一种用于提高白喉类毒素纯度的工艺.pdf

本发明涉及一种用于提高白喉类毒素纯度的工艺，其制作工艺为固体培养基传代→液体培养基发酵罐培养→离心去菌体→一段盐析→二段盐析→超滤脱盐→凝胶过滤→除菌过滤→脱毒→原液检定保存→半成品配制→成品，所述的液体培养基发酵罐中液体培养基经处理去除分子量在50000以上的蛋白，培养收获物中基本只有白喉毒素分子量在50000以上，通过盐析和凝胶过滤进一步去除收获液中分子量50000以下的蛋白和其它杂蛋白，获得高纯度的白喉毒素。

1、  一种用于提高白喉类毒素纯度的工艺，其制作工艺为固体培养基传代→液体培养基发酵罐培养→离心去菌体→一段盐析→二段盐析→超滤脱盐→凝胶过滤→除菌过滤→脱毒→原液检定保存→半成品配制→成品，其特征是：所述的液体培养基发酵罐中液体培养基经处理去除分子量在50000以上的蛋白，培养收获物中基本只有白喉毒素分子量在50000以上，通过盐析和凝胶过滤进一步去除收获液中分子量50000以下的蛋白和其它杂蛋白，获得高纯度的白喉毒素。

一种用于提高白喉类毒素纯度的工艺
技术领域
本发明涉及一种用于提高白喉类毒素纯度的工艺，属生物医药制造领域。
背景技术
白喉是急性呼吸道传染病，白喉杆菌侵入人体后在鼻咽部生长繁殖，导致局部炎症及组织坏死并产生外毒素(分子量为62000蛋白质，为一多肽链)，咽喉部的坏死组织形成灰白色假膜并继续蔓延而引起呼吸障碍甚至窒息。外毒素可致心肌、神经系统、肝、肾及肾上腺等器官受损，出现全身中毒症状。白喉类毒素可使白喉流行得到有效控制。国内原生产白喉类毒素，白喉疫苗的厂家为中国生物制品集团公司下属的六大生物制品研究所，其工艺如下：
固体培养基传代→液体培养基发酵罐培养→离心去菌体→一段盐析→二段盐析→超滤脱盐→除菌过滤→脱毒→原液检定保存→半成品配制→成品
工艺阐述：(1)菌种制备：将白喉38007菌种开启并接种于吕氏血清斜面培养基上，34℃～35℃孵箱培养16小时～24小时，再由血清斜面传于黄氏马丁肉汤(或改良林氏肉汤)培养基种子管，34℃～35℃培养16小时～24小时为第二代，如此循环由黄氏马丁肉汤传至黄氏马丁肉汤第二代，镜检合格者传于10L瓶，34℃—35℃培养48小时。(2)大罐培养(培养基主要为肉源胰酶消化液)毒素培养以抽样3次，6小时内絮状单位不上升为停止培养指标。用于生产的毒素不得低于150Lf/ml。(3)杀菌：将培养液冷却至28℃以下，按培养基的0.1％-0.15％加入甲醛溶液。(4)一段盐析(去除大分子杂蛋白)：离心机去除菌体，经浓缩，加入23％(W/V)晶体硫酸铵、1％(W/V)活性炭，然后加入0.5％(W/V)碳酸氢钠。收集上清。(5)二段盐析(去除小分子杂蛋白)：缓慢加入22％(W/V)晶体硫酸铵，收集沉淀用无菌的0.1％碳酸氢钠溶液浸泡沉淀。用无菌的0.1％碳酸氢钠(NaHCO₃)溶液分次溶解、洗涤沉淀，送超过滤脱盐。(6)超滤脱盐：将精制毒素溶液泵入超过滤系统，直至测定样品硫酸铵含量低于千分之一即可收集脱盐后精制白喉毒素液。(7)除菌过滤：用除菌过滤膜除菌过滤。(8)脱毒：精制白喉毒素按0.5％计算加入福尔马林溶液(按40％计算)及适量的10％L-赖氨酸溶液放置室温2天-3天，每日振摇一次，然后放入36℃-37℃恒温室，进行脱毒。(9)精制类毒素原液检定：毒性逆转试验，理化性状，无菌试验，Lf值测定，纯度，特异性毒性试验。保存与效期保存于2--8℃冷库中，效期自脱毒合格之日起为3年半。其不足之处：虽然，国内已有吸附白喉疫苗、DTP、DtaP、吸附白破二联疫苗上市，但其生产过程中由于工艺的限制，成人免疫时有严重的不良反应，Pappenheimer认为，可能是对白类过敏，或对细菌的非毒素蛋白过敏，也可能对二者都过敏，Henncq给对原制白类过敏者接种无毒白喉杆菌培养滤液时，受实者呈阳性反应。在过量铁培养液中培养白喉，铁抑制了白喉毒素的形成，但不能抑制致敏原的形成。证明成年人接种白类容易引起过敏反应，是因为曾经在上呼吸道感染过无毒力或毒力很小的白喉杆菌，这些菌体的非毒素蛋白使其致敏，当再接种白类时，白类中含有少量此种蛋白而引起过敏反应。固如果能制备出高纯度的精制白类有利于降低不良反应，国外生物制品规程规定，精白类的纯度应不低于2500lf/mgPN。而我国规程规定不低于1500lf/mgPN。因此用于成人免疫的精白类有必要进一步纯化，提高纯度。
