甘蓝型油菜抗旱耐盐转录因子BnHB6蛋白编码序列 【技术领域】
本发明涉及的是一种蛋白编码序列，特别是一种甘蓝型甘蓝型油菜抗旱耐盐转录因子BnHB6蛋白编码序列，属于基因工程领域。
背景技术
近代地球气候环境的变化和人类的活动引起的地表沙漠和半沙漠化，以及大面积干旱半干旱地区和盐碱滩涂地的存在，要求有适宜于这些地区种植的农作物品种能够不断地得到推广。当前一个重要的手段就是将表现出耐盐抗旱的基因对农作物进行基因工程改造，以获得抗盐耐旱的农作物新品种。植物转录因子能够启动相关的耐盐抗旱基因及其蛋白的表达来提高植物的耐盐抗旱。包含同源盒区-亮氨酸拉链(Homeodomain leucine-zipper)(HD-Zip)区域的转录因子是植物中发现地一个蛋白质家族。该基因含有一个同源盒区域和6个亮氨酸组成的拉链结构，能够结合在DNA上启动下游基因的表达，是一类同源盒(Homeobox)区域结合(Binding)的蛋白，故取第一个字母命名该基因为HB。此类转录因子在植物的生长、发育和抗逆反应中发挥重要作用。转录因子HB6基因在植物不同的逆境环境下均有明显的增强表达，并启动下游相关的耐盐抗旱基因的表达，是植物ABA信号传导中重要的调节基因。
在现有技术文献的检索中发现：杂志《Plant Molecular Biology(植物分子生物学)》在1999，40：1073-1083发表了文章“The HD-Zip gene ATHB6 in Arabidopsisis expressed in developing leaves，roots and carpels and up-regulated by waterdeficit conditions”(拟南芥HD-Zip基因ATHB6是在发育的叶、根和心皮中表达并受水分缺乏正调控)”，该文献虽然对基因ATHB6在干旱胁迫处理下的表达已经做了充分肯定，是脱落酸ABA诱导表达的正相关的基因，但到目前的报道显示该基因的转基因拟南芥植株的耐盐、抗旱和抗病虫方面的效果没有明显提高，此外至今尚未发现与本发明主题有密切联系文献的报道。
【发明内容】
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种甘蓝型油菜抗旱耐盐转录因子BnHB6蛋白编码序列，使其在抗旱耐盐具有明显的作用，能够明显降低在干旱和盐碱半盐碱土地上种植的各种农作物在生物产量上的损失。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种分离出的DNA分子，该分子包括：编码具有甘蓝型油菜BnHB6蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第207-1142位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能与SEQ IDNO.3中从核苷酸第207-1142位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的编码序列具有SEQID NO.3所示的氨基酸序列的多肽，或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。更佳地，所述的编码序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸第207-1142位的核苷酸序列。
本发明分离出的甘蓝型油菜HD-ZIP类相关蛋白质多肽BnHB6，它包括：具有SEQID NO.3氨基酸序列的多肽，较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.3序列的多肽，该多肽能够在盐、旱、淹水、创伤、活性氧以及水杨酸处理下均能发挥作用，而水杨酸是植物抗病虫的信号分子。
本发明提供的载体，它包含上述的DNA分子。一种核酸分子，它包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。
本发明用上述DNA分子转化的宿主细胞，它是真核细胞。在实例中该宿主细胞是拟南芥。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其蛋白质分开。
在本发明中，术语“甘蓝型油菜抗旱耐盐蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有甘蓝型油菜BnHB6蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中第207-1142位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框第207-1142位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中第207-1142位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.3所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下(70％-85％一致性)，更佳的在高度严紧条件下(85％以上一致性)与SEQ ID NO.3中从核苷酸第207-1142位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.3中从核苷酸第207-1142位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与天然的甘蓝型油菜BnHB6相同功能的蛋白的SEQ IDNO.3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，术语“甘蓝型油菜抗旱耐盐蛋白或多肽”指具有甘蓝型油菜BnHB6蛋白活性的SEQ ID NO.3序列的多肽。该术语还包括具有与天然甘蓝型油菜BnHB6相关相同功能的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括甘蓝型油菜BnHB6蛋白的活性片段和活性衍生物。
本发明的甘蓝型油菜BnHB6多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与甘蓝型油菜BnHB6相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用甘蓝型油菜BnHB6多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。
在本发明中，“甘蓝型油菜BnHB6保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.3的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。
表1最初的残基代表性的取代优选的取代Ala(A)Val；Leu；IleValArg(R)Lys；Gln；AsnLysAsn(N)Gln；His；Lys；ArgGlnAsp(D)GluGluCys(C)SerSerGln(Q)AsnAsnGlu(E)AspAspGly(G)Pro；AlaAlaHis(H)Asn；Gln；Lys；ArgArgIle(I)Leu；Val；Met；Ala；PheLeuLeu(L)Ile；Val；Met；Ala；PheIleLys(K)Arg；Gln；AsnArgMet(M)Leu；Phe；IleLeuPhe(F)Leu；Val；Ile；Ala；TyrLeuPro(P)AlaAlaSer(S)ThrThrThr(T)SerSerTrp(W)Tyr；PheTyrTyr(Y)Trp；Phe；Thr；SerPheVal(V)Ile；Leu；Met；Phe；AlaLeu
表2
85％ identity in 204-1142nt overlap
Query：204 TTGATGATGAAGAGATTAAGCAGTTCAGATTCAGTGGGTGGTCTCATCTCTTTATGTCCC 263
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Sbjct：216 TTGATGATGAAGAGATTAAGTAGTTCAGATTCAGTGGGTGGTCTCATCTCTTTATGTCCT 275
Query：264 ACTACTTCCACAGATCAGCCGAGTCCAAGAAGATACGG---GAGAGAATTTCAGTCGATG 320
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Sbjct：276 ACAACTTCCACAGATGAGCAGAGTCCGAGGAGATACGGTGGGAGAGAGTTTCAGTCGATG 335
Query：321 CTTGAAGGTTACGAGGAGGAAGAAGAAGAAGCCATAACCGAGGAAAGAGGACAAACCGGT 380
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Query：381 TTAGCCGAGAAGAAGAGACGGTTAAGCATTAACCAAGTTAAAGCCTTGGAGAAAAATTTC 440
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Query：441 GAGTTAGAGAACAAGCTTGAGCCCGAGAGGAAAGTGAAGCTAGCTCAAGAACTTGGTCTC 500
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Sbjct：453 GAGTTAGAGAATAAGCTTGAGCCTGAGAGGAAAGTTAAGTTAGCTCAAGAACTTGGTCTT 512
Query：501 CAACCTCGTCAAGTAGCTGTTTGGTTTCAGAACCGCCGTGCGCGGTGGAAGACAAAACAG 560
