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本发明属于基因工程和化学领域，涉及一种4-乙酰二氮烯喹啉衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。寻找新型的低副作用抗肿瘤药物是生物医药领域的一大热点。本发明提供了小分子化合物1-[2-(3-乙氧苯基)喹啉-4-基]-2-{[4-甲氧基-3-(吗啉甲基)苯基]二氮烯}乙酮在制备抗肿瘤药物中的应用。该化合物能够明显抑制肿瘤细胞的增殖，并且，该化合物是针对细胞靶点CYPJ蛋白结构设计的，对于高表达CYPJ蛋白的肿瘤细胞效果特别明显。因此，本发明的小分子化合物作为新的抗肿瘤药物进行开发，抑瘤效果明显，特异性好。

1.  一种4-乙酰二氮烯喹啉衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征是，该4-乙酰二氮烯喹啉衍生物是1-[2-(3-乙氧苯基)喹啉-4-基]-2-{[4-甲氧基-3-(吗啉甲基)苯基]二氮烯}乙酮。

2.  如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述4-乙酰二氮烯喹啉衍生物的分子量为524.61，其分子结构如

所示。

3.  如权利要求1所述的应用，其特征在于，该抗肿瘤药物为针剂或者片剂。

4.  如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物是抗肝癌药物。

5.  一种抑制肿瘤细胞增殖的方法，其特征在于，将权利要求1所述的4-乙酰二氮烯喹啉衍生物加入肿瘤细胞的培养液中。

6.  如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤细胞是HepG2细胞、SK-Hep1细胞或者7721细胞。

一种4-乙酰二氮烯喹啉衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明涉及化工领域及医药领域，涉及一种4-乙酰二氮烯喹啉衍生物在制备抗肝癌药物中的应用。
背景技术
亲环素Cycliphilins(CyPs)是普遍分布的细胞内蛋白，在植物、细菌和哺乳动物中均存在，具有高度保守性，最初是作为环孢素A的细胞受体被发现的。环孢素A(CyclosporinA，CsA)是从真菌代谢产物中分离得到的含11个氨基酸的环状多肽，是一种用于器官移植和自身免疫性疾病的免疫抑制剂，已被广泛用于临床，年销售额在50亿美元以上。由于CsA用于临床以来表现出各种毒副作用，对患者及移植物存活率的影响越来越引起人们的重视，许多科学研究者正在努力寻找与CsA作用类似的、毒副作用低的替代物。目前CsA也已经开始用于肿瘤治疗当中，并且主要是与其它抗癌药物如紫杉醇、阿霉素、长春新碱等搭配使用，增强这些药物的抗肿瘤活性(Clin Cancer Res.11，2320-2326)。因为环孢菌素A同时也是极为有效的免疫抑制剂，因此用于这些疾病的治疗时不可避免会带来免疫抑制的副作用。克服免疫抑制的方法主要两种，一是对环孢菌素A的免疫抑制基团进行修饰，或者从真菌中提取非免疫抑制的环孢菌素衍生物；另一种方法是根据CYP蛋白的结构，筛选或设计新的非肽类小分子抑制剂。
CyPs广泛分布于从微生物到哺乳动物的各类物种中。Cyclophilin A(CyPA)是首先从牛的胸腺细胞中发现的CyP家族中第一个成员，并验证它具有PPIase活性(Science，226，544-547；Nature 337，473-478)。重组人T细胞的cyclophilinA(hCyPA)的三维结构及它与CsA、四肽及一些二肽形成的复合物的三维结构已有报道(Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.88，9483-9487；J.Mol.Biol.228，539-550；J.Mol.Biol.234，1119-1130.；Nature，353，276-279；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88，3324-3328；Biochemistry，35，7362-7368)。CyPA与HIV相关蛋白质的复合物的结构也已报道(Cell，87，1285-1294；Structure 5，139-146)。CyP家族的其他成员与CyPA具有序列同源性及三维结构类似的特性(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90，11850-11854；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91，5183-5186；J.Mol.Biol.331，45-56)。
CyPJ是CyP家族的新成员，CYP-J cDNA长1.25Kb，编码161个氨基酸，已从人的胎脑cDNA文库中分离并鉴定(Cytogenet.CellGenet.92，231-236)。在氨基酸序列上与线虫(C.elegans.)CYP10具有72％的同源性。其具体核苷酸和氨基酸序列详见NCBI网站上基因登陆号为AF146799的基因报告。CYPJ蛋白能促进肝癌细胞的克隆形成率，可以促进肝癌细胞物质的复制增殖，并且能促进肝癌肿瘤细胞生长，因此，可以作为筛选抗肝癌药剂的靶标。
恶性肿瘤已成为人类致死的最重要原因之一，但是目前市售的抗肿瘤药物均有各种不良反应，因此，寻找新型的低副作用抗肿瘤药物成为生物医药领域的一大热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种4-乙酰二氮烯喹啉衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明提供了一种4-乙酰二氮烯喹啉衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，它是一种CypJ小分子抑制剂，具体而言，本发明的4-乙酰二氮烯喹啉衍生物是1-[2-(3-乙氧苯基)喹啉-4-基]-2-{[4-甲氧基-3-(吗啉甲基)苯基]二氮烯}乙酮(即1-[2-(3-ethoxyphenyl)quinolin-4-yl]-2-{[4-methoxy-3-(morpholinomethyl)phenyl]diazenyl}ethanone)，在本发明中简称为FD8。
本发明的4-乙酰二氮烯喹啉衍生物，其分子量为524.61，结构式为：

