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从克隆的核苷酸序列制备减毒负链RNA病毒疫苗
    背景技术

    负链RNA病毒包含有不同目的重要且高破坏性的病原体单负链病毒(Mononegavirales)。这个组中的人类病原体包括狂犬病病毒(RaV)、麻疹病毒(MeV)、腮腺炎病毒(MuV)、呼吸道合胞病毒(RSV)及数个基因型的副流感病毒(PIV)。以RSV为例，因为其在一岁以内的婴儿中导致肺炎及支气管炎疾病，该病原体危害位于其他所有微生物病原体之上。在因呼吸道疾病而入院治疗的儿童中，由RSV引起的占1/5以上，RSV在美国一年内导致估计有91,000名患者住院及4,500名死亡。人类PIV病毒(例如，HPIV1、HPW2及HPIV3)在人群中也导致很严重的疾病，其可导致支气管炎、哮喉及肺炎，尤其是在婴幼儿中。Karron等，J.Infect.Dis.172：1445-50(1995)；Collins等，″副流感病毒″(Parainfluenza Viruses)，p.1205-1243。在B.N.Fields等编辑地Fields Virology，第三版，第一卷，Lippincott-Raven出版社，费城(1996)；Murphy等，病毒研究(Virus Res.)，11：1-15(1988)。人类PIV病毒所致感染在婴幼儿呼吸道感染而住院的群体中占据接近20％。

    尽管经过数十年的研究也研制出几种有效疫苗以对抗RSV及PIV，但是还没有获得既安全又有效的疫苗以降低严重RSV感染的发病率和死亡率。同样需要研制出有效的疫苗或改良疫苗来对抗另一些重要的单负链病毒。阻碍抗负链RNA病毒的活疫苗发展的障碍是在减毒及免疫原性之间取得平衡的困难性。减毒病毒的遗传稳定性同样是一个问题。在RSV疫苗的发展过程中也遇到RSV在细胞培养中生长性较差及病毒颗粒不稳定性等困难。RSV感染的另一特征是诱导产生的免疫性并不完全保护随后产生的感染。产生这种情况的原因很多，包括免疫系统在呼吸道的腔表面限制病毒感染方面相对低效，局部粘膜免疫的短期性，快速及广泛的病毒复制，婴幼儿中由于免疫系统不成熟所致减毒的免疫反应，由于母亲血清抗体经胎盘传输所致的免疫抑制，以及病毒的某些特征如G蛋白的高度糖基化。同样正如下面所讨论的那样，RSV以两个抗原亚型A及B的形式存在，对抗其中之一的免疫性对另一个亚型效力较低。

    在二十世纪60年代中叶，甲醛灭活的病毒疫苗作为抗RSV的疫苗被测试，但在抗RSV感染或疾病的保护上没有获得成功，且事实上随后的病毒感染呈现恶化的症状。(Kim等，Am.J.Epidemiol.，89：422-434(1969)，Chin等，Am.J.Epidemiol.，89：449-463(1969)；Kapikian等，Am.J.Epidemiol.，89：405-421(1969))。最近，RSV疫苗的开发已聚焦于减毒RSV突变株上。Friedewald等，J.Amer.Med.Assoc.204：690-694(1968)报道了RSV的一种冷传代突变株(cpRSV)，其被充分减毒成为候选疫苗。此突变株与野生型(wt)亲代病毒相比，显示出轻微增加的在26℃生长的能力，但其复制既没有温度敏感性也没有明显的冷适应性。然而，却将冷传代突变株减毒用于成年人。尽管对于已被RSV感染的婴幼儿(例如，血清反应阳性的个体)，cpRSV已令人满意地被减毒并且具有免疫原性，但cpRSV仍保留对于血清反应阴性婴儿上呼吸道的低水平毒性。

    类似的，Gharpure等人，病毒学杂志(J.Virol.)3：414-421(1969)报道了作为有价值的候选疫苗的温度敏感性RSV(tsRSV)突变株。一种突变株ts-1，被广泛地用于实验室和自愿受试者中。突变体在成年自愿者中产生无症状感染且在致免疫45天后对野生型病毒攻击产生抗性。对比血清反应呈阳性的婴儿和遭受无症状感染的儿童，血清反应呈阴性的婴儿呈现鼻炎征兆和其它轻微的症状。此外，ts表型的稳定性被检测到，尽管表现出部分或全部温度敏感性缺失的病毒占可从疫苗重新获得的病毒的较小比例，且不与除轻微鼻炎疾病以外的疾病征兆相关联。

    这些和其它的研究显示特定的冷传代和温度敏感性RSV株被不充分减毒且在疫苗接种者导致轻微的疾病特征，尤其血清反应阴性的婴儿，而其它的被超减毒且不能充分的复制来引起保护性的免疫应答，(Wright等，Infect.Immun.，37：397-400(1982))。此外，候选疫苗突变株的遗传不稳定性导致其温度敏感性表型的缺失，进一步阻碍了有效的RSV疫苗的开发。通常参见，Hodes等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.145：1158-1164(1974)，McIntosh等，Pediatr.Res.8：689-696(1974)，以及Belshe等，J.Med.Virol.，3：101-110(1978)。

    抛弃了通过不确定的生物学方法例如冷传代构建合适减毒RSV株的方法，研究者通过纯化的RSV包膜糖蛋白来测试亚型疫苗候选毒株。糖蛋白在棉鼠的肺中诱导对RSV感染的抗性，Walsh等，J.Infect.Dis.155：1198-1204(1987)，但是抗体具有非常弱的中和活性，且用纯化的亚型疫苗免疫啮齿动物会导致疾病的加强，这使人联想到先前已处理过的RSV疫苗(Murphy等，Vaccine 8：497-502(1990))。

    表达F或G包膜糖蛋白的基于疫苗病毒重组体的疫苗已被进行研究。这些重组体表达不能被从真正病毒对应物中区别开的RSV糖蛋白，用疫苗-RSV F和G重组体经皮感染的啮齿动物表现出高水平的中和病毒感染力的特异性抗体。事实上，棉鼠用疫苗F重组体感染可刺激出对RSV在下呼吸道复制的几乎完全的抗性以及在上呼吸道中的明显的抗性。Olmsted等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)83：7462-7466(1986)。然而，用疫苗F和G重组体免疫黑猩猩，在上呼吸道中几乎没有提供抗RSV攻击的保护(Collins等，Vaccine8：164-168(1990))，其在下呼吸道中提供的保护前后不一(Crowe等，疫苗(Vaccine)11：1395-1404(1993))。

    针对RSV和其它负链RNA病毒的生物减毒疫苗株、亚型疫苗以及其它疫苗开发策略的不成功使得迫切需要一种新的方法来开发新的疫苗，特别是人工重组候选疫苗的方法来加入遗传变化，以生产具有新表型特性的活减毒RSV重组体。然而，对RSV和其它反义RNA病毒的基因组RNA的操纵处理至今仍是很难的。此方面的主要障碍包括这些病毒的裸露的基因组RNA的非感染性、病毒在组织培养物中的不良生长、冗长的复制循环、病毒体的不稳定性、染色体组复杂以及基因产物结构的难以控制。

    以PIV3为例，两个活减毒候选疫苗已经得到了特别的关注，这其中一个候选疫苗是牛PIV3(BPIV3)株其与HPIV3在抗原性上相关，且其已显示保护动物抵抗HPIV3。BPIV3是减毒的，遗传稳定的，且在人类婴幼儿中是具有免疫原性的(Karron等，J.Inf.Dis.171：1107-14(1995a)；Karron等，J.Inf.Dis.172：1445-1450，(1995b)).另一个PIV3候选疫苗JS cp45，是HPIV3的JS野生型(wt)株的冷适应性突变株(Karron等，(1995b)，同上；Belshe等，J.Med.Virol.10：235-42(1982))。该活减毒、冷传代(cp)PIV3候选疫苗展示出温度敏感性(ts)、冷适应性(ca)及其在体内病毒复制后具有稳定性的减毒(att)表型。cp45病毒在实验动物中可以产生抗人类PIV3的活性且其是减毒的，遗传稳定的，且在血清反应阴性的人类婴幼儿中具有免疫原性(Hall等，病毒研究22：173-184(1992)；Karron等，J.Infect.Dis.172(6)：1445-1450(1995b)，同上)。

    重组DNA技术使得从cDNA重新获得有感染力的负链RNA病毒、遗传操作病毒克隆来构建新的候选疫苗、以及快速估计其减毒和表型稳定性的水平成为可能(综述参见Conzelmann，J.Gen.Virol.77：381-89(1996)；Palese等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：11354-58，(1996))。在此文中，已报道了在必需病毒蛋白的存在下由cDNA编码的反基因组RNA来重组拯救传染性的呼吸道合胞病毒(RSV)、人类副流感病毒3(HPIV3)、狂犬病病毒(RaV)、水泡性口膜炎病毒(VSV)、麻疹病毒(MeV)、仙台病毒(Sev)、牛瘟病毒、S型猿猴病毒和牛RSV(参见，例如，Garcin等，EMBO J.14：6087-6094(1995)；Lawson等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.).92：4477-81(1995)；Radecke等，EMBO J.14：5773-5784(1995)；Schnell等，EMBO J.13：4195-203(1994)；Whelan等，美国国家科学院学报.92：8388-92(1995)；Hoffman等，病毒学杂志(JVirol.)71：4272-4277(1997)；Kato等，Genes to Cells 1：569-579(1996)，Roberts等，病毒学(Virology)247(1)，1-6(1998)；Baron等，病毒学杂志(J Virol.).71：1265-1271(1997)；国际申请WO97/06270；Collins等，美国国家科学院学报92：11563-11567(1995)；Durbin等，病毒学(Virology)235：323-332(1997)；专利申请U.S.No.08/892,403,申请于1997年7月5日，(相应于国际申请WO 98/02530，优先权为美国临时申请60/047,634(申请于1997年5月23日)、60/046,141(申请于1997年5月9日)和60/021,773(申请于1996年7月15日))；Juhasz等，J.Virol.71(8)：5814-5819(1997)；He等Virology237：249-260(1997)；Whitehead等，病毒学247(2)：232-9(1998a)；Whitehead等，病毒学杂志72(5)：4467-4471(1998b)；Jin等，病毒学251：206-214(1998)；Bucholz等，病毒学杂志73：251-259(1999)；以及Whitehead等，病毒学杂志73：(4)3438-3442(1999)，所述文献均引入本文作参考)。

    尽管使用反求遗传学手段以回收和修饰重组、负链RNA病毒是可行的，本领域一个迫切的需要却仍是使用另外的工具及方法以产生安全且有效的疫苗以缓解因为单负链病毒如RSV、PIV及其他病原体对身体健康的严重损害。本文所述的其他挑战是获取适度减毒、免疫原性及遗传稳定的候选疫苗的困难性。为达到这个目的，现有的鉴别减毒突变及在重组病毒株中引入减毒突变的方法必须进一步提高及改进。令人惊奇的是，本发明实现了该目的且提供了如下文所述的另外的优点。发明概述

    本发明提供新的方法及组合物以设计及生产适于疫苗使用的减毒的、重组负链RNA病毒。按照本发明所述的方法，重组负链RNA病毒产生自一个或数个分离的编码该病毒的多核苷酸。这可以通过在细胞或无细胞体系中共表达编码该病毒重组基因组或反基因组及产生感染性病毒及其颗粒所必须的病毒蛋白的一个或多个多核苷酸分子来完成。