发明内容
设计目的：避免背景技术存在的不足之处，设计一种各项质量指标均达到《中国药典三部》吸附白喉疫苗要求，尤其纯度指标达到2600lf/mgPN以上的一种用于提高白喉类毒素纯度的工艺。
设计方案：本申请在国内生产白喉类毒素工艺的基础上进行工艺改进，增加了将所用培养基超滤去除未消化彻底的蛋白降解物，二次盐析后脱盐后再经凝胶过滤工艺，其各项质量指标均达到《中国药典三部》吸附白喉疫苗要求，尤其纯度指标达到2600lf/mgPN以上，制品中的白喉类毒素纯远高于同类制品中的纯度，使制品更加安全。
白喉类毒素工艺流程：固体培养基传代→(液体培养基经处理去除分子量在50000以上的蛋白等)液体培养基发酵罐培养→离心去菌体→一段盐析→二段盐析→超滤脱盐→凝胶过滤→除菌过滤→脱毒→原液检定保存→半成品配制→成品；
关键技术有两点：
a、发酵罐培养。液体培养基经处理去除分子量在50000以上的蛋白等。这样培养收获物中基本只有白喉毒素分子量在50000以上。
b、通过盐析和凝胶过滤进一步去除收获液中分子量50000以下的蛋白和其它杂蛋白等，从而获得高纯度的白喉毒素。
技术方案：一种用于提高白喉类毒素纯度的工艺，其制作工艺为固体培养基传代→液体培养基发酵罐培养→离心去菌体→一段盐析→二段盐析→超滤脱盐→凝胶过滤→除菌过滤→脱毒→原液检定保存→半成品配制→成品，液体培养基发酵罐中液体培养基经处理去除分子量在50000以上的蛋白，培养收获物中基本只有白喉毒素分子量在50000以上，通过盐析和凝胶过滤进一步去除收获液中分子量50000以下的蛋白和其它杂蛋白，获得高纯度的白喉毒素。
本发明与背景技术相比，确定了合理的工艺路线，稳定技术工艺流程，保证了规模化生产的可能，经过培养基经处理去除分子量在50000以上的蛋白等物质，同过盐析和凝胶过滤去除收获液中分子量50000以下的蛋白和其它杂蛋白等，从而获得高纯度的白喉毒素，保证产品的安全性。
具体实施方式
实施例1：一种用于提高白喉类毒素纯度的工艺，其制作工艺为固体培养基传代→液体培养基发酵罐培养→离心去菌体→一段盐析→二段盐析→超滤脱盐→凝胶过滤→除菌过滤→脱毒→原液检定保存→半成品配制→成品，所述的液体培养基发酵罐中液体培养基经处理去除分子量在50000以上的蛋白，培养收获物中基本只有白喉毒素分子量在50000以上，通过盐析和凝胶过滤进一步去除收获液中分子量50000以下的蛋白和其它杂蛋白，获得高纯度的白喉毒素。
工艺阐述：(1)菌种制备：将白喉38007菌种开启并接种于吕氏血清斜面培养基上，34℃～35℃孵箱培养16小时～24小时，再由血清斜面传于黄氏马丁肉汤(或改良林氏肉汤)培养基种子管，34℃～35℃培养16小时～24小时为第二代，如此循环由黄氏马丁肉汤传至黄氏马丁肉汤第二代，镜检合格者传于10L瓶，34℃—35℃培养48小时。(2)大罐培养(培养基经处理去除分子量在50000以上的蛋白等物质)：毒素培养以抽样3次，6小时内絮状单位不上升为停止培养指标。用于生产的毒素不得低于150Lf/ml。(3)杀菌：将培养液冷却至28℃以下，按培养基的0.1％-0.15％加入甲醛溶液。(4)一段盐析：离心机去除菌体，经浓缩，加入23％(W/V)晶体硫酸铵、1％(W/V)活性炭，然后加入0.5％(W/V)碳酸氢钠。收集上清。(5)二段盐析(去除小分子杂蛋白)：缓慢加入22％(W/V)晶体硫酸铵，收集沉淀用无菌的0.1％碳酸氢钠溶液浸泡沉淀。用无菌的0.1％碳酸氢钠(NaHCO₃)溶液分次溶解、洗涤沉淀，送超过滤脱盐。(6)超滤脱盐：将精制毒素溶液泵入超过滤系统，直至测定样品硫酸铵含量低于千分之一即可收集脱盐后精制白喉毒素液。(7)凝胶过滤：获得高纯度白喉毒素。(8)除菌过滤：用除菌过滤膜除菌过滤。(9)脱毒：精制白喉毒素按0.5％计算加入福尔马林溶液(按40％计算)及适量的10％L-赖氨酸溶液放置室温2天-3天，每日振摇一次，然后放入36℃-37℃恒温室，进行脱毒。(10)精制类毒素原液检定：毒性逆转试验，理化性状，无菌试验，Lf值测定，纯度，特异性毒性试验。保存与效期保存于2--8℃冷库中，效期自脱毒合格之日起为3年半。
表1：工艺与批号的对应