”或“多种氨基酸”理解为包括所述20种天然氨基酸；通常在翻译后进行体内修饰的氨基酸，包括例如羟基脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；以及其他非常见氨基酸包括但不局限于2-氨基己二酸、羟基赖氨酸、异锁链赖氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸、此外，术语“氨基酸”包括D-和L-氨基酸。
以下表1和表2列出了能用于本发明的天然氨基酸(表1)和非常规或经修饰的氨基酸(例如合成的，表2)。
表1
 

氨基酸三字母简称一字母代号丙氨酸AlaA精氨酸ArgR天冬酰胺AsnN天冬氨酸AspD半胱氨酸CysC谷氨酰胺GlnQ谷氨酸GluE甘氨酸GlyG组氨酸HisH异亮氨酸IieI亮氨酸LeuL赖氨酸LysK甲硫氨酸MetM苯丙氨酸PheF脯氨酸ProP丝氨酸SerS苏氨酸ThrT色氨酸TrpW酪氨酸TyrY缬氨酸ValV以上任意氨基酸XaaX
表2
 非常规氨基酸代号非常规氨基酸代号α-氨基丁酸AbuL-N-甲基丙氨酸Nmalaα-氨基-α-甲基丁酸酯MgabuL-N-甲基精氨酸Nmarg氨基环丙烷-CproL-N-甲基天冬酰胺Nmasn羧酸酯L-N-甲基天冬氨酸Nmasp氨基异丁酸AibL-N-甲基半胱氨酸Nmcys氨基正冰片基-NorbL-N-甲基谷氨酰胺Nmgin羧酸酯L-N-甲基谷氨酸Nmglu环己基丙氨酸ChexaL-N-甲基组氨酸Nmhis环戊基丙氨酸CpenL-N-甲基异亮氨酸NmileD-丙氨酸DalL-N-甲基亮氨酸NmleuD-精氨酸DargL-N-甲基赖氨酸NmlysD-天冬氨酸DaspL-N-甲基甲硫氨酸NmmetD-半胱氨酸DcysL-N-甲基正亮氨酸NmnleD-谷氨酰胺DglnL-N-甲基正缬氨酸NmnvaD-谷氨酸DgluL-N-甲基鸟氨酸NmornD-组氨酸DhisL-N-甲基苯丙氨酸NmpheD-异亮氨酸DileL-N-甲基脯氨酸NmproD-亮氨酸DleuL-N-甲基丝氨酸NmserD-赖氨酸DlysL-N-甲基苏氨酸NmthrD-甲硫氨酸DmetL-N-甲基色氨酸NmtrpD-鸟氨酸DornL-N-甲基酪氨酸NmtyrD-苯丙氨酸DpheL-N-甲基缬氨酸NmvalD-脯氨酸DproL-N-甲基乙基甘氨酸NmetgD-丝氨酸DserL-N-甲基-叔丁基甘氨酸NmtbugD-苏氨酸DthrL-正亮氨酸NleD-色氨酸DtrpL-正缬氨酸NvaD-酪氨酸Dtyrα-甲基-氨基异丁酸酯MaibD-缬氨酸Dvalα-甲基-γ-氨基丁酸酯MgabuD-α-甲基丙氨酸Dmalaα-甲基环己基丙氨酸MchexaD-α-甲基精氨酸Dmargα-甲基环戊基丙氨酸McpenD-α-甲基天冬酰胺Dmasnα-甲基-α-萘基丙氨酸ManapD-α-甲基天冬氨酸酯Dmaspα-甲基青霉胺MpenD-α-甲基半胱氨酸DmcysN-(4-氨基丁基)甘氨酸NgluD-α-甲基谷氨酰胺DmglnN-(2-氨基乙基)甘氨酸NaegD-α-甲基组氨酸DmhisN-(3-氨基丙基)甘氨酸NornD-α-甲基异亮氨酸DmileN-氨基-α-甲基丁酸酯NmaabuD-α-甲基亮氨酸Dmleuα-萘基丙氨酸AnapD-α-甲基赖氨酸DmlysN-苯甲基甘氨酸NpheD-α-甲基甲硫氨酸DmmetN-(2-氨基甲酰乙基)甘氨酸NglnD-α-甲基鸟氨酸DmornN-(氨基甲酰乙基)甘氨酸NasnD-α-甲基苯丙氨酸DmpheN-(2-羧基乙基)甘氨酸NgluD-α-甲基脯氨酸DmproN-(羧基甲基)甘氨酸NaspD-α-甲基丝氨酸DmserN-环丁基甘氨酸NcbutD-α-甲基苏氨酸DmthrN-环庚基甘氨酸NchepD-α-甲基色氨酸DmtrpN-环己基甘氨酸NchexD-α-甲基酪氨酸DmtyN-环癸基甘氨酸NcdecD-α-甲基缬氨酸DmvalN-环十二烷基甘氨酸Ncdod
 D-α-methylalnineDnmalaN-环辛基甘氨酸NcoctD-α-甲基精氨酸DnmargN-环丙基甘氨酸NcproD-α-甲基天冬酰胺DnmasnN-环十一烷基甘氨酸NcundD-α-甲基天冬氨酸酯DnmaspN-(2，2-二苯基乙基)甘氨酸NbhmD-α-甲基半胱氨酸DnmcysN-(3，3-二苯基丙基)甘氨酸NbheD-N-甲基亮氨酸DnmleuN-(3-吲哚基乙基)甘氨酸NhtrpD-N-甲基赖氨酸DnmlysN-甲基-γ-氨基丁酸酯NmgabuN-甲基环己基丙氨酸NmchexaD-N-甲基甲硫氨酸DnmmetD-N-甲基鸟氨酸DnmornN-甲基环戊基丙氨酸NmcpenN-甲基甘氨酸NalaD-N-甲基苯丙氨酸DnmpheN-甲基氨基异丁酸酯NmaibD-N-甲基脯氨酸DnmproN-(1-甲基丙基)甘氨酸NileD-N-甲基丝氨酸DmnserN-(2-甲基丙基)甘氨酸NileD-N-甲基丝氨酸DnmserN-(2-甲基丙基)甘氨酸NleuD-N-甲基苏氨酸DnmthrD-N-甲基色氨酸DnmtrpN-(1-甲基乙基)甘氨酸NvaD-N-甲基酪氨酸DnmtyrN-甲基α-萘基丙氨酸NmanapD-N-甲基缬氨酸DnmvalN-甲基青霉胺Nmpenγ-氨基丁酸GabuN-(对-羟基苯基)甘氨酸NhtyrL-叔丁基甘氨酸TbugN-(硫甲基)甘氨酸NcysL-乙基甘氨酸Etg青霉胺PenL-高苯基丙氨酸HpheL-α-甲基丙氨酸MalaL-α-甲基精氨酸MargL-α-甲基天冬酰胺MasnL-α-甲基天冬氨酸酯MaspL-α-甲基叔丁基甘氨酸MtbugL-α-甲基半胱氨酸McysL-甲基乙基甘氨酸MetgL-α-甲基谷氨酸酯MglnL-α-甲基谷氨酸酯MgluL-α-甲基组氨酸MhisL-α-甲基高苯基丙氨酸MhpheL-α-甲基异亮氨酸MileN-(2-甲基硫乙基)甘氨酸NmetD-N-甲基谷氨酰胺DnmglnN-(3-胍基丙基)甘氨酸NargD-N-甲基谷氨酸酯DnmgluN-(1-羟基乙基)甘氨酸NthrD-N-甲基组氨酸DnmhisN-(羟基乙基)甘氨酸NserD-N-甲基异亮氨酸DnmileN-(咪唑基乙基)甘氨酸NhisD-N-甲基亮氨酸DnmleuN-(3-吲哚基乙基)甘氨酸NhtrpD-N-甲基赖氨酸DnmlysN-甲基-γ-氨基丁酸酯NmgabuN-甲基环己基丙氨酸NmchexaD-N-甲基甲硫氨酸DnmmetD-N-甲基鸟氨酸DnmornN-甲基环戊基丙氨酸NmcpenN-甲基甘氨酸NalaD-N-甲基苯丙氨酸DnmpheN-甲基氨基异丁酸酯NmaibD-N-甲基脯氨酸DnmproN-(1-甲基丙基)甘氨酸NileD-N-甲基丝氨酸DnmserN-(2-甲基丙基)甘氨酸NleuD-N-甲基苏氨酸DnmthrD-N-甲基色氨酸DnmtrpN-(1-甲基乙基)甘氨酸NvalD-N-甲基酪氨酸DnmtyrN-甲基α-萘基丙氨酸Nmanap
 D-N-甲基缬氨酸DnmvalN-甲基青霉胺Nmpenγ-氨基丁酸GabuN-(对-羟基苯基)甘氨酸NhtyrL-叔丁基甘氨酸TbugN-(硫甲基)甘氨酸NcysL-乙基甘氨酸Etg青霉胺PenL-高苯基丙氨酸HpheL-α-甲基丙氨酸MalaL-α-甲基精氨酸MargL-α-甲基天冬酰胺MasnL-α-甲基天冬氨酸酯MaspL-α-甲基叔丁基甘氨酸MtbugL-α-甲基半胱氨酸McysL-甲基乙基甘氨酸MetgL-α-甲基谷氨酰胺MglnL-α-甲基谷氨酸酯MgluL-α-甲基组氨酸MhisL-α-甲基高苯丙氨酸MhpheL-α-甲基异亮氨酸MileN-(2-甲基硫乙基)甘氨酸NmetL-α-甲基亮氨酸MleuL-α-甲基赖氨酸MlysL-α-甲基甲硫氨酸MmetL-α-甲基正亮氨酸MnleL-α-甲基正缬氨酸MnvaL-α-甲基鸟氨酸MornL-α-甲基苯丙氨酸MpheL-α-甲基脯氨酸MproL-α-甲基丝氨酸mserL-α-甲基苏氨酸MthrL-α-甲基缬氨酸MtrpL-α-甲基酪氨酸MtyrL-α-甲基亮氨酸Mval NnbhmL-N-甲基高苯丙氨酸NmhpheN-(N-(2，2-二苯基乙基)N-(N-(3，3-二苯基丙基)氨基甲酰甲基-甘氨酸Nnbhm氨基甲酰甲基(1)甘氨酸Nnbhe1-羧基-1-(2，2-二苯基乙基氨基)环丙烷Nmbc
由于本发明的肽优选用于临床，其要求所述肽为可溶解形式，因此本发明的肽优选包括一种或多种非天然或天然极性氨基酸，包括但不限制于由于其含有羟基的侧链而能够提高肽溶解度的丝氨酸和苏氨酸。
本发明的肽可通过肽合成领域中技术人员已知的任何技术进行合成。对于固相肽合成，许多技术的总结可在Stewart，J.M.和Young，J.D.(1963)，“Solid Phase Peptide Synthesis，”W.H.Freeman Co.(SanFrancisco)；和Meienhofer，J(1973).“Hormonal Proteins and Peptides，”卷2，p.46，Academic出版社(New York)中找到。对于经典溶液合成的综述，可参见Schroder，G.和Lupke，K.(1965).The Peptides，卷1，Academic出版社(New York)。
概述之，肽合成方法包括将一个或多个氨基酸或经过恰当保护的氨基酸依次加到生长中的肽链上。通常，第一个氨基酸的氨基或者羧基由恰当的保护基团保护。通过在适于形成酰胺键的条件下加入序列中的下一个氨基酸，该氨基酸的相对基团(complimentary group)(氨基或羧基)受到恰当保护，所述受保护或者经修饰的氨基酸可或者与惰性固体支持物相连或者在溶液中使用。然后从新加入的氨基酸残基上脱去保护基团，并加入下一个氨基酸(恰当保护的)，等等；传统上，该过程也伴随着洗涤步骤。在所有所需氨基酸已按照正确顺序连接以后，依次或者同时脱掉残余的任何保护基团(以及任何固体支持物)，以得到最终肽化合物。通过对该通用过程进行简单修改，可以向生长中的链一次添加多于一个的氨基酸，例如通过将受保护的三肽与受恰当保护的二肽偶联(在不使手性中心外消旋的条件下)，在脱保护之后形成五肽，等等。
肽合成的进一步在美国专利第6,472,505号中公开。制备本发明的肽化合物的优选方法包括采用固体支持物的固相肽合成。大规模肽合成由Andersson Biopolymers 2000，55(3)，227-50进行描述。
采用上述教导可以鉴别出能最终用于检测任何病毒，以及因而用在许多研究和临床应用之中的底物。
根据本发明的教导而鉴别出的最佳底物的实例提供在以下实施例部分的实施例2中(例如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47)。
根据本发明的教导而鉴别出的肽优选经设计为长度不超过20个、优选为19个、优选为18个、优选为17个、优选为16个、优选为15个、优选为14个、优选为13个、优选为12个、优选为11、优选为10个、优选为9个、优选为8个、优选为7个、优选为6个、优选为5个、优选为4个、优选为3个氨基酸。
本发明并非旨在包括美国专利申请20050048473中公开和要求保护的任何肽，并且作为根据此处公开的原理的任何已知肽，将其特别地从本发明中排除。
本发明的肽可包含在其中进一步含有用于切割检测的单元(这些单元在以下进一步描述，例如可检测部分(在此也称为信号部分和猝灭剂部分))和分离部分的组合物中。
因此，根据本发明的另一方面，本发明提供了检测样品中至少一种病毒的方法。
根据本发明的这个方面，所能检测的病毒是那些含有切割活性能作为检测基础的蛋白酶(不由宿主细胞所表达)的病毒。根据本发明的这个方面，其活性能被检测到的蛋白酶的非限制性列表包括但不局限于，丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、3C蛋白酶、PA转录酶、腺嘌呤蛋白酶、2A蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶。例如NS3、NS2、NS-pro半胱氨酸蛋白酶、nsP2半胱氨酸蛋白酶、nsP23pro、C蛋白蛋白酶、SFV NS、HIV天冬氨酸蛋白酶、nsp4动脉炎病毒蛋白酶、HCMV蛋白酶，NS2-3、NS3-4Ap蛋白酶、HTLV-1PR。
根据本发明的这个方面，能检测的病毒的非限制性列表在以下实施例部分的实施例2中提供。
此处所用的术语“检测”指鉴别所述病毒的存在，将所述病毒分类并诊断与所述病毒相关的医学状况。
此处所用的“诊断”指将医学状况分类，确定该疾病的严重性，监测病程，预测疾病后果和/或康复前景。
因此，为检测腺病毒，所述底物可含有SEQ ID NO：1或2。
为检测α病毒，所述底物含有SEQ ID NO：3。
为检测风疹病毒，所述底物含有SEQ ID NO：4。
为检测HIV，所述底物含有SEQ ID NO：5。
为检测HTLV，所述底物含有SEQ ID NO：6、7或8。
为检测动脉炎病毒，所述底物含有SEQ ID NO：9。
为检测冠状病毒，所述底物含有SEQ ID NO：10。
为检测SARS冠状病毒，所述底物含有SEQ ID NO：11或12。
为检测环状病毒，所述底物含有SEQ ID NO：13。
为检测CMV病毒，所述底物含有SEQ ID NO：14或15。
为检测疱疹病毒，所述底物含有SEQ ID NO：16。
为检测黄病毒，所述底物含有SEQ ID NO：17。
为检测登革病毒，所述底物含有SEQ ID NO：18、19或20。
为检测西尼罗病毒，所述底物含有SEQ ID NO：21、22或23。
为检测黄热病病毒，所述底物含有SEQ ID NO：24、25或26。
为检测日本脑炎病毒，所述底物含有SEQ ID NO：27、28或29。
为检测蜱传病毒，所述底物含有SEQ ID NO：30、31或32。
为检测丙型肝炎病毒，所述底物含有SEQ ID NO：33、34或35。
为检测瘟病毒，所述底物含有SEQ ID NO：36。
为检测甲型肝炎病毒，所述底物含有SEQ ID NO：37或38。
为检测HRV，所述底物含有SEQ ID NO：39或40。
为检测肠道病毒，所述底物含有SEQ ID NO：41、42、43、44、45、46或47。
应当理解如果不同的病毒具有类似的氨基酸序列，单一蛋白酶可切割这些病毒的多蛋白。因此，本发明利用该特异性提供对单一病毒类型或者对多种病毒类型有特异性的检测方法。还应当理解本发明的方法也可设计为用于非家族相关病毒的鉴别，诸如导致相同症状的病毒(多种病毒检测)。以下在实施例3和6中有进一步进行描述的实施方式。
此处使用的术语“样品”指可含有或可被病毒感染(permissive)的任何生物样品(例如组织培养样品或体液/组织样品)。优选为所述生物样品指体液诸如全血、血清、血浆、脑脊液、尿液、淋巴液、呼吸道的各种外分泌液(例如鼻清洗液样品)、肠、生殖泌尿道、泪液、唾液、精液、汗液、粪便和乳汁，以及白细胞、恶性组织、羊水和绒膜绒毛。
本发明的该方面的方法通过在允许切割所述底物的条件下将所述样品与此处所描述的任何底物接触；并监测所述底物的切割而实现，其中所述底物的切割是样品中存在所述至少一种病毒的指示。
本领域任何已知用于监测蛋白水解底物切割的测定可根据本发明的该方面进行使用。
优选为所述底物切割序列包含在组合物中，所述组合物进一步提供用于检测的单元，例如至少一个可检测部分。实例在Dorit Arad的美国专利申请20050048473中详细描述，将其在此以参考的方式引入。
如此处所使用，可检测部分指能被直接(例如荧光、放射性同位素)或间接(例如酶原)检测(可视化、计数等)的任何分子。
因此，监测蛋白水解切割可通过用于检测病毒的均相测定实现。所选择的底物经合成并且与信号部分在所述切割区域的一端相连，而与猝灭剂部分在所述切割区域的另一端相连。应当理解根据需要(取决于检测构造)所有所述部分也可位于所述切割序列的一端。
此处使用的短语“均相测定”指不需要将信号部分与其他分析成分分离的测定。
为本发明的目的，“猝灭剂部分”是能降低或者消除所述信号部分发出的信号的任何物质。例如，所述猝灭剂部分可通过吸收由所述信号部分发出的信号或者通过能量传递机制起作用。在所述信号部分和所述猝灭剂部分之间的距离使所述猝灭剂部分的存在能基本上降低或消除由所述信号部分发出的信号，除非所述底物在某个位置被切割而导致所述信号部分和猝灭剂部分分离。