    主题病毒的重组基因组及反基因组经过修饰以编码一个突变，其在一个重组病毒蛋白的一个或数个氨基酸位置发生改变，这些位点对应于在一个异源、突变负链RNA病毒的减毒突变位点。突变因此以可采用的或重复的方式“转移”，以赋予该重组病毒减毒表型。以这种方式，候选疫苗病毒被重组改造，以引发免疫反应，所述免疫反应在易于被主题病毒感染的宿主中可以抵抗所选择的负链RNA病毒。

    在与本发明相关的一些方面，提供了分离的多核苷酸分子及载体，其可以编码一个减毒的、重组负链病毒基因组或反基因组。与上述方面相关，主题基因组或反基因组编码一个在选择的病毒重组蛋白中在相应于异源的、突变负链RNA病毒中的减毒突变位点的氨基酸位置上发生的突变。

    同样本发明提供了包含如上进行突变的、减毒的、重组负链RNA病毒的方法及组合物，以预防及治疗由主题病毒所引起的感染。

    在本发明的一个优选实施例中，重组负链RNA病毒可以是一个呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒(PIV)或者麻疹病毒。与每一实施方案都相关联的是，异源性、突变负链RNA病毒可以是一个异源性RSV、人类副流感病毒(HPIV1、HPIV2、HP1V3)、牛PIV(BPIV)、仙台病毒(SeV)、新城疫病毒(NDV)、猿猴病毒5(SV5)、腮腺炎病毒(MuV)、麻疹病毒(MeV)、犬瘟热病毒(CDV)、狂犬病病毒(RaV)或者水泡性口膜炎病毒(VSV)。

    不同的目标蛋白应有益于在一个负链RNA病毒中的一个异源性蛋白的相应位点引入减毒突变，其与本发明所述方法相适应。在单负链病毒目中，五个目标蛋白都严格保守且在特定区域显示出适度至高度的序列同一性。特别是，该目所有成员都有五个蛋白的同源簇：一个核壳蛋白(N)，一个核壳磷蛋白(P)，一个非糖基化基质(M)蛋白，至少一个表面糖蛋白(HN、H或者G)及一个大的聚合酶(L)蛋白。这些蛋白都是适用于在相应于异源性突变病毒株中鉴别的减毒突变位点的位点上在重组病毒的蛋白中改变一个或多个保守残基以引入减毒突变的目标蛋白。

    在本发明更为详细的方面，可以靶向其他蛋白，其只可局限于由单负链病毒中特殊的科、亚科、属或种所具有的蛋白。例如，副粘病毒科的所有成员至少有两种表面糖蛋白，HN(或H或G)及F。在呼吸道病毒属、Rubulavirus及麻疹病毒属几乎所有的成员中都有一个富半胱氨酸蛋白V。呼吸道病毒及麻疹病毒同样编码一个同源性C蛋白。肺病毒属及Rubulaviruses的一个亚型(猿猴病毒5(SVS)及腮腺炎病毒(MuV))都具有同源性表面糖蛋白SH。在肺病毒属中(包括牛、绵羊及公山羊RSV及鼠肺病毒——在这儿也可称为鼠RSV)，几种其他蛋白，即NS1、NS2、M2(ORF1)及M2(ORF2)，都是保守性的。鸟类肺病毒缺乏NS1及NS2但具有M2(ORF1)、M2(ORF2)及SH蛋白。前述的每一蛋白提供一有用的目标，其可以在具有相同目标蛋白的分类群之间异源转移减毒突变。

    在本说明书中，本发明所述的方法是基于对第一负链RNA病毒中减毒突变的识别。在标记突变位点的主题氨基酸位置上相对于野生型序列而被识别为突变体的这一突变，提供了和不同的病毒中的同源蛋白进行序列对比的标记，所述不同的病毒是用于重组减毒的目标病毒。减毒突变可以提前获知，也可以通过诱变及反求遗传学技术进行鉴别，这些技术用于产生及表征生物学上获得的突变病毒。作为一种选择，感兴趣的减毒突变可以例如通过定点诱变及传统的筛选方法被重新产生及表征。

    每一在负链RNA病毒株中鉴别出的减毒突变都提供了与一个或多个异源负链病毒株中的同源性蛋白进行序列对比的标记。在本说明书中，可分析现有的序列对比，或者可将传统的序列对比方法用于进行序列对比分析，以鉴别出在携有减毒突变的蛋白及不同病毒同源性蛋白之间相应的蛋白区域及氨基酸位置，其中所述病毒是用于减毒的目标重组病毒。当一个或多个标记减毒突变的残基由野生型而改变，该野生型在目标病毒蛋白中的相应氨基酸位置是保守的，目标病毒的基因组及反基因组经过重组修饰为编码一氨基酸缺失、替换或插入，以改变目标病毒蛋白中的保守残基并因此在重组病毒中赋予同功的、减毒表型。

    在这个构建减毒重组负链RNA病毒株的合理设计方法中，在一个负链RNA病毒中的标记减毒突变的氨基酸残基位点的野生型特性可能是严格保守的，也可能是在目标病毒蛋白的相应氨基酸残基位点进行了保守性替换。这样，相对于野生型残基来说，目标病毒蛋白的相应残基可以是同一性的，或者可能是在氨基酸侧链基团的结构及功能方面是保守性相关的，在异源突变病毒中所述野生型残基通过减毒突变而改变。在任一种情况下，重组病毒的同功性减毒可以通过修饰目标病毒的重组基因组或反基因组来编码氨基酸缺失、替换或插入以改变保守性残基等本发明所述方法来实现。在本说明书中，优选修饰基因组或反基因组以编码保守性残基的改变，其保守地对应于在异源突变病毒中标记有的减毒突变的改变。例如，如果与相应的野生型序列相比氨基酸替换在突变病毒株中标记突变位点，则在相应的重组病毒残基位点可以进行这样的替换。优选所述替换相对于突变病毒蛋白中的替换残基是同一性的或保守性的。然而，同样可能相对于突变蛋白的替换残基在非保守性突变的天然氨基酸残基位置上发生改变(例如，通过使用任一其他氨基酸来破坏或损害野生型残基的特性及功能)。在以缺失或插入标记的突变的情况下，这些可以以相应的缺失或插入转移到重组病毒中去。然而，缺失或插入的蛋白片段的氨基酸序列及具体大小可以改变。

    在本发明的另一方面，除了预期的减毒表型外，引入重组负链病毒中去的突变还可以提供其他表型，这样，除了减毒表型以外，引入重组病毒蛋白中去的典型突变还可以赋予温度敏感性(ts)的、冷适应(ca)、小噬斑型的(sp)或宿主范围限制型的(hr)表型，或者生长或免疫原性的改变。

    在本发明的一个典型实施方案中，一个ts或非ts突变发生在负链病毒大的聚合酶L蛋白，例如HPIV3。一个减毒突变在一个异源突变负链RNA病毒株中(例如，RSV)被发现，其也可以是任一病毒，其具有与有感兴趣突变的PIV3相关的保守性的蛋白结构。在更为详细的实施方案中，异源突变病毒株中的减毒突变包含有一个氨基酸替换，其是在人类RSV cpts530(ATCC VR 2452)L蛋白的521位点的苯丙氨酸上的替换。

    在另一个典型实施方案中，一个ts或非ts减毒突变发生在副流感病毒(PIV)的重组蛋白中，例如人类PIV1(HPIV1)、人类PIV2(HPIV2)、人类PIV3(HPIV3)、牛PIV(BPIV)或鼠PIV(MPIV或仙台病毒)。重组基因组或反基因组被修饰以编码在重组病毒的N、P、C、D、V、M、F、HN或L蛋白中的氨基酸替换、缺失或插入。突变可以在重组病毒中产生一个ts或非ts减毒表型。优选的是，异源突变负链RNA病毒中的减毒突变相应于生物学上获得的突变HPIV3株JS cp45的突变，且其优选是在HPIV3 JS cp45的L蛋白中的氨基酸替换。在本说明书中典型的突变包括在HPIV3株JS cp45的L蛋白的942位酪氨酸的替换，HPIV3株JS cp45的L蛋白的992位亮氨酸的替换，和/或HPIV3株JS cp45的L蛋白的1558位苏氨酸上的氨基酸替换。

    但是在用于构建本发明所述重组PIV的异源突变负链RNA病毒株中所发现的其他突变包含有一个HPIV3株JS cp45的F蛋白中的氨基酸替换。在一个实施方案中，异源病毒株中的减毒突变包含有HPIV3株JS cp45的F蛋白的420位的异亮氨酸的替换。作为一种选择，减毒突变也可包括HPIV3株JS cp45的F蛋白的450位的丙氨酸的替换。同样，重组PIV的减毒可以通过修饰重组PIV基因组或反基因组以编码一个在RSV中发生的减毒突变的同功突变来实现。在下面所述的这样的一个实施方案中，RSV中所发生的减毒突变包括有一个RSV的L蛋白的521位苯丙氨酸的替换。PIV基因组或反基因组已被修饰以编码一个保守地相应于在异源RSV突变株中标记减毒突变的残基改变的保守性残基的改变。在一个实施方案中，突变发生在重组HPIV3蛋白中且包括一个发生在HPIV3株JS cp45的L蛋白的456位苯丙氨酸上的氨基酸替换。

    但是本发明另外的PIV候选疫苗可以通过修饰重组PIV基因组或反基因组以编码与仙台病毒(SeV)中发生的减毒突变来同功的突变完成。在下述的一个实施方案中，减毒突变包含有SeV的C蛋白170位苯丙氨酸的替换。PIV基因组或反基因组被修饰以编码一个保守性地相应于在异源SeV突变株中标记减毒突变的残基改变的保守性残基的改变。在一个实施方案中，突变在重组HPIV3蛋白中发生并包含有在HPIV3的C蛋白的164位点发生的苯丙氨酸的氨基酸。

    在另一些典型实施方案中，一个ts或非ts减毒突变在麻疹病毒(MeV)的重组蛋白中发生。其中发生减毒突变的异源突变负链RNA病毒可以是呼吸道合胞病毒(RSV)、人类副流感病毒(HPIV)1、HPIV2、HPIV3、牛PIV(BPIV)、仙台病毒(SeV)、新城疫病毒(NDV)、猿猴病毒5(SV5)、腮腺炎病毒(MuV)、麻疹病毒(MeV)、犬瘟热病毒(CDV)、狂犬病病毒(RaV)或者水泡性口膜炎病毒(VSV)。更为适宜的是，异源突变病毒是HPIV3 JS cp45。在更为详细的实施方案中，HPIV3 JS cp45中所发生的减毒突变包含有在L蛋白992位亮氨酸或在942位酪氨酸的氨基酸替换。

    但是本发明所提供的另外的实施方案中，重组负链RNA病毒是一个嵌合病毒。更为详细的情况是，该病毒具有一个重组基因组或反基因组，其包含有与其他负链RNA病毒株、亚型或种的异源基因或基因片段结合的一个负链RNA病毒株、种或亚型的一部分或全部的基因组或反基因组。减毒突变可以任选地发生在由所述异源基因或基因片段所编码的蛋白或蛋白区域。在优选的方面，嵌合病毒是一个具有与异源PIV种、亚型或株的HN及F糖蛋白基因的至少一个基因或基因片段结合的一个PIV种、亚型或株的全部基因组或反基因组的PIV。在另一个实施方案中，嵌合病毒是一个RSV，其中重组基因组或反基因组有来自一个异源RSV种、亚型或株的F、G或SH糖蛋白基因的一个基因或基因片段。优选的情况是，人类RSV亚型A中F及G糖蛋白基因为在RSV的A亚型的背景条件下人类RSV亚型B中F及G糖蛋白基因所替换。