先前对于本发明的FD8的研究主要集中在其是一种CypJ抑制剂，BIAcore分子互作仪验证其能与CypJ结合，其平衡—解离常数KD(M)：7.05±0.13×10^-6，Chi²＝0.263。其中，Chi²是BIAcore统计软件中用于检测实验误差的一个数据。其次，通过α-胰凝乳蛋白酶活性测定法(α-chymotrypsin-coupled enzymic assay)测得本发明的1-[2-(3-乙氧苯基)喹啉-4-基]2-{[4-甲氧基-3-(吗啉甲基)苯基]二氮烯}乙酮，其酶活抑制IC₅₀值(μM)为14.17±0.53。本发明中，酶活抑制IC₅₀值是指抑制酶活性50％时所需的药物浓度。
我们以不加小分子抑制剂的反应作为对照反应，测定小分子配体在不同浓度下对酶活反应的抑制率，从而计算出小分子配体的酶活抑制IC₅₀值。
进一步的研究表明，本发明的CypJ小分子抑制剂FD8对肿瘤细胞(肝癌细胞HepG2细胞、SK-Hep1细胞、7721细胞等)生长有抑制作用。
本发明测定了FD8对SK-Hep1细胞的杀伤情况，结果显示，FD8对肝癌细胞有一定程度的杀伤力。此外，FD8还能够有效降低SK-Hep1细胞的克隆形成率。研究表明，HepG2、7721和SK-CYPJ细胞加入FD8后都可以引起G0-G1期细胞增多，S期细胞减少，G2-M期无明显变化，尽管程度有差别，但是趋势是一致的。S期是细胞物质合成周期，S期减少，说明FD8可以抑制细胞物质的复制增殖。从而认为本发明的FD8有抑制肝癌细胞增长的作用。
因此，本发明的FD8能够抑制CYPJ的活性或者表达量，既可以用于制备抗肝癌药物。
本发明的小分子化合物可以采用各种常规的制备方法制备。例如，采用人工化学合成的方法。
利用本发明小分子化合物，通过各种常规筛选方法，可筛选出与FD8发生相互作用的物质，如受体、抑制剂或拮抗剂等。
本发明及其抑制剂、拮抗剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。
以本发明的人FD8为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的人FD8可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的FD8还可与其他治疗剂一起使用。
本发明的FD8在制备抗肿瘤药物中的应用中，可以是针剂或者片剂。
当本发明的人FD8多肽被用作药物时，可将治疗有效剂量的该多肽施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
更好的，本发明的FD8可以应用于制备抗肝癌药物。
本发明还提供了一种杀伤肿瘤细胞的方法，即将FD8加入肿瘤细胞的培养液中。具体的方法可以采用实施例4中所采用的方法，或者其它常规的操作。
本发明中，所述的肿瘤细胞可以是HepG2细胞、SK-Hep1细胞或者7721细胞。结果表明，本发明的FD8对于肿瘤细胞，尤其是如HepG2细胞、SK-Hep1细胞或者7721细胞等的肝癌细胞杀伤效果非常明显。
本发明提供了小分子化合物1-[2-(3-乙氧苯基)喹啉-4-基]-2-{[4甲氧基-3-(吗啉甲基)苯基]二氮烯}乙酮在制备抗肿瘤药物中的应用。该化合物能够明显抑制肿瘤细胞的增殖。FD8是针对细胞靶点CYPJ设计的药物，不易形成耐药性，而且，对于高表达CYPJ蛋白的肿瘤细胞效果特别明显。因此，本发明的小分子化合物作为新的抗肿瘤药物进行开发，抑瘤效果明显，特异性好。因此，本发明的FD8可以作为新的抗肿瘤药物进行开发，为治疗和治愈肿瘤提供了一种新的途径和手段。
具体实施方式
实施例1CypJ小分子抑制剂的虚拟筛选
在PDB蛋白结构数据库中，检索到了人类CYPA蛋白的X光衍射晶体结构(PDB代码：1CWA)。这个结构是CYPA与其天然抑制剂环孢菌素A(CsA)的复合物晶体结构。从这个结构中，确定了CYPA的活性位点，并且确定了活性位点中，能够被CsA所抑制的若干关键氨基酸位点。根据CYPJ与CYPA高度同源的序列，我们与中国科学院上海药物所合作，建立了3D结构模型，并且在此后的蛋白结晶及结构解析时也得到了证实(CYPJ PDB代码：1XYH)。针对CypJ活性位点，对若干小分子数据库进行了筛选。用于筛选的小分子数据库主要包括SPECS和CNPD。最后筛选到了本发明的FD8。整个计算过程是在中科院上海药物所64CPU-SGI ORIGN3800计算机和上海超算中心392CPU-神威I超级计算机上进行的。