在一个实施方式中，所述信号部分和猝灭剂部分由不超过3个或5个氨基酸所隔开。在另一实施方式中，所述信号部分和猝灭剂部分由不超过10个氨基酸残基隔开。在又一个实施方式中，所述信号部分和猝灭剂部分由不超过15个氨基酸残基隔开，在还一个实施方式中，所述信号部分和猝灭剂部分由不超过20个氨基酸残基隔开。根据这些指导，可以偶联能用作检测单元的其他部分(例如，也在异相测定中)，诸如以下进一步描述的。同样，应当理解任何检测单元(例如部分等)可以直接或间接地与底物或者顺序偶联或者通过氨基酸修饰偶联至所述肽切割序列自身的任何一个氨基酸。
所述组合物与用于测试病毒存在的样品相接触。如果在样品中存在病毒，所述病毒蛋白酶也存在。该蛋白酶切割底物，并可观察到来自于信号部分的信号变化。如此的同源荧光(homogenous fluorescent)和比色测定对于本领域技术人员已知。参见例如：Biochemistry，Allinger，Wang Q.M.等，“A continuous calorimetric assay for rhinovirus-14 3C protease usingpeptide p-nitroanilides as substrates”Anal.Biochem.卷252，页238-45(1997)，和Basak S.等“In vitro elucidation of substrate specificity andbioassay of proprotein convertase 4 using intramolecularly quenchedfluorogenic peptides”Biochem.J.卷380，页505-14(2004)。
在本发明的另一实施方式中，所述信号部分是化学发光信号部分。所述化学发光信号部分与所述底物的切割区域的一侧相连，而荧光接受猝灭剂部分与所述切割区域的另一侧相连。美国专利第6,243,980号，其内容在此以参考的方式引入，描述了这样的检测系统，涉及使用化学发光的1，2-二氧杂环丁烷化合物作为所述信号部分。如果在样品中不存在所述病毒蛋白酶，将不会发生所述底物的切割。来自于1，2-二氧杂环丁烷分解的能量传递至所述荧光接受部分，并在与所述1，2-二氧杂环丁烷的发射光谱区域不同的波长下释放。如果所述底物经切割，所述荧光接受部分与所述1，2-二氧杂环丁烷分离，从而观察到来自于所述二氧杂环丁烷化合物的化学发光。
在另一实施方式中，所述信号部分是荧光化合物而所述猝灭剂部分是具有与所述信号部分的发射光谱相交迭的激发光谱的荧光化合物。此处，所述两个部分以与荧光共振能量传递相符的一定距离分隔，从而使得所述荧光部分能用作共振能量供体。
在另一实施方式中，猝灭基团诸如非荧光吸收染料用以代替荧光接受猝灭部分。合适的猝灭基团在美国专利第6,243,980号中得以描述，其内容以参考的方式引入。
采用如此的检测方法，能允许发生所述底物被所述蛋白酶(在如果样品中存在病毒时)切割的条件下，所述测试样品与所述底物接触。在一个实施方式中，温度受到控制。例如，所述温度可以控制在37℃以提供酶反应的最佳条件。然后利用与所采用的标记相适应的检测设备来检测来自经切割的底物片段的信号。
本发明的另一方面提供了用于检测病毒的异相测定。“异相测定”是其中所述固相在测定过程中与其他分析成分相分离的测定。异相测定的详细描述和实例在以下实施例部分的实施例6中提供。
在此情况下，所述底物包含在具有以下通式的组合物中。
X-Y-Z
其中：
Y含有病毒蛋白酶的底物，X-Y-Z经所述病毒蛋白酶切割形成切割产物X-Y′和Y＂-Z，其中Y′是Y的第一切割产物，Y＂是Y的第二切割产物；
X含有可检测部分；和
Z含有能与两相分离体系的分离相相结合的分离部分；
其中所述X-Y-Z并不形成所述病毒蛋白酶的天然底物的相邻部分。
所述可检测部分X可以被直接或间接检测，并可以含有标记剂诸如酶、荧光团、发色团、蛋白(诸如表位标签)、化学发光物质和放射性同位素。
分离部分Z能直接或间接地结合于两相分离体系(例如固相和液相)的分离相。所述分离部分Z的实例包括免疫结合剂、磁结合部分、肽结合部分、亲合结合部分、核酸部分。更多实例在以下实施例6中提供。
本发明的组合物可在与所述样品温育之前、同时或者之后与所述分离体系进行温育。
利用本发明的异相测定来监测切割可通过实施例6的任何实施方式实现，在图7～10中进行了示意性描述。
应当进行测量使得所述可检测部分并不与所述分离部分相连。
在一个实施方式中，本发明的可检测部分是酶原。因此在底物切割时所述酶可被激活和检测(通过该酶的催化活性的检测)。如此的酶原的实例是凝血酶原(因子II)或者该级联中的其他酶。
在此处所描述的任何实施方式中，任何部分可通过共价键与所述肽直接相连或者通过在每端都具有偶联官能团的间隔分子间接地相连。如此的连接子的实例包括烷基、乙二醇、醚、聚醚、聚核苷酸和多肽分子。
适用于所述异相测定的固相包括但不局限于试管、微滴定板、微滴定孔、珠子、试纸条(dipstick)、聚合物微粒、磁性微粒、硝基纤维素、芯片阵列和其他本领域技术人员熟知的固相。在所述异相测定中使用的信号部分可以是任何本领域技术人员已知的标记。所述标记包括放射性、量热性、荧光和发光标记。
用于检测蛋白酶的异质化学发光测定在美国专利第56,243,980号中描述，其内容在此以参考的方式引入。在一个实施方式中，本发明的同质或异相测定方法自动化进行，从而可以得到结果而无需医疗人员接触接受测试的据认为感染了所述病毒性疾病的受试者。例如，所述受试者在洁净室中进行测试(例如但不局限于P3型室)。所述受试者可以在进入房间前获得或者得到诊断试剂盒，所述试剂盒可包括包被有以上讨论的所述类型的标记肽的固相。例如，所述固相可以是之前用肽浸入的组织，或者源自用于测试怀孕那一类型的测试棒。所述受试者可以提供样品(诸如唾液样品)在所述固相的预备点上。
然后将含有所述样品的固相进行温育以进行所述酶反应。在一个实施方式中，所述反应温度控制在37℃以提供所述酶反应的最佳条件。当所述温育完成时，可使用遥控或者可从所述房间外手动操作的机械系统在分光光度计中测量所述待测试的样品。可测量所述样品的量化颜色或UV检测。在测试后，所述样品可由能丢弃所述样品的自动系统或者远程操作把手丢弃。
为一次检测多种病毒的存在(诸如为了检测与特定症状或特定宿主相关的病毒，参见实施例3)，可以使用本领域已知的任何方法或者上述适用于检测多种病毒的方法。
以下提供了这些手段的非穷尽性实例。
微板-在X孔板中。每个孔含有不同的对应于不同病毒的特定肽序列。随着加入所述临床样品，用标准微板读数器在合适波长下监测反应并记录下哪个孔表现出酶活性。由于每个孔含有一种特定肽，因此根据微板读数器提供的数据可以说明在所述临床样品中存在哪种病毒酶。所述酶的存在证实了所述病毒的存在。
Medisel芯片技术(Schiffenbauer等2002 Anticancer Res.22：2663-9)-采用Medisel技术，可以在芯片上固定所述特定肽(对应于感兴趣的病毒)。随着加入所述临床样品，用激光束监测反应。由于所述芯片上每个点含有一种特定肽，根据Medisel设备提供的数据可以说明在所述临床样品中存在哪种病毒酶。所述酶的存在证实了所述病毒的存在。
柱上分离-特定肽(对应于感兴趣的病毒)可以利用独特DNA间隔子连接在商业来源的珠子上。通过加入所述临床样品来进行反应。一旦发生特定肽的切割(通过在所述临床样品中的特定病毒酶)，猝灭剂被释放而所述珠子发出荧光。然后通过与所述独特DNA间隔子的杂交在柱上分离所述珠子，并用标准荧光计在合适的波长下测量每种类型的珠子的荧光(对应于每种不同的病毒)。仅有被所述病毒酶切割的珠子发出荧光。因此可以说明在所述临床样品中存在哪种病毒酶。所述酶的存在证实了所述病毒的存在。
珠子FACS分离-仅与柱分离类似，当每种特定的肽与具有不同颜色的珠子相连时，所述分离步骤由FACS完成。在该方法中，所述间隔子可以是DNA或者是肽或者是拟肽或者是碳水化合物或者是任何有机成分间隔子[Gonzalez(2005)Clin.Biochem.38：966-72]。
可用于本发明的其他方法在Tozzoli等，(2006)Clin.Chem.Lab Med.44：837-42；Abreu(2005)Ann.N.Y.Acad.Sci.1050：357-63；Buliard(2005)Ann.Biol.Clin.(Paris)63：51-8；Yinnaki(2004)J.ImmunoassayImmunochem.25：345-57；Rouquette(2003)120：676-81；Toellner(2006)Clinical Chemistry 52：1575-1583；Horejsh(2005)Nucl.Acids Res.33中有描述，其中每一篇的内容以参考的方式在此整体引入。
根据本发明的教导鉴别的肽切割序列可用于检测新型病毒株。诸如例如SARS流行病的检测，其表现出与原始病毒家族(诸如冠状病毒)的同源性。这依赖于所述检测方法对导致大流行病的新型病毒的快速适应性。
因此，一旦突然出现的病毒的基因组得以鉴别并且知道其复制系统，可通过检查所述突然出现的病毒的序列与已知病毒的序列之间的序列同源性确定病毒蛋白酶以及由所述蛋白酶所切割的病毒多蛋白的区域。根据该比对，可以实现对最佳切割序列的选择。
也提供了含有本发明的肽的试剂盒。不同的试剂盒成分可包装在分开的容器中并在使用前立即混合。如此独立的成分包装使之能长期保存而不丧失所述活性成分的功能。也设想了其中在同一容器中装有两种或两种以上的成分的实施方式。一个示例性试剂盒可包含一种或多种以下试剂：用于异相测定的洗涤缓冲试剂；不含有能切割底物的蛋白酶的阴性对照试剂；含有能切割所述底物的蛋白酶的阳性对照；(d)用于显现来自于所述信号部分的可检测信号的信号产生试剂；和(d)样品收集单元，诸如注射器、喉拭子或者其他样品收集设备。
对于多种病毒检测试剂盒，其中如上所述检测一种或多种病毒，每一个多板检测试剂盒将根据常见主题进行优选设计，诸如导致相同或相似疾病的不同病毒；感染相同组织或器官的病毒；具有相近种系发生关系的病毒诸如归类为同一家族、亚家族等的病毒；可在相同体液诸如唾液、鼻分泌物、血液、尿液、粪便等中检测到的病毒；常见并广泛传播的病毒；通过相同体液传播的病毒等等。
在所述试剂盒中包含的试剂可在任何类型的容器中提供，使得不同成分的使用寿命得以保留而不被所述容器的材料所吸附或改变。例如，密封的玻璃安瓿瓶可含有在中性、非反应性气体诸如氮气下包装的冻干试剂或者缓冲剂。安瓿瓶可由任何合适的材料构成诸如玻璃、有机聚合物诸如聚碳酸酯、聚苯乙烯等；陶瓷、金属或任何其他通常用于盛放相似试剂的材料。合适容器的其他实例包括能由与安瓿瓶相似的材料制造的简单瓶，和可含有箔状衬里诸如铝或合金的封袋。其他容器包括试管、小瓶、烧瓶、瓶子或注射器等。容器可具有无菌接触口，诸如具有能被皮下注射针头刺穿的塞子的瓶子。其他容器可具有被容易移除的膜所分隔开的两个腔室，将所述膜移除可以使所述成分混合。可移除的膜可以是玻璃、塑料、橡胶等。
试剂盒也可配有说明材料。说明书可印刷在纸或其他基材上，和/或以电子可读介质方式提供，诸如软盘、CD-ROM、DVD-ROM、Zip碟、录像带、录音带等。详细的说明书可以不与所述试剂盒物理相连；取而代之的是，用户可以访问由所述试剂盒的制造商或者分销商所指定的互联网网站，或者以电子邮件方式提供。
本发明进一步设想本发明的肽用于设计干扰所述病毒蛋白水解活性以及因而干扰病毒复制和感染的治疗剂。优选为，所述肽序列经过修饰因而能与所述蛋白酶结合并抑制其活性(例如不可逆抑制剂)。只要依然能保持蛋白酶的识别，通过引入至少一个非肽键(如上所述)，如此的拟肽可用于利用不可切割的序列替代可切割序列。
本发明的治疗性肽可加入到经鉴别可用于治疗感兴趣的病毒疾病的药物组合物中。
本发明进一步设想利用本发明的组合物筛选抗病毒剂。
因此，本发明提供了能用在治疗性和诊断性应用中的肽和含有所述肽的组合物和试剂盒。
在研究以下实施例之后，本发明的其他目的、优点和新型特征对于本领域普通技术人员是显而易见的，所述实施例并非旨在进行限制。此外，以上描述的以及在权利要求部分要求保护的本发明的各种实施方式和方面在以下实施例中找到实验支持。
实施例
现在开始参考以下实施例，所述实施例与以上描述共同以非限制性方式描述了本发明。
通常，此处使用的术语和在本发明中采用的实验程序包括分子、生物化学、微生物和重组DNA技术。这些技术在文献中详细描述。参见例如“Molecular Cloning：A laboratory Manual”Sambrook等，(1989)；“Current Protocols in Molecular Biology”，卷I-III，Ausubel，R.M.编辑.(1994)；Ausubel等，“Current Protocols in Molecular Biology”，John Wiley和Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，“A Practical Guide toMolecular Cloning”，John Wiley & Sons，New York(1988)；Watson等，“Recombinant DNA”，Scientific American Books，New York；Birren等(编辑)“Genome Analysis：A Laboratory Manual Series”，卷1-4，Cold SpringHarbor Laboratory出版社，New York(1998)；在美国专利4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中描述的方法；“Cell Biology：A Laboratory Handbook”，卷I-III，Cellis，J.E.，编辑(1994)；“CurrentProtocols in Immunology”，卷I-III，Coligan J.E.，编辑(1994)；Stites等(编辑)，“Basic and Clinical Immunology”(第8版)，Appleton & Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(编辑)，“Selected Methods in CellularImmunology”，W.H.Freeman和Co.，New York(1980)；可供使用的免疫测定在专利和科学文献中得以详细描述，参见例如美国专利3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；“Oligonucleotide Synthesis”Gait，M.J.，编辑(1984)；“Nucleic Acid Hybridization”Hames，B.D.，和HigginsS.J.，编辑(1985)；“Transcription and Translation”Hames，B.D.，和Higgins S.J.，编辑(1984)；“Animal Cell Culture＂Freshney，R.I.，编辑(1986)；“Immobilized Cells and Enzymes”IRL出版社，(1986)；“APractical Guide to Molecular Cloning”Perbal，B.，(1984)和“Methods inEnzymology”卷1-317，Academic出版社；“PCR Protocols：A Guide ToMethods And Applications”，Academic出版社，San Diego，CA(1990)；Marshak等，“Strategies for Protein Purification and Characterization-ALaboratory Course Manual”CSHL出版社(1996)；所有这些在此以参考的方式全文引入。其他常见参考文献在该说明书中提供。其中的程序据信为本领域内熟知，并为了阅读者的方便而提供。其中含有的所有信息在此处以参考的方式引入。
实施例1
丙型肝炎NS3蛋白酶共有切割序列鉴别
以下描述了丙型肝炎的NS3蛋白酶的经优化的切割序列的鉴别。
阶段1：获得所述多蛋白被其病毒蛋白酶切割的机理，要点是病毒生命周期中切割事件的顺序(1、4，参见取自丙型肝炎病毒(HCV)的图11：Models structure and genome organization(模型结构和基因组组织结构)，Vol 5；2003年11月19日，Cambridge University出版社)。
阶段2：利用数据库诸如Swiss prot.、Pubmed、Gene bank和OWL对尽可能多的相同病毒的病毒株的所有切割序列进行比较，并利用FASTA软件对其进行比对(参见以下表1)。
表1


