曼氏无针乌贼皮下荧光标记方法及其专用试剂 【技术领域】
本发明涉及一种水生动物的标记方法及其专用试剂，特别涉及曼氏无针乌贼皮下荧光标记方法及其专用试剂。
背景技术
曼氏无针乌贼曾是我国渔场的四大渔业之一，对温度的适应性较强，在我国沿海分布很广，是一种经济价值很高的传统渔业种类。由于过度捕捞和生态恶化，自20世纪70年代以来，先后出现了衰退现象。上世纪八十年代有报道李星颉等对曼氏无针乌贼资源及增殖的初步研究，而国外有对商乌贼的生物学及养殖方面的报道。至今，有关科研机构已初步解决了曼氏无针乌贼生殖调控、人工繁育、苗种培育与养成技术，为曼氏无针乌贼资源养护提供了重要的基础。为了在人工繁育后对自然种群进行养护，需要一种效果稳定、操作简单的标记方法，以利于在理论上对放流效果进行评估，进而优化放流增殖方案。目前头足类的放流工作的特点只注重向海区放流，而忽视放流效果(常抗美等，2008)，跟踪示踪等技术的研究却相对滞后。目前国内外还没有关于曼氏无针乌贼标记技术的公开报道。现有技术如中国发明专利《一种标志金乌贼的方法》，专利号ZL200610070448.6，公开了一种标志金乌贼的方法，其特征是将孵化后的金乌贼暂养5-20天，将染色剂溶于淡水，向盛有乌贼和海水的容器中放入制得的染色剂的水溶液，使上述海水中染色剂的浓度为60-80ppm，浸泡染色20-28小时。所述的染色剂为茜素络合指示剂。本发明的方法操作简便，鉴别方法简单，无毒无损伤，并可一次性进行大量染色处理且不易退色，是一种标志金乌贼的好方法。然而，其标记效果不明显，并且标记浮色会短期残留于体表，将经过该方法标记的乌贼放流到自然海域影响其本身的保护色，不利于其自然环境中的存活，并且该方法通过浸染金乌贼的针部而对其内壳尾端进行染色标记，这种方法对于无针乌贼属的个体将不再适用。
【发明内容】
本发明的目的是提供曼氏无针乌贼皮下荧光标记方法，以此解决曼氏无针乌贼放流标记的技术问题，并且该方法操作简单、安全快速，并且不应激，标记物的色彩不残留于体表，不影响曼氏无针乌贼的保护色，有利于自然放流环境下的存活。
本发明的曼氏无针乌贼皮下荧光标记方法，其包括如下步骤：
①麻醉步骤：选取待标记的曼氏无针乌贼放入浓度为40ppm至70ppm的MS-222麻醉剂溶液中0.5分钟至4分钟；
②标记步骤：用注射器将染色膏注入经步骤①处理的曼氏无针乌贼的外套膜皮层；
染色膏含有茜素络合指示剂。
步骤②染色膏还含有酸奶，并且茜素络合指示剂与酸奶的重量比为1∶4至1∶8。染色膏注射的量小于0.5ml。注射器的针头与曼氏无针乌贼内壳表面呈锐角插入。步骤②中，注射器在使用前在90％至95％的酒精中消毒10分钟至15分钟。
曼氏无针乌贼皮下荧光标记方法专用试剂，其按照重量份数含有1份的茜素络合指示剂粉末和4份至8份的酸奶。茜素络合指示剂粉末和酸奶采用研磨方式混合。
本发明使用了茜素络合指示剂粉末与酸奶混合使用，在注射到曼氏无针乌贼的外套膜皮下后，能够集中在较小的区域，不易扩散，因而标记的识别效果更好。并且，本发明采用了注射的方法并结合酒精消毒、MS-222降低活性，从而减低了乌贼的应激反应及其产生的体表损伤，并且特别适用于无针乌贼属的染色。本发明的方法在乌贼复苏后，无需暂养除去浮色，可以立即放流。
【具体实施方式】
以下结合附实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1：曼氏无针乌贼皮下荧光标记方法，其包括如下步骤：
①麻醉步骤：选取待标记的曼氏无针乌贼放入浓度为60ppm的MS-222麻醉剂溶液中0.5分钟；
②标记步骤：用注射器将染色膏注入经步骤①处理的曼氏无针乌贼的外套膜皮层；
染色膏含有茜素络合指示剂(ALC)。
步骤②染色膏还含有酸奶，并且茜素络合指示剂与酸奶的重量比为1∶8。染色膏注射的量小于0.5ml。注射器的针头与曼氏无针乌贼内壳表面呈锐角插入。步骤②中，注射器在使用前在92％的酒精中消毒10分钟。
曼氏无针乌贼皮下荧光标记方法专用试剂，其按照重量份数含有1份地茜素络合指示剂粉末和8份的酸奶。茜素络合指示剂粉末和酸奶采用研磨方式混合。
操作步骤如下：首先将6ml注射器置于92％的酒精中消毒10min。之后取出并吸取3ml糊状染色膏(ALC粉末与酸奶按照重量1∶8)。将一头胴长为1.1cm的乌贼个体放入浓度为60ppm的MS-222麻醉剂溶液中约0.5min后立即取出置于铺有浸水毛巾的操作台上。将注射器针头从乌贼个体背部下端向头部方向以与水平面约12°角斜着刺穿外套膜的外表皮，针头进入外套膜约0.3cm，使之处于中间膜与外表皮之间。在向外拔针的过程中同时适力推动注射器将针筒内糊状染色膏成条状注射进乌贼外表皮下，用量在0.2ml左右。拔出针头后，立即将标记个体放入清洁海水中复苏。
实施例2：首先将10ml注射器置于90％的酒精中消毒15min。之后取出并吸取3.0ml呈糊状的染色膏(ALC粉末与酸奶按照重量1∶4)。将一头胴长为6.2cm的乌贼个体放入浓度为70ppm的MS-222麻醉剂溶液中约3.5min后立即取出置于铺有浸水毛巾的操作台上。将注射器针头从乌贼个体背部前端向尾部方向以与水平面12°角斜着刺穿外表皮，针头进入外套膜外表皮约1.2cm，使之处于中间膜与外表皮之间的外套膜组织。在向外拔针的过程中同时适力推动注射器将针筒内糊状染色膏成条状注射进乌贼外表皮下。拔出针头后，立即将标记个体放入清洁海水中复苏。
试验结果表明，将175头胴长为2-3cm的乌贼个体利用本发明的皮下荧光标记方法标记，5d后标记保持率为100％，且用肉眼可直接观察到其背部的荧光条标记。养殖两个月后至成体并开始产卵。期间每隔10天左右取样测量被标记个体的生物学指标如全长、胴长、胴宽、体重、壳长、壳宽、壳重等，并与空白组乌贼个体进行比较，结果表明两者并无显著性差异，说明该标记方法对乌贼的生长发育及繁殖并无影响。排除养殖过程中的正常死亡及取样个体的影响，该标记方法下乌贼的成活率在95％以上且标记保持率为100％。
尽管已结合优选的实施例描述了本发明，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，能够对在这里列出的主题实施各种改变、同等物的置换和修改，因此本发明的保护范围当视所提出的权利要求限定的范围为准。