制备棘白菌素衍生物的方法.pdf

本发明涉及制备式(I)化合物的方法，如右式其中R如说明书所定义，以及它们的盐、它们的中间体、它们的二盐酸盐作为药物的用途和含有它们的药物组合物。

1.  制备式(I)化合物的方法，

其中R代表含有至多30个碳原子的直链或支链或环状链，任选含有一个或多个杂原子和一个或多个杂环，包括下列步骤：
a)使式(II)化合物，

与式R-CO₂H的酸作用，所述酸视情况而定呈分离或非分离的活化形式，以便得到式(III)化合物，

b)视情况而定使式(III)化合物在PPTS存在下通过式Alk-OH醇的作用而在5位进行醇的烷基化反应，其中Alk代表含有1至4个碳原子的烷基，以便得到式(III’)化合物，

c)使式(III)或(III’)化合物进行脱水反应，以便得到式(IV)化合物，

d)使式(IV)化合物在还原剂如路易斯酸存在下的NaBH₃CN，或NaBH(OCOR’₃)存在下通过乙二胺的作用而进行还原胺化反应，其中OCOR’代表Boc-L-Pro、Bzl-L-Pro或任何其它光学活性氨基酸以及任何其它手性或非手性羧酸，以便得到如上所定义的式(I)化合物，该化合物中活性异构体之一占多数，然后视情况而定以任何合适的顺序对所述式(I)化合物进行一个或多个下列操作：
-色谱分离，
-结晶，
-与碱作用，
-成盐。

2.  权利要求1所定义的方法，其中式(I)、(III)、(III’)或(IV)化合物含有代表下列基团的R基团：


3.  权利要求1所定义的方法，其中式(I)、(III)、(III’)、(IV)化合物含有代表下列基团的R基团：


4.  制备式(Ia)化合物的方法：

包括下列步骤：
a)使式(II)化合物，

与式C₈H₁₇-O-Ph-Ph-CO₂H的酸作用，所述酸视情况而定呈分离或非分离的活化形式，以便得到式(IIIa)化合物，

b)视情况而定使式(IIIa)化合物在PPTS存在下通过甲醇的作用而在5位进行醇的烷基化反应，以便得到式(IIIa’)化合物，

c)使式(IIIa)或(IIIa’)化合物进行脱水反应，以便得到式(IVa)化合物，

d)使式(IVa)化合物在还原剂如与TiCl₄偶联的NaBH₃CN、NaH(Boc-L-pro)₃或NaH(Bzl-L-Pro)₃存在下通过乙二胺的作用而进行还原胺化反应，以便得到如上所定义的式(Ia)化合物，该化合物中活性异构体之一占多数，对所述式(Ia)化合物进行一个或多个下列操作：
-色谱分离，
-结晶，
-与碱作用，
-与盐酸作用而成盐。

5.  根据权利要求4的方法，其特征在于：对式(Ia)化合物接连进行下列操作：
a)使用有机溶剂、水和三氟乙酸的混合物经硅胶色谱、然后经反相色谱纯化，以便得到式(Ia)化合物的三氟乙酸盐；
b)与碱作用、例如与碳酸氢钠水溶液作用，以便得到碱形式的式(Ia)化合物；
c)与盐酸作用而成盐，以便得到相应的盐，即式(Ia)化合物的二盐酸盐。

6.  根据权利要求1至5中任一项的方法，其特征在于：酸的活化反应在五氟苯酚、N-羟基琥珀酰亚胺或任选N-羟基苯并三唑存在下进行。

7.  根据权利要求1至5中任一项的方法，其特征在于：在分离的活化酸存在下的酰化反应在二异丙基乙基胺存在下进行。

8.  根据权利要求1至5中任一项的方法，其特征在于：活化反应和随后在非分离的活化酸存在下的酰化反应在N-甲基吡咯烷酮和DMTMM存在下进行。

9.  根据权利要求1至5中任一项的方法，其特征在于：脱水反应在AIBB和视情况而定的MgI₂存在下进行。

10.  根据权利要求1至7中任一项的方法，其特征在于：脱水反应在HBr-AcOH和MgI₂存在下进行。

11.  根据权利要求9和10的方法，其特征在于：得自脱水作用的产物通过从DMF/丙酮或DMF/AcOEt混合物中结晶而纯化。

12.  根据权利要求1至5中任一项的方法，其特征在于：还原胺化反应在选自与TiCl₄偶联的NaBH₃CN，NaH(Boc-L-pro)₃和NaH(Bzl-L-Pro)₃的还原剂存在下进行。

13.  通过权利要求1至4和6至8中任一项所定义的式(II)化合物的酰化反应而制备式(III)或(IIIa)化合物的方法。

14.  通过权利要求1至4和9至11中任一项所定义的式(III)、(III’)、(IIIa)或(IIIa’)化合物的脱水反应而制备式(IV)或(IVa)化合物的方法。

