以肿瘤细胞MIR221/222为药靶的抗癌重组腺病毒和构建方法及用途.pdf

本发明公开了一种应用遗传工程的方法在细胞内获得靶向敲低miRNA表达的构建方案，以及用该方案获取的重组腺病毒和真核表达质粒在肿瘤治疗药物制备中的用途。用定向克隆、同源重组、转染、腺病毒纯化等技术，获得重组腺病毒和真核表达质粒，即在多克隆位点下游分别插入针对人源性和小鼠源性U6启动子，在U6启动子下游连接反义的miR-221和miR-222成熟序列片断(序列表中的序列1至4)，所获得重组腺病毒和真核表达质粒能选在胶质瘤、胃癌、乳腺癌等肿瘤细胞内复制增殖；插入的反义miR-221/222cDNA片段在肿瘤细胞内高效表达，抑制肿瘤细胞miR-221/222的表达；对肿瘤细胞具有强效旁观者效应。该腺病毒和真核表达质粒在肿瘤治疗药物、放射治疗增敏的制备中具有独特的实用价值。

1、  一种用于产生siRNA的DNA序列组，包括如下四个序列：
DNA序列1
5‘-CTCGAGTTTATTAGCTCAAAAAAGAAACCCAGCAGACAATGTAGCT-3’
DNA序列2
5’-CTCGAGTTTATTAGCTCAAAAAAGAAACCCAGCAGACAATGTAGCT-3`
DNA序列3
5′-CACCGGATCCATTGTCTGCTGGGTTTCTTTTTTGAATAAAGAGCTC-3’
DNA序列4
5’-CTCGAGTTTATTAGCTCAAAAAAGAAACCCACAGACAATGGATCC-3’。

2、  一种包含权利要求1所述的DNA序列组的真核表达质粒。

3、  一种权利要求2所述的真核表达质粒的构建方法，其特征在于将序列表中的SEQ IDNO.1/SEQ IDNO.2、SEQ IDNO.3/SEQ IDNO.4退火形成双链结构，通过亚克隆连接于质粒载体用以构建真核表达质粒，获得以肿瘤细胞miR-221/222为药靶的抗癌重组质粒。

4、  一种基于反义RNA技术的、以肿瘤细胞miR-221/222为药靶包含权利要求1所述的DNA序列组的腺病毒穿梭载体，其特征是联合应用2个反义RNA序列，在U6启动子下游分别连接反义的miR-221和miR-222成熟序列的表达模扳，所述的2个反义RNA序列采用：序列表中的DNA序列1/DNA序列2，DNA序列1为正义链、DNA序列2为反义链，DNA序列3/DNA4序列，DNA序列3为正义链、DNA序列4为反义链。

5、  一种权利要求4所述的腺病毒穿梭载体的构建方法，其特征在于将序列表中的SEQ IDNO.1/SEQ IDNO.2、SEQ IDNO.3/SEQ IDNO.4退火形成双链结构，通过亚克隆连接于穿梭载体，获得以肿瘤细胞miR-221/222为药靶的抗癌腺病毒穿梭载体。

6、  一种基于反义RNA技术的、以肿瘤细胞miR-221/222为药靶的抗癌重组腺病毒，其特征在于该腺病毒是在pGSadeno基因组多克隆位点下游分别插入针对人源性和小鼠源性U6启动子，在U6启动子下游连接反义的miR-221和miR-222成熟体RNA序列构成，所述的序列是：
反义miR-221成熟序列的RNA序列：5‘-GAAACCCAGCAGACAAUGUAGCT-3’
反义miR-222熟序列的RNA序列：5‘-GAAACCCAGCAGACAATGGAUCC-3’。

7、  一种权利要求6所述的重组腺病毒的构建方法，其特征在于，首先按照权利要求5所述的方法构建权利要求4所述的腺病毒穿梭载体，然后LR体外同源重组至pGSadeno腺病毒载体，线性化腺病毒DNA后转染293包装细胞，获得以肿瘤细胞miR-221/222为药靶的抗癌重组腺病毒。

8、  权利要求6所述的重组腺病毒在制备抑制肿瘤生长药物中的用途。

9、  权利要求2所述的真核表达质粒在制备抑制肿瘤生长药物中的用途。

以肿瘤细胞miR-221/222为药靶的抗癌重组腺病毒和构建方法及用途