    在本发明的其他方面，重组负链RNA病毒通过对重组基因组或反基因组的其他改变而进一步被修饰或者减毒。在一个实施方案中，基因组或反基因组进一步被修饰，以编码一个或多个附加的减毒突变，其已被生物学上获得的突变负链RNA病毒株所采用。例如，在一个重组RSV中，基因组或反基因组被修饰以编码存在于生物学上获得的突变RSV株的组中的至少一个直到全部的减毒突变。所谓小组包含有(ATCC VR 2450)、cpts RSV 248/404(ATCC VR 2454)、cpts RSV248/955(ATCC VR 2453)、cpts RSV 530(ATCC VR 2452)、cpts RSV530/1009(ATCC VR 2451)、cpts RSV 530/1030(ATCC VR 2455)、RSV B-1 cp52/2B5(ATCC VR 2542)和RSV B-1 cp-23(ATCC VR2579)。另外，在一个重组PIV中，重组基因组或反基因组编码至少一个直到全部存在于HPIV3 JS cp45中的减毒突变。优选的情况是，本文所述的至少一个减毒突变通过编码突变的专一性密码子中的多个核苷酸的变化来稳定。

    在本发明的其他方面，重组负链RNA病毒通过专门针对一选自生长特征、减毒、温度敏感性、冷适应性、小噬斑大小、宿主范围限制性或免疫原性的改变中的表型改变的核苷酸修饰而进一步被修饰或减毒。例如，在RSV中，重组基因组或反基因组可以包括SH、NS1、NS2或G基因的修饰，例如基因缺失或基因表达的消除。在RSV及其他的负链RNA病毒中的其他的核苷酸修饰包括在顺式作用调控序列或者重组基因组或反基因组当中的核苷酸缺失、插入、增加或重排。

    在其它相关方面，本发明提供了一个分离的重组负链RNA病毒，其已被减毒且在对主题病毒感染易感的宿主中引发免疫反应。该病毒包含有重组基因组或反基因组及产生RNA病毒的感染性病毒颗粒所必需的病毒蛋白。重组基因组或反基因组已被修饰，以编码病毒重组蛋白中相应于异源突变负链RNA病毒中所鉴别的减毒突变的氨基酸位置的氨基酸位置上的突变。该突变，通过在重组蛋白中引入，对于该重组病毒来说提供了一个减毒表型。

    本发明同样也提供了分离的多核苷酸分子，其编码一个重组负链RNA病毒的重组基因组或反基因组。重组基因组或反基因组同样被修饰，以编码一个在病毒重组蛋白中发生在相应于异源突变负链RNA病毒中减毒突变的氨基酸位置的氨基酸位置上的突变。该突变，通过在重组蛋白中引入，对于该重组病毒来说提供了一个减毒表型。在相关的方面，所提供的表达载体包含有一个可操作性连接的转录启动子，一个编码上述重组负链RNA病毒的重组基因组或反基因组的多核苷酸分子及一个转录终止子。

    本发明同样也提供了一种方法，其可以激发个体的免疫系统以诱导产生抗负链RNA病毒感染的免疫保护反应。该方法包括给予个体以免疫学上足够量的如上所述的减毒重组负链RNA病毒及一生理学上可以接受的载体。在其它相关方面，提供一免疫原性组合物，其诱导产生抗负链RNA病毒感染的免疫反应。该组合物包括免疫学上足够量的本发明所述的减毒重组负链病毒及一生理学上可以接受的载体。减毒重组负链病毒优选是RSV、PIV或者麻疹病毒。图例的简要说明

    图1中的A组提供了一个呼吸道合胞病毒(SEQ W NO.44)、副流感病毒3(SEQ ID NO.45)、麻疹病毒(SEQ ID NO.46)及仙台(SEQID NO.47)病毒等的横跨RSV Phe-521(以箭头注释)的L聚合酶蛋白的氨基酸序列对比。一个共有序列(SEQ ID NO.48)产生于每一位置至少三个残基的精确匹配。这儿已经标明所列举序列的首个氨基酸的位置编号。所有四个病毒中的保守性残基都以粗体标明。底下画横线的残基在PIV2、犬瘟热病毒、猿猴副流感病毒41、猿猴副流感病毒5、鸟肺病毒、新城疫病毒、Hendra病毒及牛瘟病毒L聚合酶蛋白中同样是保守的(登记号分别为P26676、P24658、P35341、Q88434、Y09630、U65312、X05399、AF017149、P41357)。PIV3的L聚合酶中456位氨基酸残基相应于在RSV cpts530中发生521位的苯丙氨酸至亮氨酸突变的位置。

    图1中的B组提供了一个表示被引入到PIV3 rwt中的F456L突变及cp45突变的示意图。引入的cp45突变的相应位置以(*)标明，F456L突变的相应位置以(◆)标明。

    图1中的C组显示了一个核苷酸序列(正义)，其编码F456L突变(SEQ ID NO.50)相比较于wt序列(SEQ ID NO.49)。针对wt病毒的按照完全的rwt的反基因组编号的PIV3核苷酸序列已显示，突变序列如下进行显示。核苷酸的改变以下划线表示，携有F456L突变的密码子以粗体表示。所引入的Xmnl限制性核酸内切酶识别位点在突变序列中以斜体表示。

    图2描绘的是在黑猩猩上呼吸道中的rcp45及rcp45-456的复制。在鼻咽(NP)擦拭标本中平均的病毒滴度是在感染后指定的日期来自使用口，rcp45-456，n＝6；或者■，rcp45 n＝4感染的动物。在指定病毒之间的统计学显著差异分别为：(a)P＜0.005；(b)p＜0.05；(c)p＜0.025；斯氏t检验。(d)检测限≤0.5log10 TCID50/ml。

    图3描绘的是HPIV3 P/C/D/V ORF的组织结构图(没有按照比例)。P mRNA的三个阅读框被显示为(+1、+2及+3)，同时，P、C、D及V ORF通过矩形来显示。RNA编辑位点被显示为一垂直线，且显示了其序列基元并按照其在完整HPIV3反基因组序列中的核苷酸位置进行编号。

    图3中A组描绘的是未编辑的P mRNA的组织结构图。该含有P及C ORF的翻译起始位点的序列得以显示(SEQ ID NO.52)，且按照完整的反基因组序列对其进行了编号。在完整的反基因组序列中的P、C、D及V ORF核苷酸位点为：P，1784-3595；C，1794-2393；D，2442-2903；V，2792-3066。相对于P mRNA，开放P之ORF的AUG在80-82位点。

    图3中B组显示了一个在编辑位点(SEQ ID NO.51)含有两个非模板残基G(GG)(SEQ ID NO.53)插入的经编辑的P mRNA的组织结构图。这样就改变了阅读寄存器以致于P ORF在框+2处的上游末端与在框+3处的D ORF融合。所得的嵌合蛋白含有为P ORF所编码的N末端241个氨基酸，所述P ORF与为D ORF所编码的C末端131个氨基酸融合。

    图4显示了证明C蛋白在rF164S中表达的放射免疫沉淀试验。路径(a)35S-标记的细胞溶解物使用多克隆C特异性兔抗血清进行免疫沉淀。一个相应于C蛋白(空心箭头)的22kD带清楚地存在于rJS及rF164S溶解物中。路径(b)细胞溶解物使用两个特异于HPIV3 HN蛋白的单克隆抗体的混合物进行免疫沉淀。相应于HN蛋白(实心箭头)的64kD带存在于每一病毒沉淀物中，这确定它们确实是HPIV3且表达类似水平的蛋白。模拟路径显示出获自未感染细胞的组织培养物的溶解物。

    图5显示了与亲本病毒rJS相比较，重组突变病毒rF164S的多循环复制的结果。病毒滴度以TCID50/ml表示且其是平行两份样品的平均结果。具体实施方案的说明

    本发明所述方法提供了一个适于作为疫苗使用的减毒重组负链RNA病毒。重组负链RNA病毒产生自一个或多个分离的编码该病毒的多核苷酸分子。重组病毒的生产通过在细胞或无细胞体系中一个或多个编码下述物质的多核苷酸分子进行共表达而实现：(i)病毒的重组基因组或反基因组及(ii)产生感染性病毒或亚病毒颗粒所必需的基本病毒蛋白。

    主题重组病毒的重组基因组或反基因组被修饰，以编码在病毒重组蛋白的一个或多个氨基酸位置上的突变，其相应于在异源突变负链RNA病毒中的减毒突变位点。异源负链RNA病毒中的减毒突变因此被“转移”进入重组病毒的一个相应位点，从而赋予重组病毒减毒表型。转移的突变与在异源突变病毒中所鉴别的减毒突变相比较为同一性的或保守性的，尽管非保守型的替换也可以被使用。通过以这种方式在重组负链RNA病毒中引入转移的突变，设计出候选疫苗病毒，以引发一预期的在对该感染型病毒易感的宿主中抵抗主题病毒的免疫反应。

    本发明提供了一个新的范例，用于基于在异源负链RNA病毒中减毒突变的鉴别合理性设计减毒疫苗病毒。在异源病毒中的减毒突变被定为一个或数个氨基酸在感兴趣的异源突变病毒蛋白中的缺失、替换或插入，例如，通过传统的在突变病毒及其非减毒亲本病毒之间的核苷酸或氨基酸比对。在本说明书中，亲本病毒一般为生物学上获得的株，其为野生型，至少对于减毒表型来说是这样的。然而，部分减毒突变病毒株也可以被使用，其中附加的减毒突变可以通过人工诱变或自然的多态现象等来实现。此外，其中减毒突变可以被引入且随后被作图的亲本病毒，其包括人工产生的病毒例如通过cDNA病毒克隆按照已知的反求遗传学方法所提供的病毒。

    这样，在异源负链RNA病毒中鉴别的减毒突变可以是先前已知的或者可以通过传统的诱变和/或反求遗传学技术产生或鉴别。这些技术可以被用于产生或者表征生物学上获得的突变病毒，或重新产生及表征感兴趣的减毒突变，例如通过定点诱变野生型或者非减毒突变病毒cDNA克隆且结合传统的筛选方法一起，以鉴别减毒衍生物。用于感染性病毒克隆的回收和遗传学操作的反求遗传学方法对于整个单负链病毒(综述可以参见Conzelmann，J.Gen.Virol.77：381-89(1996)；Palese等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：11354-58，(1996))的代表性的病毒群体来说是已知的。

    例如，已报道了从cDNA-编码的反基因组RNA拯救针对狂犬病病毒(RaV)、水泡性口膜炎病毒(VSV)、麻疹病毒(MeV)及仙台病毒(SeV)牛瘟(Baron等，J.Virol.71：1265-1271(1997))及猿猴病毒S(He等，Virology 237：249-260(1997)，参见第5页)的感染型病毒克隆，所述cDNA-编码的反基因组RNA与基本病毒蛋白共表达以产生感染性，所述基本病毒蛋白即为核壳N、磷蛋白P、大的聚合酶亚基L(参见，例如，Garcin等，EMBO J.14：6087-6094(1995)；Lawson等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：4477-81(1995)；Radecke等，EMBO J.14：5773-5784(1995)；Schnell等，EMBO J.13：4195-203(1994)；Whelan等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：8388-92(1995)；及国际公开WO 97/06270，所述文献均引入本文作为参考)。