15.  通过权利要求1至4和12中任一项所定义的式(IV)或(IVa)化合物的还原胺化反应而制备式(I)或(Ia)化合物的方法。

16.  4S或4R形式或立体异构体混合物形式的1-[4-[(2-氨基乙基)氨基]-N2-[[4’-(辛氧基)-[1，1’-联苯基]-4-基]羰基]-L-鸟氨酸]-4-[4-(4-羟基苯基)-L-苏氨酸]-5-L-丝氨酸棘白菌素B的二盐酸盐。

17.  能够通过权利要求1至15中所述方法得到的活性异构体A形式的1-[4-[(2-氨基乙基)氨基]-N2-[[4’-(辛氧基)-[1，1’-联苯基]-4-基]羰基]-L-鸟氨酸]-4-[4-(4-羟基苯基)-L-苏氨酸]-5-L-丝氨酸棘白菌素B的二盐酸盐。

18.  作为药物的权利要求16或17所定义的1-[4-[(2-氨基乙基)氨基]-N2-[[4’-(辛氧基)-[1，1’-联苯基]-4-基]羰基]-L-鸟氨酸]-4-[4-(4-羟基苯基)-L-苏氨酸]-5-L-丝氨酸棘白菌素B的二盐酸盐。

19.  作为抗真菌药物的权利要求16或17所定义的1-[4-[(2-氨基乙基)氨基]-N2-[[4’-(辛氧基)-[1，1’-联苯基]-4-基]羰基]-L-鸟氨酸]-4-[4-(4-羟基苯基)-L-苏氨酸]-5-L-丝氨酸棘白菌素B的二盐酸盐。

20.  药物组合物，含有权利要求1 6或17所定义的1-[4-[(2-氨基乙基)氨基]-N2-[[4’-(辛氧基)-[1，1’-联苯基]-4-基]羰基]-L-鸟氨酸]-4-[4-(4-羟基苯基)-L-苏氨酸]-5-L-丝氨酸棘白菌素B的二盐酸盐和可药用载体。

21.  作为中间体化合物的权利要求1和6所定义的式(III’)或式(IIIa’)化合物。

22.  作为中间体化合物的式(IV’)化合物，其中R如权利要求1至2中任一项所定义，或式(IVa’)化合物，此时R代表基团Ph-Ph-OC₈H₁₇，

制备棘白菌素衍生物的方法
本发明的主题是制备棘白菌素衍生物的方法、中间体、所得产物和它们作为抗真菌药物的用途。
现有技术中已知多种具有抗真菌活性的化合物。具体而言，可提及国际申请WO 99/29716中所定义的棘白菌素衍生物。
本发明的目的是提供制备棘白菌素衍生物的新方法并得到后者的新盐。
棘白菌素可以以两种称作异构体A和异构体B的差向异构体形式存在，这两种异构体对应于4位取代基的R和S构型。本发明的主题之一是在该方法中主要得到这两种异构体之一，即至少大于50％(称作A型的异构体，对应于式(I)的药理学活性化合物)，这与WO 99/29716的方法不同，在后者中，经色谱柱纯化前在方法中所得的活性异构体A占少数。
此外，本发明的另一目的是避免中间产物的色谱纯化并得到结晶产物，这使得产率显著改进。
因此，本发明的主题是制备式(I)化合物的方法，

其中R代表含有至多30个碳原子的直链或支链或环状链，任选含有一个或多个杂原子和一个或多个杂环，包括下列步骤：
a)使式(II)化合物，

与式R-CO₂H的酸进行作用，其中R如上所定义，所述酸视情况而定呈分离或非分离的活化形式，以便得到式(III)化合物，

b)视情况而定使式(III)化合物在PPTS存在下通过式Alk-OH醇的作用而在5位进行醇的烷基化反应，其中Alk为含有1至4个碳原子的烷基，以便得到式(III’)化合物，

c)使式(III)或(III’)化合物进行脱水反应，以便得到式(IV)化合物，

d)使式(IV)化合物在还原剂如路易斯酸存在下的NaBH₃CN，或NaBH(OCOR’₃)存在下通过乙二胺的作用而进行还原胺化反应，其中OCOR’代表Boc-L-Pro、Bzl-L-Pro或任何其它光学活性氨基酸以及任何其它手性或非手性羧酸，以便得到如上所定义的式(I)化合物，该化合物中活性异构体之一占多数，然后视情况而定以任何合适的顺序对所述式(I)化合物进行一个或多个下列操作：
-色谱纯化，
-结晶纯化，
-与碱作用，
-成盐。
优选地，本发明的主题是前面所定义的方法，其中式(I)、(III)、(III’)或(IV)化合物含有代表下列基团的R基团：

