体外培养的细胞构建物、制备及应用.pdf

本发明涉及体外培养的细胞构建物，其特征在于所述构建物包括(i)在保证形成三维组织结构的条件下体外培养的动物细胞，和(ii)所述细胞被束缚于其中的一种内源性细胞外基质，并且其特征在于所述细胞构建物在所述细胞中包括具有矿化和/或骨化能力的细胞。本发明尤其适用于移植和植入学(组织重建和修复)领域，以及医药工业，用于组织研究和分析可用于制药学研发和/或药用组合物的分子的毒性或者有益性谱。

1.  体外培养的细胞构建物，其特征在于所述构建物包括(i)在保证形成三维组织结构的条件下体外培养的动物细胞，和(ii)所述细胞被束缚于其中的一种内源性细胞外基质，并且其特征在于所述构建物在所述细胞中包括具有矿化和/或骨化能力的细胞。

2.  根据权利要求1的构建物，其特征在于所述构建物具有的厚度在30和120微米之间，优选在50和120微米之间。

3.  根据权利要求1或者2任一项的构建物，其中动物细胞为哺乳动物细胞，优选为人细胞。

4.  根据权利要求3的构建物，其特征在于动物细胞为未分化的干细胞和/或源于成熟组织的细胞。

5.  根据权利要求4的构建物，其特征在于源于成熟组织的细胞为来自肌肉，骨头，牙齿，软骨，腱和/或韧带，尤其是牙周韧带或者前交叉韧带的细胞。

6.  根据权利要求5的构建物，其特征在于源于牙周韧带的细胞包括成纤维细胞，内皮细胞，成牙骨质细胞，成骨细胞和/或这些不同细胞类型的祖细胞。

7.  根据权利要求4的构建物，其特征在于未分化的干细胞为间充质细胞或者从骨髓提取物分离的细胞。

8.  根据上述权利要求中任一项的构建物，其特征在于所述构建物包括单个细胞类群或者几个细胞类群的组合。

9.  根据上述权利要求中任一项的构建物，其特征在于所述构建物在其厚度中包括相对于培养支持物的一个基层和一个极层，所述基层富含胶原蛋白，还另外包括成纤维细胞和保证矿化和/或骨化作用的祖细胞，并且所述极层比所述基层富含的胶原蛋白少。

10.  细胞构建物或者组织，其特征在于可以通过包括如下步骤的方法获得：在不存在合成的基质或者支架，在保证包括一层或者多层束缚于内源性细胞外基质的细胞的构建物形成的条件下体外培养细胞，以及从其培养支持物脱附构建物，在其自身上叠加或者辗平构建物，从而产生具有增加厚度的重建组织的步骤。

11.  细胞构建物或者组织，其特征在于可以通过包括如下步骤的方法获得：在不存在合成的基质或者支架，在保证包括一层或者多层束缚于内源性细胞外基质的细胞的构建物形成的条件下体外培养来自牙周或者前交叉韧带的细胞，以及优选地，从其培养支持物脱附构建物，在其自身上叠加或者辗平，从而产生具有增加厚度的重建组织的步骤。

12.  细胞构建物或者组织，其特征在于可以通过包括如下步骤的方法获得：在不存在合成的基质或者支架，在保证包括一层或者多层束缚于内源性细胞外基质的细胞的构建物形成的条件，以及在刺激矿化作用或者骨化作用的条件下进行体外培养。

13.  体外培养的细胞构建物，其特征在于所述构建物包括(i)在保证形成三维组织结构的条件下体外培养的动物细胞，和(ii)所述细胞被嵌入(或者束缚于)其中的一种内源性细胞外基质，并且其中其厚度大于或者等于约100μm。

14.  细胞构建物，其特征在于所述构建物包括(i)在保证形成三维组织结构的条件下体外培养的取样自哺乳动物的韧带，腱，牙齿和/或骨头的细胞和(ii)所述细胞被嵌入(或者束缚于)其中的一种内源性细胞外基质，并且其特征在于其厚度大于或者等于约100μm。

15.  细胞构建物，其特征在于所述构建物包括(i)在保证形成三维组织结构的条件下体外培养的取样自哺乳动物的韧带，腱，牙齿和/或骨头的细胞和(ii)所述细胞被嵌入(或者束缚于)其中的一种内源性细胞外基质，特征在于其厚度大于或者等于约100μm并且其特征在于其含有具有矿化能力和/或矿化带的细胞。

16.  制备权利要求1到15任一项的细胞构建物的方法，其特征在于，所述方法包括：
a)将目的细胞培养在适合于合成细胞外基质和形成构建物的条件下，所述构建物包括一层或者多层束缚在新合成的内源性细胞外基质中的细胞的，以及
b)回收构建物。

17.  根据权利要求16的方法，其特征在于所述方法在步骤a)和步骤b)之前还包括下列步骤a’)和b’)：
a’)从一种或者多种组织提取目的细胞，以及
b’)在通常存在抗坏血酸或者其衍生物的合适培养基中扩增所述提取的细胞。

18.  根据权利要求16或者17任一项的方法，其特征在于所述方法还包括回收细胞构建物的步骤c)和人工增加所述构建物厚度的步骤d)，尤其是通过在其自身上叠加，辗平构建物或者收缩构建物的方式进行。