【技术领域】：
本发明属于生物医药技术与恶性肿瘤的基因治疗技术领域，涉及重组腺病毒和真核表达质粒，具体为以肿瘤细胞miR-221/222为药靶的抗癌重组腺病毒和真核表达质粒的构建及抑制人胶质瘤、乳腺癌和胃癌的生长，对上述肿瘤具有放疗增敏作用。
【背景技术】：
微RNA(microRNA或miRNA)为长度约21～25核苷酸的小型非编码RNA，能够识别特定的目标mRNA，并在转录后水平通过促进靶mRNA的降解和(或)抑制翻译过程而发挥负调控基因表达的作用。miRNA-221/222是成簇的miRNA，与胶质母细胞瘤、前列腺癌、甲状腺乳头状癌等有关。
Ciafre`等小组应用微阵列的方法比较了9例原发性胶质母细胞瘤与核磁共振强化边缘2cm处“正常瘤周脑组织”的miRNA表达谱，发现超过半数的肿瘤组织过表达包括miR-221在内的9种miRNA。Gillies等研究发现，在脑胶质母细胞瘤中，miRNA-221、miRNA-222通过与p27<sup>kip1</sup>mRNA的3<sup>/</sup>-UTRs结合来降低p27<sup>kip1</sup>的表达。这为脑胶质母细胞瘤提供了一种潜在的新的治疗途径。Galardi等发现miR-221与miR-222明显影响前列腺癌LNCaP细胞虫荧光素酶的表达。可以看出p27<sup>kip1</sup>是miR-221、miR-222的靶基因。Pallante等在分析乳头状甲状腺癌的miRNA表达谱时发现，miRNA-222最高增高60倍，平均增高13.7倍。除了上述肿瘤，miRNA-221与miRNA-222在肝细胞癌、胰腺癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、直肠癌、肾癌和膀胱癌中均异常表。
【发明内容】：
本发明目的是应用遗传工程的方法在细胞内获得靶向敲低miRNA表达的构建方案，为此提出：
目的之一，提供可以用于产生siRNA的DNA序列组；
目的之二，提供含有目的一序列组的真核表达质粒及其构建方法；
目的之三，提供含有目的一序列组的腺病毒穿梭载体及其构建方法；
目的之四，提供目的三所述穿梭载体构建的腺病毒；以及，
目的之五，提供真核表达质粒和腺病毒的用途。
本发明应用遗传工程的方法在细胞内获得靶向敲低miRNA表达的构建方案，该方案可以获取重组腺病毒和真核表达质粒，并可应用于肿瘤治疗，运用该方法可以在实验条件下抑制人源性胶质瘤、胃癌、乳腺癌等肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡，同时上调抑癌基因PUMA、PTEN、Cx43和p27的表达，下调DNAPKcs和miR-21的表达；对肿瘤细胞具有增强效旁观者效应和放射治疗增敏的作用。
本发明的技术方案概述如下：
第一、本发明提供了四种用于产生siRNA的DNA序列
DNA序列1
5‘-CTCGAGTTTATTAGCTCAAAAAAGAAACCCAGCAGACAATGTAGCT-3’
DNA序列2
5’-CTCGAGTTTATTAGCTCAAAAAAGAAACCCAGCAGACAATGTAGCT-3`
DNA序列3
5′-CACCGGATCCATTGTCTGCTGGGTTTCTTTTTTGAATAAAGAGCTC-3’
DNA序列4
5’-CTCGAGTTTATTAGCTCAAAAAAGAAACCCACAGACAATGGATCC-3’。
第二、本发明提供了包含上述四组DNA序列的组合的真核表达质粒及其构建方法
具体如下：质粒为DNA序列-1、DNA序列2、DNA序列3、DNA序列4/Pgenesil-1。质粒DNA序列-1、DNA序列2、DNA序列3、DNA序列4/Pgenesil-1的通用结构如图2示。质粒构建方法如下，将序列表中的DNA序列1/DNA序列2、DNA序列3/DNA序列4退火形成双链结构，通过亚克隆连接于质粒载体用以构建真核表达质粒，获得以肿瘤细胞miR-221/222为药靶的抗癌重组质粒。最终在Pgenesil-1中形成的酶切位点顺序为MluI—hU6promoter—KCNH11—HindIII—KCNH12—mU6promoter—BamHI—EcoRI—Sal。