优选地，本发明的主题是前面所定义的方法，其中式(I)、(III)、(III’)或(IV)化合物含有代表下列基团的R基团：

式(II)化合物根据国际申请WO 99/29716第18页(制备2，“去氧牟伦多菌素核”)中所述方法制备。
式R-CO₂H酸的活化根据本领域熟练技术人员已知的标准方法进行(Journet M.等人，J.Org.Chem.(1999)，64，2411-2417；P_chiauer P.等人，Tetrahedron 54(1998)3489-3494；Kunushima等人，Tetrahedron(1999)55 13159-13170)。具体地使用了五氟苯酚，以得到活化的五氟苯酚酯，将该酯在用于胺的酰化反应之前分离。另一方法是使用N-羟基琥珀酰亚胺(任选N-羟基苯并三唑)，以得到活化的N-羟基琥珀酰亚胺(任选羟基苯并三唑)酯，也将该酯分离。
接下来为得到式(III)化合物的酰化步骤在碱存在下根据本领域熟练技术人员已知的方法进行，并且在下文所述实施例中阐述。还可在不分离活性酯和不添加碱的情况下通过在氯化4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基-吗啉鎓(DMTMM)存在下操作而进行该酰化。该后一替代方案的优点在于省去了分离步骤，从而改进了产率。
为得到式(IV)化合物的式(III)化合物的脱水步骤可按以下方式进行：
-脱水步骤在氢卤酸如HBr存在下、在MgI₂存在下进行。该情况下，不必经由式(III’)中间体。
-通过方法变型，可期望在进行脱水步骤之前将5位的羟基烷基化。例如甲基化可以用甲醇在PPTS(对甲苯磺酸吡啶鎓)存在下进行，以便得到式(III’)化合物，其中Alk代表甲基。
-最后，该脱水反应还可在α-乙酰氧基异丁酰溴(AIBB)存在下于二氧杂环己烷中进行。在后一种情况下，该操作可在MgI₂存在下对式(III’)化合物或直接对式(III)化合物进行。
优选地，然后将脱水反应后得到的化合物从DMF(二甲基甲酰胺)/MeCN(乙腈)混合物中结晶纯化。还可使用下例溶剂的混合物：DMF/丙酮和DMF/AcOEt(乙酸乙酯)。
为得到式(I)棘白菌素的式(IV)化合物的还原胺化反应根据文献所述且本领域熟练技术人员已知的方法进行(Yamada K.等人，J.Chem.Soc.Perkin Trans I(1983)265-270；Hutchins R.等人，Org.prep.Proc.Int.11(5)(1979)201-246)。具体地在与TiCl₄或任何其它路易斯酸偶联的NaBH₃CN存在下或在NaBH(OCOR’₃)存在下使用乙二胺，其中OCOR’代表Boc-L-Pro、Bzl-L-Pro或任何其它光学活性氨基酸以及任何其它手性或非手性羧酸。
将还原剂NaBH₃CN与路易斯酸、尤其是TiCl₄偶联对于选择性而言是必备要素，从而得到其中活性异构体A占多数的异构体A和异构体B的混合物。通常，得到的异构体A的比例大于70％、具体地为为80至85％。该情形与上述其它试剂相似。
特别地，对于式(Ia)化合物，在该步骤中得到的异构体A/异构体B比例分别为80至85％/20至15％，而WO 97/29716所述方法得到的混合物中异构体A占少数或半数(外消旋A和B混合物)。
在还原胺化步骤中，可视情况而定在还原前将反应中间体分离，因此该中间体也是本发明的主题。它是式(IV’)或(IV’a)的咪唑烷，

此时R代表-Ph-Ph-O-C₈H₁₇基团。
可以期望通过色谱法或通过重结晶将所得一种或多种产物纯化。该操作根据本领域熟练技术人员已知的常规方法进行。当所得产物在色谱分离之后具体地为三氟乙酸盐形式时，可以期望通过碱的作用消除该盐，以便得到碱形式的式(I)化合物。
成盐反应根据本领域熟练技术人员已知的常规方法进行。盐酸盐或二盐酸盐的制备在盐酸存在下于甲醇中进行。
非常特别的是，本发明的主题是制备式(Ia)化合物地方法：