 E1<＝>NS1细胞HCV633202FSGVDA|ETYIT99E1<＝>NS1细胞HCV221615ISQAEA|ALENL100E2<＝>NS1细胞HCV22129793IAQAEA|ALENL101E2<＝>NS1细胞HCV2764398ISNVEA|AVERL102E2<＝>NS1细胞HCV(6a33)57791994LGQAEA|ALEKL103E2<＝>NS1细胞HCV(JPUT971017)9757542IAQAEA|TLENL104E2<＝>NS1细胞HCV 2496367PQRAYA|LDTEM105E2<＝>NS2细胞HCV9843677DARVCA|CLWMM106
 NS1<＝>NS2细胞HCV1381032PQRAYA|LDTEV107NS1<＝>NS2细胞HCV22129793PPRAYA|LDREM108NS1<＝>NS2细胞HCV2764398PHRAYA|MDNEQ109NS1<＝>NS2细胞HCV(6a33)57791994PQRAYA|LDQEL110NS1<＝>NS2细胞HCV(HC-G9)464178PQQAYA|LDAAE111NS1<＝>NS2细胞HCV(JPUT971017)9757542LLLADA|RVCVA112NS1<＝>NS2细胞HCV(NZL1)1183029PPRAYA|MDREM113NS1<＝>NS2细胞HCV 1b5420377PPQAYA|MDREM114
 NS3<＝>NS4ANS3-4ApHCV221615DLEIVT|STWVL115NS3<＝>NS4ANS3-4ApHCV2764398DLEVIT|STWVL116NS3<＝>NS4ANS3-4ApHCV9843677DLEVMT|STWVL117NS3<＝>NS4ANS3-4ApHCV(6a33)57791994DLEVTT|STWVL118NS3<＝>NS4ANS3-4ApHCV(JPUT971017)9757542DLEVTT|SAWVL119NS3<＝>NS4ANS3-4ApHCV(NZL1)1183029DLEIMT|STWVL120NS3<＝>NS4ANS3-4ApHCV(Tr Kj)1435035DEMEEC|SQHLP121NS3<＝>NS4ANS3-4ApHCV(VAT96)6521009AGVAGA|LVAFK122
 NS4A<＝>NS4BNS3-4ApHCV22129793DEMEEC|ASHLP123NS4A<＝>NS4BNS3-4ApHCV221615DEMEEC|SRHIP124NS4A<＝>NS4BNS3-4ApHCV2764398DEMEEC|ASKAA125NS4A<＝>NS4BNS3-4ApHCV(6a33)5779199DEMEEC|SQAAP126NS4A<＝>NS4BNS3-4ApHCV9757542DEMEEC|ASRAL127NS4A<＝>NS4BNS3-4APHCV(NZL1)1183029ECTTPC|SGSWL128
 NS4B<＝>NS5ANS3-4ApHCV221607DCSTPC|SGSWL129NS4B<＝>NS5ANS3-4APHCV2764398ESTTPC|SGSWL130NS4B<＝>NS5ANS3-4APHCV59479DTATPC|ATSWL131NS4B<＝>NS5ANS3-4APHCV9843677DCTAPC|AGSWL132NS4B<＝>NS5ANS3-4APHCV(6a33)57791994DCPVPC|SGSWL133NS4B<＝>NS5ANS3-4ApHCV(HC-G9)464178DYPSPC|SDDWL134NS4B<＝>NS5ANS3-4ApHCV(JPUT971017)9757542DYPSPC|NGDWL135NS4B<＝>NS5ANS3-4ApHCV(Tr Kj)1435035EDVVCC|SMSYT136NS4B<＝>NS5ANS3-4ApHCV(VAT96)6521009DDVVCC|SMSYS137
 NS5A<＝>NS5BNS3-4ApHCV2764398QSVVCC|SMSYS138NS5A<＝>NS5BNS3-4ApHCV(6a33)57791994GSEVCC|SMSYS139NS5A<＝>NS5BNS3-4ApHCV(NZL1)1183029DDIVCC|SMSYT140NS5A<＝>NS5BNS3-4ApHCV(VAT96)6521009EDVVCC|SMSYS141NS5A<＝>NS5BNS3-4ApHCV 2496367DSVICC|SMSYS142
步骤3：根据取代或者通过根据以下表2中所列的参考文献进行数据挖掘而动力学优化的位点获得最快速的切割序列。在HCV NS3蛋白酶的情况下所述位点是NS5A/B(3、4、5)。
表2
1.Grakoui，A.，D.W.McCourt，C.Wychowski，S.M.Feinstone，和C.M.Rice.1993.A second hepatitis C virus-encoded proteinase.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：10583-10587.
2.Reed KE，Grakoui A，Rice CM.Hepatitis C virus-encoded NS2-3protease：cleavage-site mutagenesis and requirements for bimolecularcleavage.
3.J Virol.1995 Jul；69(7)：4127-36.
4.Bartenschlager，R.，L Ahlborn-Laake，J.Mous，和H.Jacobsen.1994.Kinetic and structural analysis of hepatitis C virus polyproteinprocessing.J.Virol.68：5045-5055.
5.Failla，C.，L.Tomei，和R.De Francesco.1994.Both NS3 and NS4Aare required for proteolytic processing of hepatitis C virus nonstructural protein.J.Virol.68：3753-3760.
6.Grakoui，A.，C.Wychowski，C.Lin，S.M.Feinstone和C.M.Rice.1993.Expression and identification of hepatitis C virus polyprotein products.J.Virol.67：1385-1395.
7.Pacini L，Vitelli A，Filocamo G，Bartholomew L，Brunetti M，Tramontano A，Steinkuhler C，Migliaccio G.In vivo selection of proteasecleavage sites by using chimeric Sindbis virus libraries.J Virol.2000 Nov；74(22)：10563-70.
8.AA Kolykhalov，EV Agapov和CM Rice Specificity of the hepatitisC virus NS3 serine protease：effects of substitutions at the 3/4A，4A/4B，4B/5A，and 5A/5B cleavage sites on polyprotein processing.J.Virol.1994 Nov 68(11)，7525-7533.
9.Urbani A，Bianchi E，Narjes F，Tramontano A，De Francesco R，Steinkuhler C，Pessi A.Substrate specificity of the hepatitis C virus serineprotease NS3.J Biol Chem.1997 Apr 4；272(14)：9204-9.
表3-基于NS4A/B、NS5A/B序列的底物肽的活性以及所选择的切割位点<sup>a

a</sup>在150mM NaCl存在(+)或不存在(-)时测定动力学参数
，正亮氨酸(noreleucine)
表4-反式

表5-顺式


表6
P6和P1’修饰的十肽的切割动力学参数-相应于所述NS4A/NS4B切割位点
粗体印刷的残基指示了相对于野生型序列的更改。数据为至少三次不同测量的平均值±S.D.。