19.  根据权利要求16到18任一项的方法，其特征在于细胞培养在存在选自如下物质的刺激物的条件下：矿化支持物或者材料，所述材料的颗粒，分化因子，条件培养基，合成的物质和/或天然物质。

20.  根据权利要求19的方法，其特征在于矿化支持物或者材料包括羟基磷灰石，生物玻璃，骨替代物，陶瓷，珊瑚或者其表面涂敷了一种上述化合物的复合材料。

21.  根据权利要求19的方法，其特征在于矿化支持物或者材料产生自由能够诱导构建物矿化的物质的表面移植而生物活化的惰性材料。

22.  权利要求1到15任一项的构建物在制备植入物中的应用。

23.  根据权利要求22的应用，其特征在于植入物为牙齿或者韧带植入物。

24.  通过权利要求1到15中任一项的构建物的方式制备植入物的方法，其特征在于所述方法包括将所述构建物辗平在植入物的表面并将与所述构建物相关的所述植入物培养在下述条件下：保持或者刺激细胞全部增殖和/或分化同时促进所述构建物的不同细胞层整合和重建在植入物表面。

25.  权利要求1到15任一项的构建物在体外评价设计用于治疗用途的分子中的应用。

26.  用于制备权利要求1到15任一项的构建物或者用于实施权利要求16到21的任一项的制备方法的试剂盒，包括容器和培养试剂。

27.  药用组合物，其特征在于其包括权利要求1到15任一项的一种细胞构建物，以及一种药用载体。

28.  移植物，其特征在于其包括用权利要求1到15任一项的细胞构建物覆盖的一部分。

体外培养的细胞构建物、制备及应用
背景技术的介绍及描述
本发明涉及生物，生物技术，毒物，药物和医学技术领域。本申请尤其涉及人类和脊椎动物的健康领域。更具体的，本发明描述了体内或者离体培养和重建人或者动物组织的新方法，通常是从组成人或者动物组织的细胞进行培养或者重建。所述方法保持了所用细胞所有的，而且是以需要的方向定向分化的分化能力。本发明同样涉及如此重建的细胞构建物和组织，以及这些构建物或者组织的多种应用。本发明进一步提供了实施所述方法的工具和试剂盒。
本发明尤其适用于移植和植入学(组织重建和修复)领域，以及医药工业，用于组织研究和分析可用于制药学研发和/或药用组合物的分子的毒性或者有益性谱。
组织重建将生物工程技术与调控生命科学的原理相结合，以便理解哺乳动物正常和病理组织的结构和功能的相互关联。一种普遍的目的就是生产用于试验，恢复，保持或者提高体外或者体内生物功能的生物替代物，以及生产与需要重建的天然组织尽可能相似的体外组织或者细胞构建物。
来自高等真核生物的细胞用于实验研究(遗传研究，毒理研究等等)，或者用于药物学或者治疗的目的(细胞治疗，组织修复等)的应用越来越广泛。到目前为止，已经发展了获得细胞或者组织，尤其是主要基于活体解剖的取样和离体处理制备原代细胞培养物的多种方法。
从前描述的组织重建(例如血管重建)的方法主要基于多孔细胞膜或者设计用于支撑或者使来自待重建的组织的细胞培养成为可能的外源合成的支架。此外，虽然在不存在合成的基质或者多孔细胞膜的条件下已经进行了组织培养，但是这种组织培养主要局限在特定的组织并且不具有适合于定向治疗应用的特性。
本发明的概述
本发明想要解决的问题是在所述构建物的细胞来源和所述构建物特性的帮助下，获得能够生物学整合到受试宿主组织中的功能性细胞构建物。在本发明的精神范围内，尤其优选的组织是当移植到宿主时能够表现功能性行为的组织，换言之，能够持久的掺入并整合到所述宿主体内和/或被宿主的细胞逐渐的重塑，从而补偿、修复或者恢复缺陷的特性。
本发明的第一个具体方面涉及包括具有矿化和/或骨化能力的细胞的重建组织或者细胞构建物。
本发明的另一方面涉及能够持久地掺入或者整合到宿主体内并且包括矿化和/或骨化带的重建组织或者细胞构建物。
本发明的组织或者细胞构建物可以以单独或者组合的形式产生自不同的细胞类型，尤其是来自韧带，牙齿，骨头，腱细胞，并且包括将所述细胞束缚于其中的细胞外基质。
本发明的一个具体方面是基于从韧带，尤其是牙周韧带重建的组织。
本发明的另一个具体方面是提供具有高厚度，通常高于或者等于约100μm的重建的组织，尤其是其中的细胞和基质功能性地组织在一起。
本发明大体上涉及从体外培养的动物细胞，优选哺乳动物，例如从人细胞重建的细胞组织(或者构建物)，所述体外培养无需使用用于支撑组织的合成的支架或者基质。因此，细胞构建物优选地仅仅从动物细胞，优选哺乳动物，例如人细胞和内源性细胞外基质组分(也就是从所述细胞生成的)制备而来。
本发明的另一个方面是基于包括诸如上述的重建细胞组织的治疗组合物。尤其是，本发明提供了包括诸如上述的并且设计用于移植到宿主体内的重建组织或者细胞团块的细胞衣(或者生物活性衣)。