第三、本发明在发明1的基础上构建了穿梭载体以及腺病毒
将序列表中的SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4退火形成双链结构，通过亚克隆连接于穿梭载体，LR体外同源重组至pGSadeno腺病毒载体，但不仅限于所提及的腺病毒和其他应用穿梭载体重组的病毒载体。线性化腺病毒DNA后转染293包装细胞，获得以肿瘤细胞miR-221/222为药靶的抗癌重组腺病毒，但不仅限于所提及的腺病毒。
第四、本发明还提供了真核表达质粒和重组腺病毒在制备抑制肿瘤生长药物中的用途。
本发明的优点和积极效果：
本发明通过在多克隆位点下游分别插入针对人源性和小鼠源性U6启动子，在U6启动子下游连接反义的miR-221和miR-222成熟序列片断，所获得的重组腺病毒和真核表达质粒能选在胶质瘤、胃癌、乳腺癌等肿瘤细胞内复制增殖；插入的反义miR-221/222eDNA片段在肿瘤细胞内高效表达，抑制肿瘤细胞miR-221/222的表达。该腺病毒和真核表达质粒在肿瘤治疗药物、放射治疗增敏的制备中具有独特的实用价值。
本发明与化学修饰的miRNA抑制剂相比，以miR-221/222为药靶的抗癌重组腺病毒应用便利，能提高反义RNA的基因转导效率，产生明显的基因治疗效果。
【附图说明】：
图1质粒即DNA序列组的腺病毒穿梭载体构建图谱。
图2是酶切鉴定分析目的基因片段DNA序列1+2与目的基因片段DNA序列3+4连接成功。
图3是northern blot显示反义-miR221/222腺病毒可明显敲低胶质瘤U251细胞的miR-221、miR-222的表达。
图4是反义miR-221/222腺病毒转染的U251细胞有明显的G1期阻滞(1：对照组2：转染无义序列组3：反义miR-221/222腺病毒组)。
图5是反义miR-221/222腺病毒使肿瘤细胞增殖减慢。
图6反义miR-221/222腺病毒联合照射可明显降低MCF-7细胞S期的细胞比例(1：对照组2：转染无义序列组3：反义miR-221/222腺病毒组4：对照组+照射5：转染无义序列组+照射6：反义miR-221/222腺病毒组+照射)。
图7反义miR-221/222腺病毒对乳腺癌细胞系MCF-7细胞有明显的放射增敏作用。
图8Westem blot显示反义miR-221/222腺病毒可上调MCF-7细胞p27kip1表达并与放疗有协同作用(1：对照组2：转染无义序列组3：反义miR-221/222腺病毒组4：对照组+照射5：转染无义序列组+照射6：反义miR-221/222腺病毒组+照射)。
图9反义miR-221/miR222腺病毒可以明显抑制裸鼠移植瘤的生长。
图10反义miR-221/miR222腺病毒可以明显提高p27—3`UTR报告质粒的荧光强度，说明p27kip1是miR-221/222的靶基因。
图11反义miR-221/miR222腺病毒可以明显提高乳腺癌细胞系MCF-7细胞的p27kip1表达(1：对照组2：转染无义序列组3：反义miR-221/222腺病毒组)。
【具体实施方式】：
实施例1 以肿瘤细胞miR-221/222为药靶的真核表达质粒的构建(图1)
1.合成单链目的基因片段的退火连接：
2.稀释退火片段分别与线性化质粒pGenesil1.1、pGenesil1.2和pGenesil1.3载体的连接：
3.各取5ul连接产物转化感受态细胞DH5a，分别涂布于含Kanar抗性(终浓度为30ug/ml)的LB平板上，37℃恒温培养箱培养过夜。