    拯救呼吸道合胞病毒(RSV)已通过开发一新型的使用cDNA编码的反基因组RNA的系统来完成，所述反基因组RNA与核壳N、磷蛋白P、大的聚合酶亚基L及先前未表征的M2 ORF1基因产品共表达(参见，美国专利申请No.08/720,132(申请日为1996年9月27日，其是一个美国临时申请No.60/007,083(申请日为1995年9月27日))的继续申请，及美国专利申请No.08/892,403(申请日为1997年7月15日，其相应于公布的国际申请No.WO 98/02530且是美国临时申请No.60/047,634(申请日为1997年5月23日)，60/046,141(申请日为1997年5月9日)及60/021,773(申请日为1996年7月15日)等的部分继续申请，所述文献均引入本文作为参考)。这些发明包括对用于产生感染性重组RSV的代表性构建体的说明，所述重组RNV包括含有来自生物学上获得的RSV突变株的减毒突变的重组RSV克隆。其中一个这样的构建体是含有RSV突变株cpts530(被命名为D53-530-位点)的减毒突变的重组病毒克隆。用于RSV克隆回收及重组操作的组合物及方法的其他描述参见Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：11563-7(1995)；Juhasz等，疫苗17：1416-1424(1999)；Juhasz等，J.Virol.71(8)：5814-5819(1997)；Whitehead等，Virology247(2)：232-9(1998a)；Whitehead等，J.Virol.72(5)：4467-4471(1998b)；及Whitehead等，J.Virol.73：(4)3438-3442(1999)，所述文献均引入本文作为参考。

    在另一个重要的实施方案中，感染性副流感病毒(PIV)的拯救同样可以使用cDNA编码的与N、P及L蛋白共表达的反基因组RNA来实现(参见，美国专利申请No.09/083,793(申请日期1998年5月22日)，其相应于已公开出版的专利申请WO 98/53078且是美国临时申请No.60/047,575(申请日期1997年5月23日)及60/059,385的部分继续，所述文献均引入本文作为参考)。这些参考资料包括下述用于产生感染性PIV克隆的质粒：p3/7(131)(ATCC 97990)；p3/7(131)2G(ATCC 97989)；及p218(131)(ATCC 97991)；每一个都按照布达佩斯条约的条款保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 Boulevard大学，Manassas，Virginia 20110-2209。

    用于负链RNA病毒回收及操作的反求遗传学系统的发展允许对减毒突变具体的分析及作图，以开发专门针对主题病毒的有用的候选疫苗。迄今为止，在单负链病毒目中通过重组技术转移减毒突变，其并未被测试或完成。但是，所鉴别的减毒突变株较宽范围例如有代表性的种类如RSV、PIV、麻疹病毒及其它单负链病毒，其与通过反求遗传学手段所提供的有力工具一起在本发明方法中用作确定可用于异源的突变的丰富资源。

    在异源负链RNA病毒中的减毒突变可以在生物学上获得的突变株中进行鉴别，其已被引入本发明所述的异源重组病毒中去了。通过已知的诱变程序，野生型或者部分减毒的亲本株中，该主题突变可以天然存在或者被引入。例如，减毒突变病毒株可以通过在病毒在细胞培养的过程中经过加入化学诱变剂化学诱变而产生，通过选择在亚适温下传代的病毒以引入生长限制性突变而产生，或者通过选择以诱变剂诱变的其可以在细胞培养物中产生小噬斑(sp)或温度敏感性(ts)病毒的病毒而产生(参见，例如，美国专利08/327,263，所述文献引入本文作为参考)。

    “生物学上获得的突变株”这儿是指任何不经过重组手段所产生的突变病毒。这样，生物学上获得的突变株就包括具有与相关野生型序列在基因组不同的天然存在的突变株，例如，部分减毒突变PIV株。同样，生物学上获得的突变株也包括获自任一亲本病毒株且不经过重组手段尤其是人工诱变及选择技术的突变株。

    一个众所周知的用于产生生物学上获得的负链RNA病毒的技术程序涉及使一野生型或部分减毒突变株以逐渐降低的温度在一细胞培养物中传代。例如以RSV为例，野生型病毒一般在将近34-37℃的温度下培养。部分减毒突变株则在亚适温例如20-26℃下在细胞培养物中经过传代而产生(例如，初级牛肾细胞)。这样，cp突变株或其他部分减毒株例如ts-l或者spRSV，在低温下通过在MRC-5或者Vero细胞中传代而有效生长，所述温度低至大约20-24℃，最好是20-22℃。所述在冷传代过程中选择的突变RSV，相比较部分减毒亲本株而言，充分地消除了在衍生株中残余的任何毒性。

    作为一种选择，具体的突变可通过对野生型或部分减毒亲本株化学诱变而被引进生物学上获得的病毒中去，例如，引入ts突变或在病毒已经是ts的病毒中，引入其他ts突变，其足以增加减毒衍生株减毒的程度和/或稳定ts表型。将ts突变引入负链RNA病毒中去的方法包括在诱变物质例如5-氟尿苷或5-氟尿嘧啶在其浓度大约为10-3至10-5M，最好是大约10-4M的存在下进行病毒复制，将病毒暴露于浓度大约为100μg/ml的亚硝基胍中，按照普通的例如Gharpure等J Virol.3：414-421(1969)及Richardson等，J.Med.Virol.3：91-100(1978)所述的步骤进行。其他的化学诱变剂也可以被用到。减毒可来自于一个几乎在所有病毒基因中的ts突变，尽管特别适用于此目的的目标已被发现为高度保守性聚合酶(L)基因。

    在本发明所使用的典型减毒突变病毒株中复制的温度敏感性水平通过比较许可温度下的复制及极端限制性的温度下复制而确定。与许可温度下的复制相比较病毒复制减少100倍或者更多的最低温被定义为截止温度。在实验动物及人类中，典型突变RSV株的复制及毒性近似地与突变株的截止温度相关联。具有39℃的截止温度的突变株的复制被适度限制，而具有38℃的截止温度的突变株的复制明显较差且疾病的症状主要限于上呼吸道。而具有35至37℃截止温度的病毒在人类中一般是完全减毒的。这样，本发明所使用的减毒的生物学上获得的突变株RSV(为ts型)，其截止温度的范围大约为35至39℃，且优选是35至38℃。将ts突变加入到部分减毒突变株中可以产生数倍减毒的病毒，其可用于本发明的疫苗组合物。

    许多作为候选疫苗的减毒的RSV株通过多次使用化学诱变剂以在其已经经过冷传代减毒的病毒中引入多重突变而得以开发(例如，Connors等，Virology 208：478-484(1995)；Crowe等，Vaccine 12：691-699(1994a)；及Crowe等，Vaccine 12：783-790(1994b)，所述文献均引入本文作为参考)。在适宜的啮齿类动物或猩猩类动物模型中和在人类成人及婴儿中测定生物学上获得的突变株，显示这些候选疫苗株中的一些是遗传稳定的，高免疫原性的且减毒的。同样也有关于PIV及其他一些本发明所述的负链RNA病毒株类似的减毒突变病毒株的描述(参见美国专利08/892,403及其相应的国际申请WO98/02530；美国专利09/083,793及其相应的国际申请WO 98/53078,所述文献均引入本文作为参考)。

    按照本发明所述的方法，减毒突变病毒株的核苷酸序列分析可被用于以具体的核苷酸及氨基酸改变绘制减毒突变图谱，所述分析涉及比较突变株与亲本病毒株如野生型或部分减毒株的DNA或氨基酸序列。经常是这些改变涉及到个别的氨基酸替换，但是按照本发明所述方法其他进行保守性转移的突变涉及多重氨基酸替换、氨基酸插入或缺失，同样也在目标蛋白的保守区发生大规模的改变。

    通过使用上述反求遗传学手段，减毒突变病毒株中核苷酸和氨基酸的改变可被引入一个先前已被描述的cDNA编码的病毒，这样就允许技术人员区别无记载的偶然发生的突变及用于目标表型改变的突变。在这点上，主题突变被个别引入和以不同的组合方式进入感染性RSV克隆的基因组或反基因组中去。这个过程结合亲本及衍生性病毒表型特征的测定进一步鉴别出用于减毒、温度敏感性、冷适应性、小噬斑尺寸、宿主范围限制性等目标特征的突变。

    这样，所鉴别及作图的突变提供了一个用于使用本文所述的异源转移方法设计重组负链RNA病毒的候选突变的丰富源泉。鉴别及描述负链RNA病毒中该减毒突变的典型的说明参见美国专利08/892,403及其相应的国际申请WO 98/02530；及美国专利申请08/083,793及其相应的国际申请WO 98/53078。这些及其他一些引入本文的参考资料提供了一个减毒突变的“目录”，所述减毒突变候选用于按照本发明所述方法转移进入异源病毒克隆中去。

    例如，美国专利申请08/892,403及其相应的国际申请WO 98/02530描述了RSV的冷传代(cp)及温度敏感性(ts)突变株(肺病毒亚科；肺病毒属)，包括命名为cpts RSV 248(ATCC VR 2450)、cpts RSV248/404(ATCC VR 2454)、cpts RSV 248/955(ATCC VR 2453)、cptsRSV 530(ATCC VR 2452)、cpts RSV 530/1009(ATCC VR 2451)、cpts RSV 530/1030(ATCC VR 2455)、RSV B-1 cp52/2B5(ATCC VR2542)及RSV B-1 cp-23(ATCC VR 2579)的典型突变株。在这些生物学上获得的突变株中减毒突变的一个典型组已被作图且描述，包括在大的聚合酶基因L中的具体的核苷酸改变，其结果在于亲本残基/序列位置Phe521、Gln831、Met1169及Tyr1321等处氨基酸的替换，正如减毒替换：Leu替换Phe521，Leu替换Gln831，Val替换Met1169，Asn替换Tyr1321。每一个这样的突变发生在高度保守的L蛋白中且在突变病毒中赋予一个ts表型。然而，其他突变已在RSV及其他的一些负链RNA病毒和其他的一些保守性蛋白中得以鉴别，其赋予了一些减毒表型，包括ts或非ts减毒表型，如本文所列举的冷传代(cp)、小噬斑(sp)、冷适应性(ca)或宿主范围限制性(hr)突变病毒株。

    这样，按照本发明所述方法用于引入重组负链病毒的其他典型性突变已被鉴别为不很相关的副粘病毒、人类PIV3(副粘病毒亚科；呼吸道病毒属)。生物学上获得的(冷传代型)HPIV3突变病毒株JS cp45(参见美国专利08/083,793及其相应的国际申请WO 98/53078，所述文献引入本文作为参考)中，这样一组突变已被鉴别且表征。在这株中作图且已表征的突变为编码在减毒突变聚合酶L基因的亲本残基/序列位点Tyr942、Leu992、和/或Thr1558处ts减毒氨基酸替换的核苷酸的改变。在典型的JS cp45突变L蛋白中，Tyr942为Ile所替换，Leu992为Phe所替换，Thr1558为lie所替换。这些突变都已被成功引入不同的PIV重组体中，包括命名为r942、r992、r1558、r942/992、r992/1558、r942/1558及r942/992/1558，其中用数字表示单一和组合突变。

    在HPIV3 JS cp45中另一个典型的突变已作图且表征为在HPIV3中的F及C蛋白中编码氨基酸替换。这些包括编码非ts减毒氨基酸替换的突变，所述替换位于P基因的C蛋白的JS HPIV3亲本残基/位点Ile96上，例如Ile96为Thr所替换。HPIV3的F蛋白中所鉴别的其他典型突变编码在亲本残基/位点Ile420和Ala450处的氨基酸替换，例如Ile420为Val替换，Ala450为Thr所替换。