本发明还涉及治疗或者组织修复地方法，所述方法包括制备重建的组织并将其植入同源的、异源的或者异种类型的宿主，优选同源类型的宿主。
本发明适用于治疗或者修复受试者的组织缺陷，制备植入体，进行体外或者离体研究等等。
本发明的详细描述
本发明涉及体外制备的细胞构建物，其生成和应用。
本发明的一个特别目的更具体的涉及一种细胞构建物，其中包括：
(i)在保证形成三维组织结构的条件下体外培养的动物细胞，和
(ii)一种所述细胞被束缚于其中的内源性细胞外基质，
并且，其中在所述细胞中包括具有矿化和/或骨化能力的细胞。
在本发明的精神范围内，术语“构建物”或者“细胞构建物”是指展开形式的细胞组织或者聚集体。它可以是包括一层或者多层堆积在在彼此顶端的细胞聚集体或者组织，通常从1到20层细胞，优选从约2到15层细胞。构建物的细胞被束缚在由所述构建物的细胞合成的致密三维细胞外基质中，并且所述三维细胞外基质给本发明的构建物提供了结构和支撑。术语构建物通常是指包括一层或者多层体外培养、束缚在由所述细胞产生的细胞外基质中的细胞的人工组织构建物(即，尤其是体外产生，培养或者保存的)，构建物的细胞具有生物活性，即能够分化，增殖，重建，分泌细胞因子等。根据细胞的来源和培养条件，构建物通常具有极性，具有不同的特性的基面和极面。
矿化
本发明的细胞构建物或者重建组织的一个特别的优点是基于所述的细胞构建物或者重建的组织包括保留了矿化和/或骨化能力的细胞的事实。本申请确实显示出可以人工重建具有矿化能力，从而产生矿化带的组织或者构建物。本发明的这个方面尤其出人意料并且重要，因为它能够构建具有适应缺陷重建的生物学特性和/或显示整合到宿主的极大改良特性的组织。
在本发明的精神范围内，具有矿化/骨化能力的细胞被理解为这些细胞在自然或者特异性刺激后在细胞外基质中产生催化磷酸钙或者碳酸钙或者这些不同离子的混合物通常以颗粒，沉淀，小块形式的形成和/或聚集的酶活。通常，这些细胞在培养条件下以生成无机磷酸盐的方式产生碱性磷酸酶和/或其它蛋白(BMP，BSP，OPN，OCN等)。
本发明显示尽管可以进行培养和/或处理步骤产生构建物，构建物可以从外植体产生，在所述外植体中细胞保持了产生矿化带的能力。
所述矿化通常引起细胞构建物矿化和/或骨化面的形成，所述矿化和/或骨化面通常对应于暴露于培养支持物的位置。如下文所述，所述面也富含胶原。实际上，矿化发生在构建物中存在的胶原纤维中，因此能够使胶原纤维稳固的锚定在矿化沉积上。此外，在培养支撑物附近祖细胞的数目增加并且有助于由基质和胶原网络起始的矿化作用。
本发明的这种特性对于产生修复诸如韧带，腱，牙齿，骨头，关节等的结构的细胞构建物尤其重要和有益，进而产生矿化作用以促进组织的胶原纤维锚定到矿化层中并且产生更加类似于天然组织，尤其是含有胶结物组织的重建组织。
本发明构建物的矿化细胞通常为间充质细胞或者其前体。它们的矿化能力由于培养条件和/或构建物中细胞的处理，和/或由于所述细胞的特异性组织来源得以保留。
细胞组分
如上所述，本发明的重建组织或者构建物优选包括动物细胞，尤其是哺乳动物细胞，优选人类细胞。它们可以是未分化的干细胞或者来源于成熟组织的细胞，或者这些细胞的组合。如果所述细胞取自成熟组织，所述细胞可以是能够尤其是在外来因子的作用下产生细胞外基质和/或保留或者获得矿化和/或骨化能力的任何类型的细胞。因此，参与组织重建的所述细胞可来自不同的细胞群并且进而形成异源细胞群。
例如，它们可以是来源于例如肌肉，骨头，牙齿，软骨，腱或者韧带，尤其是牙齿和韧带，特别是牙周韧带或者前交叉韧带的成熟组织。优选地，当细胞来源于牙周组织时，所述细胞，至少在初始培养时包括来自牙周韧带的细胞，牙骨质和牙本质细胞，也就是，主要是成纤维细胞(约80％)。来自牙周韧带的细胞通常包括成纤维细胞，上皮细胞，成牙骨质细胞，成骨细胞和/或这些不同细胞类型的祖细胞。当所述细胞来自牙齿时，它们包括成牙本质细胞，成牙釉质细胞，髓细胞，上皮细胞，成牙骨质细胞和/或这些不同细胞类型的祖细胞。它也可以是含有多数未分化干细胞的样品，所述的这些未分化干细胞的分化由不同的培养方法进行定向。所述细胞也可为软骨细胞或者成骨细胞。所述细胞可以来源于间充质干细胞和/或分离自骨髓提取物的细胞。然而，例如成骨细胞或者成软骨细胞类型的细胞或者前成骨细胞或者前成软骨细胞类型的所述细胞的前体或者其它获得自骨髓的细胞的存在对于根据本发明获得尤其是存在矿化和/或骨化带的构建物不是必须的。