4.从每个培养皿上各挑取3个单克隆菌落接种于3ml含Kanar抗性(终浓度为30ug/ml)的LB培养液中，37℃恒温摇床培养过夜。
5.用试剂盒小量提取质粒(中鼎公司)，并分别用SacI做酶切鉴定：
6.挑取克隆正确的质粒转化菌液GYL1-1.1-1、GYL2-1.2-5和GYL3-1.1-9，GYL4-1.2-13去测序。经测序结果分析：均为插入正确的克隆质粒，而且质量均符合设计标准。
7.质粒GYL1-1.1-1、GYL2-1.2-5的HindIII+BamHI双酶切分别回收大片段和小片段(约350bp)：质粒GYL3-1.1-1、GYL4-1.2-5的HindIII+BamHI双酶切分别回收大片段和小片段(约350bp)。
8.质粒GYL1-1.1-1回收大片段与质粒GYL2-1.2-5回收小片段的连接，质粒GYL3-1.1-9回收大片段与质粒GYL4-1.2-13回收小片段的连接：
9.取5ul过夜连接产物转化感受态细胞DH5a，涂布于含Kana<sup>r</sup>抗性(终浓度为30ug/ml)的LB平板上，37℃恒温培养箱培养过夜。
10.从培养皿上挑取3个单克隆菌落接种于3ml含Kana<sup>r</sup>抗性(终浓度为30ug/ml)的LB培养液中，37℃恒温摇床培养过夜。
11.用试剂盒小量提取质粒(中鼎公司)，并分别用MluI+BamHI做酶切鉴定。
实施例2 重组腺病毒构建实验
1.从pGenesil-1上通过LR体外同源重组将上例中得到的GYL1+2及GYL3+4shRNA表达框移至pGSadeno腺病毒表达载体上：LR体外同源重组，中提试剂盒(维特洁)提取质粒，用PI-SceI/I-CeuI双酶切鉴定提取的质粒并1％Agarose凝胶电泳(图2)。
2.包装重组腺病毒：PacI酶切重组腺病毒质粒，将PacI线性化的腺病毒DNA转染HEK293，将上步的裂解上清感染再次HEK 293、放大培养。
实施例3 重组腺病毒介导反义miR221/222上调p27kip1抑制胶质母细胞瘤U251细胞生长的体外研究
1.细胞培养和转染：U251恶性胶质瘤体外细胞在DMEM完全培养液中常规培养。U251细胞分3组，分别为对照组、对照病毒转导组和反义miR-221/222腺病毒转导组。转染方法按照MOI＝50进行，转导48-72小时。
2.RNA提取及Northern blot：将预先准备好的3组细胞用Trizol试剂按照说明书将总RNA提取出来。然后以每个样品20μg的量上样在10％聚丙稀变性凝胶进行电泳，然后用尼龙膜进行转膜。随后将转好的膜放进紫外交联仪进行固定。固定好的膜可以与探针进行杂交。杂交后通过Dig Luminescent Detection Kit使膜成像。
3.Western blot分析转染前后p27表达变化：将5×107待检验细胞培养过夜后十二烷基肌酸纳上样缓冲液裂解法收获蛋白，20μl上样量(约10<sup>7</sup>细胞/上样孔)进行电泳。
4.MTT法(噻唑兰比色分析法)检测转染后U251细胞增殖率：分别为对照组、对照病毒转导组和反义miR-221/222腺病毒转导组。转染后48小时开始。
5.流式细胞术检测转染后细胞周期分布：将U251细胞接种于6孔板。转导后48小时后消化成单细胞悬液，离心，弃上清，按照GENMED细胞周期流式细胞分析试剂盒产品说明书(杰美公司，上海)标记细胞；流式细胞仪分别检测周期分布。
6.Northern blot法检测转染后miR-221、miR-222的表达水平。反义miR-221/222腺病毒转导组使miR-221、miR-222的表达水平明显下降。转染对照病毒组及对照组的microRNA-221、microRNA-222表达水平没有改变。观察期内反义miR-221/222腺病毒转导组U251细胞生长速度较转染对照病毒组和对照组明显缓慢。反义miR-221/222腺病毒转导组U251细胞出现了明显的G1期阻滞，G1占46.2％，而对照组、转染对照病毒组分别为28.6％、26％。