表7
粗体印刷的残基指示了相对于野生型序列的更改。数据为至少三次不同测量的平均值±S.D.。

顺式-作用的蛋白酶仅仅切割相邻切割位点。反式-作用的蛋白酶对较远的切割位点起作用。
顺式-
1.P1-具有苏氨酸。
2.P4-接受大多数具有非极性脂肪族侧链的残基。
3.P2-显示出对带电荷的残基的偏好。
4.所述蛋白酶顺式-切割位点NS4A/C连接的特异性极大地退化(6)指示出所述切割是由多蛋白折叠所决定的。
反式
1.P1-半胱氨酸非常重要并且不能被替换。
2.P3-仅接受缬氨酸、谷氨酸、苏氨酸和异亮氨酸。用Asn或Lys替代Glu没有效果。
3.P4-能容忍大多数残基。
4.P2-显示出对亮氨酸的偏好。用Asn或Lys替代Glu没有效果。
5.P5-偏好带电荷的残基(负电荷残基→天冬氨酸酯)。
6.P6-酸性残基是重要的。(酪氨酸)
7.P3-残基有助于有效底物识别(gln)。
8.P4′-残基有助于有效底物识别(疏水残基→Leu)。
9.P7-用His或者Arg取代Phe没有效果。
10.P5-用Lys替代Glu没有效果。
11.P2′-用Lys取代Gln没有效果。
12.P1′-用Ile、Thr、Arg、Ala、Asp或His取代Ser使得可以有效切割。然而，用Pro取代显著地抑制切割(7)。
13.有效体外切割要求从P6至P4′间至少10个残基的肽底物。
步骤4：根据来自步骤3的两个最快速的位点和取代得出共有序列位点，并根据步骤3所允许的变体由步骤4总结出共有序列方案。对于HCVNS3蛋白酶，整理所有数据得到结果如以下序列：
(T/S/酸性氨基酸)X(E/T/I/N/K/D/V)(C/F)C-/-X(M/norL)(S/D)(Y/疏水氨基酸)(SEQ ID NO：33)
实施例2
根据本发明的教导鉴别出的动力学优化底物
以下代号用于表示共有序列的表达式。
疏水氨基酸：G、A、V、L、I、M、W、F、Y、H
碱性氨基酸：Q、N、K、H、R
HB供体：K、R、S、C、T、Q、N、Y
酸性氨基酸：E、D、Y
芳香族氨基酸：Y、F、H、W
-/-：切割位点
腺病毒科(1-9)：
猿：腺病毒25、腺病毒24、腺病毒23、腺病毒22、腺病毒21、腺病毒19。
猪：腺病毒C、腺病毒B、腺病毒A、腺病毒5、腺病毒4、腺病毒3、腺病毒2、腺病毒1。
羊：腺病毒B、腺病毒A、腺病毒5、腺病毒4、腺病毒3、腺病毒2、腺病毒1。
鼠：腺病毒A、腺病毒1。
人：腺病毒F、腺病毒E、腺病毒D、腺病毒C、腺病毒B、腺病毒A、腺病毒9、腺病毒8、腺病毒7、腺病毒6、腺病毒51、腺病毒50、腺病毒5、腺病毒49、腺病毒48、腺病毒47、腺病毒46、腺病毒45、腺病毒44、腺病毒43、腺病毒42、腺病毒41、腺病毒40、腺病毒4、腺病毒39、腺病毒38、腺病毒37、腺病毒36、腺病毒35、腺病毒34、腺病毒33、腺病毒32、腺病毒31、腺病毒30、腺病毒3、腺病毒29、腺病毒28、腺病毒27、腺病毒26、腺病毒25、腺病毒24、腺病毒23、腺病毒22、腺病毒21、腺病毒20、腺病毒2、腺病毒19、腺病毒18、腺病毒17、腺病毒16、腺病毒15、腺病毒14、腺病毒13、腺病毒12、腺病毒11、腺病毒10、腺病毒1。
马：腺病毒B、腺病毒A、腺病毒2、腺病毒1。
犬：腺病毒2、腺病毒1、腺病毒。
牛：腺病毒C、腺病毒B、腺病毒A、腺病毒9、腺病毒3、腺病毒2、腺病毒10、腺病毒1。

披膜病毒科(10-33)
α病毒：Aura病毒、巴马森林病毒(Barmah Forest virus)、东部马脑炎病毒、米德尔堡病毒(Middelburg virus)、恩杜姆病毒(Ndumu virus)、贝巴鲁病毒(Bebaru virus)、孔贡亚病毒(Chikungunya virus)、格塔病毒(Getah virus)、马雅罗病毒(Mayaro virus)、阿尼昂-尼昂病毒(O′nyong-nyong virus)、罗斯河病毒(Ross River virus)、塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus)、乌纳病毒(Una virus)、Trocara病毒、Cabassou病毒、Mucambo病毒、Pixuna病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、摩根堡病毒(Fort Morgan virus)、Highlands J病毒、辛德毕斯病毒(Sindbis virus)、西部马脑脊髓炎病毒、Whataroa病毒、α病毒HBb 17、挪威鲑亚目α病毒(Norwegian salmonid alphavirus)、Rio Negro病毒、海豹寄生虫病毒(Seallouse virus)。

风疹病毒：风疹病毒、风疹病毒(BRDI株)、风疹病毒(BRDII株)、风疹病毒(Cendehill株)、风疹病毒(M33株)、风疹病毒(RN-UK86株)、风疹病毒(THERIEN株)、风疹病毒(TO-336疫苗株)、风疹病毒(TO-336株)、风疹病毒(RA27/3疫苗株)。

反转录病毒科(34-60)
正反转录病毒亚科、慢病毒、灵长类慢病毒组：
人类免疫缺陷病毒1：HIV-1 M:C_92BR025、HIV-1 M:C_ETH2220、HIV-1 M:F1_93BR020、HIV-1 M:F1_VI850、HIV-1 M:F2_MP255C、HIV-1M:F2_MP257C、HIV-1 M:G_92NG083、HIV-1 M:G_SE6165、HIV-1M:H_90CF056、HIV-1 M:H_VI991、HIV-1 M:J_SE9173、HIV-1M:J_SE9280、HIV-1 M:K_96CM-MP535、HIV-1 M:K_97ZR-EQTB11、HIV-1 N_YBF106、HIV-1 N_YBF30、HIV-1 O_ANT70、HIV-1O_MVP5180、人类免疫缺陷病毒3、人类免疫缺陷病毒1型(ARV2/SF2ISOLATE)、人类免疫缺陷病毒1型(BH10 ISOLATE)、人类免疫缺陷病毒1型(BH5 ISOLATE)、人类免疫缺陷病毒1型(BH7分离株)、人类免疫缺陷病毒1型(BH8 ISOLATE)、人类免疫缺陷病毒1型(BRAINISOLATE)、人类免疫缺陷病毒1型(BRU ISOLATE)、人类免疫缺陷病毒1型(CDC-451 ISOLATE)、人类免疫缺陷病毒1型(CLONE 12)、人类免疫缺陷病毒1型(ELI ISOLATE)、人类免疫缺陷病毒1型(HXB2ISOLATE)、人类免疫缺陷病毒1型(HXB3 ISOLATE)、人类免疫缺陷病毒1型(分离株YU2)、人类免疫缺陷病毒1型(JH3 ISOLATE)、人类免疫缺陷病毒1型(JRCSF ISOLATE)、人类免疫缺陷病毒1型(KB-1分离株)、人类免疫缺陷病毒1型(Lai分离株)、人类免疫缺陷病毒1型(MALISOLATE)、人类免疫缺陷病毒1型(MFA ISOLATE)、人类免疫缺陷病毒1型(MN ISOLATE)、人类免疫缺陷病毒1型(NDK ISOLATE)、人类免疫缺陷病毒1型(NEW YORK-5 ISOLATE)、人类免疫缺陷病毒1型(NIT-A分离株)、人类免疫缺陷病毒1型(OYI ISOLATE)、人类免疫缺陷病毒1型(PV22 ISOLATE)、人类免疫缺陷病毒1型(RF/HAT ISOLATE)、人类免疫缺陷病毒1型(SC ISOLATE)、人类免疫缺陷病毒1型(SF162ISOLATE)、人类免疫缺陷病毒1型(SF33 ISOLATE)、人类免疫缺陷病毒1型(STRAIN UGANDAN/ISOLATE U455)、人类免疫缺陷病毒1型(WMJ1分离株)、人类免疫缺陷病毒1型(WMJ2 ISOLATE)、人类免疫缺陷病毒1型(Z-84 ISOLATE)、人类免疫缺陷病毒1型(Z2/CDC-Z34ISOLATE)、人类免疫缺陷病毒1型(ZAIRE3 ISOLATE)、人类免疫缺陷病毒1型(ZAIRE 6 ISOLATE)、人类免疫缺陷病毒1型(ZAIRE HZ321ISOLATE)、人类免疫缺陷病毒1型1w12.3分离株。
人类免疫缺陷病毒2型：人类免疫缺陷病毒2型(ISOLATE BEN)、人类免疫缺陷病毒2型(ISOLATE ROD)、人类免疫缺陷病毒2型(ISOLATE ST)、人类免疫缺陷病毒2型(分离株ST/24.1C#2)、HIV-2B_EHO、HIV-2 B_UC1、HIV-2.D205、人类免疫缺陷病毒2型(ISOLATED205，7)、人类免疫缺陷病毒2型(分离株7312A)、人类免疫缺陷病毒2型(ISOLATE CAM2)、人类免疫缺陷病毒2型(ISOLATE D 194)、人类免疫缺陷病毒2型(ISOLATE GHANA-1)、人类免疫缺陷病毒2型(分离株KR)、人类免疫缺陷病毒2型(ISOLATE NIH-Z)、人类免疫缺陷病毒2型(ISOLATE SBLISY)。

反转录病毒科；正反转录病毒亚科；δ反转录病毒；灵长类嗜T-淋巴细胞病毒
人类T细胞嗜淋巴细胞病毒1型(加勒比分离株)、人类T细胞嗜淋巴细胞病毒1型(分离株MT-2)、人类T细胞嗜淋巴细胞病毒1型(ATK株)、人类T细胞嗜淋巴细胞病毒1型(非洲分离株)、人类T细胞嗜淋巴细胞病毒1型(北美分离株)。

套病毒纲：动脉炎病毒科(78-82)
动脉炎病毒：马动脉炎病毒Bucyrus、乳酸脱氢酶增高病毒、病毒C、乳酸脱氢酶增高病毒Plagemann、Lelystad病毒、PRRSV 16244B、PRRSVHB-1(sh)/2002、PRRSV HB-2(sh)/2002、PRRSV HN1、PRRSV VR2332、猿出血热病毒。

套病毒纲：冠状病毒科(61-77)
冠状病毒：犬冠状病毒、猫冠状病毒、人类冠状229E、猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、非分类牛冠状病毒、人类冠状病毒OC43、鼠肝炎病毒、猪血凝性脑脊髓炎病毒、puffinosis冠状病毒、大鼠冠状病毒、SARS冠状病毒、传染性支气管炎病毒、火鸡冠状病毒、蝙蝠冠状病毒China 2005、蝙蝠冠状病毒株61、蝙蝠冠状病毒ZS-2005、鸟粪便冠状病毒、鸡肠冠状病毒、鸭冠状病毒、鹅冠状病毒、人类冠状病毒NO、鹦鹉冠状病毒AV71/99、鸽子冠状病毒

环状病毒：牛环状病毒、布雷达病毒(Breda virus)、马环状病毒、伯尔尼病毒(Berne virus)、人环状病毒、猪环状病毒、猪环状病毒(病毒株P10)。

疱疹病毒科(83-105)；
β疱疹病毒亚科：巨细胞病毒
恒河猴巨细胞病毒株68-1、人类疱疹病毒5(病毒株1042)、人类疱疹病毒5(病毒株119)、人类疱疹病毒5(病毒株2387)、人类疱疹病毒5(病毒株4654)、人类疱疹病毒5(病毒株5035)、人类疱疹病毒5(病毒株5040)、人类疱疹病毒5(病毒株5160)、人类疱疹病毒5(病毒株5508)、人类疱疹病毒5病毒株AD 169、人类疱疹病毒5病毒株Eisenhardt、人类疱疹病毒5病毒株Merlin、人类疱疹病毒5病毒株PT、人类疱疹病毒5病毒株toledo、人类疱疹病毒5病毒株Towne、黑猩猩巨细胞病毒、Aotine疱疹病毒1、狒狒巨细胞病毒OCOM4-37、ercocebus agilis巨细胞病毒1、髭长尾猴(Cercopithecus cephus)巨细胞病毒1、黑红疣猴(Colobus badius)巨细胞病毒1、黑白疣猴(Colobus guereza)巨细胞病毒1、中麝鼩(Crocidura russula)巨细胞病毒1、食蟹猴(Macaca fascicularis)巨细胞病毒1、山魈属(Mandrillus)巨细胞病毒、非洲疣猪(Phacochoerusafricanus)巨细胞病毒1、猩猩(Pongo pygmaeus)巨细胞病毒1、猪巨细胞病毒、猿巨细胞病毒。

α疱疹病毒亚科：单纯疱疹病毒：
牛疱疹病毒2型(病毒株BHM-1)、牛疱疹病毒2型(病毒株BMV)、猕猴疱疹病毒1(病毒株E2490)、猕猴疱疹病毒16、猕猴疱疹病毒2(SA8)、单纯疱疹病毒(1型/病毒株17)、单纯疱疹病毒(1型/病毒株A44)、单纯疱疹病毒(1型/病毒株Angelotti)、单纯疱疹病毒(1型/病毒株CL101)、单纯疱疹病毒(1型/病毒株CVG-2)、单纯疱疹病毒(1型/病毒株F)、单纯疱疹病毒(1型/病毒株HFEM)、单纯疱疹病毒(1型/病毒株HZT)、单纯疱疹病毒(1型/病毒株MGH-10)、单纯疱疹病毒(1型/病毒株MP)、单纯疱疹病毒(1型/病毒株Patton)、单纯疱疹病毒(1型/病毒株R19)、单纯疱疹病毒(1型/病毒株SC16)、单纯疱疹病毒1病毒株R-15、人类疱疹病毒7病毒株JI、人类疱疹病毒1病毒株KOS、人类疱疹病毒2(单纯疱疹病毒2型)、单纯疱疹病毒(2型/病毒株B4327UR)、人类疱疹病毒2病毒株186、人类疱疹病毒2病毒株333、人类疱疹病毒2病毒株G、人类疱疹病毒2病毒株HG52、人类疱疹病毒2病毒株SA8、人类疱疹病毒2病毒株SN03、人类疱疹病毒2病毒株SS01、人类疱疹病毒2病毒株ST04。