本发明的组织可包括单细胞类群或者多种细胞类型(或者类群)的组合或者混合，所述的多种细胞类群均一的或者不均一的分布在组织中，从而模拟天然组织的细胞组成和结构。如果存在不同的细胞类型，优选的，至少一种所述细胞类型能够矿化和/或骨化。不具有矿化能力的细胞类型可进一步的以诱导矿化和/或骨化的方式进行诱导或者转化。
也可以诱导构建物的细胞(例如，成纤维细胞)表达天然不存在的化合物，例如通过将其暴露于化学物质，通过实施物理刺激或者通过使用转基因的方法进行。
不同的细胞类群可以在培养的开始阶段，例如以特定的比例，或者顺序的加入，例如通过将几种构建物组合在一起的方式进行组合。
本发明的一个具体目的是如上所述的细胞构建物，由)体外培养的韧带细胞，尤其是来自牙周或者前交叉韧带产生(或者包括)。本发明显示人工矿化组织可以产生自这种类型的细胞，所述的细胞可以进行重建形成致密的构建物，并且表现出功能性生物组织。
内源性细胞外基质
如上所述，本发明的组织或者构建物包括由内源性细胞外基质围绕或者嵌入或者束缚其中的细胞，换言之由培养的细胞产生。细胞外基质通常(并且主要)包括主要组织成为纤丝的胶原蛋白纤维网络，可能参与体内调节原纤维直径的硫酸化蛋白聚糖，以及简单的或者硫酸化的葡糖胺聚糖(GAG)。简单的GAG通常包括透明质酸(HA)，和/或纤连蛋白，并且在硫酸化GAG中特别的例子为，二-透明质酸，0-硫酸-二-软骨素，4-硫酸-二-软骨素，6-硫酸-二-软骨素，4，6-硫酸-二-软骨素，4-硫酸-UA-2S-二-软骨素和/或6-硫酸-UA-2S-二-软骨素。细胞外基质还可以包括核心蛋白聚糖，诸如双糖链蛋白聚糖或者多功能蛋白聚糖，以及尤其是在间充质或者进行修复的组织中发现的基质的一种细胞外糖蛋白，腱生蛋白。用较稀疏的富含III型胶原蛋白和纤连蛋白的基质逐渐填充培养的细胞之间的空隙，然后用I型胶原蛋白重建这种基质使其更致密。
为了实施本发明，细胞外基质的确切组分不需要是已知的。通常，构建物包括能够合成内源性细胞外基质的细胞，其组成类似于初始组织，除非有意识的修饰(例如，通过引入合成的材料，细胞的遗传修饰等)。
在一个具体的实施方案中，本发明涉及如上定义的构建物，包括相关于培养支持物的基层和极层，所述基层富含胶原蛋白还包括成纤维细胞和保证矿化和/或骨化作用的祖细胞，并且所述极层比所述基层的胶原蛋白少，通常包括更多的增殖细胞。
构建物的尺寸
本发明的构建物在面积上以及在厚度上可具有不同的尺寸。此外，本发明的构建物可具有或者适应于不同的形式。根据需要的用途，本领域技术人员或者使用者可以选择不同的尺寸和形式。
本发明的构建物或者组织的一个特别的优选特征在于它们相当大的厚度，通常在30到120微米之间，优选在50到120μm之间，更优选大于或者等于约100μm。实际上，本发明显示可以体外产生具有高厚度的细胞构建物，其中细胞能够组织，分化和增殖，从而在构建物中产生功能极性，而不引起任何的细胞坏死。
所述特征是很有益的，因为所述特征提供了一种重建的组织，其中细胞组织并发展了有益的生物学特征。例如，由于组织增加的厚度，细胞表现的行为不同。尤其是，物质在组织中广泛的扩散，并且由此在细胞环境中的扩散被削弱，从而提高了细胞的潜在作用并导致它们的再组织和重建。这种组织也促进矿化作用，组织的极化作用，增殖层在极面的表达，构建物的支撑和/或在受试者体内的整合。
构建物的厚度可以不同的方式进行改良。优选地，例如通过在其自身上叠加或者辗平更薄的构建物人工进行，从而通过整合和重建不同的细胞层增加其厚度。实际上，本发明显示可以压缩包括大约三层培养获得的细胞的第一个组织构建物，并且所述压缩(例如，叠加，辗平，等)给提供了其中的细胞组织，分化并且发展优良生物学特征的组织。本发明也显示可以将组织或者构建物切割成可以小片可在其自身上叠加或者辗平。也可以通过引起细胞收缩和压缩的脱附构建物的边缘人工增加厚度。
在这个方面，本发明的一个具体目的也基于细胞构建物，其特征在于所述细胞构建物包括(i)在保证三维组织结构形式的条件下体外培养的动物细胞，以及(ii)所述细胞嵌入(或者束缚于)其中的内源性细胞外基质，而且其中其厚度大于或者等于约100μm。
更具体的，所述的构建物含有或者产生自具有矿化能力的细胞，和/或含有或者产生自韧带，腱，牙齿或者骨细胞。
因此，本发明的一个更具体的目的是基于一种细胞构建物，其特征在于所述细胞构建物包括(i)取样自哺乳动物的韧带，腱，牙齿和/或骨头，在保证三维组织结构形式的条件下体外培养的细胞，以及(ii)所述细胞嵌入(或者束缚于)其中的内源性细胞外基质，而且其中其厚度大于或者等于约100μm。
因此，本发明的另一个更优选的目的基于一种细胞构建物，其中所述细胞构建物包括(i)取样自哺乳动物的韧带，腱，牙齿和/或骨头，在保证三维组织结构形式的条件下体外培养的细胞，以及(ii)所述细胞嵌入(或者束缚于)其中的内源性细胞外基质，而且其中其厚度大于或者等于约100μm，并且其中含有具有矿化能力和/或矿化带的细胞。