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Sbjct：573 CTTGAGAAAGATTACGGTGTTCTTAAAACCCAGTACGATTCTCTCCGTCATAACTTTGAT 632
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Sbjct：744 ACGGAGAGTGATATTTCGGTCAAGGAGGAAGAAGTTTCGTTGCCGGAGAAGATTACAGAG 803
Query：798 CCGCCGTCTTCTCCTCCGCAGCTTCTAGAGCATTCCGACAGTTTCAATTACCGGAGTTTC 857
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Sbjct：804 GCACCGTCGTCTCCTCCACAGTTTCTTGAACATTCTGATGGTCTTAATTACCGGAGTTTC 863
Query：858 ACCGACCTCCGCGACCTTCTTCCGTTAAAGGCCGCGGCTTCCTC---CGTCGCCGCCGCT 914
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Sbjct：864 ACAGATCTACGTGATCTTCTTCCATTAAAGGCGGCGGCTTCTTCATTCGCCGCCGCAGCT 923
Query：915 GGATCGTCGGACAGTAGCGATTCGAGCGCCGTGTTGAACGAGGAAAGTAGCTCTAACGTT 974
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Sbjct：924 GGATCTTCAGACAGTAGCGATTCAAGCGCTCTGCTGAATGAAGAAAGCAGCTCTAATGTC 983
Query：975 AC---GGCGGCTCCGGCGACGGTTCCCCGGCGGCAGTTTCTTGCAGTTTGTGAAAATGGA 1031
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Sbjct：984 ACTGTGGCGGCTCCGGTGACGGTT-CCAGGAGGTAATTTCTTCCAGTTTGTGAAAATGGA 1042
Query：1032 GCAGACGGAGGATCACGACGACTTTCTGAGTGGAGAAGAAGCGTGCGGGTTTTTCTCCGA 1091
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Sbjct：1043 GCAGACGGAGGATCATGAGGACTTTCTGAGTGGAGAAGAAGCTTGTGAATTCTTTTCCGA 1102
Query：1092 TGAACAGCCACCGTCTCTGCACTGGTATTCCACCGTTGATCAGTGGAA 1139
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Sbjct：1103 TGAACAACCGCCGTCTCTACACTGGTACTCCACCGTTGATCATTGGAA 1150
Query：1321 TTTCGTTCAGTTCTTGTAATTAAGGATCAT 1350
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Sbjct：1346 TTTCGTGCACTTCTTGTAATTAAGGATCAT 1375
Query：甘蓝型油菜BnHB6的核酸序列
Sbjct：拟南芥AtHB6的核酸序列(AY063819)
表2为本发明的甘蓝型油菜BnHB6蛋白与拟南芥AtHB6蛋白的核苷酸序列的同源比较(GAP)表。
表3
86％ identity in 311aa overlap，90％ similarity in 311aa overlap
Query：1 MMKRLSSSDSVGGLISLCPTTSTDQPSPRRY-GREFQSMLEGYEEEEEEAITEERGQTGL 59
MMKRLSSSDSVGGLISLCPTTSTD+ SPRRY GREFQSMLEGY EEEEEAI EERG GL
Sbjct：1 MMKRLSSSDSVGGLISLCPTTSTDEQSPRRYGGREFQSMLEGY-EEEEEAIVEERGHVGL 59
Query：60 AEKKRRLSINQVKALEKNFELENKLEPERKVKLAQELGLQPRQVAVWFQNRRARWKTKQL 119
+EKKRRLSINQVKALEKNFELENKLEPERKVKLAQELGLQPRQVAVWFQNRRARWKTKQL
Sbjct：60 SEKKRRLSINQVKALEKNFELENKLEPERKVKLAQELGLQPRQVAVWFQNRRARWKTKQL 119
Query：120 EKDYGVLKTQYDSLRHNFDSLRRDNESLLQEIGKLKAKLNGEEEVEEDDEDEENNAVTME 179