    以这种方法同样可被确认的是在一个负链病毒基因中非编码区的减毒突变。例如，减毒突变可以包括基因起始序列中的单一或数个碱基的改变，例如在RSV M2基因起始序列中在7605位核苷酸处的减毒碱基替换。当这些突变位于异源负链RNA病毒中的保守性核苷酸位点时，其按照本发明所述方法也可适于在异源群之间进行转移。

    这样，在负链RNA病毒中鉴别的每一减毒突变提供了一个对同源蛋白在一个或数个异源负链病毒中进行序列对比的一个指标。为了实践本发明的这一方面，可以分析已有的序列对比，或者应用传统的序列对比方法以进行序列比较，以鉴别在一个负链RNA病毒中携有已鉴别减毒突变的蛋白及一个在不同的且为用于重组减毒的目标病毒的病毒的同源蛋白之间的相应蛋白区域及氨基酸位置。该技术的焦点在于鉴别一个或多个与第一(异源)病毒减毒突变相关的残基，也就是说，其是已被从一个亲本序列改变的残基，其中亲本缺乏突变表型。经过序列对比其已被确定是否突变株的亲本序列是保守性的，这通过鉴别在目标(重组)病毒蛋白中在相应氨基酸位置相同或保守性氨基酸残基的存在来进行确定。一般情况下，这样保守性的野生型序列元件将在蛋白的保守性区域出现，但分离的残基及氨基酸残基结构在不同的单负链病毒分类群中也是广泛保守的且能提供同样可用于在异源RNA病毒之间异源性转移减毒突变的目标(其中全部或部分携有突变改变的保守性序列元件被复制或输入重组病毒，以产生一新型的减毒衍生体)。

    单负链病毒中不同的保守性蛋白在本发明中对于将在一个异源负链RNA病毒中发现或产生的减毒突变引入一个不同的重组病毒株中提供了一个有益的目标。这些可归功于单负链病毒中不同分类群之间特别突出的功能及结构的保守性。在此目中，五个目标蛋白是普遍保守的，其为公认的获自关系较远的祖辈普通病毒的同源蛋白。这些蛋白一般显示出中等至高等的序列同一性，尤其是在具有共同功能特征的具体的区域或结构域。明确一点地说，所有已知的负链RNA病毒都有含有核壳蛋白(N)、一个核壳磷蛋白(P)、一个非糖基化基质(M)蛋白、至少一个表面附着糖蛋白(HN、H或G)及一个大的聚合酶(L)蛋白的同源蛋白群。这些蛋白每一个都展示出保守性的序列元件，其为通过改造在目标病毒及异源亲本病毒之间相同的一个或数个保守性残基进行转移减毒突变的有用的目标，对此突变衍生物或构建体已被鉴别，已显示出影响某一减毒表型的氨基酸的改变。此外的蛋白也被以此种方式靶定，其仅在单负链病毒的一定的科、亚科、属或者种之间是共有的。

    单负链病毒目包括线状病毒科、副粘病毒科、博纳病毒科(Bornaviridae)科及棒状病毒科，其均包含具有单分裂(monopartite)负链RNA基因组的病毒，参见Pringle，Arch Virol.117：137-140(1991)。该组中分类学的一个概要包括科/亚科/属的鉴别且每一组中具体的类型由Pringle，Arch Virol.142(11)：2321-2326(1997)提供。单负链病毒的一个代表性的分类及副粘病毒科的一个扩展型的分类列于表1中。这三科病毒与线性负链RNA基因组中所出现的基因结构的共同特征证明了其作为一个目的合理性，尤其是考虑到这样的事实，遗传重组很少发生，毕竟在这些病毒中及随后出现的表型关系中都反映出遗传上的连续性。表1.非节段化的负链RNA动物病毒单负链病毒目  -棒状病毒科

    水疱病毒属(水泡性口膜炎病毒)

    狂犬病毒属(狂犬病病毒)

    Ephemerovirus属(牛短暂热病毒)

    其他属  -线状病毒科(埃博拉病毒，马尔堡病毒)  -博纳病毒科(博纳疾病病毒)  -副粘病毒科在副粘病毒科及指定分类群的成员中的呼吸道合胞病毒分类副粘病毒亚科   呼吸道病毒属

      -仙台病毒(鼠副流感病毒1型)

      -人类副流感病毒1型

      -人类副流感病毒3型

      -牛副流感病毒3型   麻疹病毒属

      -麻疹病毒

      -犬瘟热病毒

      -牛瘟病毒

      -鲸(海豚)麻疹病毒

      -海豹瘟热病毒

      -pest-des-petits-反刍动物病毒

      -Hendra病毒(新鉴定的澳大利亚病原体)Rubulavirus属

    -腮腺炎病毒

    -猿猴病毒5(犬副流感病毒2型)

    -人类副流感病毒2型

    -人类副流感病毒4型

    -鸟类副流感病毒(包括新城疫病毒)

    -猪Rubulavirus

    -猿猴病毒41型

    -Mapuera病毒肺病毒亚科  肺病毒属

    -人类呼吸道合胞病毒(亚型A及B)

    -牛呼吸道合胞病毒

    -绵羊及公山羊呼吸道合胞病毒

    -鼠肺炎病毒  鸟类肺病毒属1

    -鸟类肺病毒(先前为火鸡鼻气管炎病毒)1准备分配一独立的属，尚未命名

    博纳病毒科及线状病毒科以单一的属表示。博纳病毒属仍然含有一个单一的种(博纳疾病病毒)。根据病毒核苷酸序列及抗原性差别及附着(G)蛋白的差异表达，在线状病毒属(典型种为马尔堡病毒)属中鉴别出四个种。棒状病毒科包括5个属：水疱病毒属、狂犬病毒属、Ephemerovirus、Cytorhabdovirus及Nucleorhabdovirus，除了序列及抗原性差异，其还通过宿主范围、补加基因的存在及胞内增殖位点而被鉴别。副粘病毒科具有两个亚科；有三个属的副粘病毒亚科，所述三个属为呼吸道病毒属(HPIV 1为典型株)、麻疹病毒属(典型种为MeV)及Rubulavirus属(MuV为典型种)，及肺病毒亚科(人类RSV为典型种)及一个计划中的附加的种，其包括鸟类肺病毒。

    在该目的所有成员中，其中有5-10个基因，且转录起始于一个单一的假定的3’末端启动子，其通过一病毒RNA依赖性的RNA聚合酶启动。除了一些肺病毒的例外情况以外，基因次序都是严格保守的。在Pringle，Arch Virol.142(11)：2321-2326(1997)的图1中，对单负链病毒中代表不同科、亚科及属的16种病毒进行基因对比，其中所述基因在所述不同分类群中被划分且分组为具有同源性。这样，VSV展示了最低限度的5个基因；核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、附着蛋白(G)及聚合酶蛋白(L)。博纳病毒科中的博纳疾病病毒、线状病属科中的埃博拉病毒及棒状病毒科中的8个成员展示了基本的五基因模式(N-P-M-G-L)，在埃博拉病毒及八个棒状病毒中的四个病毒中，该模式通过在G及L之间插入一个或多个基因而增加，或者在剩余的四个棒状病毒中的三个中，通过在P及M之间插入一个或多个基因而增加。副粘病毒亚科中的副粘病毒展示的更为复杂，基本的5基因模式通过P基因中遗传信息的多重编码及在M及附着蛋白(H或者HN)之间插入附加的包膜蛋白基因F而增加，在某些Rubulaviruses中还通过SH而使得其提高。所有的副粘病毒都至少有两个表面糖蛋白HN(或H或G)及F。几乎所有的呼吸道病毒、Rubulavirus及麻疹病毒属成员都有一个富半胱苷酸蛋白V。呼吸道病毒及麻疹病毒还编码同源性C蛋白。肺病毒及Rubulaviruses亚群(猿猴病毒5(SV5)及腮腺炎病毒(MuV))都具有同源性表面糖蛋白SH。在肺病毒属中(包括牛、绵羊及公山羊RSV及鼠肺炎病毒----这儿还称为鼠RSV)几种附加蛋白，NS1、NS2、M2(ORF1)及M2(ORF2)都是保守性的。肺病毒亚科的副粘病毒展示出与基本模式的唯一的不同之处，最明显的是拥有附加的基因。在鸟类、人及鼠肺病毒中，M2基因在不同的阅读框中编码两个蛋白，两者都对在体外合成RNA产生明显的效果。在人类及鼠肺病毒中，两个编码未知功能的非结构性蛋白NS1及NS2的两个基因定位于3’前导区及N之间。鸟类肺病毒接近于基本模式，缺乏两个独特的3’末端NS基因并保留有标准的副粘病毒基因次序，除了有M2基因插入以外。该基因组结构的保守性模式提示通过基因间隔区的扩张及通过基因复制而不是从外部引入遗传信息来进行演变。Pringle，Semin.Virol.8：49-57，1997。

    如上所述，本发明所述的方法是基于减毒突变在第一负链RNA病毒中的鉴别，该突变通过比较突变株及野生株的序列进行定位，以进行对标记突变位点的主题氨基酸位置的鉴别。优选的是，这些突变被引入非减毒或部分减毒的重组病毒克隆中，以证明事实上的主题改变产生了一个减毒表型。典型减毒突变的宿主在本文中也将被提供，其他一些减毒突变按照本说明书所述的已知的诱变及反求遗传学技术都是很容易鉴别的。在一个负链RNA病毒中每一个所鉴别的减毒突变提供了一个进行序列对比的指标，该对比是指在一个或多个异源负链病毒株中同源蛋白的序列比较。

    为了实现本发明上述的几个方面，可以分析已有的序列对比，也可使用传统的序列对比方法以进行序列对比分析，以鉴别在减毒突变蛋白与另外的减毒的目标重组病毒的同源性蛋白之间的相应的蛋白区域及氨基酸位置。当一个或多个标记减毒突变的残基已在目标病毒蛋白的相应氨基酸位置从亲本例如野生型保守性特征(即，同一性的或表现为保守性相关氨基酸残基)进行了改变，靶病毒基因组或反基因组经过重组修饰以编码一个相同的或保守性的氨基酸的缺失、替换或插入，以改变靶病毒蛋白中的保守性残基并因此在重组病毒中产生一个同源减毒表型。

    通过序列对比及分析以实现本发明的几个方面，其聚焦于同源性“对应”基因、基因片段、蛋白和/或蛋白结构域，其中多核苷酸或氨基酸参照序列被用作一个已定义的序列以提供一个统计性序列对比的基础。例如，该序列可以是一个已定义的cDNA或基因片段、一个全部的cDNA或基因序列或一个蛋白或其中一部分的序列。

    一般来讲，一个参照序列，用于确定对应基因或者基因片段，其一般在长度上都有至少20个核苷酸，最为常见的是至少25个核苷酸，经常是在50个核苷酸的长度，而对于蛋白质和蛋白片段来说至少有20个氨基酸的长度。既然两个多核苷酸或氨基酸序列均可以(1)含有一个序列(也就是说，全部多核苷酸或蛋白序列的一部分)，其在两个多核苷酸或蛋白之间是相似的，且(2)可以进一步包括一个序列，其在两个(或更多)多核苷酸或蛋白序列之间是不同的，那么两个(或更多)的多核苷酸或蛋白序列之间的对比一般通过比较两个主题序列的“比较窗口”来实现，以鉴别和比较具有同一性或相似性的序列区域。本文作用的“比较窗口”，意指一个概念意义上的至少20个连续的核苷酸或者氨基酸位置的片段，其中一个序列可以与至少20个连续核苷酸或氨基酸的参照序列相比较，在进行两个序列的最为理想的比对时，其中的多核苷酸或氨基酸序列的一部分在比较窗口中可以包括其与参照序列(其并不包括增加或缺失)相比较有20％或更低的比例的序列增加或缺失(即缺口)。