黄病毒科；黄病毒(106-133)
阿尔弗病毒(Alfuy virus)、Alkhurma出血热病毒、阿波衣病毒(Apoivirus)、Aroa病毒、巴加扎病毒(Bagaza virus)、班奇病毒(Banzi virus)，巴图洞穴病毒(Batu Cave virus)、Bouboui病毒、布卡拉沙蝙蝠病毒(Bukalasa bat virus)、巴休夸拉病毒(Bussuquara virus)、CY1014病毒、Cacipacore病毒、凯莉岛病毒(Carey Island virus)、细胞融合剂病毒、牛骨山脊病毒(Cowbone Ridge virus)、达喀尔蝙蝠病毒(Dakar batvirus)、鹿蜱病毒(Deer tick virus)、登革病毒、边山病毒(Edge Hill virus)、恩德培蝙蝠病毒(Entebbe bat virus)、黄病毒CbaAr4001、黄病毒FSME、黄病毒属病毒、Gadgets Gully病毒、希腊山羊脑炎病毒、伊瓜佩病毒(Iguape virus)、伊利乌斯病毒(Ilheus virus)、以色列火鸡脑脊膜脑脊髓炎病毒(Israel turkey meningoencephalomyelitis virus)、日本脑炎病毒、朱格拉病毒(Jugra virus)、胡蒂亚帕病毒(Jutiapa virus)、凯丹姆病毒(Kadam virus)、Kamiti河病毒(Kamiti River virus)、喀什病毒(Karshi virus)、凯杜古病毒(Kedougou virus)、科科贝拉病毒(Kokoberavirus)、库坦戈病毒(Koutango virus)、库姆灵厄病毒(Kumlinge virus)、库宁病毒(Kunjin virus)、科萨努尔森林病病毒(Kyasanur forest virus)、兰加特病毒(Langat virus)、兰加特病毒(病毒株TP21)、兰加特病毒(Yelantsev病毒株)、跳跃病病毒、Meaban病毒、默多克病毒(Modocvirus)、蒙大拿鼠耳蝠脑白质炎病毒(Montana myotis leukoencephalitisvirus)、美利谷脑炎病毒(Murray Valley encephalitis virus)、Naranjal病毒、Negishi病毒、恩塔亚病毒(Ntaya virus)、鄂木斯克出血热病毒(Omsk hemorrhagic fever virus)、金边蝙蝠病毒(Phnom Penh bat virus)、波蒂斯库姆病毒(Potiskum virus)、玻瓦桑病毒(Powassan virus)、热伯维病毒(Rio Bravo virus)、罗西欧病毒(Rocio virus)、皇家农场病毒、俄罗斯春夏脑炎病毒、莎波亚病毒(Saboya virus)、Sal Vieja病毒、San Perlita病毒、Saumarez Reef病毒、赛皮克病毒(Sepik virus)、实兆远病毒(Sitiawan virus)、sokoluk病毒、西班牙羊脑炎病毒、斯庞德温尼病毒(Spondweni virus)、圣路易斯脑炎病毒、斯特拉特福德病毒(Stratford virus)、塔玛纳蝙蝠病毒(Tamana bat virus)、坦布苏病毒(Tembusu virus)、蜱传脑炎病毒、蜱传黄病毒、蜱传播玻瓦桑(Tick-bornepowassan)病毒(病毒株1b)、土耳其绵羊脑炎病毒、Tyuleniy病毒、乌干达S病毒、尤苏它病毒(Usutu virus)、Wang Thong病毒、韦瑟尔斯布朗病毒(Wessselsbron virus)、西尼罗病毒、雅温得病毒(Yaoundevirus)、黄热病病毒、Yokose病毒、齐卡病毒(Zika virus)、蚊传播病毒。

黄病毒科；肝炎病毒属(134-142)；丙型肝炎病毒
丙型肝炎病毒亚型1a、丙型肝炎病毒亚型1b、丙型肝炎病毒亚型1c、丙型肝炎病毒亚型1d、丙型肝炎病毒亚型1e、丙型肝炎病毒亚型1f、丙型肝炎病毒亚型2a、丙型肝炎病毒亚型2b、丙型肝炎病毒亚型2c、丙型肝炎病毒亚型2d、丙型肝炎病毒亚型2f、丙型肝炎病毒亚型2i、丙型肝炎病毒亚型2k、丙型肝炎病毒亚型3a、丙型肝炎病毒亚型3b、丙型肝炎病毒亚型3g、丙型肝炎病毒亚型3k、丙型肝炎病毒亚型4a、丙型肝炎病毒亚型4c、丙型肝炎病毒亚型4d、丙型肝炎病毒亚型4f、丙型肝炎病毒亚型4h、丙型肝炎病毒亚型4k、丙型肝炎病毒亚型5a、丙型肝炎病毒亚型6a、丙型肝炎病毒亚型6b、丙型肝炎病毒亚型6d、丙型肝炎病毒亚型6g、丙型肝炎病毒亚型6h、丙型肝炎病毒亚型6k、丙型肝炎病毒(分离株EC1)、丙型肝炎病毒(分离株EC10)、丙型肝炎病毒(分离株Glasgow)、丙型肝炎病毒(分离株HC-J2)、丙型肝炎病毒(分离株HC-J5)、丙型肝炎病毒(分离株HC-J7)、丙型肝炎病毒(分离株HCT18)、丙型肝炎病毒(分离株HCT27)、丙型肝炎病毒(分离株HCV-476)、丙型肝炎病毒(分离株HCV-KF)、丙型肝炎病毒(分离株Hunan)、丙型肝炎病毒(分离株TH)、丙型肝炎病毒(分离株VT204)、丙型肝炎病毒(分离株VT316)、丙型肝炎病毒(分离株VT681)、丙型肝炎病毒(分离株VT886)、丙型肝炎病毒(分离株VT887)、丙型肝炎病毒(分离株VT897)、丙型肝炎病毒(分离株VT898)。

黄病毒科；瘟病毒(143-144)；
边界病病毒(Border disease virus)、牛病毒性腹泻病毒、岩羚羊瘟病毒、经典猪瘟病毒(Classical Swine Fever virus)、经典猪瘟病毒、猪霍乱病毒、绵羊瘟病毒、瘟病毒、猪瘟病毒(Porcine pestivirus)、叉角羚瘟病毒。

小RNA病毒科；肝病毒属；甲型肝炎病毒(145-151)：
甲型肝炎病毒(病毒株18F)、甲型肝炎病毒(病毒株24A)、甲型肝炎病毒(病毒株43C)、甲型肝炎病毒(病毒株CR326)、甲型肝炎病毒(病毒株GA76)、甲型肝炎病毒(病毒株HM-175)、甲型肝炎病毒(病毒株LA)、甲型肝炎病毒(病毒株LCDC-1)、甲型肝炎病毒(病毒株MBB)、甲型肝炎病毒(病毒株MSM1)、猿甲型肝炎病毒(病毒株AGM-27)、猿甲型肝炎病毒(病毒株CY-145)。

小RNA病毒科；鼻病毒(152-163)；
人类鼻病毒10、人类鼻病毒100、人类鼻病毒11、人类鼻病毒12、人类鼻病毒13、人类鼻病毒15、人类鼻病毒16、人类鼻病毒18、人类鼻病毒19、人类鼻病毒1A、人类鼻病毒1B、人类鼻病毒2、人类鼻病毒20、人类鼻病毒21、人类鼻病毒22、人类鼻病毒23、人类鼻病毒24、人类鼻病毒25、人类鼻病毒28、人类鼻病毒29、人类鼻病毒30、人类鼻病毒31、人类鼻病毒32、人类鼻病毒33、人类鼻病毒34、人类鼻病毒36、人类鼻病毒38、人类鼻病毒39、人类鼻病毒40、人类鼻病毒41、人类鼻病毒43、人类鼻病毒44、人类鼻病毒45、人类鼻病毒46、人类鼻病毒47、人类鼻病毒49、人类鼻病毒50、人类鼻病毒51、人类鼻病毒53、人类鼻病毒54、人类鼻病毒55、人类鼻病毒56、人类鼻病毒57、人类鼻病毒58、人类鼻病毒59、人类鼻病毒60、人类鼻病毒61、人类鼻病毒62、人类鼻病毒63、人类鼻病毒64、人类鼻病毒65、人类鼻病毒66、人类鼻病毒67、人类鼻病毒68、人类鼻病毒7、人类鼻病毒71、人类鼻病毒73、人类鼻病毒74、人类鼻病毒75、人类鼻病毒76、人类鼻病毒77、人类鼻病毒78、人类鼻病毒8、人类鼻病毒80、人类鼻病毒81、人类鼻病毒82、人类鼻病毒85、人类鼻病毒88、人类鼻病毒89、人类鼻病毒9、人类鼻病毒90、人类鼻病毒94、人类鼻病毒95、人类鼻病毒96、人类鼻病毒98、人类鼻病毒B、人类鼻病毒14、人类鼻病毒17、人类鼻病毒26、人类鼻病毒27、人类鼻病毒3、人类鼻病毒8001芬兰1995年11月、人类鼻病毒35、人类鼻病毒37、人类鼻病毒6253芬兰1994年9月、人类鼻病毒9166芬兰1995年9月、人类鼻病毒4、人类鼻病毒42、人类鼻病毒9864芬兰1996年9月、人类鼻病毒5、人类鼻病毒52、人类鼻病毒7425芬兰1995年12月、人类鼻病毒5928芬兰1995年5月、人类鼻病毒70、人类鼻病毒72、人类鼻病毒79、人类鼻病毒83、人类鼻病毒8317芬兰1996年8月、人类鼻病毒86、人类鼻病毒7851芬兰1996年9月、人类鼻病毒92、人类鼻病毒93、人类鼻病毒97、人类鼻病毒99、安特卫普鼻病毒98/99(Antwerp rhinovirus 98/99)、人类鼻病毒263柏林2004、人类鼻病毒汉克斯病毒株(Human rhinovirusstrain Hanks)、未分型人类鼻病毒OK88-8162、美洲钝眼蜱病毒(Amblyomma americanum)、人类鼻病毒UC。

小RNA病毒科；肠道病毒(164-179)
牛肠道病毒、牛肠道病毒病毒株K2577、牛肠道病毒病毒株SL305、牛肠道病毒2型、柯萨奇病毒(Coxsackievirus)A16、柯萨奇病毒B3、肠道病毒A01-2A-1、肠道病毒H02-2A-3、肠道病毒H02-2B-1、肠道病毒H04-2B-2、肠道病毒Hu、肠道病毒I01-1-2、肠道病毒S01-2A-1、肠道病毒S02-1-6、肠道病毒S03-1-3、肠道病毒S06-1-1、人类柯萨奇病毒A16、人类柯萨奇病毒A9、人类柯萨奇病毒A9B、柯萨奇病毒、肠道病毒69、肠道病毒74、肠道病毒79、肠道病毒81、肠道病毒82、肠道病毒83、肠道病毒86、肠道病毒延边(Enterovirus Yanbian)96-83csf、肠道病毒延边96-85csf、人类柯萨奇病毒A1、人类柯萨奇病毒A10、人类柯萨奇病毒A11、人类柯萨奇病毒A12、人类柯萨奇病毒A13、人类柯萨奇病毒A14、人类柯萨奇病毒A15、人类柯萨奇病毒A17、人类柯萨奇病毒A18、人类柯萨奇病毒A19、人类柯萨奇病毒A2、人类柯萨奇病毒A20、人类柯萨奇病毒A21、人类柯萨奇病毒A22、人类柯萨奇病毒A24、人类柯萨奇病毒A3、人类柯萨奇病毒A4、人类柯萨奇病毒A5、人类柯萨奇病毒A6、人类柯萨奇病毒A7、人类柯萨奇病毒A8、人类柯萨奇病毒B1、人类柯萨奇病毒B2、人类柯萨奇病毒B4、人类柯萨奇病毒B5、人类柯萨奇病毒B6、人类艾柯病毒1、人类艾柯病毒11、人类艾柯病毒12、人类艾柯病毒13、人类艾柯病毒14、人类艾柯病毒15、人类艾柯病毒16、人类艾柯病毒17、人类艾柯病毒18、人类艾柯病毒19、人类艾柯病毒2、人类艾柯病毒20、人类艾柯病毒21、人类艾柯病毒24、人类艾柯病毒25、人类艾柯病毒26、人类艾柯病毒27、人类艾柯病毒29、人类艾柯病毒3、人类艾柯病毒30、人类艾柯病毒31、人类艾柯病毒32、人类艾柯病毒33、人类艾柯病毒4、人类艾柯病毒5、人类艾柯病毒6、人类艾柯病毒7、人类艾柯病毒8、人类艾柯病毒9、人类肠道病毒68、人类肠道病毒69、人类肠道病毒70、人类肠道病毒71、人类肠道病毒73、人类肠道病毒74、人类肠道病毒75、人类肠道病毒77、人类肠道病毒78、人类肠道病毒89、人类肠道病毒90、人类肠道病毒91、人类肠道病毒B、人类脊髓灰质炎病毒1、人类脊髓灰质炎病毒2、人类脊髓灰质炎病毒3、猪肠道病毒10、猪肠道病毒9、猪肠道病毒J10、猪肠道病毒J4、猪肠道病毒J6、猿小RNA病毒7、猿小RNA病毒7′、猪水疱病病毒、野生型脊髓灰质炎病毒3型。