包括下列步骤：
a)使式(II)化合物，

与式C₈H₁₇-O-Ph-Ph-CO₂H的酸进行作用，所述酸视情况而定为活化的分离或非分离形式，以便得到式(IIIa)化合物，

b)视情况而定使式(IIIa)化合物在PPTS存在下通过甲醇的作用而在5位进行醇的烷基化反应，以便得到式(IIIa’)化合物，

c)使式(IIIa)或(IIIa’)化合物进行脱水反应，以便得到式(IVa)化合物，

d)使式(IVa)化合物在还原剂如与TiCl₄偶联的NaBH₃CN、NaH(Boc-L-pro)₃或NaH(Bzl-L-Pro)₃存在下通过乙二胺的作用而进行还原胺化反应，以便得到如上所定义的式(Ia)化合物，该化合物中活性异构体之一占多数，以合适的顺序对所述式(Ia)化合物进行一个或多个下列操作：
-色谱纯化，
-结晶，
-与碱作用，
-与盐酸作用而成盐。
可发现式(Ia)化合物为称作异构体A或异构体B的两种差向异构体(4位的不对称碳)的混合物形式。根据如上所定义的方法得到的式(I)化合物可以以约70-85％/30-15％的异构体A/异构体B混合物的形式存在。
在还原胺化反应之后进行的纯化/结晶和成盐步骤可选择性地得到式(Ia)化合物的活性差向异构体A。
优选地，式(Ia)化合物经硅胶色谱、然后经反相色谱、使用有机溶剂、水和三氟乙酸的混合物纯化，以便得到式(Ia)化合物的三氟乙酸盐。然后使该盐与碱作用例如与碳酸氢钠水溶液作用，以便得到碱形式的式(Ia)化合物。然后，使所得碱与盐酸作用而成盐，以便得到相应的盐，即式(Ia)化合物的二盐酸盐。
因此，本发明的非常特别主题是前面所定义的方法，其特征在于：对式(Ia)化合物接连进行下列操作：
a)使用有机溶剂、水和三氟乙酸的混合物经硅胶色谱纯化、然后经反相色谱纯化，以便得到式(Ia)化合物的三氟乙酸盐；
b)与碱作用例如与碳酸氢钠水溶液作用，得到碱形式的式(Ia)化合物；
c)与盐酸作用而成盐，得到相应的盐，即式(Ia)化合物的二盐酸盐。
因此，本发明非常特别的主题是前面所定义的方法，其特征在于：酸的活化反应在五氟苯酚、N-羟基琥珀酰亚胺或任选N-羟基苯并三唑存在下进行。
因此，本发明非常特别的主题是前面所定义的方法，其特征在于：在分离的活化酸存在下的酰化反应在二异丙基乙基胺存在下进行。
因此，本发明非常特别的主题是前面所定义的方法，其特征在于：活化反应和随后在分离的活化酸存在下的酰化反应在N-甲基吡咯烷酮和DMTMM存在下进行。
因此，本发明非常特别的主题是前面所定义的方法，其特征在于：脱水反应在AIBB和视情况而定的MgI₂存在下进行。
因此，本发明非常特别的主题是前面所定义的方法，其特征在于：脱水反应在HBr-AcOH和MgI₂存在下进行。
因此，本发明非常特别的主题是前面所定义的方法，其特征在于：得自脱水作用的产物通过从二甲基甲酰胺(DMF)/乙腈、DMF/丙酮或DMF/AcOEt混合物中结晶而纯化。
因此，本发明非常特别的主题是前面所定义的方法，其特征在于：还原胺化反应在选自与TiCl₄偶联的NaBH₃CN，NaH(Boc-L-pro)₃和NaH(Bzl-L-Pro)₃的还原剂存在下进行。
因此，本发明的主题还有4S或4R形式或两种立体异构体混合物形式的1-[4-[(2-氨基乙基)氨基]-N2-[[4’-(辛氧基)-[1，1’-联苯基]-4-基]羰基]-L-鸟氨酸]-4-[4-(4-羟基苯基)-L-苏氨酸]-5-L-丝氨酸棘白菌素B的二盐酸盐。
前述方法使得通过色谱法分离各异构体之前可得到占多数的式(I)或(Ia)化合物的异构体A。
因此，本发明的主题还有由前述方法得到的活性异构体A形式的1-[4-[(2-氨基乙基)氨基]-N2-[[4’-(辛氧基)-[1，1’-联苯基]-4-基]羰基]-L-鸟氨酸]-4-[4-(4-羟基苯基)-L-苏氨酸]-5-L-丝氨酸棘白菌素B的二盐酸盐。
本发明的主题还有作为药物并尤其作为抗真菌药物的、4S或4R形式或两种立体异构体混合物形式的1-[4-[(2-氨基乙基)氨基]-N2-[[4’-(辛氧基)-[1，1’-联苯基]-4-基]羰基]-L-鸟氨酸]-4-[4-(4-羟基苯基)-L-苏氨酸]-5-L-丝氨酸棘白菌素B的二盐酸盐。
最后，本发明的主题是含有4S或4R形式或两种立体异构体混合物形式的1-[4-[(2-氨基乙基)氨基]-N2-[[4’-(辛氧基)-[1，1’-联苯基]-4-基]羰基]-L-鸟氨酸]-4-[4-(4-羟基苯基)-L-苏氨酸-S-L-丝氨酸棘白菌素B的二盐酸盐和可药用载体的药物组合物。