EKDYGVLKTQYDSLRHNFDSLRRDNESLLQEI KLK KLNG EE++E+ AVT E
Sbjct：120 EKDYGVLKTQYDSLRHNFDSLRRDNESLLQEISKLKTKLNGGGGEEEEEENNA--AVTTE 177
Query：180 SDVSVKEEEVSLPEELTDPPSSPPQLLEHSDSFNYRSFTDLRDLLPLK-AAASSVAAAGS 238
SD+SVKEEEVSLPE++T+ PSSPPQ LEHSD NYRSFTDLRDLLPLK AA+S AAAGS
Sbjct：178 SDISVKEEEVSLPEKITEAPSSPPQFLEHSDGLNYRSFTDLRDLLPLKAAASSFAAAAGS 237
Query：239 SDSSDSSAVLNEESSSNVT-AAPATVPRGSFLQFVKMEQTEDHDDFLSGEEACGFFSDEQ 297
SDSSDSSA+LNEESSSNVT AAP TVP G+F QFVKMEQTEDH+DFLSGEEAC FFSDEQ
Sbjct：238 SDSSDSSALLNEESSSNVTVAAPVTVPGGNFFQFVKMEQTEDHEDFLSGEEACEFFSDEQ 297
Query：298 PPSLHWYSTVDQWN 311
PPSLHWYSTVD WN
Sbjct：298 PPSLHWYSTVDHWN 311
Query：甘蓝型油菜BnHB6的氨基酸序列
Sbjct：拟南芥AtHB6的氨基酸序列(S47136)
表3为本发明的甘蓝型油菜BnHB6蛋白与拟南芥AtHB6的氨基酸序列的同源比较(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。
发明甘蓝型油菜BnHB6蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然甘蓝型油菜BnHB6相关多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的甘蓝型油菜BnHB6多肽时，可以将甘蓝型油菜BnHB6编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成甘蓝型油菜BnHB6蛋白表达载体。
如本发明所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中，术语“宿主细胞”为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。
还可用Northern印迹法技术分析甘蓝型油菜BnHB6基因产物的表达，即分析甘蓝型油菜BnHB6的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。
此外，本发明提供的可用作探针的核酸分子，该分子通常具有甘蓝型油菜BnHB6核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码甘蓝型油菜BnHB6相关的核酸分子。
本发明的检测样品中是否存在甘蓝型油菜BnHB6相关核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于甘蓝型油菜BnHB6相关核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。
此外，根据本发明的甘蓝型油菜BnHB6核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选甘蓝型油菜BnHB6相关同源基因或同源蛋白。
为了得到与甘蓝型油菜BnHB6相关基因相关的甘蓝型油菜cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选甘蓝型油菜cDNA文库，这些探针是在低严谨条件下，用32P对甘蓝型油菜BnHB6相关的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自甘蓝型油菜的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。这种筛选方法可以识别与甘蓝型油菜BnHB6相关相关的基因家族的核苷酸序列。
本发明的甘蓝型油菜BnHB6相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH FreemanCo.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。
利用本发明的甘蓝型油菜BnHB6蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与甘蓝型油菜BnHB6相关发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。