7.结果：Northern blot法检测转染后miR-221、miR-222的表达水平。反义miR-221/222腺病毒转导组使miR-221、miR-222的表达水平明显下降。转染无意序列组及对照组的microRNA-221、microRNA-222表达水平没有改变(图3)。反义miR-221/222腺病毒转导组U251细胞出现了明显的G1期阻滞，G1占46.2％，而对照组、转染无意序列组分别为28.6％、26％(图4)。观察期内反义miR-221/222腺病毒转导组U251细胞生长速度较转染无意序列组和对照组明显缓慢(图5)。
实施例4 重组腺病毒介导反义miR221/222上调p27对乳腺癌细胞系MCF-7的放射增敏作用
1.细胞培养和转染：MCF-7乳腺癌体外细胞在DMEM完全培养液中常规培养，MCF-7乳腺癌体外细胞系培养与转染方法同上。MCF-7细胞分3组，分别为对照组、对照病毒转导组和反义miR-221/222腺病毒转导组。转染方法按照MOI＝50进行，转导48-72小时。
2.照射方法采用美国瓦里安walian600直线加速器6MV X线，源皮距为100cm，剂量率为3.2Gy/min。
3.MTT法(噻唑兰比色分析法)检测转染后MCF-7细胞增殖率：分别为对照组、对照病毒转导组和反义miR-221/222腺病毒转导组。转染后24小时实施4Gy照射，24小时后开始测MTT。
4.流式细胞术检测转染后细胞周期分布：将MCF-7细胞接种于6孔板，分为6组分组为对照组、对照照射组、转染无意序列组、转染无意序列照射组、反义miR-221/222腺病毒转导组和反义miR-221/222腺病毒转导照射组。转染后45小时后给予4Gy照射，3小时后消化成单细胞悬液，离心，弃上清，按照GENMED细胞周期流式细胞分析试剂盒产品说明书(杰美公司，上海)标记细胞；流式细胞仪分别检测五组细胞的周期分布。
6.平板克隆形成实验测定下调miR-221/222表达对MCF-7细胞的放射增敏作用：对已转染好的三组细胞分别进行0Gy，2Gy，4Gy，6Gy X线照射(源皮距＝100cm，剂量率＝320cGy/min，瓦里安600C加速器6MV X线照射)。用0.25％胰酶消化细胞成单细胞悬液，根据不同照射剂量种植不同细胞数的细胞于已有全培养基的培养皿中，观测10～14天，随后用PBS冲洗，用Giesma液染色10分钟，用清水冲洗，在SYNGENE ChemGenius成像系统上成像并计算克隆数(细胞数>50个细胞的克隆)。转染过程中对细胞造成的毒副作用通过未行照射的三组U251细胞的贴壁效率(plating efficiency PE)来评测。PE＝克隆形成数/细胞接种数×100％。然后按下列公式计算出MCF-7细胞的各治疗组在不同照射剂量点的存活率(survival fraction SF)。SF＝计算所得克隆数/(细胞接种数×PE)。
7.Western blot分析转染前后p27kip1表达变化：将5×107已转染的五组待检验细胞培养过夜后十二烷基肌酸纳上样缓冲液裂解法收获蛋白，20μl上样量(约107细胞/上样孔)进行电泳；方法同上。
8.结果：用Northern blot法检测转染后miR-221、miR-222的表达水平。反义miR-221/222腺病毒组使miR-221、miR-222的表达水平明显下降。转染无意序列组及对照组的microRNA-221、microRNA-222表达水平没有改变。观察期内反义miR-221/222腺病毒组MCF-7细胞生长速度较转染无意序列组和对照组明显缓慢。与照射相结合无明显协同作用。反义miR-221/222腺病毒组MCF-7细胞出现了明显的G1期阻滞，G1占63.0％，而对照组、转染无意序列组分别为30.6％、29.8％。