    用于对比比较窗口的序列的理想比对可以通过Smith&WatermanAdv.Appl.Math.2：482(1981)的区域同源性运算法则来进行操作，或者Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性对比运算法则来进行操作，或者通过Pearson&Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)的相似性搜索方法来进行操作(所述文献均引入本文作为参考)，或者通过这些运算法则的计算机化实施(GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA(在7.0版威斯康星遗传学软件包中，遗传学计算机集团，575 Science Dr.，Madison，WI)，其引入本文作为参考)来进行，或者经过检查来进行，然后选择通过不同的方法所产生的最好的比对(也就是说，使比较窗口的序列相似性百分比最高)。

    这里所使用的词组“序列同一性”意指两个多核苷酸或者蛋白序列在比较窗口中是相同的(也就是说，基于核苷酸—核苷酸或残基—残基的比对)。“序列同一性百分比”通过以下步骤计算得出：比较在比较窗口中两个最佳对比的序列，确定两个序列中相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、U或者I)或氨基酸残基的位置数目以得出匹配位置的数目，用匹配位置的数目除以比较窗口中的位置总数(也就是窗口的大小)，结果乘以100就得出序列同一性百分比。

    本文所使用的词组“基本同一性”表示两个多聚核苷酸或氨基酸序列在至少有20个，经常是至少25-50个核苷酸或氨基酸位置的比较窗口中具有至少85％，优选90-95％，有时在99％或者更高的序列同一性百分比的特征，其中序列同一性百分比可以通过在比较窗口之上比较参照序列与可以包含有缺失或增加其一共是参照序列的20％或更少的比较序列计算得出。参照序列可以是一个大序列的一部分。

    当应用于蛋白及蛋白中的结构元件，词组“序列同一性”意指在相应位点具有一个或更多的相同氨基酸的序列。词组″序列相似性″意指两个序列在相应位点例如在保守性替换位点具有相同的一个或更多的保守性相关氨基酸。词组“基本序列同一性”意指两个肽序列，当进行最适对比时，例如使用程序GAP或BESTFIT并使用默认的缺口重量，至少有85％的序列同一性，优选是在90％的序列同一性，更好是在95％或者更高的序列同一性(例如有99％的序列同一性)。词组“基本相似性”意指两个多肽序列具有相应的序列相似性百分比。

    保守性的序列关系甚至当氨基酸残基在两个序列的相应位点并不是同一性但是区别在一个保守性氨基酸的结构关系时存在。在本说明书中，保守性氨基酸替换指的是具有相似侧链的氨基酸残基通用互换性。例如，一组具有脂肪侧链的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸；一组具有脂肪族羟基侧链的氨基酸是丝氨酸及苏氨酸；一组具有含酰胺侧链的氨基酸是天冬酰胺及谷氨酰胺；一组具有芳香族侧链的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸；一组具有碱性侧链的氨基酸是赖氨酸、精氨酸及组氨酸；一组具有含硫侧链的氨基酸是半胱氨酸及甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸替换组是：缬氨酸—亮氨酸—异亮氨酸、苯丙氨酸—酪氨酸、赖氨酸—精氨酸、丙氨酸—缬氨酸及天冬酰胺—谷氨酰胺。二十个传统氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)、非天然的氨基酸例如α，α-双取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸及其他的非传统性氨基酸也可以是本发明多肽的适宜成分。非传统性的氨基酸的例子包括：4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、ω-N-甲基精氨酸及其他一些相似的氨基酸及亚氨基酸(例如，4-羟基脯氨酸)。而且，氨基酸可以通过糖基化、磷酸化等进行修饰。

    为了促进实施本发明上述各个方面，参考了一些已知的在单负链病毒目中的保守性病毒蛋白的分子发展史，在这一点，进行了更为广泛的研究，其详细评估了在更为精确的分子水平上的蛋白相关性。这些研究包括对于在单负链病毒中的保守性蛋白的序列的逐条比较，作出了更为广泛接受的这些蛋白的保守性结构域、序列元件及限制的分离残基的图谱。这些保守性蛋白结构域、序列元件及限制性残基的每一个通过提供从一个异源减毒突变病毒株中保守性转移减毒突变至一个不同的按照本发明所述方法进行重组的病毒中去的有益的目标而促进了本发明的实施。

    例如，Poch等，J.Gen.Virol.5：1153-62，(1990)(引入本文作为参考)提供了一个详细的单负链病毒的5个L蛋白的推导的氨基酸序列的比较，其包括棒状病毒(V.SV及RaV)及副粘病毒(SeV，NDV及MeV)的L蛋白。常规的对比方法(引入本文作为参考)揭示了来自不同病毒科的L蛋白沿着其长度的绝大多数展示了一个很高程度的同源性——其在保守区域中有着始终不变的氨基酸，其为一些相对保守的区域所分离。这样，这些来自异源负链RNA病毒的不同L蛋白占据了一个连接功能区的保守性的结构。例如，L蛋白包括一个高度保守性的中心区域，其被认为含有RNA合成的活性位点。其他的保守性结构区、基序及序列元件，包括严格保守的分离的残基，同样也被鉴别，其中一些沿着保守性中心区进行分布且被认为对于聚合酶活性是至关重要的。在L蛋白中所鉴别的这些保守性的序列元件(参见，Poch等，J.Gen.Virol.5：1153-62，(1990)及Poch等EMBO J.8(12)3867-3874，(1989)，特别是图1，所述文献引入本文作为参考)，所提供的详细信息与其中减毒突变已产生且作图的异源亲本株L蛋白序列相比较。这样，使用这些及其他的测序列方法及数据，包括本文所引用的出版物中的测序列方法及数据，其可以很容易地测定是否一个标有减毒突变的残基从亲本株如野生株中已被改变，在目的病毒L蛋白的相应氨基酸位置是保守性的同一性(也就是说，同一性或者为保守性相关氨基酸残基所代表)其指出了在异源病毒中所鉴别的减毒突变成功发生在重组目标病毒的基因组或反基因组中去的极高的可能性。

    关于在单负链病毒中不同L蛋白的同源体的结构保守性的进一步详细的描述为Stec等，Virology 183：273-287(1991)(所述文献引入本文作为参考)所提供。这些序列分析是基于已公布的3个副粘病毒(来自呼吸道病毒属中的两个(PIV3及SeV)，Rubulavirus(NDV)病毒中的一个)、麻疹病毒属(MeV)病毒属的一个副粘病毒及两个来自棒状病毒(RaV和VSV)科的病毒(参见，例如Schubert等，1985；Shioda等，1986；Yusoff等，1987；Blumberg等，1988；Galinski等，1988；及Teart等，1988，所述文献均引入本文作为参考)的L基因及蛋白的序列且提供了针对RSV的另外的序列信息及比对。这些结果都证实了Poch等(同上)关于在副粘病毒及棒状病毒科中有重大意义的序列保守性的描述，此外其还鉴别出另外的保守性结构域、基序及序列元件。

    简而言之，Stec等的发现赖于传统的对比方法，在其它相似的方法中其在本发明中是非常有用的。具体来讲，Stec等对比异源性负链RNA病毒序列，其中使用Wilbur及Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.USA80：726-730(1983)等已接受的方法，使用缺失及12及6的缺口惩罚和在“蛋白序列及结构图谱”(M.O.Dayhoff编辑)，Vol.5，Suppl.3，pp.345-352 Natl.Biomed.Res.Found.，Silver Spring，MD(1978)中的Dayhoff等的相似性得分矩阵(所述文献均引入本文作为参考)。相似性得分系统被用于在RSV及其他一些列于表1的负链RNA病毒L蛋白之间构建配对的球形点矩阵对比。通过这些方法，明确的序列相关区域在RSV的L蛋白及并不甚相关的副粘病毒及棒状病毒的L蛋白之间被发现。正如图3所示那样，在RSV的L蛋白与其他一些L蛋白之间的序列相关区域是在同一直线上且集中在最接近氨基的区域，可能占据了分子的大约1/5。这些序列相似性的同一模式在其它一些副粘病毒及棒状病毒中的L蛋白中序列对比中也记载过(Blumberg等，1988，Galinski等，1988；Teart等，1988，所述文献均引入本文作为参考)，包括SeV、MeV、NDV、RaV及VSV L蛋白的五路对比，其由Poch等(1989，同上)完成。

    在Stec等(同上)的七路对比方法中，RSV L蛋白被确定与其他负链RNA病毒相比较含有一个大约有70个氨基酸残基的氨基末端延伸及一个大约100个氨基酸残基的羧基末端平头。然而，这一变化并不影响对比方法鉴别保守性结构元件的可靠性且被认为可以归于这样的事实，RSV的L蛋白被L基因与其上游相邻部分，即M2基因(以前称为22K)(Collins等，1987，所述文献引入本文作为参考)的重叠部分所部分编码。

    Stec等的发明(同上)证明了异源负链RNA病毒的L蛋白中一部分短片段的存在，这些片段几乎可以被确定在不同分类群之间是保守的。这些近于同一的片段在RSV的L蛋白中同样也显示出保守性，且其位于显示于图4(Stec等，所述文献引入本文作为参考，参见装入盒中的序列)的高度保守性区域。在这六个片段中氨基酸的同一性在七种蛋白中由30％至80％进行变化。所鉴别的片段中的大量残基在进行对比的七种不同的负链RNA病毒中是稳定不变的。此外，值得注意的是当替换在这些保守性片段中发生时，很多是保守性替换。正如先前所述那样，在两个病毒科的每一个成员中高度同一性的这些片段提示他们对于L蛋白的功能是至为重要的。

    更为详细的是，在单负链病毒中不同分类群之间如Stec等所述的图4那样进行对比的L蛋白的高度保守性区域同样也含有四个不同的聚合酶基元(下划线标出且被指名为A-D)，其与Poch等，(1989)，同上所鉴别的基元一致。这些与四个聚合酶基序同源性的区域在RSV的L蛋白的696至887位氨基酸之间被发现。四个元件中的三个(A-C)与上述副粘病毒及棒状病毒的L蛋白的高度保守性片段一致。D片段在这些病毒中的保守性较差，但是其含有一个不变的赖氨酸及一个保守性的甘氨酸(在RSV，分别为K-886及G-877)，其为这一基序的特征。

    对于其它的存在于负链RNA病毒中的蛋白的类似的详尽的序列对比及分析已经公开，其在本发明中作为靶定蛋白是非常有用的。在这一点，Barr等，J.Gen.Virol.72：677-685(1991)，分析了在单负链病毒中的异源成员中的N蛋白中序列保守性，所述文献引入本文作为参考。尤其是该研究显示了一个在RSV及PVM的N蛋白的预测氨基酸序列之间的高水平的氨基酸同一性(60％)(参见图7，所述文献引入本文作为参考)。氨基酸残基1至150及150至393分别含有38％及74％的同一性，然而残基245至315在71个氨基酸中含有68个相同的氨基酸(96％的同一性)。这些蛋白的高度保守性与在RSV及PVM的N蛋白为血清学相关的这一结果一致(Gimenez等，1984；Ling&Pringle，1989)。