在WO 99/29716中，制备了碱或三氟乙酸盐形式的1-[4-[(2-氨基乙基)氨基]-N2-[[4’-(辛氧基)-[1，1’-联苯基]-4-基]羰基]-L-鸟氨酸]-4-[4-(4-羟基苯基)-L-苏氨酸]-5-L-丝氨酸棘白菌素B(实施例14)。该二盐酸盐的优点是具有更好的稳定性和水中的溶解性。而且，该二盐酸盐是优选的可药用盐，即为本发明的主题。
实施例1
1-[4-[(2-氨基乙基)氨基]-N2-[[4’-(辛氧基)-[1，1’-联苯基]-4-基]羰基]-L-鸟氨酸]-4-[4-(4-羟基苯基)-L-苏氨酸]-5-L-丝氨酸棘白菌素B的二盐酸盐
I)第一阶段：将式(II)化合物酰化，得到式(III)化合物
1-[(4R，5R)-4，5-二羟基-N2-[[4’-(辛氧基)-[1，1’-联苯基]-4-基]羰基]-L-鸟氨酸]-4-[4-(4-羟基苯基)-L-苏氨酸]-5-L-丝氨酸棘白菌素B
路线1：经由分离的五氟苯酚的活化酯
步骤1：活化酯的制备
4’-辛氧基-联苯基-4-甲酸五氟苯基酯
将100g 4-辛氧基联苯基-4’-甲酸和62g五氟苯酚引入1L二氯甲烷中。搅拌15分钟，并在15分钟内加入69.6gN，N’-二环己基碳二亚胺的500mL二氯甲烷溶液。将深褐色的悬液在室温下搅拌20分钟。过滤二环己基脲并浓缩滤液。通过规律添加乙醇至蒸气温度为74℃，蒸馏至恒定体积。将反应介质冷却至室温，然后搅拌1小时，过滤，之后用乙醇洗涤。干燥后，得到晶体形式的145.7g期望产物。
产率：96.5％
NMR(CDCl₃)：8.23-7.72(AA’BB’)4H；7.01-7.60(AA’BB’)4H；4.02(t)2H；1.82(五重峰)2H；1.48(五重峰)2H；1.32(m)8H；0.89(t)3H。
步骤2：酰化
引入60mL DMF中的23.2g式(II)化合物(根据WO 99/29716的制备2制备的“去氧牟伦多菌素核”)和14.1g以上所得的酯。将6.7mL二异丙基乙基胺引入该悬液中，并在氮气氛和室温下搅拌24小时。将该均相反应介质在10分钟内倾入1L水中，同时适度搅拌，将该悬液搅拌2小时，过滤并用水洗涤固体。将该固体在真空和室温下干燥，然后于100mL二氯甲烷中在氮气氛下回流，同时搅拌2小时(40℃)，之后在1小时内冷却至室温，搅拌1小时，过滤固体，将该固体用二氯甲烷冲洗三次，并在真空和室温下干燥。得到米色固体形式的26.9g期望产物。
产率：91.5％
TLC：Rf：0.13硅胶板；UV 254nm显影；洗脱剂：CH₂Cl₂-MeOH-水：86-13-1
NMR：(DMSO)
苏氨酸：8.16(1H)，4.85(1H)，4.41(1H)，1.13(3H)；γ-羟基脯氨酸：4.42(1H)，1.92-2.28(2H)，4.44(1H)，3.86-3.70(2H)；β-羟基高酪氨酸7.36(1H)，4.23(1H)，4.20(1H)，2.53-2.46(2H)，6.98(2H)，6.68(2H)；丝氨酸：7.40(1H)，4.86(1H)，3.66-3.60(2H)；β-羟基-γ-甲基脯氨酸：4.27(1H)，4.03(1H)，2.38(1H)，0.99(3H)，3.25-3.93(2H)；鸟氨酸：7.98(1H)，5.16(1H)，3.96(1H)，8.54(1H)，4.44(1H)，1.98(2H)；芳族和辛氧基链：7.98(2H)，7.71(2H)，7.68(2H)，7.02(2H)，4.00(2H)，1.72(2H)，1.41(2H)，1.28(2H)，1.25(2H)，1.31(2H)，1.27(2H)，0.86(3H)。
路线2：经由分离的HOSu的活化酯
步骤1：活化酯的合成
4’-辛氧基-联苯基-4-甲酸2，5-二氧代-吡咯烷酯
引入9.3g辛氧基联苯基甲酸、93mL二氯甲烷、3.8g N-羟基琥珀酰亚胺和6.3g EDC，并在室温下搅拌3小时。加入6mL水，搅拌10分钟，之后滗析并用45mL二氯甲烷反萃取。将有机相用水洗涤(3×45mL)并经硫酸钠干燥。真空干燥后，得到晶体形式的12.05g期望产物。
产率：99.9％
NMR：CDCl₃：8.2-7.65(AA’BB’)4H；7.6-6.97(AA’BB’)4H；4.02(t，2H)；2.93(宽)4H；1.83(五重峰2H)；1.45(m)2H；1.3(m)8H；0.9(t)3H。
步骤2：酰化
将1.43g如上制备的琥珀酰亚胺酯溶解于6mL DMF中。引入2.42g“去氧牟伦多菌素核”(根据WO 99/29716的制备2制备)和0.66mL二异丙基乙基胺。将该溶液在室温下搅拌18小时。引入35mL水并在室温下搅拌2小时。过滤后，在反应容器中搅拌2小时将固体溶于30mL水中，之后过滤并用水冲洗。将固体在真空和室温下干燥，得到米色固体形式的2.75g期望产物。