通常，构建物包括一个基层(面)和一个极层(面)，基层富含胶原蛋白以及矿化带。
如上所示，可以由本领域技术人员通过改变接种细胞的量，培养时间，培养容器的大小等调整构建物或者组织的面积。此外，如上所示，构建物可被切割成小块，其形状应适合构建物随后的应用，例如矩形，正方形，圆形等，面积也应适合所述的应用，例如面积在1和20cm²之间，优选在1和15cm²之间，更优选在2和10cm²之间。
制备
本发明的组织或者构建物可以不同的方式产生。根据一个特别优选的实施方案，本发明的另一个目的是通过如下的典型方法制备细胞构建物：
a)将目的细胞培养在适合于合成细胞外基质和形成包括一层或者多层细胞的构建物，所述一层或者多层细胞束缚在新合成的内源性细胞外基质中，以及
b)回收构建物
所述方法还包括，在步骤a)和步骤b)之前的下列步骤a’)和b’)：
a’)通过任何合适的方法，例如通过酶解，机械处理，外植等从一种或者多种组织提取目的细胞，以及
b’)将在步骤a’)中收获的所述细胞在通常存在抗坏血酸或者其衍生物的合适培养基中进行扩增。
所述方法也包括其它的回收细胞构建物(例如，通过脱附)的步骤c)和通常通过在其自身上叠加(例如顺序叠加)辗平构建物或者收缩构建物人工增加所述构建物厚度的步骤d)。
在步骤a’)中，可以通过任意合适的方法从选择的组织中提取细胞，例如，通过酶解(例如，胶原酶)或者通过使用本领域技术人员公知的外植技术进行。也可以通过机械解剖(例如，用解剖刀)，酶冲洗，调整细胞浓度，机械切割(例如，剪刀)，等进行。这样收获的细胞通常包括具有不同特征的细胞群，例如成熟细胞和祖细胞。所述细胞通常是待重建的组织或者构建物的代表性组成。
然后将这样获得的细胞悬浮在培养基中，从而进行扩增(或者扩大或者增殖)步骤b’)。这个步骤的主要目的是提高细胞的数目从而促进组织的组成。根据细胞的类型，合适的细胞量等该过程可以进行不同的时间段，例如从1到10天，或者更长。使用的培养基通常为下列描述的基础培养基(可能补充了抗坏血酸或者类似的分子)，根据细胞增殖的状况可以每周更换培养基2或者3次。在这个步骤的最后，当细胞实现铺满培养或者约50％铺满培养时，例如通过使用胰蛋白酶处理培养物以脱附吸附的细胞。根据细胞类型或者铺满生长的程度，在培养器中随后进行的或者使组织脱附的时间段可以更长或者更短。例如对于内皮细胞而言为3分钟，对于成纤维细胞而言为5分钟，对于角质细胞而言为8分钟等，(参见实施例)。在这个阶段，细胞只产生少量的细胞外基质。
然后，这样获得的扩增的细胞用于制备构建物。为此，将这些细胞接种在合适的容器中并培养在适合于合成细胞外基质和形成包括一层或者多层束缚于新合成的内源性细胞外基质的构建物的条件下进行培养。
通常，细胞的接种密度(例如在培养皿中)在大约10³和10⁶个细胞/cm²之间，优选在3.10³和5.10⁵个细胞/cm²之间，典型的在3,000和12,000个细胞/cm²之间。在一个典型的试验中，例如人们使用每75cm²的平皿约5.10⁵个细胞。
然后细胞培养足够的时间使得：
-产生需要面积的构建物，包括一层或者多层细胞，典型的1到3层(约30μm厚)，束缚在内源性细胞外基质中，
-将构建物吸附在支持物上，
-在表面上增殖细胞，以及，
-优选地，产生或者起始矿化作用(或者骨化作用)。
所述培养可以进行2到6周，任选地进行温和搅拌，优选地每星期更换培养基1到3次。
为了保证形成细胞外基质，优选在含有抗坏血酸或者其衍生物的基础培养基上进行培养。加入抗坏血酸是为了促进前胶原的脯氨酸水解和分泌，所述前胶原是一种可溶性胶原蛋白前体，而且它是转录后阶段酶活的一种重要的辅因子，而且它还保证I型和III型胶原蛋白合成的上游调节。抗坏血酸可以由一种其合成的衍生物或者由作用细胞外基质合成的营养物代替。由于这种原因，本发明的方法不需要使用外源性基质。