此处提供的序列的数据挖掘基于在本说明书结尾处所列的参考文献。
实施例3
示例性多板式检测试剂盒
表8-呼吸试剂盒
 病毒株冠状病毒SARS其他冠状病毒HMPV(人类间质肺病毒)流感病毒A+B禽流感病毒腺病毒RSV(呼吸道合胞病毒)鼻病毒副流感病毒：1、2、3特殊呼吸试剂盒汉他病毒拉克罗斯脑炎病毒
表9-胃肠试剂盒：
 病毒株轮状病毒腺病毒40/41甲型肝炎病毒丙型肝炎病毒戊型肝炎病毒杯状病毒CMV(巨细胞病毒)
表10-脑膜炎试剂盒：
 病毒株肠道病毒(1～80)(包括脊髓灰质炎病毒1、2、3)西尼罗病毒单纯疱疹病毒1&2&6特殊脑膜炎试剂盒披膜病毒(东方/西方马)黄病毒(圣路易斯脑炎、日本脑炎......)狂犬病病毒
表11-性传播疾病试剂盒：
 病毒株HIV病毒株单纯疱疹1型病毒单纯疱疹2型病毒HSV-1HSV-2HPV(人乳头状瘤病毒)HTLV-1
表12-旅行者试剂盒：
 病毒株甲型肝炎病毒乙型肝炎病毒丙型肝炎病毒HIV疱疹病毒1&2型
表13-兽医试剂盒：
 病毒株狂犬病毒犬瘟热病毒
以下提供了能采用上述试剂盒进行检测的疾病的实例。
呼吸试剂盒：
 百日咳，未指明生物体肺炎球菌感染，在他处分类的情况下(in condition classif.elsewhere)；未具体指明地点腺病毒感染，在他处分类的情况下；未具体指明地点酗酒中急性酒精中毒(ac.alcoholic intoxic.in alcoholism)，短暂饮酒行为急性非化脓性中耳炎，未具体指明地点急性浆液性中耳炎急性粘液性中耳炎急性血性中耳炎(acute sanguinous otitis media)急性过敏性浆液性中耳炎急性过敏性粘液性中耳炎急性过敏性血性中耳炎急性化脓性中耳炎，未有自发的鼓膜破裂急性化脓性中耳炎，伴随自发的鼓膜破裂慢性咽鼓管鼓室化脓性中耳炎未具体指明的慢性化脓性中耳炎未具体指明的化脓性中耳炎未具体指明的中耳炎急性乳突炎不伴并发症乳突骨膜下脓肿
 急性乳突炎伴其他并发症鼓膜穿孔，未具体指明鼓膜中心穿孔鼓膜的上鼓室穿孔鼓膜的其他边缘穿孔鼓膜的多个穿孔鼓膜完全穿孔萎缩性松弛鼓膜萎缩性非松弛鼓膜未具体指明的鼓膜疾病急性鼻咽炎(感冒)急性上颌窦炎急性额窦炎急性筛窦炎急性蝶窦炎其他急性鼻窦炎急性鼻窦炎，未具体指明急性咽炎急性扁桃体炎急性喉炎急性气管炎，未提及梗阻急性气管炎，伴梗阻急性喉气管炎，未提及梗阻急性喉气管炎，伴梗阻急性会厌炎，未提及梗阻急性会厌炎，伴梗阻格鲁布急性咽喉炎其他多个部位的急性上呼吸道感染未具体指明部位的上呼吸道感染急性支气管炎急性细支气管炎腺病毒所致肺炎呼吸道合胞病毒所致肺炎副流感病毒所致肺炎别处未分类的其他病毒所致的肺炎病毒性肺炎，未具体指明肺炎球菌性肺炎肺炎克雷白菌所致肺炎假单胞菌所致肺炎流感嗜血杆菌(h.influenzae)所致肺炎细菌性肺炎，未具体指明
 巨细胞包涵体病中的肺炎百日咳中的肺炎炭疽中的肺炎曲霉病中的肺炎其他系统性真菌病中的肺炎别处分类的其他传染性疾病中的肺炎支气管肺炎，未具体指明生物体肺炎，未具体指明生物体伴肺炎的流行性感冒伴其他呼吸道表现的流行性感冒伴其他表现的流行性感冒支气管炎，未具体指明急性或慢性其他慢性支气管炎外因性哮喘，未提及哮喘持续状态外因性哮喘，伴哮喘持续状态内因性哮喘，未提及哮喘持续状态内因性哮喘，伴哮喘持续状态哮喘，未具体指明类型，未提及哮喘持续状态哮喘，未具体指明类型，伴哮喘持续状态吸入(食物、呕吐物或者n.o.s.)所致肺炎伴瘘管的积脓症积脓症，未提及瘘管胸膜炎，未提及渗漏液或当前的结核伴渗漏液的胸膜炎，由tbc之外的其他细菌所致其他明不形式的胸膜渗漏，除结核性之外未具体指明的胸膜渗漏肺脓肿纵隔脓肿肺萎陷呼吸衰竭呼吸系统其他疾病，别处未分类未具体指明的呼吸系统疾病中毒性胃肠炎和结肠炎其他的以及未具体指明的非感染性胃肠炎和结肠炎发绀呼吸异常，未具体指明换气过度端坐呼吸其他呼吸困难和呼吸异常咳嗽窒息
胃肠道试剂盒：
 霍乱弧菌(vibrio cholerae)所致霍乱艾尔托霍乱弧菌(vibrio cholerae eltor)所致霍乱霍乱，未具体指明伤寒副伤寒甲副伤寒乙副伤寒丙副伤寒，未具体指明沙门氏菌胃肠炎沙门氏菌败血症局部沙门氏菌感染，未具体指明沙门氏菌脑膜炎沙门氏菌肺炎沙门氏菌关节炎沙门氏菌骨髓炎其他局部沙门氏菌感染其他明示的沙门氏菌感染沙门氏菌感染，未具体指明痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)索氏志贺氏菌(Shigella sonnei)其他明示的志贺氏菌感染志贺氏菌病，未具体指明葡萄球菌食物中毒肉毒中毒产气荚膜梭菌(clostridium perfringens)(韦氏梭菌(c.welchii))所致食物中毒其他梭菌所致中毒副溶血性弧菌(vibrio parahaemolyticus)所致食物中毒食物中毒，未具体指明急性阿米巴痢疾，未提及脓肿慢性肠阿米巴病，未提及脓肿阿米巴非痢疾性结肠炎阿米巴肝脓肿阿米巴肺脓肿阿米巴脑脓肿阿米巴皮肤溃疡其他部位的阿米巴感染阿米巴病，未具体指明纤毛虫病
 贾第虫病球虫病肠滴虫病其他明示的原虫性肠疾病未具体指明的原虫性肠疾病亚利桑那类副大肠杆菌(paracolon bacilli)所致肠感染产气气杆菌(aerobacter aerogenes)所致肠感染变形菌(proteus)(奇异变形菌(mirabilis))(摩氏变形菌(morganii))所致肠感染葡萄球菌所致肠感染假单胞菌所致肠感染由其他明示的细菌所致肠感染细菌性肠炎，未具体指明他处未分类的其他生物体所致肠感染传染性结肠炎、肠炎和胃肠炎假定为传染性来源的结肠炎、肠炎和胃肠炎传染性腹泻假定为传染性来源的腹泻
脑膜炎试剂盒
未具体指明菌血症
菌血症
败血症
肺炎球菌败血症
细菌性脑膜炎
肺炎双球菌脑膜炎
在别处分类的其他细菌性疾病中的脑膜炎
由其他明示细菌所致脑膜炎
脑膜炎，未具体指明
化脓性关节炎
眼窝周围蜂窝组织炎
乳突炎及相关病症
急性乳突炎
急性乳突炎，无并发症
肺炎球菌性腹膜炎
疱疹性脑膜脑炎
疱疹性败血症
性传播疾病(std)试剂盒
单纯疱疹
眼睑的单纯疱疹性皮炎
单纯疱疹盘状角膜炎
单纯疱疹性虹膜睫状体炎
单纯疱疹性脑膜炎
单纯疱疹性外中耳炎
单纯疱疹，伴眼科并发症
单纯疱疹，伴其他眼科并发症
单纯疱疹，伴其他明示的并发症
单纯疱疹，伴其他明示的并发症
单纯疱疹，伴未具体指明的并发症
单纯疱疹，伴未具体指明的眼科并发症
单纯疱疹，未提及并发症
带状疱疹
眼睑的带状疱疹性皮炎
带状疱疹性虹膜睫状体炎
带状疱疹性角结膜炎
带状疱疹，伴脑膜炎
带状疱疹，伴眼科并发症
带状疱疹，伴其他神经系统并发症
带状疱疹，伴其他神经系统并发症
带状疱疹，伴其他眼科并发症
带状疱疹，伴其他明示的并发症
带状疱疹，伴其他明示的并发症
带状疱疹，伴未具体指明的并发症
带状疱疹，伴未具体指明的神经系统并发症
带状疱疹，未提及并发症
疱疹性龈口炎
疱疹性阴茎感染
疱疹性脑膜脑炎
疱疹性败血症
疱疹性外阴溃疡
疱疹性外阴阴道炎
疱疹性瘭疽
实施例4
蛋白酶克隆和活性测定
材料和实验方法
蛋白酶测定：
HRV 3C：室温下，在25mM HEPES、150mM NaCl、1mM EDTA、5％甘油(PH 7.5且总体积＝1ml)中进行HRV 3C活性的常规体外测定。监测样品中、细胞溶解产物中、转化细胞提取物(重组)中和纯化的重组HRV16 3C样品中的HRV 3C蛋白酶活性。荧光底物(pep 1、5、6、8、Ori 2；EDANS/DANCYL)通常在4μM浓度使用。可检测的底物包括但不局限于Ori 2、PEP1。在对应于EDANS/DABCYL基团的激发/发射特征的激发/发射340/490±15nm利用荧光计监测反应。酶浓度在1μM～500pM之间变化。
作为另外一种选择，在30℃，采用在96孔板中的体积为100μl的用7-甲氧基香豆素-4-乙酸(MOC)荧光团和二硝基苯酚(DNP)猝灭剂标记的底物进行3C蛋白酶测定，其中含有25mM Tris HCl(pH 8.0)、150mMNaCl、1mM EDTA(pH 8.0)、6mM DTT、2μM～6μM底物、2％ DMSO、416nM 3C蛋白酶以及如需则加入的抑制剂。通过在328nm的激发和在393nm的发射来监测荧光(截止值为10nm)。用非线性回归分析程序EnzFitter(BioSoft)采用以下等式对数据进行分析：
K_i＝(I/((V_max×S)/V₀)/K_s)-I-S
所使用的底物浓度低于所述底物的K_m(16.8μM)，因此不需要修正S/K_m项。
向所述反应中加入的包括DTT、甘油、Na₂SO₄、BSA和鼻清洗液。
肠道病毒(非脊髓灰质炎肠道病毒NPEV)活性测定：在4℃将新鲜CSF样品(在4℃保存1～2天)超声处理3×20秒。将100μl所述细胞溶解产物加入到100μl的2×反应缓冲液中，采用4μM的Pep 1作为底物。所述反应在室温下进行，并用荧光计分别在激发/发射340/490±15nm下进行监测。
组织培养物测定：H1 HeLa细胞在补充有5％ FBS、1％ pen-strep和1％非必需氨基酸的DMEM培养基中生长。汇合培养瓶的H1 Hela细胞用MOI为1～10PFU/细胞的HRV血清型14&1A进行感染。在感染后48小时，或者用胰蛋白酶处理或者刮拭来收获细胞。将细胞用PBS洗涤三次并重新悬浮在反应缓冲液中。在冰上超声3×15秒使细胞破裂，随后在4℃，13000rpm离心10min。经清理的细胞溶解产物(含有可溶性3C pro)用于所述测定。
SARS和HRV 16 3C蛋白酶的克隆：将SARS和HRV蛋白酶克隆作为用于实验和试剂盒的蛋白酶的来源。
HRV 16：引物经设计位于基因组的4320～4869bp位置。正向引物加有5′引物延伸，CACC，以协助定向克隆入拓扑异构酶克隆载体中。反向引物用以将终止密码子(TGA)导入至3′引物端。利用这些引物的所期望的PCR产物为556bp。所使用的模板源自含有HRV 16 cDNA(GenBank登录号gi：3915817)的载体。
HRV 16正向引物：5′CACCGGTCCAGAAGAAGAAT 3′SEQID NO：48
HRV 16反向引物：5′TCATTGTTGTTCAGTGAAGTAT 3′SEQID NO：49
SARS：引物经设计位于基因组(SARS 3CL，GenBank登记号gi：37999886)的9985～10902bp位置。正向引物加有5′引物延伸，CACC，以协助定向克隆。反向引物用以将终止密码子(TAA)导入至3′引物端。利用这些引物的所期望的PCR产物为925bp。所使用的模板源自于从Dr.Av-Gay(Av Gay；温哥华；加拿大)获得的cDNA文库。
SARS正向引物：5′CACCAGTGGTTTTAGGAAAATGGC 3′SEQ ID NO：50
SARS反向引物：5′TTATTGGAAGGTAACACCAGAGC 3′SEQID NO：51
在标准反应混合物中利用校正聚合酶(Pfu)进行基因的PCR扩增(1×反应缓冲液、0.5mM dNTP、100pmol引物和1单位pfu。采用以下循环方案：94℃，3min；随后35个循环(94℃，1min；59℃，1min；72℃，1min)并在72℃，10min结束)。来自SARS 3CL和HRV 16 3C蛋白酶的PCR产物直接克隆入pET 151/D-TOPO(Invitrogen，Carlsbad，CA)(图1a和1b)。对于HRV 16 3C蛋白酶，筛选的35个克隆中发现一个呈阳性。对于SARS 3CL蛋白酶，在筛选的15个中有3个呈阳性。
实验结果
SARS和HRV 16 3C蛋白酶的克隆：如上所述将SARS 3CL和HRV16蛋白酶克隆入pET 151/D-TOPO(Invitrogen，Carlsbad CA)作为用于所述实验和试剂盒的蛋白酶来源。图1a和1b分别示出SARS3CL(pMND2)和HRV 16 3C(pMND1)质粒。对于HRV 16 3C蛋白酶，筛选的35个克隆中发现一个呈阳性。对于SARS 3CL蛋白酶，在筛选的15个中有3个呈阳性。在来自于转化细菌的全细胞溶解产物中检测到重组HRV 16 3C和SARS 3CL蛋白酶活性(图2)。
体外测定中采用最佳切割序列底物肽的优异底物活性
肽设计：为提供用于检测并表征所感兴趣的蛋白酶的选择性的最有效的底物，在体外测定中将天然的和经设计的肽底物的切割进行比较。肽底物经设计用在HRV 3C蛋白酶的测定中。肽底物序列或者根据天然切割位点序列进行设计，或者根据本发明的方法进行选择。通常而言，通过进行多个已知HRV切割位点的多序列比对，以及根据其生物信息学性质确定在特定位置的最佳氨基酸，来确定底物序列设计。以下表14描述了在体外测定中采用的3C蛋白酶底物及其来源。
表14
 SEQ IDNO名称序列目标设计143Ori2(DABCYL)-S-A-I-F-Q-G-P-I-S-M-D(EDANS)-K基于HRV 16的原始切割位点144PEP1(DABCYL)-L-E-A-L-F-Q-G-P-D(EDANS)-S-Q基于多个HRV切割位点和生物信息学进行设计145PEP3E-A-L-F-Q-pNA基于HRV切割位点和PEP1146PEP4D-S-L-E-V-L-F-Q-pNA基于HRV切割位点147PEP5(DABCYL)-L-E-V-L-F-Q-G-P-D(EDANS)-S-Q基于多个HRV切割位点和生物信息学进行设计148PEP6(DABCYL)-T-S-A-V-L-Q-S-G-F-R-D(EDANS)-K基于SARS的原始切割位点149PEP7：T-S-A-V-L-Q-pNA基于SARS的原始切割位点150PEP8(DABCYL)-L-E-A-L-F-Q-A-A-D(EDANS)-S-Q-NH₂经设计为不被HRV蛋白酶切割。同时还具有N末端修饰以设计为阻断所述末端并降低背景151PEP9(DABCYL)-L-E-A-L-F-Q-G-P-D(EDANS)-S-Q-NH₂根据多个HRV切割位点和生物信息学进行设计，同时还具有N末端修饰以设计为阻断所述末端并降低背景
确定3C蛋白酶的最佳肽底物：为确定3C蛋白酶的最佳切割底物，所述合成肽底物Pep1～Pep9(参见以上表14)被重组3C蛋白酶(参见以上实施例1)的切割与所述天然底物序列Ori 2的切割进行比较。在Pep1～Pep9中表现出最快速的动力学的底物是Pep1，其在多个HRV 3C切割位点和生物信息学的基础上进行设计。图3描述了与Ori 2相比时，所述3C蛋白酶测定的优异动力学。图4描述了在0.003μM～4μM的底物浓度内，采用250nM 3C蛋白酶时，重组3C蛋白酶对Pep1进行切割的动力学。对于所测试的所有底物浓度，均观察到至少3分钟反应过程的线性动力学。
确定采用最佳肽底物的3C蛋白酶测定的最佳条件：为确定使用所述经设计的底物的3C蛋白酶测定的最佳条件，评估了对反应条件改变的敏感性。改变了所述标准缓冲液的主要成分诸如DTT、甘油、Na₂SO₄和BSA的浓度，并测定了对反应速率(RFU/min)的影响。所述结果指出与Pep1底物一起使用的最佳反应缓冲液包含6mM DTT、5％甘油、0.8MNa₂SO₄和0.1～1mg BSA/ml。
确定采用最佳肽底物的3C蛋白酶测定的灵敏度：预计在临床样品中的酶浓度通常较低。为测定采用所述经设计的肽底物的3C蛋白酶活性检测的下限，用一定范围的重组酶浓度测试了4μM的Pep1。在该测定中蛋白酶检测的下限经确定为0.5nM～1.0nM 3C蛋白酶。
确定采用最佳肽底物的3C蛋白酶测定的特异性：对于评估真正临床样品中切割活性而言至关重要的是所希望的切割活性对经设计的底物的特异性。为测试HRV 3C蛋白酶对Pep1的特异性，测试了Pep1底物与SARS蛋白酶和大肠杆菌(E.coli)溶解产物的酶交叉反应性。
图5显示了在HRV 16溶解产物中HRV 3C蛋白酶对Pep1切割的特异性，以及用SARS 3CL溶解产物或E.coli溶解产物未有任何可检测到的切割反应。
采用H1HeLa细胞培养物以模拟真正的原位HRV感染来进行更多的特异性测试，并测试所设计的底物在如此条件下检测3C活性的效力。HRV感染的HeLa细胞的经清理和超声处理的溶解产物用底物Pep1、Ori2和Pep6进行测试。所述结果指出HeLa细胞对于非特异性蛋白酶活性有很高的背景。
为试图消除利用HeLa细胞进行工作时的非特异性影响，评估了多种已知的蛋白酶抑制剂(EDTA、EGTA、PMSF和抑蛋白酶肽(Aprotinin))对HeLa细胞溶解产物对所设计的底物的切割的影响。以下表15描述了采用Pep1作为底物的蛋白切割反应对抑制剂PMSF和抑蛋白酶肽的相对不敏感性。EDTA/EGTA部分抑制所述3C蛋白酶对Pep1的切割。
表15
 对照(仅有H1细胞溶解产物，没有抑制剂)完全的不含EDTA的片剂(Sigma)PMSF2mM抑蛋白酶肽8μg/mlEDTA/EGTA10mM反应速率RFU/min11911011911565抑制％(相对于对照)-7.5％0％3.3％45％
在临床条件下确定采用最佳肽底物的3C蛋白酶测定的效力：HRV蛋白酶测定的临床背景的特征在于存在粘膜分泌物。为了在真正临床条件下确定3C蛋白酶对所设计的底物的切割的效力，比较了在存在加入的鼻清洗样品和不存在加入的鼻清洗样品时重组3C蛋白酶对Pep1的切割。图6显示鼻清洗样品对反应动力学没有影响，表明所述反应在临床应用中的适用性。
通过在临床鼻清洗样品中最佳切割序列底物肽的切割来准确检测鼻病毒感染-为测试所设计的肽底物在临床环境中应用的适用性，对获得自受试者的鼻清洗样品(利用粘液抽取器试剂盒-带有过滤器的Mucosafe抽取器-Maersk Medical A/S-丹麦)在病毒存在的情况下进行评估，然后用本发明的的方法进行蛋白酶催化活性测试。每个样品的一部分通过直接免疫荧光测定(IFA)采用商购单克隆抗体(Chemicon International，Inc.，Temecula，CA)，利用组织培养物检测RSV、流感A和B病毒、副流感病毒和腺病毒的存在。其余部分保存在-80℃，直至用于HRV存在的分析。
目前，并不存在HRV检测的“金牌标准”。由于病毒易感性使得组织培养物并非是一种例行测试，而且没有可供采用的商业免疫测定测试。因此选择RT-PCR分析，在瑞士日内瓦的日内瓦大学医院内科部传染病科病毒学中心实验室(The Central Laboraotry of Virology，Division of InfectiousDiseases，Department of Internal Medicine，University Hospitals of Geneva)进行样品分析。
临床鼻清洗液测试：利用24份临床样品(鼻清洗液)进行测定。使用合成肽底物Pep1计算了相对于总蛋白浓度的3C蛋白酶比活(通过Bradford)(比活＝RFU/min/mg蛋白质)。
以下表16显示了通过RT-PCR和通过蛋白酶活性(MND测定)检测样品中HRV的比较结果。24份样品中的17份确定为与所述RT-PCR结果相关的蛋白酶阳性或蛋白酶阴性(比活分别大于或小于0.5RFU/min/mg蛋白质)。在余下的7份样品中，5份在RT-PCR中为阴性，但根据蛋白酶测定为阳性，2份在RT-PCR中为阳性，但根据蛋白酶测定为阴性。假定所述RT-PCR的绝对正确性，这些初步结果的统计分析(表17)显示75％的灵敏度相容性和70％的特异性相容性。
表16
 样品RT-PCR其他病毒比活RFU/min/mgMND结果2μM底物阈值(Trashhold)＝0.5*E0260N0.49084N*E0265P0.532999377P*E0269N0N*E0281NRSVPIAD0.296603037N**E0282N0.588661728P*E0283N0N**E0300NCMV2.94504P*E0306N0N*E0312N0N**E0313NHPMV1.10124359P*E0314N0.332420741N*E0317P6.932318182PH1 HeLa0.1911111114μM底物样品阈值(Trash hold)＝0.53*E0320PCMV19.30126825P**E0335N21.87407626P*E0336P6.405326675P**E0347NPI16.08482439P*E0370N0.658017493N*E0424P9.198241407P***E0474P0.120745921N***E0497P0.334046092N*E0499N0N*W0006N5.290901444N*W0007NAD3.075N*W0011P9.290322581PH1 HeLa0.375
P-HRV阳性，N-HRV阴性，PI-副流感病毒，AD-腺病毒
^*-与RT-PCR相关，^**-RT-PCR阴性MND阳性，^***-RT-PCR阳性MND阴性。
表17