本发明具有实质性特点和显著进步，本发明在抗旱耐盐具有明显的作用，能够明显降低在干旱和盐碱半盐碱土地上种植的各种农作物在生物产量上的损失。地球上存在大面积的干旱半干旱、盐碱半盐碱地区，因此，本发明具有很大的应用价值。
【具体实施方式】
下面结合实验室试验具体数据，以具体实施例来进一步阐述本发明：
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
甘蓝型油菜BnHB6基因的克隆
1.组织分离(isolation)
甘蓝型油菜(品种为“沪油15”)从市场上购得，将甘蓝型油菜置于28℃发芽24小时，然后播种于温室中，待甘蓝型油菜叶片为3-5片时，准备抽取DNA或RNA。
2.RNA的分离(RNA isolation)
取部分组织，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至1.5mL EP管中，抽提总RNA(TRIzol Reagents，GIBCOBRL，USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。
3.基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)
根据拟南芥AtHB6基因的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法(GibcoBRL试剂盒)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行：
(1)RT-PCR
PCR[HB001(SEQ ID NO.1)+HB002(SEQ ID NO.2)]得到2003BP(761bp)，回收，连接到pGEMT-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知十字花科植物如拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtHB6基因的同源性很高，故初步认为它是一个HD-ZIP基因。
(2)3’-RACE
PCR[AP+HB301(5’-CGCCGCTGGATCGTCGGACA-3’)]得到HB3’(474bp)，回收，连接到T-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知十字花科植物如拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtHB6基因的同源性很高，故初步认为它是一个与HD-ZIP相关基因。
(3).5’-RACE
第一轮PCR[AAP+RD501(5’-GTGATCCTCCGTCTGCTCCA-3’)]
第二轮PCR[(AUAP+RD502(5’-TCCGGCAACGAA(A/T)CTTCTTC-3’))得到HB5’(约233bp)(过程同(1))
将测序结果的重叠区拼接，发现过程(1)得到的片段既是该基因的完整编码区。
BLAST的结果证明从甘蓝型油菜中新得到的基因确为一个与拟南芥AtHB6相关的基因。
通过组合使用上述3种方法，获得了候选的甘蓝型油菜BnHB6蛋白的全长编码序列(SEQ ID NO.3)。
实施例2
甘蓝型油菜BnHB6基因的序列信息与同源性分析
本发明新的甘蓝型油菜BnHB6全长cDNA的长度为1572bp，详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于207-1142位核苷酸(935个核苷酸)。根据全长cDNA推导出甘蓝型油菜BnHB6的氨基酸序列，共311个氨基酸残基，分子量为35176.49道尔顿，等电点(pI)为4.57。详细序列见SEQ ID NO.3。
将甘蓝型油菜BnHB6的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与拟南芥基因AtHB6在核苷酸水平上具有85％的相同性，(附表2)；在氨基酸水平上，它与拟南芥基因AtHB6(S47136)也有86％的相同性(附表3)。由此可见，甘蓝型油菜基因BnHB6与拟南芥基因AtHB6无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性。拟南芥基因AtHB6(S47136)已经被证明在干旱条件下明显增强表达，并发挥着重要的作用，可以认为甘蓝型油菜基因BnHB6在抗旱耐盐方面也具有相似的作用。
实施例3
甘蓝型油菜基因BnHB6蛋白或多肽在拟南芥中进行真核细胞表达及转基因植株的抗旱耐盐性鉴定
含目的基因(甘蓝型油菜基因BnHB6)的表达载体的构建
根据甘蓝型油菜基因BnHB6的全长序列(SEQ ID NO.3)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将甘蓝型油菜基因BnBDCl基因cDNA克隆至中间载体(如pBluescript)，进一步克隆到双元表达载体(如pBI121和改进的pCAMBIA2300)，在保证阅读框架正确的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入农杆菌中，利用叶盘法技术转化模式植物拟南芥。