    PVM及更多的其他单负链病毒成员的N蛋白的氨基酸序列进行计算机矩阵比较同样也揭示出了保守性的区域(Barr等，同上，图5)。在本说明书中的同样序列保守性也在PVM及埃博拉病毒的N蛋白中出现。更进一步，来自非节段化的负链RNA病毒的更广泛群体的成员的N蛋白的亲水性图谱在副粘病毒和麻疹病毒(Galinski等，1985，所述文献引入本文作为参考)之间序列相似性最大的区域是彼此相似的。大约180个氨基酸，从每一蛋白的氨基末端的130至170残基，形成交替的亲水区及疏水区。这些氨基酸序列的二级结构(Garnier等，1978，所述文献引入本文作为参考)提示保守性亲水性的这些区域可能以高比例的a-螺旋开始但其终止于一个高比例的β-折叠及转角。这些数据提示这些保守性蛋白可以有一个在相似亲水性区域中的相似重叠结构。

    集中于保守性亲水性区域的对代表性的N蛋白使用已知的程序CLUSTAL(Higging&Sharp，Gene 33：237-244(1988)，所述文献引入本文作为参考)所作的进一步的排列研究指向仍为附加保守性蛋白功能区、结构基元及分离的保守性氨基酸残基(参见，Barr等，图7，盒子A、B及C)。从这个研究得知，其已发现在SeV、VSV及PVM的N蛋白之间的保守性在PVM序列的羧基末端的一半(图7，盒子C)的确定区域是很高的。该区域同样在DIAGON中鉴别，其在埃博拉病毒及PVM间在小于99的窗口中进行比较。两个较短的相似性区域在该序列中同样被检测到，每一个都含有疏水性区域，其为一个单一、保守性的碱性氨基酸(K或R：盒子A及B，在图7中)所间隔。在其他副粘病毒及棒状病毒的N蛋白中也有相应的相似区域。在这些区域中的同一性水平如Barr等的表1所示。尽管在一个病毒科中有着高比例的同一性，高水平的相似性在这些病毒科的这些区域中也是可以证实的，尤其是考虑为保守性替换时。

    同样有利于本发明实施的是证实在单负链病毒异源成员中的N蛋白高水平的分子保守性的独立的序列对比。例如，Parks等，Virus Res.22：259-279，(1992)，所述文献引入本文作为参考，描述了来自10个不同的副粘病毒的N蛋白的氨基酸序列的计算机辅助对比。正如该参考资料中的图3所示，在N蛋白靠近中间的一的明显区域(SV5残基323-340)在不同分类群的N蛋白中含有一个大的序列保守性，其包括一个不变的疏水性基元F-X4-Y-X4-S-Y-A-M-G(其中X为任一残基)。另一个高度保守性的区域，其富含带负电荷的谷氨酸及天冬氨酸，被发现在N蛋白的羧基末端区域(SV5残基455-469)。

    在N蛋白分子保守性的另外的研究中，Miyahara等，Arch.Virol.124：255-268(1992)，所述文献引入本文作为参考，比较了HPIV-1 N蛋白与12个另外的副粘病毒的相应序列，所述12个副粘病毒为HPIV-2(Yuasa等，Virology 179：777-784(1990))、HPIV3(Galinski等，Virology 149：139-151(1986))、HPIV-4A及4B(Kondo等，Virology174：1-8(1990))、SV5及SV41(Tsurudome等，J.Gen.Virol.72：2289-2292(1991))、MuV(Elango，Virus Res.12：77-86(1989))、SeV(Morgan等，Virology 135：279-287(1984))、PIV-3(Sakal等，Nucleic AcidsRes.&：2927-2944(1987))、NDV(Ishida等，Nucleic Acids Res.14：6551-6564(1986))、MeV及(CDV)(Rozenblatt等，J.Virol.53：684-690(1985))(所述文献均引入本文作为参考)。

    正如Miyahara等图3所示，HPIV1的N基因与SeV显示了很广泛的同源性；核苷酸及氨基酸的同一性分别为70.8％及87.8％。HPIV-1的N蛋白与HPIV-3(63.1％)及与BPIV-3(63.3％)同样显示出很高的氨基酸同一性，且与以下病毒的同一性较低，与NDV(20.9％)，MeV(20.5％)，CDV(19.6％)，SV41(18.6％)，SV5(17.9％)，HPIV-4A(17.9％)，HPIV-4B(17.5％)，HPIV-2(17.5％)及MuV(17.1％)。一个蛋白酶敏感性的“铰合部”被发现位于两个SeV K蛋白的确定区域的结合位点；所述区域为(1)一个氨基末端区域，其直接与RNA相互作用，和(2)一个羧基末端区域，其位于已组合核壳的表面(Heggeness等，Virology 114：555-562(1981)，所述文献引入本文作为参考)。

    正如Miyahara等所进一步描述的那样，在所有的副粘病毒N蛋白中26个氨基酸残基是保守性的，且一个保守性的N区在N蛋白的氨基酸位点260-360之间被发现。此外，40个甘氨酸中的37个及13个脯氨酸中的13个在HPIV-1及SV的N蛋白中是保守性的，提示出这些蛋白SeV保持有一个共同的三级结构。

    Miyahara在HPIV-1 M蛋白及13个其他的副粘病毒(参见，例如图4，Miyahara等)中同样比较了M蛋白序列。这些异源病毒同样显示出M蛋白序列元件的高度保守性。例如，HPIV-1及SeV显示出M的核苷酸及氨基酸同一性的水平分别为72.6％及88.4％。HPIV-1同样显示出与HPIV-3(65.7％)及与BPIV-3(65.4％)高水平的保守性，且与MeV(36.4％)、CDV(34.6％)及RPV(36.7％)表现出中度保守性。HPIV-1中的所有5个半胱氨酸，22个脯氨酸中的20个及25个甘氨酸中的24个在SeV中是保守性的，其中几乎所有这些在PIV-3中也是保守性的。这些发现提示M蛋白的三级结构在HPIV-1、SeV、HPIV-3及BPIV-3中可能是保守性的。此外，14个氨基酸在所有比较的副粘病毒M蛋白中是保守性的。

    对于P蛋白的其他序列对比及分析已经被公开，P蛋白在单负链病毒中同样是普遍保守性的且在本发明中的突变异源转移中是一个特别有用的靶子。参见，例如，Kondo等，Virology 178：321-326(1990)，所述文献引入本文作为参考。在本说明书中，已知SeV的P蛋白(Giorgi等，Cell 35：82-836(1983)；Neubert，Nucleic Acids Res.17：10-101(1989)，所述文献引入本文作为参考)及PIV3(Luk等，Virology153：318-325(1986)，所述文献引入本文作为参考)大小非常近似，分别具有568及603位氨基酸。在不同的分类群例如MuV、SV5、PIV-2及NDV中，P基因分别编码含有391、392、395及395个氨基酸的蛋白。(Takeuchi等，J.Gen.Virol.69：2043-2049(1988)；Thomas等Cell 54：891-902(1988)；及Sato等，Virus Res.7：241-255(1987))。MeV及CDV的P蛋白为中等大小(Barret等，Virus Res.3：367-372(1985；Bellini等，J.Virol.53：908-919(1985)。

    由Kondo等，Virology 178：321-326(1990)比较的所有的异源病毒中的P特异性区域都能按照传统的方法进行排列比较(所述文献引入本文作为参考)。显著的保守性结构被发现位于PIV4A、PIV4B、SV5、PIV-2、MuV、NDV、MeV、CDV、PIV-3及SeV(参见Kondo等的图2，所述文献引入本文作为参考)。这样，该研究及其他一些有关P蛋白分子进化学的研究鉴别出附加的保守性蛋白区域，结构基元、氨基酸片段及分离残基，其在突变位点进行比对以评估用于将来自异源突变病毒的减毒突变引入重组疫苗株中的靶子。

    提供了可以促进本发明的实现的进一步的序列对比及分析，其被用于在单负链病毒中的所有蛋白。简而言之，Yuasa等，Virology179：777-784(1990)，所述文献引入本文作为参考，在3’基因末端及人类及非人类副粘病毒即PIV-4A、PIV-4B、MuV、NDV、MeV、PIV-3、BPIV-3、SeV及RSV(参见，例如图2及4)的N基因中鉴别出保守性结构元件。Kawano等，Virology 174：308-313(1990)提供了八种异源副粘病毒(参见，例如图2)的HN蛋白的分子分析及序列对比。tsurudome等，J.Gen.Virol.72：2289-2292(1991)提供了一个HPIV-2、SV5及SV41(参见，例如图3)的序列对比及分析。Spriggs等，1986，Virology 152：241-251(1986)在异源副粘病毒(包括RSV)中的F蛋白中鉴别出结构保守性序列。Higuchi等，J.Gen.Virol.73：1005-1010(1992)(参见，例如图4)，Kawano等，Nuc.Acids.Res.19(10)：2739-2746(1991)(参见例如图2及6)，Muhlberger等，Virology 187：534-547(1992)(参见例如图4及6)，及Ogawa等，J.Gen.Virol.73：2743-2750(1992)(参见例如图3)，描述了对于在单负链病毒中的一个大的分类群集合中的L蛋白及3’及5’非编码基因组末端。一个更能充分理解的观点，其包括在单负链病毒的N、P、C、L、M、HN、F、SH、V、D及其他ORF及基因产品中的分子保守性详细描述的引用资料为Collins等所提供，Fields Virology，Fields等编辑，第三版，第41章：1205-1241，Lippincott-Raven，Philadelphia(1996)。这些研究均引入本文作为参考，尤其是包括其按照本发明的提示在作为用于将减毒突变引入重组疫苗病毒中去的靶定位点上的确定位点上的保守性结构元件的鉴别的排列对比及图形。

    在本发明更为详细的方面，已经通过将在异源病毒中鉴别的突变转移而减毒的重组负链RNA病毒株被改造为一个嵌合病毒，例如，一个嵌合RSV或PIV病毒。本发明的嵌合负链病毒的核酸序列与另外的多个病毒株或亚型的核酸序列进行重组，以产生一个感染性的嵌合病毒或亚病毒颗粒。以这种方式，候选疫苗病毒株被重组加工，以在哺乳动物宿主，包括人类或非人类的灵长类动物中引发一免疫反应。按照本发明的嵌合病毒可以针对特定病毒亚型或株引发一免疫反应或引发一个针对多种病毒亚型或株的多重反应。

    在一个典型的实施方案中，含有减毒突变的嵌合病毒如上所述也可以包括异源病毒的异源基因或基因片段，其被加入或引入主题病毒中的重组基因组或反基因组，例如，通过来自异源RSV的对应序列的替换来产生一个嵌合RSV基因组或反基因组。本发明的一个嵌合病毒这样就包括来自一个病毒株或亚型病毒的一部分或全部“受体”基因组或反基因组及来自一个不同病毒株或亚型的附加的或替换的“供体”基因或基因片段。

    在本发明的优选的方面，嵌合减毒病毒是RSV，其包括一部分或全部人类RSV A或B亚型病毒基因组或反基因组及来自于不同的人类RSV的A亚型或B亚型的异源基因或基因片段。为了产生这一重组病毒，来自于一个RSV株或亚型的异源供体基因或基因片段结合或替换为作为主链用于插入或增加受体基因组或反基因组的供体基因或基因片段。这样，受体基因组或反基因组作为一种载体以输入或表达外源基因或基因片段，以产生一嵌合RSV，其表现出新的结构和/或表型特征。优选的是，当其与相应的未修饰的受体和/或供体的表型相比较时，异源基因或基因片段在所选择的受体RSV株中的增加或替换产生一新的表型，例如减毒、生长改变、免疫原性的变化或其他预期的表型改变。