产率：98.2％
路线3：用DMTMM直接活化的合成法
将2.8g去氧牟伦多菌素(根据WO 99/29716的制备2制备)溶解于8.3mL N-甲基吡咯烷酮中。加入1.12g辛氧基联苯基甲酸和0.95g氯化4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基-吗啉鎓(DMTMM)。在室温下搅拌24小时后，在搅拌下将反应介质倾入133mL水中。搅拌20分钟，将固体过滤并用水冲洗三次(3×7mL)。在真空和40℃下干燥后，得到米色固体形式的2.66g期望产物。
产率：73.5％
II)第二阶段：脱水(得到式(IVa)化合物)
1-[N2-[4’-(辛氧基)-[1，1’-联苯基]-4-基]羰基]-4-氧代-L-鸟氨酸]-4-[4-(4-羟基苯基)-L-苏氨酸]-5-L-色氨酸-棘白菌素B
路线1：经由式(IIIa’)化合物
步骤1：烷基化
1-[(4R，5R)-4-羟基-5-甲氧基-N2-[[4’-(辛氧基)-[1，1’-联苯基]-4-基]羰基]-L-鸟氨酸]-4-[4-(4-羟基苯基)-L-苏氨酸]-5-L-丝氨酸棘白菌素B(IIIa’)
将283g第一阶段中所得的产物IIIa溶解于5.67L甲醇中。在搅拌下一次性加入22.7g对甲苯磺酸吡啶鎓，并在回流(42℃)下搅拌6小时，在室温下搅拌12小时。真空浓缩至两个残余物体积，然后加入1.2升水。将悬液搅拌18小时。过滤固体并用水冲洗两次。在烘箱中于真空和室温下干燥后，得到米色粉末形式的270.5g期望产物。
产率：94.2％
NMR：(DMSO)
苏氨酸：8.11(1H)，4.84(1H)，4.41(1H)，1.11(3H)；γ-羟基脯氨酸：4.40(1H)，1.91-2.27(2H)，4.42(1H)，3.67-3.87(2H)；β-羟基-高酪氨酸：7.32(1H)，4.22(1H)，4.18(1H)，2.51-2.44(2H)，6.96(2H)，6.65(2H)，9.03(1H)；丝氨酸：7.36(1H)，4.87(1H)，3.58-3.63(2H)；β-羟基-γ-甲基脯氨酸：4.32(1H)，4.05(1H)，2.37(1H)，1.00(3H)，3.27-3.94(2H)；鸟氨酸：7.88(1H)，4.94(1H)，4.06(1H)，8.50(1H)，4.43(1H)，3.16(3H)；1.93-2.03(2H)；芳族和辛氧基链：7.97(2H)，7.70(2H)，7.65(2H)，7.02(2H)，4.00(2H)，1.73(2H)，1.43(2H)，1.32(2H)，1.27-1.28(6H)，0.87(3H)。
步骤2：脱水
将265.3g以上所得的甲氧基化产物(IIIa’)溶解于5.3L二氧杂环己烷中。在20分钟内加入71.8mLα-乙酰氧基异丁酰溴(AIBB)。将该介质搅拌7小时。在15分钟内加入4.1L饱和碳酸氢钠(NaHCO₃)水溶液。搅拌15分钟，并在真空和不超过30℃的温度下蒸馏二氧杂环己烷。加入3.2L水并在室温下搅拌15小时。过滤固体并用水冲洗2次。在烘箱中真空干燥后，得到赭色固体形式的251.2g期望产物。
产率：97.5％
将该产物根据下述制备法结晶。
路线2：从第一阶段中所得产物(IIIa)开始，与AIBB/MgI₂/二氧杂环己烷作用
将23.26g无水碘化镁悬浮于500mL二氧杂环己烷中并搅拌30分钟。引入12.25mLα-乙酰氧基异丁酰溴(AIBB)，并将赭色悬液在室温下搅拌45分钟。在1小时内加入50g第一阶段中所得产物(IIIa)溶解于400mL二氧杂环己烷中的溶液，并用25mL二氧杂环己烷冲洗该添加漏斗。将该悬液在室温下搅拌19小时。在30分钟内引入5g碳酸氢钠溶解于50mL水中的溶液(添加结束时pH为5-6)。搅拌2小时，之后在内部温度低于35℃下真空蒸馏至残余体积为250mL。重新使氮压达到大气压，加入200mL二甲基甲酰胺，之后真空蒸馏至残余体积为250mL，并将该溶液在室温下倾入2.8L水中。用DMF冲洗后，搅拌1小时。过滤固体并用水冲洗。将固体在真空和30℃下干燥24小时。得到米色固体形式的46g期望产物。
产率：：98.6％
然后将该产物根据下述方法结晶。
路线3：从第一阶段中得到的产物IIIa开始，与HBr-AcOH/MgI₂/MEK作用