所使用的基础培养基适合于所述的细胞类型，待重建的组织或者构建物。培养基和培养条件应该刺激构建物中细胞的生长和细胞外基质的合成。优选限定组分的培养基，换言之所述培养基不包含动物器官或者组织提取物，虽然根据本发明如果它能够促进构建物的产生，可能存在这些未限定的组分。本领域技术人员公知的合成的或者重组的功能等同物也可以加入限定组分的培养基中。本领域技术人员可以很容易的确定培养动物细胞所需的基本组分。在市售的可用于本发明的培养基中，特别的例子为添加无机盐，能源，氨基酸和维生素B的培养基，诸如DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)，MEM(Minimal Essencial Medium)，RPMI 1640，EDMEM(Isocove’s ModifiedDulbecco’s Medium)，Ham培养基(尤其是Ham’s F-12)或者NCTC109。根据本发明优选的基础培养基为DMEM/Ham F12(50∶50的体积比)的混合物。培养基可以含有血清。基础培养基通常添加诸如氨基酸的化合物，尤其是作为胶原结构组分的脯氨酸和甘氨酸，生长因子，激素和无机盐。用于本发明的具体培养基描述在WO96/21003中。其它培养基描述在实施例中。
可以在任意合适的装置，诸如平板，培养皿，培养瓶，袋子等中进行培养。通常是培养皿或者类似的装置。培养物通常优选保持在能够控制温度，湿度和气体混合的培养箱中。优选的培养条件为，例如约35和40℃之间的温度，优选约37℃，含有5到10％CO₂的气体，和相对湿度在约75和95％之间。
以这种方式产生的组织含有与由所述细胞新合成的细胞外基质的致密三维网络相关的细胞。在这个阶段，相对于抗坏血酸或者其衍生物对细胞的刺激，细胞进行增殖，堆叠并且产生细胞外基质，其组成与天然的细胞外基质基本上相同。当细胞构建物从尤其是衍生自腱或者韧带，皮肤或者真皮的细胞制备而来时，那么在培养约三周后，所述细胞构建物包括大部分的胶原聚集在构建物的尤其是直接接触培养支持物的那半面中。就是在这个胶原网络中启动了矿化作用。
在本发明方法的一个优选的实施方案中，细胞培养在保证形成或者保持细胞矿化(或者骨化)能力的条件下。所述的能力可能相关于所使用的细胞并且受惠于在存在活化或者提高细胞，主要是基础祖细胞的矿化和/或骨化作用的刺激因子的条件下进行的培养。
在一个具体的实施方案中，通过改良培养条件以令人惊讶的方式实现了组织的矿化作用。所述矿化作用涉及新合成的基质，尤其是组成与培养支持物接触的一半构建物的基质。可以通过将构建物或者细胞与特别的材料或者与所述材料的颗粒接触，通过添加分化因子，条件培养基，合成的物质或者通过添加诸如珊瑚的天然物质或者通过机械刺激产生刺激。可使用的矿化材料的例子通常包括如下组分的支持物或者颗粒：羟基磷灰石，生物活性玻璃(或者生物玻璃)，矿化胶原替代物，骨替代物，尤其是基于锌的陶瓷，，或者珊瑚或者任意的其表面至少部分涂敷了一种所述组分的材料(例如，一种组成材料)。例如，矿化材料也可以产生自通过表面移植能够诱导构建物矿化的物质生物活化的惰性材料。可使用的物质或者因子的例子包括，例如添加到培养基中并且加强由所选择的支持物(细胞因子，地塞米松，β-甘油磷酸盐，β-氨基丙腈)产生的矿化刺激作用的辅助剂。
在一个优选的实施方案中，本发明包括制备矿化的或者矿化细胞构建物的方法，包括如下步骤：将细胞与刺激物接触刺激细胞的矿化或者矿化能力，所述刺激物为诸如矿化支持物或者材料，所述材料的颗粒，分化因子，细胞因子，条件培养基，合成的物质或者天然的物质。优选的刺激由优选包括羟基磷灰石或者生物玻璃的矿化支持物或者材料诱导。最终，生物玻璃的水合作用引起其吸收作用，并且当待重建的组织用于移植时，这种类型的支持物特别适用并且优选，因为最终只有移植物保留在受体宿主中。
因此，本发明的一个具体目的是基于制备重建的细胞组织或者构建物的方法，所述方法包括将细胞体外培养在保证细胞外基质合成和矿化的培养条件下。在一种优选的方式中，在存在诸如矿化处理剂或者支持物的刺激物的条件下进行的培养，优选地在矿化支持物或者在存在矿化颗粒的条件下培养。根据本发明，具有矿化带的构建物的产生不需要加入诸如例如TGF-β1的生长因子。
本发明的一个具体目的也涉及一种构建物或者细胞组织，其特征在于可以通过在不存在合成的基质或者支架，在保证包括一种或者多种束缚于内源性细胞外基质的构建物形成的条件下，以及在刺激矿化或者骨化作用的条件下，体外培养细胞的方法获得。
通常，矿化作用在与构建物形成和细胞外基质合成的相同时间进行或者启始。然而，通常矿化作用在构建物重建和/或其人工加厚后继续进行。
因此，本发明的一个具体目的包括在存在矿化剂，例如微米或者纳米生物玻璃或者羟基磷灰石颗粒的条件下，正好在培养的开始放置培养的细胞。所述试剂促进祖细胞的迁移并且刺激它们的矿化和/或骨形成能力。
这种矿化和/或骨化尤其引起重建的组织或者细胞构建物整合到受体宿主组织的有益改进。
可以用例如锰铬铬合金钢或者von Kossa染色观察矿化作用。作为具体的实例，以大约5,000个细胞/cm²的密度接种的牙周细胞可在存在羟基磷灰石微粒子的条件下培养约3周(参见图5)。培养的细胞识别刺激物和产生碱性磷酸酶的特异性酶。例如类似β-甘油磷酸盐的磷酸化底物可被水解。它们可释放能够通过与钙离子复合形成磷酸钙诱导组织的部分结晶化。