对照组与反义miR-221/222腺病毒组经x2检验x2值为11.25，p值为0.002，有统计学意义。经照射后G1期细胞比例与未照射对比无明显变化，而G2有明显增高，致使受照射后S期细胞比例明显下降。反义miR-221/222腺病毒组MCF-7细胞照射后S期占10.7％，而对照组、转染无意序列组分别为45.4％、38.2％，明显高于反义miR-221/222腺病毒组，对比差异有统计学意义(图6)。通过克隆形成失实验显示反义miR-221/222共转染可明显增加MCF-7细胞受照射后的增殖性死亡几率。如图4显示对照组、转染无意序列组在2Gy的细胞存活率(survival fraction SF)分别为51.59％、49.6％，4Gy的SF分别为32.43％、28.36％，6Gy的SF分别为9.72％、8.75％。而反义miR-221/222腺病毒组2Gy、4Gy、6Gy的SF分别为25％、12.5％、1.28％，明显低于对照组和转染无意序列组，经统计学分析(p<0.05)，差异有统计学意义(图7)。反义miR-221/222腺病毒组可明显上调MCF-7细胞中p27kip1表达，经照射后p27kip1表达近一步提高，说明反义miR-221/222共转染联合照射在提高p27kip1表达水平上有协同作用(图8)。
实施例5.反义-miR221/222腺病毒转导上调p27kip1抑制胶质母细胞瘤U251细胞生长的体内研究
1.裸鼠移植瘤模型建立：对数生长期的U251胶质母细胞瘤细胞，经0.125％胰酶消化，1000rpm×10分钟常温离心去上清，以PBS离心洗涤2次。计算细胞数，调整细胞浓度至5×107/ml，将细胞悬浮于无血清DMEM培养液中。然后用带6号针头的注射器抽取细胞悬液200μl，接种于裸鼠鼠鼷部皮下。该组接种裸鼠3只，为第一代荷瘤裸鼠。待移植瘤长至直径约7mm，断颈处死，在无菌条件下，解剖切取适当大小的肿瘤组织，立即放入无血清DMEM中，修剪肿瘤组织，去除脂肪和坏死肿瘤组织，并用无血清DMEM洗涤，将其剪成1mm3大小的瘤块接种到裸鼠左侧鼠鼷部皮下。一周后待移植瘤体积长至约50mm<sup>3</sup>后，准备治疗。
2.将已长成的荷瘤裸鼠分成3组，分别为对照组、转染无意序列组、和反义miR-221/222腺病毒转染组。每组8只，共40只裸鼠。将已配好的转染液采取多点注射的方法注射进移植瘤内，每次注射约30μl。每三天注射一次，共注射5次。从治疗开始测量移植瘤的最大径和最小径，按公式V＝(ab2)/2计算肿瘤大小。每2天测量1次，直至第30天。30天时观察肿瘤大体形态，并取肿瘤组织固定于10％福尔马林溶液中，石蜡包埋，组织切片，HE染色，进行组织病理检查。
3.荧光原位杂交：荧光原位杂交试剂盒购于陕西超英生物技术有限公司，其中mir-221用地高辛标记，mir-222用抗生蛋白链菌素标记。具体操作按说明书进行。采用S-P免疫组化试剂盒。在同一标本的两张病理切片中分别加入Ki67(1:100北京中杉公司)、p27kip1(1:100北京中杉公司)两种I抗，4℃过夜，然后加入生物素标记II抗，辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，DAB显色，苏木素复染。具体步骤按S-P免疫组化试剂盒说明书。以胞核染成黄褐色为阳性。高倍镜下(×200)计数1000个细胞后计算阳性细胞表达率。阳性细胞表达率＝(阳性细胞数/总细胞数)×100％。
4.结果：反义miR-221/222腺病毒转导组的移植瘤生长速度明显慢于对照组和转染无意序列组(图9)。使用荧光原位杂交法检测转染后miR-221、miR-222的表达水平。反义miR-221/222腺病毒转导组使miR-221、miR-222的表达水平明显下降。转染无意序列组及对照组的microRNA-221、microRNA-222表达水平没有改变。在组织病理切片行免疫组化检测发现反义miR-221/222腺病毒组的p27kip1的阳性率明显高于对照组和转染无意序列组(p＝0.001)。Ki67的表达正好与之相反。对照组和转染无意序列组的阳性率明显高于反义miR-221/222腺病毒组(p＝0.003)。