实施例2利用BIAcore分子互作仪验证虚拟筛选结果
BIAcore分子互作仪是基于表面等离子共振技术来实现跟踪生物分子间的相互作用，无需任何标记物，因此最大限度的保证了实验结果的真实性。实验时，将目的生物分子(CypJ蛋白)固定在传感芯片表面，然后将小分子化合物溶于溶剂并且流过芯片表面。监测器能实时跟踪检测溶液中的分子与芯片表面目的生物分子结合、解离整个过程的变化。通过BIAcore的结合数据，我们最终计算出了本发明的1-[2-(3-乙氧苯基)喹啉-4-基]2-{[4-甲氧基-3-(吗啉甲基)苯基]二氮烯}乙酮与CypJ结合的平衡—解离常数KD(M)：7.05±0.13×10^-6，Chi²＝0.263。其中，Chi²是BIAcore统计软件中用于检测实验误差的一个数据。
实施例3利用酶活实验证明小分子化合物对CypJ酶活抑制的能力
测定CyP活性的方法很多，但以α-胰凝乳蛋白酶活性测定法(α-chymotrypsin-coupled enzymic assay)最常用。其原理是含脯氨酸的寡肽底物，如N-琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe对硝基苯胺(N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phep-nitroanilide)在溶液中其顺式、反式结构处于平衡，CyP能催化该底物发生顺反异构作用，即催化脯氨酸由顺式变为反式；当其处于反式结构时，C端p-nitroanilide被α-胰凝乳蛋白酶裂解，释放出色素基团对硝基苯胺，在390nm连续测定吸光值的变化即可得知CyP的PPIase活性。
我们以不加小分子抑制剂的反应作为对照反应，测定小分子配体在不同浓度下对酶活反应的抑制率，从而计算出小分子配体的IC₅₀值。本发明的1-[2-(3-乙氧苯基)喹啉-4-基]-2-{[4-甲氧基-3-(吗啉甲基)苯基]二氮烯}乙酮(Interchim公司，AK-968/15603640)其酶活抑制IC₅₀值(μM)为14.17±0.53。
实施例4 FD8对肿瘤细胞生长的抑制作用
1MTS法测定FD8对SK-Hep1细胞的生长抑制作用
人肝癌细胞株SK-Hep1细胞(ATCC公司)2～5×10³/孔接种至96孔板，培养24小时使之贴壁后加入FD8(Interchim公司，AK-968/15603640)，设6个浓度梯度，每个浓度设3个复孔。细胞在37℃，5％ CO₂条件下培养72小时后，倒掉培养液，用MTS试剂盒(Promega公司)测定细胞存活率，测试方法为：将细胞用无血清培养基洗一遍，按照100μl/well的量加入预先配制好的MTS显色溶液(10ml无血清培养基中加入2ml溶液1和100μl溶液2，充分混匀)。将一个没有细胞的孔设为本底孔，用以校正溶液的背景光吸收。把细胞放入细胞培养箱中继续培养2～4小时，然后用酶标仪读取光吸收值(参考波长630-700nm，测定波长490nm)，计算细胞存活率，以测定孔光吸收值/对照孔光吸收值作为细胞存活率的数值。
结果：1-[2-(3-乙氧苯基)喹啉-4-基]-2-{[4-甲氧基-3-(吗啉甲基)苯基]二氮烯}乙酮对SK-Hepl细胞的半数抑制浓度IC₅₀值为29.32±9.06(ug/ml)。
其中，半数抑制浓度IC₅₀值是指抑制细胞生长50％时所需的药物浓度。
2FD8对细胞周期的影响
人肝癌细胞株HepG2细胞(ATCC公司)、7721细胞(ATCC公司)以及SK-CYPJ稳定细胞株(本室构建及保存)3×10⁵/皿接种于60mm细胞培养皿中，培养24小时使之贴壁后加入FD8。37℃CO₂培养箱培养48hr。将细胞培养液和细胞一起收集到细胞离心管中，1000rpm离心10min，弃上清。细胞用2ml预冷的1×PBS洗1次，1000rpm离心10min，弃上清。用70％预冷的乙醇4℃固定2hr或者更长(过夜也可以)。1000rpm离心10min，小心吸掉上清。用500-1000μl PI染液重悬，室温暗处染色20min，过滤膜后用流式细胞仪检测细胞周期变化情况。
结果显示，加入FD8后的HepG2和7721细胞都可以引起G0-G1期细胞增多，S期细胞减少，G2/M期无明显变化。而对于CYPJ蛋白表达量高的稳定株细胞SK-CYPJ效果更明显。
表1 FD8对HepG2细胞周期的影响