将10g阶段I)所得的产物溶解于180mL甲乙酮(MEK)中。引入4.65g无水碘化镁和10mL MEK。在室温下搅拌35分钟，然后冷却至20℃。引入3mL 33％的HBr的AcOH溶液。将该悬液在20℃下搅拌4小时。加入10mL饱和NaHCO₃(碳酸氢钠)水溶液。在20℃下搅拌1小时(溶解)。将该溶液在2小时内倾入700mL水中，同时在真空和40℃下蒸馏MEK。蒸馏进行至残余体积为430mL。加入100mL水，继续蒸馏至残余体积为430mL。重复该操作两次。使该悬液达到室温并搅拌过夜。将固体过滤并用水洗涤3次，每次用50mL。在真空和室温下干燥后，得到米色粉末形式的9.3g期望产物。
将该产物根据下述方法结晶纯化。
产率：94.5％，不考虑溶剂。
以上所得式(IVa)产物(路线1、2或3)的结晶
将10g 1-[N2-[4’-(辛氧基)-[1，1’-联苯基]-4-基]羰基]-4-氧代-L-鸟氨酸]-4-[4-(4-羟基苯基)-L-苏氨酸]-5-L-色氨酸-棘白菌素B(以上路线1、2或3所得)在1小时内在搅拌和室温下溶解于30mL二甲基甲酰胺(DMF)中。引入51mg引发剂(根据路线1、2或3得到产物的晶体)并搅拌2小时。然后在2小时内逐步引入67mL乙腈。在引入结束时，搅拌19小时，之后过滤并用乙腈冲洗三次，每次用10mL。在真空和室温下干燥后，得到白色晶体形式的7.10g期望产物。
产率：71％
TLC：Rf＝0.28
硅胶60F₂₅₄，UV 254nm
流动相：CH₂Cl₂/MeOH/水86/13/1
NMR：(DMSO)
苏氨酸：7.94(1H)，4.50(1H)，4.25(1H)，1.18(3H)；γ-羟基脯氨酸：4.39(1H)，1.93-2.20(2H)，4.40(1H)，3.85-3.71(2H)；β-羟基高酪氨酸：7.53(1H)，4.06(1H)，4.25(1H)，2.44-2.53(2H)，6.96(2H)，6.66(2H)，9.06(1H)；丝氨酸：7.74(1H)，4.96(1H)，3.72(2H)；β-羟基-γ-甲基脯氨酸：4.33(1H)，3.98(1H)，2.31(1H)，0.99(3H)，3.26-4.0(2H)；鸟氨酸：8.37(1H)，3.84-3.64(2H)，8.11(1H)，4.83(1H)，2.82-3.11(2H)；芳族和辛氧基链：7.91(2H)，7.69(2H)，7.66(2H)，7.02(2H)，4.02(2H)，1.74(2H)，1.43(2H)，1.32-1.28(6H)，1.28(2H)，0.87(3H)。
III：第三阶段：将式(IVa)化合物还原胺化，得到式(Ia)化合物
1-[4-[(2-氨基乙基)氨基]-N2-[[4’-(辛氧基)-[1，1’-联苯基]-4-基]羰基]-L-鸟氨酸]-4-[4-(4-羟基苯基)-L-苏氨酸]-5-L-丝氨酸棘白菌素B
路线1：
将8g根据阶段II得到的式(IVa)化合物和2.52mL乙二胺溶解于80mL四氢呋喃(THF)中，同时在氮气和室温下搅拌30分钟至1小时。在30分钟内引入0.36g四氯化钛溶解于80mL THF中的溶液。搅拌1小时，之后冷却至5℃。加入溶解于16mL THF中的3.2mL冰醋酸。在5℃下搅拌1小时，然后冷却至0℃，在15分钟内加入1.04g氰基硼氢化钠溶解于24mLTHF中的溶液。使反应介质在30分钟内升温至5℃并在该温度下搅拌30分钟。然后升温至室温，同时搅拌3小时，之后真空蒸馏至体积为40mL，加入7.2g碳酸氢钠溶解于80mL水中的溶液，真空蒸馏至残余体积为80mL，然后加入32mL甲醇和128mL乙酸乙酯。搅拌10分钟，之后滗析，用乙酸乙酯/甲醇混合物对水相进行反萃取，并在真空下蒸馏所有有机相至残余体积为40mL。引入40mL DMF，继续蒸馏至残余体积为60mL。将该溶液在20分钟内倾入320mL水中，并在室温下搅拌15小时。必要时用稀苏打将pH调节至9-9.5，之后过滤并用1.2g碳酸氢钠的水溶液(pH9-9.5)冲洗。将固体于烘箱中在真空和30℃下干燥18小时后，得到白色固体形式的8.55g期望的粗碱。
产率：100％
异构体比例A/B＝80/20
路线2：
在搅拌和氮气氛下将10g阶段II)所得的式(IV)产物引入600mL THF中。然后依次加入20g 3_分子筛、3.16mL乙二胺和110.4g三-苄基-L-脯氨酸硼氢化钠。将该均相溶液在室温下搅拌6小时，之后将分子筛过滤并用THF冲洗。将滤液在真空和低于40℃的内部温度下蒸馏至干。将600mL饱和碳酸氢钠水溶液缓慢加至所得树脂上，同时搅拌。将20g HyflosupercelKieselgühr过滤剂加入该悬液中，并在室温下搅拌16小时，之后过滤并用水洗涤。通过使100mL甲醇通过四次将滤饼溶解。将甲醇滤液在真空和不超过40℃的温度下浓缩至干。得到21.25g期望产物。
路线3：
还原胺化反应的中间体(式IV’a)的分离