实施例6.敲低胃癌细胞系SGC7901细胞miR-221/222上调p27kip1表达对其生长抑制的体外研究
1.细胞培养和转染：SGC7901胃癌细胞在DMEM完全培养液中常规培养，其培养与转染方法和分组同上。RNA提取及Northernblot、Western blot分析转染前后p27kip1表达变化、MTT法(噻唑兰比色分析法)检测转染后SGC7901细胞增殖率、流式细胞术检测转染后细胞周期分布同以上步骤描述。
2.虫荧光素酶活性实验：将SGC7901细胞接种于96孔板，将反义miR-221/222腺病毒转染分别与p3`UTR-P27和p3`UTRmut-p27进行共转染，同时设对照，48小时后用Tecen多功能连续波长扫描分析检测系统分析虫荧光素酶活性。
3.结果：反义miR-221/222腺病毒转导组使miR-221、miR-222的表达水平明显下降。转染无意序列组及对照组的microRNA-221、microRNA-222表达水平没有改变。反义miR-221/222腺病毒转导与p3`UTR-P27同时转染组所检测的荧光活性明显高于其它组(图10)。观察期内反义miR-221/222腺病毒转导组SGC7901细胞生长速度较转染无意序列组和对照组明显缓慢。反义miR-221/222腺病毒转导组SGC7901细胞出现了明显的G1期阻滞，G1占63.7％，而对照组、转染无意序列组分别为22.3％、28.6％。各组经x2检验x2值为13.25，p值为0.002，有统计学意义。反义miR-221/222腺病毒转导组可明显上调SGC7901细胞中p27kip1表达，而转染无意序列组和对照组的p27kip1表达较弱。
实施例7.敲低乳腺癌细胞系MCF-7细胞miR-221/222上调p27kip1表达对其生长抑制的体外研究
1.细胞培养和转染：乳腺癌细胞系MCF-7细胞在DMEM完全培养液中常规培养，其培养与转染方法和分组同上。RNA提取及Northernblot、Western blot分析转染前后p27kip1表达变化、MTT法(噻唑兰比色分析法)检测转染后MCF-7细胞增殖率、流式细胞术检测转染后细胞周期分布同以上步骤描述。
2.结果：反义miR-221/222腺病毒转导组使miR-221、miR-222的表达水平明显下降。转染无意序列组及对照组的microRNA-221、microRNA-222表达水平没有改变。观察期内反义miR-221/222腺病毒转导组MCF-7细胞生长速度较转染无意序列组和对照组明显缓慢。反义miR-221/222腺病毒转导组MCF-7细胞出现了明显的G1期阻滞，G1占63.0％，而对照组、转染无意序列组分别为30.6％、29.8％。各组经x2检验x2值为11.25，p值为0.001，有统计学意义。反义miR-221/222腺病毒转导组可明显上调MCF-7细胞中p27kip1表达，而转染无意序列组和对照组的p27kip1表达较弱(图11)。
序列表
<110>天津医科大学总医院
<120>以肿瘤细胞miR-221/222为药靶的抗癌重组腺病毒和构建方法及用途
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<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
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<212>DNA
<213>人工序列
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