表2 FD8对7721细胞周期的影响

表3 FD8对SK-CYPJ细胞周期的影响

由上述三张表可见，FD8对肝癌细胞周期影响的趋势是一致的，程度有差别。对测得的FD8对HepG2细胞的周期影响进行统计分析，用t检验方法，结果显示G0-G1期和S期加入FD8与对照相比两者有显著差异，p<0.01，而在G2-M期无显著差异，p>0.05。用相同的方法分析FD8对7721和SK-CYPJ细胞的影响，结果与上相似，说明加入FD8后可以引起HepG2、7721和SK-CYPJ细胞G0-G1期增多，S期减少，而对G2-M期影响较小。S期是细胞物质合成周期，S期减少，说明FD8可以抑制细胞物质的复制增殖，尤其是能够明显抑制肝癌细胞的增殖。
3 FD8对克隆形成率的影响
SK-Hep1细胞(ATCC公司)1000个/皿接种于60mm细胞培养皿，一组加入FD8，另一组加入DMSO作为对照。连续培养15-20天时间，中间酌情换液。用室温1×PBS洗一次，加2ml预冷的甲醇4℃固定10min。弃去固定用的甲醇，用预冷的1×PBS洗一次，加GIMESA染色剂，室温染色10min，清水洗3遍，去浮色，拍照、计数。
根据细胞数目确定克隆大小，大于200个细胞的称为大克隆，100-200个细胞之间的称为中克隆，50-100个细胞之间的称为小克隆。比较大中克隆之间的差异，重复2次每次三皿取平均值，加入FD8后SK-Hep1细胞所形成的克隆数显著少于加入DMSO后所形成的克隆数。这些结果提示，FD8能抑制细胞克隆形成。
表4 宿主细胞SK-HeD1的大中克隆数