然而，RT-PCR检测的准确性是令人怀疑的，采用本发明的方法的蛋白酶检测具有比RT-PCR检测更明显的优势。RT-PCR仅仅检测病毒的RNA并因此也可检测失活的病毒。因此，可能的是在RT-PCR中为阳性在蛋白酶活性中为阴性的样品是由于以下事实，即所述蛋白酶测定仅仅检测处于活性形式的病毒。此外，应当理解所测试的样品在使用前在-80℃保存3～4年。因此，在RT-PCR中测试为阳性而蛋白酶测定为阴性的样品可能含有由于长期保存而失活的3C蛋白酶。再次，蛋白酶检测可能比RT-PCR更加灵敏，这可以反映在RT-PCR中测试为阴性而对蛋白酶为阳性的样品中。
因此，采用最佳切割序列底物肽的3C蛋白酶测定成功地检测到临床样品中的HRV16。
实施例5
通过临床CSF样品中最佳切割序列底物肽的切割来准确检测肠道病毒感染
非脊髓灰质炎肠道病毒(NPEV)感染在每年夏末秋初很常见，并且是仅次于鼻病毒的最常见人类病毒感染因子。超过90％的无菌性脑膜炎病例由NPEV引起，典型症状为发热、严重头疼、颈部僵硬、颈部疼痛、恶心和呕吐、对亮光敏感、以及可能出现皮疹。
CSF中NPEV的检测目前通过PCR和组织培养进行。NPEV PCR相比病毒培养能在收到样品后5～24小时内更灵敏地更短时间地提供结果。然而，组织培养和RT-PCR均花费较大并要求复杂的仪器，而不适用于快速的现场诊断。为测试采用最佳切割序列底物肽的蛋白酶测定的肠道病毒检测效力，人类脑脊液(CSF)样品利用本发明的方法以及在确定性组织培养测定中测定NPEV。
临床CSF测试：表18描述了本发明的方法的优异灵敏性。为了在CSF中准确、灵敏地检测，选用Pep9作为所述最佳序列底物肽。基于以下原因选用Pep9：首先，NPEV和HRV的蛋白酶属于相同家族，虽然采用非最佳测定条件，但仍能获得结果。其次，由于HRV并不存在于CSF中，因此没有交叉反应性的风险。通过腰椎穿刺获得新鲜CSF。
表18
 CSF样品细胞/mm³MND结果组织培养结果N1450阳性阳性N24阴性阴性N32阴性阴性N41阴性阴性N5148阴性阴性N6194阴性阴性N74阴性阴性
在7份新鲜CSF样品中，组织培养测定结果和基于蛋白酶活性的检测的结果间获得完全相关性。注意到所述组织培养结果和蛋白酶检测结果之间的正相关并不受到细胞密度(450细胞/mm³～1细胞/mm³)的影响。因此，在临床条件下可使用通过CSF样品中最佳切割序列底物肽的切割进行的蛋白酶检测从而进行肠道病毒的准确和快速检测。
总之，这些结果显示根据比较酶动力学设计和选择的最优肽底物可用于检测具有诊断意义的目标酶，其具有优异的灵敏度和准确性。这些具有诊断意义的目标酶的检测可极大地改进常见疾病诸如肠道病毒和鼻病毒，以及可疑的流行性或大流行性致病原诸如SARS和禽流感的快速诊断。
实施例6
基于分离的蛋白酶检测
本发明还提供了根据在反应中进行的特定底物切割来同时检测一种或多种反应物质(酶或特定化学品)的新型方法，描述了基于亲合性的分离。所述切割的检测指示了所述检测所必需的特定反应的存在。在一个实施方式中，如此方法的一个应用是用于检测催化特定反应的特定酶。在另一实施方式中，所述酶是需要进行检测的生物体系的一部分。在另一实施方式中，所述生物体系是病毒或细菌或其他病原体。所述检测方法由两步的组合构成：
第一步-在反应中经过加工的分子和未经过加工的分子的分离。第二步-仅对经加工的分子进行检测。
所述分离机制或者可利用两个部分的特异亲合性结合例如抗体-底物，核酸杂交，或者可利用与固定表面例如膜、芯片、珠子等的连接。所述检测步骤或者可以基于亲合性或者任何其他方式例如荧光法、比色法、酶法，或者二者。
进行待测特定反应的底物包含三部分(X、Y、Z)和C(图7)。具有特异性切割位点的核心分子(片段Y，例如动力学最佳底物，诸如以上描述所确定的)一端连接于标签分子(片段X，即可检测部分)，其目的是检测被切割的底物。另一端与将经加工的底物和未加工的底物分离开的结构片段(片段Z，分离部分)相连。在分子Y的切割时，形成底物切割产物：(1)含有X部分和部分Y的标签片段(TS，在此处也称为X-Y′)和(2)含有Z和部分Y的分离片段(SS，在此处也称为Y＂-Z)。引发所述分子切割并且其检测是所希望的过程可以是酶反应、化学反应、变性或任何其他过程。
在图8中描述的底物与其经设计的切割部分反应。一旦发生切割，所述Z部分(分离片段)用于分离经加工的底物和未经加工的底物。因此，仅有所述经加工的底物的TS(含有可检测部分)与具有对可检测分子的高亲合性的部分相结合。因此仅仅对于被切割的底物检测到所述亲合性结合过程。检测可基于已有的、已知的或新型方法。按此方式可仅仅检测经过加工的分子(图8)。
在另一实施方式中，也可能采用上述方法同时检测许多底物的切割。这种可能性在如果以下情况时发生，即所述底物的分离结构(Z)相似但其特异性切割分子(Y)不同。在该情况下，每种底物具有可与其核心分子(Y)相连的独特的不同可检测部分(X)。在发生切割和经加工和未经加工的底物之间的分离后，仅有所述不同(和经过加工)的底物的TS通过亲合性相结合(根据上述方法)。含有Z(未经过加工的底物或者经过加工的底物的SS)的任何分子通过所述分离结构而保留。通过设计膜、芯片等可以实现不同底物的不同TS之间的分离，在所述膜、芯片上每个预定地点含有与各不同TS具有亲和性的部分，例如每个地点仅仅能结合一种TS。随后经分离的溶液与该芯片或膜相接触并发生亲合性结合。通过知晓哪些预定地点通过亲合性与不同的TS相连接，可以鉴别出哪些底物经过加工。由于每种底物对于引发所述底物切割的所述酶而言是特异性的，因此有可能鉴别出哪种酶已切割其相应底物，推论出哪种蛋白酶存在于所述溶液中，并因此推论出是哪种对应于相应酶的病原体或因子(图9)。
反向PH系统(RPHS)-在该实施方式中，所述C片段是在缓冲溶液中对于所有底物而言共有的特定分子。对应于各种底物的A片段是染料分子实体，其不同颜色对不同的PH敏感。在切割后，所述缓冲溶液经过与片段C具有亲和性的柱子的过滤。任何含有片段C的分子(未经加工的底物或经过加工的底物的片段SS)将保留在所述柱上(通过对应于片段C的亲和部分)。仅有所述经过加工的底物的TS片段(不含有片段C)将能随着进入具有数个小单元的小室，其中每个小单元具有不同PH。一但所述TS片段(含有A)与所述小单元(不同PH)相接触，所述小单元根据片段A的性质改变颜色。这指示出何种底物已经过加工。
分离机制
所述分离机制的目的在于分离所述TS和SS使得仅仅所述TS能被允许与相应于所述可检测部分具有亲合性的部分相结合。在同时检测许多底物的情况下，所述分离机制还具有其他功能，即在对于这些底物未能引发切割的情况下除去完整的底物。
对于上述系统，可以采用任何分离方法。以下提供了这些分离方法的简单说明。
1.固定分离系统(ISS)-在该系统中，Z是通过珠子、硝基纤维素膜、生物素-抗生物素蛋白或者其他亲合性对与固定表面相连接的间隔子。在缓冲溶液中切割之后，任何未经过加工的底物或者经过加工的底物的SS通过从所述缓冲溶液中分离所述固定表面(通过萃取、离心、过滤等)而移除，仅留下经过加工的底物的TS。在此方式中也可能监测每种底物的动力学。
2.动态分离系统(DSS)-在该系统中，Z是在所述缓冲溶液中对于所有底物而言共有的或者独特的特定分子。在发生切割后，所述缓冲溶液与经过特殊设计的膜或芯片相接触。所说膜为垂直并在底部其具有相应于Z具有亲合性的部分。所述膜的相邻部分包括相应于不同底物的X的不同地点。然后通过毛细作用力或者电力将所述缓冲溶液沿所述膜或芯片的长度推进。含有Z的任何分子(未经过加工的底物或经过加工的底物的SS)将保留在所述膜的底部(通过相应于Z的亲合性部分)。仅有经过加工的底物的TS(不含有Z)将能够沿膜向上移动并与其预定地点通过亲合性结合(图10)。
3.亲合性过滤系统(AFS)，在该系统中，所述缓冲溶液经与Z具有亲合性的柱子过滤，因此含有Z的任何分子(未经过加工的底物或经过加工的底物的SS)将保留在柱子中。流出物将仅仅含有经过加工的底物的TS。
亲合性对的实例
用于该系统的亲合性对可以是本领域中已知的任何亲合性对。亲合性对的例子包括但不局限于生物素-抗生物素蛋白、抗体-底物；受体-底物；基于核酸杂交的正义-反义DNA/RNA链；PH依赖性颜色分子；荧光-可检测部分，可基于FRET或其他荧光检测方法。
检测方法实例
抗体/受体-底物-基于荧光或颜色的任何已有的或新型免疫化学方法是合适的。
标记-可检测部分(X)可以是以下分子或者是连接于以下分子：能产生颜色、荧光、FRET或任何其他可测量的、可见的或可容易检测到的分子。
DNA杂交-诸如基于荧光或颜色探针的任何已有的或新型杂交方法是合适的。
酶反应-可检测部分(X)可以与能催化颜色或荧光或任何其他可测量的、可见的或任何其他易于检测的反应的酶相连。
基于抗体亲合性的蛋白酶检测
根据其特异性蛋白酶活性检测了临床样品中大量病毒的存在。许多病毒家族采用特定的蛋白酶活性作为其生命周期的重要部分。例如鼻病毒(3C蛋白酶)、肠道病毒(3C蛋白酶)和SARS(3CL蛋白酶)全部采用对其病毒家族而言独特的切割序列。
在该实施例中，所述底物是在一端与生物素(对应于Z)相连的肽切割序列(对应于Y)。另一端与对特定抗体具有亲合性的分子(对应于X)相连。该底物的切割将导致SS和TS的分离(如上所述)。
所述反应混合物含有不同类型的上述底物。所有所述底物在一端含有生物素部分。所述肽的不同在于对应于特定蛋白酶的切割序列，而所述独特的抗体底物能相关联于特异性切割序列(例如A1、A2、A3......)。按此方式，每种底物能与不同病毒相关联。
所述反应混合物与临床样品相接触并可发生切割。在切割后，在膜或芯片上分析所述反应混合物，所说膜或芯片形如条状并专为该目的而特别设计(图10)。在底部其具有含有抗生物素蛋白的区域。在该区域以上为其具有含有相应于不同底物的不同抗体底物的抗体[例如抗A1(相应于抗X1)、抗A2(相应于抗X2)、抗A3(相应于抗X3)......]的不同地点。然后通过毛细作用力或者电力将所述缓冲溶液沿所述膜或芯片的长度推进。任何含有生物素的分子(未加工的底物或者经过加工的底物的SS)将保留在所述膜的底部(通过与抗生物素蛋白的亲合性)。仅有经过加工的底物的TS(不含有生物素)将能够沿所述膜向上移动并与其预定地点通过亲和力相结合(例如，A1-抗A1、A2-抗A2等，对应于上述的命名)。
由于每个地点代表不同的蛋白酶，因此可能由所述经过加工的底物的存在而确定何种蛋白酶存在于所述临床样品中。所述蛋白酶的存在确认了相应特定病毒的存在。
基于核酸杂交的蛋白酶检测
DNA或RNA的正义链和反义链相互之间具有很高的亲合性。所述系统利用了该性质。该系统按照上述抗体实施例中所述的准则进行设计。
差别在于所述亲合性结合基于核酸杂交。在该实施例中，所述底物是一端与分离ssDNA链(对应于Z)相连的肽切割序列(对应于Y)。另一端与独特的ssDNA链(相应于X)相连。该底物的切割导致SS和TS的分离(如上所述)。
所述反应混合物含有不同类型的上述底物。所有底物具有相同的分离ssDNA链。它们的不同在于相应于特定蛋白酶的切割序列，以及可与特异性切割序列相关联的独特ssDNA(例如A1ssDNA、A2ssDNA、A3ssDNA......)。按此方式，每种底物能与不同病毒相关联。
所述反应混合物与临床样品相接触并可发生切割。在切割后，在膜或芯片上分析所述反应混合物，所说膜或芯片形如专为该目的而特别设计的条状(图10)。在底部其具有含有反义分离DNA链的区域。在该区域以上其具有含有相应于不同底物的独特ssDNA的反义DNA链(例如反义A1ssDNA、反义A2ssDNA、反义A3ssDNA......)的不同地点。然后通过毛细力或者电力将所述缓冲溶液沿所述膜或芯片的长度推进。任何含有所述分离ssDNA链的分子(未加工的底物或者经过加工的底物的SS)将保留在所述膜的底部(通过与所述反义分离DNA的亲合性)。仅有经过加工的底物的TS(不含有分离ssDNA链)将能够沿所述膜向上移动并与其预定地点相结合(例如，A1ssDNA-反义A1ssDNA、A2ssDNA-反义A2ssDNA等)。
由于每个地点代表不同的蛋白酶，因此可能由所述经过加工的底物的存在而确定何种蛋白酶存在于所述临床样品中。所述蛋白酶的存在确认了相应特定病毒的存在。仅仅根据所述固相上的所述分析产物的可寻址定位可以采用单一可检测部分来检测数种病毒。
应当理解为清楚起见在单独的实施方式内容中描述的本发明的某些特征也可以在单一实施方式中组合提供。相反，为简洁起见在单一实施方式内容中描述的各种特征也可分别提供或者以任何合适的亚组合提供。
虽然结合本发明的具体实施方式而对本发明进行了描述，但显然许多改变、修改和变体对于本领域技术人员而言是显而易见的。因此，旨在涵盖落在所附权利要求的精神和广泛范围内的这些改变、修改和变体。在本说明书中的出版物、专利和专利申请在此以参考的方式整体引入到说明书中，如同每篇独立的出版物、专利和专利申请在此以特异和单独所示以参考的方式引入所达到的同样范围。此外，在本申请中的任何参考文献的引用或标识并不应解释为承认如此的参考文献可作为本发明的现有技术获得。
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<222>(1)..(1)
<223>可以是A或V
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>可以是A、G或任何碱性氨基酸残基
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(4)
<223>蛋白酶切割点
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>可以是A、G或Y
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(5)
<223>可以是任何疏水性氨基酸残基
<400>3