如上所述，可以通过任何合适的设备产生组织或者构建物，诸如平板，培养皿，培养瓶，袋子等。通常为培养皿或者类似的装置。优选地，在不存在合成的三维基质或者支架的条件下进行制备。
本发明的一个具体的目的是基于制备重建的构建物或者组织的方法，所述方法包括在保证细胞外基质合成的条件下体外培养来自牙周或者交叉韧带的细胞。
一旦产生构建物，可以通过任何已知的技术，通常通过脱附从支持物回收构建物。事实上，本发明的一个特征就是通过从其培养支持物简单的脱附所述构建物可以很容易的回收重建的细胞构建物。
此外，在辅助步骤d)中，回收的构建物或者组织可通常通过叠加，辗平，聚集等从提高其厚度的角度进行处理(例如，压缩)。通常，在人工增加前，细胞构建物的厚度相当于在彼此顶部堆叠的约2或者3层细胞，或者约30μm。实际上，通常保持细胞的培养直到所述细胞分泌足够量的基质以提供细胞构建物的最少支持物。因此可以在不撕碎的条件下从其培养支持物脱附细胞构建物，并且产生具有提高厚度的细胞构建物，例如相对于较薄的培养的构建物增加2到5倍。
本发明的一个具体目的也涉及细胞构建物或者组织，其特征在于可以通过如下方法产生，所述方法包括在不存在合成的基质或者支架，在保证包括一层或者多层束缚于内源性细胞外基质的构建物形成的条件下体外培养细胞，以及从其培养支持物脱附构建物，在其自身上叠加或者辗平，从而产生具有增加厚度的重建组织的步骤。
本发明的另一个具体目的也涉及细胞构建物或者组织，其特征在于可以通过如下方法产生，所述方法包括在不存在合成的基质或者支架，在保证包括一层或者多层束缚于内源性细胞外基质的构建物形成的条件下体外培养牙周或者前交叉韧带细胞，以及优选地从其培养支持物脱附构建物，在其自身上叠加或者辗平的步骤，从而产生具有增加厚度的重建组织。
通常在存在培养基的条件下，本发明的构建物可以培养不同的时间段，以促进细胞的再组织，持续的矿化等。然后，构建物或者组织可用于临床(移植，植入)或者药用。
储藏/保藏
本发明的构建物或者组织可以在培养基，营养培养基或者等渗盐溶液的存在下，储藏在任意合适的装置中。通常，组织储藏或者保藏在培养皿，试管，培养瓶，安瓿瓶，袋子等中，优选存在大量的培养基。组织可以随时使用或者优选储藏在低温下。
应用
上述的构建物或者组织可用于移植或者植入学领域，以及制药工业，用于研究组织以及分析分子尤其是候选药物制剂的毒性或者有益性谱。
因此，本发明的组织或者构建物可用于移植和植入学领域，在这种情况下，组织或者构建物优选具有较高的厚度，通常约100μm。优选地，为致密的组织，例如通过如上所述的整合和重建不同的细胞层或者简单的从支持物上脱附形成细胞的聚集物，在其自身上叠加或者辗平从而增加厚度。
对于组织修复的应用而言，本发明的构建物可以细胞衣或者“膜片”的形式使用，或者包上或者覆盖待导入受试者体内的全部或者部分植入体。
本发明的组织或者细胞构建物可以直接用于移植。本发明实际上提供了主要包括如上所述细胞聚集物的细胞衣的产生。因此本发明的一个目的尤其就是基于包括如上所述构建物或者组织的药用组合物。在一个优选的方式中，它是如上所述的厚的或者致密的组织。在简单的手术过程中，细胞衣可以直接施用于孔穴或者损伤的组织。例如，如果组织是从牙周细胞重建的，本发明的细胞衣可用于治疗牙周袋。如果是韧带细胞的情况，它可以重建或者修复例如，诸如前交叉韧带的韧带。如果组织是从保留了矿化和/或骨化能力的软骨细胞重建的，也可以直接在受试者宿主的感染部位观察到移植。
因此，本发明也提供了组织修复或者治疗的方法，所述方法包括通过如上所述的体外培养制备重建的组织，以及可能在包裹到任何的药用溶液或者载体后注射所述组织。在本发明中，组织可任选地与外源基质，诸如胶原蛋白相连。
在其它实施方案中，本发明的组织或者构建物被用于制备植入物，尤其是覆盖或者包裹所有或者部分的植入物。可以是牙齿植入物(参见涉及“韧带植入物”的实施例4)，韧带植入物、骨或者软骨假肢，等。在这种情况下，产生的构建物通常围绕着移植物的结构排列或者辗平。
牙齿植入物可例如包括附着待移随的牙齿的牙冠的冠状部分，以及相应于所述牙齿的牙根的牙根部分，围绕者这个部分根据本发明可以辗平细胞构建物。因此，本发明涉及通过诸如上述的构建物的方式制备植入物的方法，所述方法包括将所述构建物辗平在植入物的表面并且将与所述构建物相关的植入物培养在保证细胞所有增殖和/或分化的保持或者激活，同时促进所述构建物的不同细胞层在植入物表面的整合和重建的条件下。