1-[4-[N，N’-咪唑烷]-N2-[[4’-(辛氧基)-[1，1’-联苯基]-4-基]羰基]-L-鸟氨酸]-4-[4-(4羟基苯基)-L-苏氨酸]-5-L-丝氨酸棘白菌素B
将阶段II)中所得的式(IVa)产物在40mL二氯甲烷和0.32mL乙二胺中的悬液搅拌18小时。加入80mL乙醚并搅拌5小时。将固体过滤并用乙醚冲洗几次。于烘箱中在真空和室温下干燥15小时后，得到白色固体形式的0.76g期望化合物。然后使该中间体进行前面路线1或2的还原反应。该分离的化合物是新化合物并且构成本发明的组成部分。
产率：73％
MASS：(FAB)MH⁺1100；MNa⁺：1122
NMR：苏氨酸：8.51(1H)，4.72(1H)，4.38(1H)，1.20(3H)；γ-羟基脯氨酸：4.37(1H)，1.90-2.22(2H)，4.42(1H)，3.88-3.66(2H)；β-羟基-高酪氨酸：7.46(1H)，4.17(1H)，4.17(1H)，2.46(2H)，6.96(2H)，6.65(2H)；丝氨酸：7.47(1H)，4.84(1H)，3.65-3.60(2H)；β-羟基-γ-甲基脯氨酸：4.22(1H)，3.93(1H)，2.29(1H)，0.95(3H)，3.22-3.90(2H)；鸟氨酸：7.45(1H)，2.72-3.51(2H)，9.55(1H)，4.28(1H)，1.63-2.12(2H)；咪唑烷：2.63-2.94(2H)；2.78-3.02(2H)；芳族和辛氧基链：7.87-7，72(2H，2H)，7.66(2H)，7.03(2H)，4.02(2H)，1.72(2H)，1.27、1.32、1.43(4×2H)，1.29(2H)，0.88(3H)。
IV)：第四阶段：前面所得的式(Ia)化合物(根据路线1、2或3)的色谱纯化和两种异构体A和B(A或B对应于4位的立体异构体R或S)的分离
1-[4-[(2-氨基乙基)氨基]-N2-[[4’-(辛氧基)-[1，1’-联苯基]-4-基]羰基]-L-鸟氨酸]-4-[4-(4-羟基苯基)-L-苏氨酸]-5-L-丝氨酸棘白菌素B的二-三氟乙酸盐
利用二氯甲烷(43)-乙腈(50)-甲醇(7)-水(5)-三氟乙酸(1)混合物作为流动相，以将2.5g Merck 11763硅胶填充Prochrom LC 200柱并使之平衡。将24g以上所得的化合物(阶段III，路线1)溶解于126mL由乙腈(50)-甲醇(7)-水(5)-TFA(1)组成的混合物中。将该溶液过滤并加入86mL二氯甲烷。将该溶液注入柱中。以76L/h的流速并在14巴的压力下洗脱。在280nm处进行检测，之后在真空和不超过40℃的内部温度下蒸馏收集的各级分。得到36.75g产物，为固体二-TFA盐的形式。
异构体比例A/B＝99.3/0.7
V)：第五阶段：二-三氟乙酸盐的色谱纯化(除去其它盐)
利用水(90)-乙腈(10)-三氟乙酸(0.1)混合物作为流动相，以300g反相Daisogel SP 120n°5/1502硅胶填充Prochrom LC 50柱并使之平衡。将以上第一次色谱分离中所得的36.75g盐溶解于含57.3mL水(90)-乙腈(10)-三氟乙酸(0.1)和26.8mL纯乙腈的混合物中。将该溶液过滤并将其注入柱中。首先用水(90)-乙腈(10)-三氟乙酸(0.1)洗脱以除去无机盐，然后用水(50)-乙腈-(50)-三氟乙酸(0.1)洗脱以除去产物。将收集的各级分在真空和不超过40℃的内部温度下蒸馏。将所得的清澈水溶液冻干。得到15.59g期望产物，为絮状白色固体的二-TFA盐的形式。
异构体比例A/B＝99.4/0.6
两次色谱分离的累积产率：53.8％
氨基还原的产率：28.7％
VI)第六阶段：返回到碱
1-[4-[(2-氨基乙基)氨基]-N2-[[4’-(辛氧基)-[1，1’-联苯基]-4-基]羰基]-L-鸟氨酸]-4-[4-(4-羟基苯基)-L苏氨酸]-5-L-丝氨酸棘白菌素B
将14.37g以上所得的冻干的二-三氟乙酸盐形式的化合物溶解于143.7mL水中。在氮气下搅拌15分钟，并在15分钟内在室温下加入57.5mL饱和碳酸氢钠水溶液。搅拌17小时。加入430mL乙酸乙酯/甲醇的8/2混合物并搅拌15分钟。滗出上层有机相并用288mL乙酸乙酯(8)-甲醇(2)混合物对水相进行反萃取。将各有机相合并、小心滗析并在真空和不超过35℃的温度下蒸馏至干。向干萃取物中加入143.7mL水，并将该悬液搅拌30分钟，之后过滤并用水洗涤，直至不再有氟化物。在将固体于真空和40℃下干燥后，得到白色粉末形式的10.91g期望产物。
产率：91.6％
微量分析：(水：8.8％)