<210>4
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>风疹病毒蛋白酶底物共有
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(5)
<223>蛋白酶切割点
<400>4

<210>5
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HIV蛋白酶底物共有
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>可以是S或G
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>可以是Q、G、R或K
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
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<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>可以是Y、任何疏水性或芳香族氨基酸残基)-/-
     P(I/V/疏水性)(V/Q
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(5)
<223>蛋白酶切割点
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
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<220>
<221>misc_feature
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<210>6
<211>7
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<220>
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<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
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<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
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<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>可以是任何疏水性氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>可以是F或L
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(5)
<223>蛋白酶切割点
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>可以是任何疏水性氨基酸
<400>6


<210>7
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HTLV蛋白酶底物共有
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(5)
<223>可以是F或L
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(6)
<223>蛋白酶切割点
<400>7

<210>8
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HTLV蛋白酶底物共有
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>可以是任何氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>可以是任何疏水性氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(6)
<223>蛋白酶切割点
<400>8

<210>9
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>动脉炎病毒蛋白酶底物共有
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>可以是L或任何芳香族或碱性氨基酸残基
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(3)
<223>
<400>9

<210>10
<211>8
<212>PRT
<213>
<220>
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<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>可以是S或任何疏水性氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>可以是任何氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(5)
<223>蛋白酶切割点
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(5)
<223>可以是S或A
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(7)
<223>可以是任何氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(8)
<223>可以是任何疏水性或碱性氨基酸
<400>10

<210>11
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
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<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>可以是任何疏水性氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>可以是K、R或N
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(5)
<223>蛋白酶切割点
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(5)
<223>可以是A或K
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>可以是任何疏水性氨基酸
<400>11

<210>12
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>SARS冠状病毒3CL蛋白酶底物共有
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>可以是A或S
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>可以是任何疏水性氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(5)
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<400>12

<210>13
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
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<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>可以是任何碱性氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
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<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(5)
<223>蛋白酶切割点
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(5)
<223>可以是S、A或G
<400>13

<210>14
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
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<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
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<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(5)
<223>蛋白酶切割点
<400>14

<210>15
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CMV蛋白酶底物共有
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(5)
<223>蛋白酶切割点
<400>15

<210>16
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>单纯疱疹病毒蛋白酶底物共有
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>可以是任何疏水性或芳香族氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>可以是任何疏水性氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>可以是Q、N、E或D
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(5)
<223>蛋白酶切割点
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>可以是S、T、D或E
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(7)
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<210>17
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
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<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>可以是G或任何碱性氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(3)
<223>可以是任何碱性氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(4)
<223>蛋白酶切割点
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>可以是S、G或A
<400>17

<210>18
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>登革病毒蛋白酶底物共有
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(3)
<223>可以是任何碱性氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(4)
<223>蛋白酶切割点
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>可以是S、T或A
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(5)
<223>可以是任何疏水性氨基酸
<220>
<221>misc_feature
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>登革病毒蛋白酶底物共有
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>可以是S、T或A
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>可以是任何氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(6)
<223>蛋白酶切割点
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(7)
<223>可以是任何疏水性氨基酸
<400>19

<210>20
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>登革病毒蛋白酶底物共有
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(6)
<223>蛋白酶切割点
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<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
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<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>可以是A或HB供体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>可以是任何氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(4)
<223>可以是任何碱性氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(5)
<223>蛋白酶切割点
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(5)
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<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>可以是任何氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(7)
<223>可以是任何疏水性氨基酸
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<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>西尼罗病毒蛋白酶底物共有
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(6)
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<400>22

<210>23
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>西尼罗病毒蛋白酶底物共有
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(7)
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<400>23

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<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>黄热病病毒蛋白酶底物共有
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(3)
<223>可以是任何碱性氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(4)
<223>蛋白酶切割点
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>可以是S或G
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(5)
<223>可以是任何氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>可以是任何疏水性氨基酸
<400>24

<210>25
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>黄热病病毒蛋白酶底物共有
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(5)
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<400>25

<210>26
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>黄热病病毒蛋白酶底物共有
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(5)
<223>蛋白酶切割点
<400>26

<210>27
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>日本脑炎病毒蛋白酶底物共有
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(2)
<223>可以是任何碱性氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(3)
<223>蛋白酶切割点
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>可以是S或G
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(5)
<223>可以是任何疏水性氨基酸
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<210>28
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>日本脑炎病毒蛋白酶底物共有
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(5)
<223>蛋白酶切割点
<400>28

<210>29
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>日本脑炎病毒蛋白酶底物共有
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(7)
<223>蛋白酶切割点
<220>
<221>misc_feature
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<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>蜱传病毒蛋白酶底物共有
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(2)
<223>可以是任何碱性氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(3)
<223>蛋白酶切割点
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>可以是任何疏水性氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(5)
<223>可以是任何氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>可以是任何酸性氨基酸
<400>30

<210>31
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>蜱传病毒蛋白酶底物共有
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(5)
<223>蛋白酶切割点
<400>31

<210>32
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>蜱传病毒蛋白酶底物共有
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(5)
<223>蛋白酶切割点
<400>32

<210>33
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>丙型肝炎NS3蛋白酶底物共有
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>可以是T、S或任何酸性氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>可以是任何氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>可以是E、T、I、N、K、D或V
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>可以是C或F
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(6)
<223>蛋白酶切割点
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>可以是任何氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(7)
<223>可以是M或Nleu
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(8)
<223>可以是S或D
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>可以是Y或任何疏水性氨基酸
<400>33

<210>34
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>丙型肝炎NS2-3蛋白酶底物共有
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>可以是任何疏水性氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(4)
<223>可以是任何氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(5)
<223>可以是除P之外的任何氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(6)
<223>蛋白酶切割点
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(6)
<223>可以是任何疏水性或碱性氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(7)
<223>可以是任何氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(8)
<223>可以是除P之外的任何氨基酸
<400>34

<210>35
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>丙型肝炎NS2-3蛋白酶底物共有
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(3)
<223>可以是任何氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(6)
<223>蛋白酶切割点
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>可以是A、V或R
<400>35

<210>36
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>瘟病毒蛋白酶底物共有
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>可以是任何疏水性氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>可以是任何氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>可以是G、N或Q
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(5)
<223>蛋白酶切割点
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(5)
<223>可以是S或A
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(5)
<223>可以是G、A或HB供体
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(7)
<223>可以是N或A
<400>36

<210>37
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>甲型肝炎3C蛋白酶底物共有
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>可以是L或I
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(5)
<223>蛋白酶切割点
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(8)
<223>可以是D或E
<400>37

<210>38
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>甲型肝炎3C蛋白酶底物共有
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(5)
<223>蛋白酶切割点
<400>38

<210>39
<211>4
<212>PRT
<213>蛋白酶切割点
<220>
<223>HRV 3C蛋白酶底物共有
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(3)
<223>蛋白酶切割点
<400>39

<210>40
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HRV 2A蛋白酶底物共有
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>可以是S或T
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>可以是任何疏水性氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(3)
<223>蛋白酶切割点
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>可以是任何疏水性氨基酸
<400>40

<210>41
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肠道病毒3C蛋白酶底物共有
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