1.发苗：种子用无菌水漂洗15-20分钟，再用70％的乙醇消毒1分钟，然后用0.1％升汞消毒10-12分钟。最后再用无菌水冲洗5遍。将洗好的种子用吸水纸吸干，放入MS培养基。光照培养5天，待苗长到4-5厘米便可以剪苗。
2.剪苗：剪取0.5-1厘米的下胚轴小片段放入预培养基，培养2天。
预培养基：MS+6BA(0.2mg/l)+2.4D(1.2mg/l)
3.转化共培养：将预培养2天的下胚轴放入事先培养好的菌液中(OD值0.4-0.6)侵染3-5分钟。接着取出放入预培养基暗培养2天。
4.筛选培养：共培养结束后，将外植体放入筛选培养基。2周继代一次。2-4周有愈伤组织形成和芽的分化。待绿芽长到2厘米后，切下生根。
筛选培养基：MS+6BA(4.5mg/l)+NAA(0.1mg/l)+AgNO3(6mg/l)+cb(250mg/l)+Kan(20mg/l)
生根培养基：MS+NAA(0.5mg/l)+cb(250mg/l)+Kan(5mg/l)
5.转化植株培养；待根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。
含甘蓝型油菜基因BnHB6的转基因拟南芥植株的抗旱耐盐性鉴定
鉴于编码BnHB6，如拟南芥的AtHB6基因已被证明在抗旱耐盐条件下发挥作用，而甘蓝型油菜基因BnHB6转录水平与拟南芥的AtHB6具有较高的同源性，可进一步对含甘蓝型油菜基因BnHB6的转基因拟南芥植株进行抗旱耐盐鉴定。用300mM氯化钠和300mM甘露醇处理处理转基因植株和转基因植株的种子(2天、7天、14天、21天、28天)后研究BnHB6基因在转基因植株中的表达情况以及各种处理对植株的生长情况。Northern blot分析结果证明，转基因植株BnHB6转录水平在盐和甘露醇处理后其表达量显著增强，而对照非转基因植株虽表达量提高，但明显低于转基因植株。此外非转基因植株生长缓慢，最后在盐和甘露醇处理下枯萎而死，转基因植物依然能正常生长，只是比未经处理的植株生长稍慢。在抗厌氧、抗氧化和抗病试验中，转基因植株也明显表现出比对照(未转基因植株)生长正常。这证明甘蓝型油菜基因BnHB6基因比拟南芥基因AtHB6具有更有效的和更广泛的抗逆境的功能，将可用于利用转基因技术改良植物抗旱耐盐的研究和产业化生产中。
实施例4
甘蓝型油菜基因BnHB6在甘蓝型油菜中的拷贝数分析
采用常规方法从甘蓝型油菜叶片中提取DNA(参考《分子克隆》，Sambrook等，1989)，分别用HindIII Xba I BamH和EcoRI酶切DNA[13μg(微克)/样品]后，将DNA转至杂交膜(尼龙膜)上后。使用Amersham Pharmacia公司Gene ImagesTMContents CDP-StarTM labelling module(PRN3540)，我们将BnBDC1基因编码区标记为探针，然后进行杂交(于60℃杂交16小时)。取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于60℃漂洗3次，每次15分钟。转入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于60℃漂洗3次，每次同样15分钟。用X光片压片60-90分钟，然后显影、定影(方法参照Roche DIG labeled试剂盒说明书)。结果(Southern blot)发现在杂交膜上出现多条杂交条带，说明甘蓝型油菜基因BnHB6在甘蓝型油菜中拷贝数不低于2。
实施例5
甘蓝型油菜基因BnHB6在不同处理的甘蓝型油菜中的表达谱分析
1.RNA的提取：将生长了3-5片叶的甘蓝型油菜幼苗先后经200mM甘露醇0.5小时、100mMNaCl3小时、4℃48小时、1500μJ/m2紫外线照射0.5小时，淹水处理两天，剪刀创伤后0.5小时，200uM H2023小时，100μM脱落酸4小时和500uM水杨酸12小时处理，然后用TRIzol试剂盒(GIBCO BRL，USA)提取并参考《分子克隆》有关RNA的制备章节(Sambrook等，1989)。
2.RNA的定量：参考《分子克隆》(Sambrook等，1989)，分光光度计测OD260；RNA含量计算：1 OD260＝40μg/ml。
3总RNA琼脂糖凝胶电泳分离：1)取6ml 25*(倍)电泳缓冲液，加入117ml无菌水，混匀。2)称取1.5g琼脂糖，加入到上述溶液中，于微波炉里加热融化，转入55℃水浴中。3)于通风橱中取26.8ml甲醛，加入到55℃的凝胶溶液中，混匀。4)迅速倒入制胶板中，室温水平放置30分钟，待胶凝固。5)将提取的RNA(20μg)溶解于RNA变性溶液中，在65℃下加热10分钟，然后立即放在冰上。6)在样品中加入2ul 10*上样缓冲液，混匀。7)在电泳液未盖过胶的条件下点样，5V/cm电压电泳5小时左右。
4.RNA尼龙膜上转移：1)转移之前，将尼龙膜用10*SSC浸泡。2)将湿润的膜准确地盖在膜上，将两张与膜大小相同的滤纸置2*SSC溶液中湿润，盖在膜上，排除气泡。3)滤纸上放一叠与膜大小相同的吸水纸，在吸水纸上放一玻璃板和一重物，水平放置，转移12-20小时。4)转移后，将膜于80℃烘烤2小时。