尤其是，所述构建物可以从在上述条件下培养约3周的牙周细胞重建(也参见图4)。然后，相对于暴露于培养支持物的细胞构建物的矿化表面直接暴露于在扩增培养基并且存在抗坏血酸中的植入物。然后，细胞构建物的这一面能够使得完整的构建物以稳定，牢固并且尤其是优选的方式附着到植入物上，尤其是由于能够围绕所述植入物数量增加的祖细胞，并且促进由基质和胶原网络启动的矿化作用。如此重建的结构非常类似于牙齿的天然牙骨质。至于考虑到扩增培养基，如果促进构建物的不同细胞层的整合和重建，那么就不用施加营养限制。因此，本发明的矿化组织全面地提高了植入物在受试者牙槽部位的整合。
所以，本发明的构建物可用于制备，例如牙齿或者韧带植入物。
本发明的另一个目的涉及本发明的细胞组织或者构建物在药物工业中的应用，用于研究组织以及分析分子的毒性或者有益性谱。在一个具体的实施方案中，本发明重建的组织(或者其部分)与一种或者多种试验化合物接触，并且确定所述试验化合物的效果，例如从而鉴定对所述试验化合物的细胞反应。
试验化合物性质上可能有显著的不同。例如，它可以是分离的化合物或者是物质的混合物。化合物在性质上可以是化学的或者生物学的。尤其是，可以是肽，多肽，核酸，脂，碳水化合物，化学分子，植物提取物，组合文库等。试验化合物可以是施用于组织的处理(辐射，UV等)。
为了实施本发明的方法，由使用者选择试验化合物可以采用不同的浓度。
因此，本发明具有如上所述的重建的组织的应用目的，用于评价(体外或者离体)试验化合物，尤其是用于治疗应用的分子的生物学和/或毒理学特征。
如上所述的重建组织的应用目的还包括筛选用于治疗应用的分子。
本申请还包括实施制备和研究的方法的试剂盒并且也用于如上所述重建的组织的应用。这种试剂盒优选包括容器和/或培养试剂，和/或如上所述的组织构建物。
本发明的其它方面和优点将在下列实施例中更详细的描述，这些实施例的给出只是说明而非限制的目的。
附图说明
图1：以5,000个细胞/cm²的密度接种在J2(A)上，培养3周后(B)，从牙周韧带提取的细胞。细胞扩增，叠加并合成细胞外基质。
图2：在100mm直径的培养皿中静息培养3周后构建物的大致照片。
图3：矿化组织。锰铬铬合金钢染色显示矿化沉积。
图4：根据本发明牙齿植入物及其与组织的关联。
图5：通过加入羟基磷灰石处理牙周袋矿化的组织。在存在羟基磷灰石微颗粒的条件下培养牙周细胞3周。新近合成的胶原蛋白基质含有矿化沉积(von Kossa染色)。
图6：根据本发明的方法，从培养在羟基磷灰石支持物表面，并且移植在无胸腺的小鼠(Swiss nu/nu小鼠)的皮肤下12周的牙周韧带细胞(来自cemento amelar junction的细胞)制备的构建物的组织切片(放大倍率×100)。在去矿化后石蜡包埋样品并用三色Masson染色。
在“细胞”部分细胞核表现为黑点。与羟基磷灰石支持物接触的矿化基质的胶原纤维(Sharpey纤维)和蛋白相应于标记为“HA”的多孔团状物。
产生的组织结构类似于正常牙齿中发现的纤维性细胞牙骨质。
图7：这个图显示了由单层组成的组织，进行免疫组化标记以检测V型胶原蛋白。浅灰色表示相反的颜色，深灰色是标记的V型胶原蛋白。
图8：这个图显示了叠加或者辗平以后与图7相同的组织。标记图谱显示已经发生了重建(在组织中没有保留每次叠加的极性)。浅灰色表示相反的颜色，深灰色是标记的V型胶原蛋白。
实施例
材料和方法
使用的培养基和/或试剂(例如，维生素C，抗坏血酸2-磷酸盐，胶原酶，地塞米松，等)通常来源于市售或者可以从市售获得。通常，这些试剂在使用前已经进行了灭菌。
胶原酶A(梭菌肽酶A)是由溶组织梭菌产生的一种细菌蛋白酶。这种蛋白酶显示出对于胶原蛋白三链螺旋中发现的Pro-X-Gly-Pro(X代表中性氨基酸)序列中的X-Gly的特异性条带。胶原蛋白酶不被血清抑制，而由EDTA抑制，并且由钙激活。其最适pH值在6和8之间。在冷冻干燥的情况下，在+2和+8℃之间是稳定的，在-15和-25℃的溶液中是稳定的。胶原蛋白酶在含有钙的诸如PBS，HBSS或者DMEM/F12的缓冲液中可以重新形成。
地塞米松是一种糖皮质激素，分子量为392.5，其增加了碱性磷酸酶的水平。它可以从市售获得(Sigma D-2915)。
β-甘油磷酸盐分子量为216，为了有效矿化的需要由碱性磷酸酶水解成磷酸离子。它可以从市售获得(Sigma D-9891)。
为了制备和控制培养基，等量的试剂在水浴中解冻并在放入层流净化罩下之前进行灭菌。利用无菌技术将其加入液体DMEM/F12培养基中。
在使用前1到2天制备不含抗生素的培养基，用于控制无菌状态。然后混合并控制。在使用前加入抗生素。通过传统的方法进行细菌试验。在+2和+8℃之间进行保藏。
合成的培养基