5.膜上杂交信号的检出：1)将膜浸在5×Dendart’s，0.1％SDS，0.1mg/ml鲑鱼精DNA]，65℃下预杂交2小时。2)将用Gene ImagesTM Contents CDP-StarTM labellingmodule标记的探针在沸水中变性5分钟，直接加入1)的杂交液中，于65℃杂交16-24小时。3)取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于65℃漂洗3次，每次15分钟。转入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于65℃漂洗3次，每次15分钟。4)用X光片压片60-90分钟，然后显影、定影(方法参照Roche DIG labeled试剂盒说明书)。Northern杂交表明：除了冷处理外，不同的化学物质、环境和激素处理，都不同程度的提高了甘蓝型油菜BnHB6转录水平。说明甘蓝型油菜BnHB6转录水平在干旱、盐、创伤和活性氧胁迫下，均能发挥作用。水杨酸处理也明显提高该基因的表达水平，说明该基因在病虫害胁迫下也会发挥作用。
甘蓝型油菜BnHB6基因在甘露醇和脱落酸的不同时间处理的表达谱分析
1.RNA的提取：将生长了3-5片叶的甘蓝型油菜幼苗经200mM甘露醇处理2分钟、5分钟、20分钟、1小时、3小时、6小时和12小时，然后按照上面提到的方法抽提RNA，并进行定量；同时将生长了3-5片叶的甘蓝型油菜幼苗经100mM脱落酸处理，处理时间和抽提方法同上。
2.Northern杂交方法同实施例5。试验结果证明，随着甘露醇和脱落酸处理时间的延长，BnHB6的表达逐步增强，说明BnHB6是干旱和逆境信号激素脱落酸诱导表达的，在油菜抗逆性中扮演重要的角色。
本发明涉及的序列及记号分列如下：
(1)SEQ ID NO.1的信息
(i)序列特征：
(A)长度：21bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii).分子类型：寡核苷酸
(iii).序列描述：SEQ ID NO.1
GC ATA ACT T(A/T/C/G)G ATT CCC TCC
(2)SEQ ID NO.2的信息
(i)序列特征：
(A)长度：20bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii).分子类型：寡核苷酸
(iii).序列描述：SEQ ID NO.2
(A/T)TT CCC GCC CA(A/G)A(A/T/C/G)T TAA CC
(2)SEQ ID NO.3的信息
<110>上海交通大学
<120>甘蓝型油菜抗旱耐盐转录因子BnHB6蛋白编码序列
<140>
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1572
<212>DNA
<213>甘蓝型油菜(Brassica napus)
<400>1
ttcatatgga aaacaaagaa ctctgtctct ctctctcctc tcttactgaa tagaatctcc 60
ccattgttct aatttatctc ttccttcaaa gtattgatca tcaagtacta gatgcatttt 120
aaactgagag ttaaaacaaa caaaaaaatc attattttga agtaactaaa aggtttttga 180
gaagaccctt tttgtagtgc tgtttgatga tgaagagatt aagcagttca gattcagtgg 240
gtggtctcat ctctttatgt cccactactt ccacagatca gccgagtcca agaagatacg 300
ggagagaatt tcagtcgatg cttgaaggtt acgaggagga agaagaagaa gccataaccg 360
aggaaagagg acaaaccggt ttagccgaga agaagagacg gttaagcatt aaccaagtta 420
aagccttgga gaaaaatttc gagttagaga acaagcttga gcccgagagg aaagtgaagc 480
tagctcaaga acttggtctc caacctcgtc aagtagctgt ttggtttcag aaccgccgtg 540
cgcggtggaa gacaaaacag ctcgagaaag attacggtgt tctcaaaacg cagtacgatt 600
ctctccgcca taacttcgat tccctccgcc gtgacaatga atctcttctt caagagatcg 660
gtaaactaaa agctaagcta aacggagaag aagaagttga agaagatgat gaagatgaag 720
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