    典型的减毒嵌合RSV已被开发且描述，其包含有人类RSV B亚型糖蛋白基因F及G，其与RSV A亚型基因组相比较替换了相应的F及G糖蛋白基因。这一典型的嵌合体已被进一步修饰，以含有减毒突变，其选自(i)一组表征温度敏感性氨基酸替换Gln831至Leu及Tyr1321至Asn的突变；(ii)在基因M2的基因起始序列中的温度敏感性的核苷酸替换；及(iii)获自冷传代RSV的表征RSV N基因中氨基酸替换Va1267至Ile及RSV聚合酶基因L中的Cys319至Tyr及His1690至Tyr的减毒突变组；或(iv)缺失SH基因(参见，例如美国专利申请号09/291,894)。优选的情况是，这些及其他的嵌合病毒实例含有至少两种减毒突变，其可以来自相同或不同的突变病毒株。

    典型的减毒嵌合PIV同样已被开发且描述其含有来自HPIV-1及HPIV-3的异源序列，和从PIV3突变株cp45中获得的减毒突变，参见美国专利09/083,793，申请日期为1998年5月22日(相应的国际申请号为WO 98/53078)及其优先权申请，申请日为1997年5月23日，申请号为60/047,575，所述文献均引入本文作为参考。最近，所有的在cp45中鉴别的减毒突变，除了F蛋白中的以外，均已成功被引入减毒重组的HPIV3-1嵌合体中。

    异源免疫原性蛋白、结构域及抗原决定簇的引入用以产生一个嵌合负链RNA病毒，其对于在一个免疫宿主中产生新的免疫反应是尤其有用的。在一个不同的病毒株或亚型的受体基因组或反基因组中增加或替换为来自于一供体病毒株或亚型的免疫原性基因或基因片段将产生一个直接针对供体株或亚型、受体株或亚型、或同时抗供受体株或亚型的免疫反应。为了达到这个目的，嵌合病毒同样可被构建，以表达一嵌合蛋白，例如，一具有细胞质尾和/或跨膜结构域的免疫源性蛋白，其特定针对一个病毒株或亚型，并与一个不同病毒的胞外区域融合。该种类型的另外的典型重组体可以表达重复蛋白区域，例如重复免疫原性区域。

    虽然在一个嵌合基因组或反基因组中一般情况下增加或替换全部基因(包括顺式作用元件及编码区域)是有用的，仅仅转移一部分感兴趣的供体基因也是有用的。更为普遍的是，非编码性核苷酸例如顺式作用调控元件及基因间隔序列没有必要使用供体基因编码区进行转移。此外，许多基因片段提供了有用的供体多核苷酸，用以包含在嵌合基因组或反基因组中以表达具有新及有用的特性的嵌合病毒。这样，异源基因片段可以有利地编码来自一个病毒的所选择蛋白的细胞质尾部、跨膜功能区或胞外域、抗原决定位点或区域、结合位点或区域、活性位点或含活性位点的区域等。这些及其他的基因片段可以被添加或替换别的病毒中的对应基因片段以产生一个新的嵌合重组体，例如表达具有与另一病毒糖蛋白胞外区融合的一个病毒糖蛋白的细胞质尾部和/或跨膜功能区的嵌合蛋白的重组体。在这一点上有用的基因组片段大约从15-35个核苷酸(这些基因片段编码蛋白的小功能性区域)例如抗原决定位点，到大约50、75、100、200-500及500-1,500或更多的核苷酸范围(基因片段编码大的蛋白区域或结构域)。

    为了构建携有转移的减毒突变的嵌合病毒，在整个或部分的背景基因组或反基因组中可以增加或替换为异源基因以形成一个嵌合基因组或反基因组。所述突变可与一个或多个附加的突变一起存在于异源基因(即，供体基因)或基因片段中，或可以被引入全部或部分的受体基因组或反基因组“背景”中去。以通过替换产生的嵌合病毒为例，用来自一个病毒的选择的蛋白或蛋白区域(例如，一个细胞质尾，跨膜功能区或胞外域，抗原决定位点或区域，结合位点或区域，活性位点或含活性位点的区域等)替换在不同的基因组或反基因组中一个相应的“对应”基因或基因片段以产生一个与野生型或亲本株相比较具有预期表型改变的新重组株。正如本文所使用的，“对应”基因、基因片段、蛋白或蛋白区域指的是两个异源的相对应的多核苷酸，来源包括在单一种或株中的不同基因或同一基因的不同变体，包括在不同病毒株或亚型中的等位基因变体或种。

    对应基因或基因片段一般至少具有中等程度的结构相似性。例如，对应基因片段可以编码一共同的相关蛋白结构域，例如细胞质结构域，跨膜结构域或胞外域，抗原决定位点或区域，结合位点或区域等等。典型的情况是，它们都可以具有一共同的生物学功能。例如，为对应基因片段所编码的蛋白结构域可以提供一相同的跨膜结构域，一个特异的结合活性，一个免疫学识别位点等。用于在本发明中构造减毒嵌合病毒的对应基因或基因片段可以包括具有不同大小及序列差异的不同种的集合。然而，对应基因或基因片段的选择赖于主题对应物之间基本的序列同一性，正如上所述的那样。在本说明书中，一个选择的多核苷酸参照序列作为供体或受体基因组或反基因组中序列的全部或一部分。该参照序列被用于一个提供序列对比基础的确定序列。例如，参照序列可以为确定的cDNA或基因的片段，或完整的cDNA或基因序列。

    众所周知的基于cDNA的方法对于构建一大组含有在异源病毒中所鉴别的减毒突变的重组嵌合病毒或亚病毒颗粒是非常有用的。这些重组构建体提供了用于疫苗试剂的改善的减毒及免疫原性特征。在本说明书所预期的表型改变中有对一个减毒表型反转的抗性，在培养物或选择的宿主环境中减毒的提高，免疫原性特征(例如，由增加、减少或引发的免疫反应而确定)，所选择的病毒产品的翻录或转译的正调节或负调节等。

    在本发明的其他方面，含有在异源病毒中所鉴别的减毒突变的减毒重组病毒通过引入一个或多个表征改变的减毒表型的其他减毒突变而进一步被修饰。这些突变可重新产生且按照合理性设计的诱变策略测试减毒效果。作为一种选择，减毒点突变在生物学上获得的突变株如一个RSV或PIV ts或cp突变株中被鉴别，然后被引入本发明的一个减毒重组病毒中去。这样被进一步减毒的重组株可以是一个嵌合病毒。

    被用于引入疫苗株的生物学上获得的RSV中的进一步的减毒突变可天然存在或通过如上述和USSN 08/327,263(所述文献引入本文作为参考)所述的已知的诱变技术被引入至野生株中去。

    “生物学上获得的”突变病毒意指其并未通过重组手段产生的任一突变病毒。这样，生物学上获得的突变病毒株可以是任意负链RNA病毒株、亚型或种，例如，天然存在的RSV或PIV，其具有一个突变的基因组序列，或RSV或PIV，其具有来自于一个参照野生型序列的基因组变化，例如，具有表征减毒表型的突变。同样地，生物学上获得的病毒包括通过(尤其是)人工诱变及选择程序获自一亲本株的突变株。

    如上所述所鉴别的进一步的减毒突变被编辑进入了一个“目录”中然后如期被单独或结合引入以调节候选疫苗病毒至一合适的减毒，免疫原性、对从减毒表型中反转的遗传抗性等等如预期的那样的水平。更适宜的是，本发明的重组突变病毒通过引入至少一种，且更优选两种或更多的鉴别自这样一个目录的减毒点突变而被减毒，所述目录为，例如，RSV突变株组例如cpts RSV 248(ATCC VR 2450)，cptsRSV 248/404(ATCC VR 2454)，cpts RSV 248/955(ATCC VR 2453)，cpts RSV 530(ATCC VR 2452)，cpts RSV 530/1009(ATCC VR 2451)，cpts RSV 530/1030(ATCC VR 2455)，RSV B-1 cp52/2B5(ATCC VR2542)，及RSV B-1 cp-23(ATCC VR 2579)等。其它突变可来自同种或异种病毒，包括具有已被鉴别的ts、cp或非-ts或非-cp的减毒突变的病毒，所述减毒突变例如在小噬斑(sp)、冷适应性(ca)或宿主范围限制性(hr)突变株中得以鉴别。减毒突变可在基因的编码区域或非编码区域例如顺式作用调控序列中选出。例如，减毒突变可以包括在一个基因起始序列中一个或多个碱基的改变，例如在RSV中M2起始序列的7605位核苷酸上的单个碱基发生替换。以这种方式，重组候选疫苗的减毒可以被很精确地计算，以用于一个或更多类别的病人中去，包括血清反应阴性的婴幼儿。从cDNA中生产病毒的可能性允许将这些突变单独或以不同的所选组合常规引入全长cDNA克隆，随后可很容易确定含有引进突变的已拯救的重组病毒的表型。

    通过鉴别及引入与预期表型例如一个cp或ts表型相关的减毒突变进入一感染性的重组病毒克隆，本发明提供了一个另外的在或靠近于所鉴别突变的位点特异性修饰。尽管许多产生于生物学上获得的病毒的减毒突变为单一性的氨基酸替换，其他的“位点特异性”突变通过重组技术也可以被引入到本发明所述重组病毒中去。正如本文所述，位点特异性突变包括从1-3直到大约5-15或更多的已改变的核苷酸(例如，从野生型序列改变，从一选择的突变株改变，或从一个进行诱变的亲本重组克隆中改变)的插入、替换、缺失或重排。这样的位点特异性突变可以被引入在所选择减毒突变上或位于其区域中。作为一种选择，突变在病毒克隆中可以在其他的不同的区域引入，例如在或接近于顺式作用调控序列或编码蛋白活性位点、结合位点、免疫原性抗原决定簇等的核苷酸序列上。位点特异性病毒突变株一般保留一个预期的减毒表型，但是可能显示出充分改变的表型特征，其与减毒无关，例如，免疫原性的提高或范围增大、生长改善。预期的位点特异性突变体的进一步的例子包括含有附加的表征减毒突变的密码子中的稳定的核苷酸突变的重组病毒。在一些可能情况下，在亲本突变株或重组克隆中表征减毒氨基酸改变的密码子上两个或更多的核苷酸替换被引入，因此产生了一个具有对从减毒表型中反转有遗传抗性的重组株。在另一些实施方案中，位点特异性核苷酸替换、增加、缺失或重组在相对于靶定核苷酸位点的上游(按照所编码病毒蛋白的N末端方向)或下游(C-末端方向)，例如，从1-3、5-10直至15个核苷酸或更多5’或3’，例如，以构建或切除一个已存在的顺式作用调控序列。

    除了单一或多重点突变或位点特异性突变外，本发明减毒重组病毒的改变包括缺失、插入、替换或整个基因或基因片段的重排。这些突变可以改变在受体或供体基因组或反基因组中小量的碱基(例如，从15-30个碱基，直至35-50个碱基或更多)，或大的核苷酸区域(例如50-100、100-300、300-500、500-1000个碱基)，其依赖于改变的性质(也就是说，小数量的碱基可以被改变，以插入或缺失一个免疫原性抗原决定簇或改变一小的基因片段，而涉及大的碱基区域时，大的基因或基因片段被增加、替换、缺失或重排。

    在另一方面，本发明提供了在来自于异源病毒的重组负链病毒中CDNA的突变，例如cp及ts突变株中补充进一步修饰的重组病毒中涉及相同或不同基因的附加类型的突变。这样看来，病毒蛋白可以被选择性地按照表达量进行改变，或被全部或部分增加、缺失、替换、重排，单独或与其他的预期修饰结合以产生一个重组减毒病毒，其具有另外的新疫苗特征。

    这样，除了获自异源病毒突变株的减毒突变，本发明同样提供了一些其他方法，其用于减毒和基于重组技术的重组候选疫苗的修饰。与本发明这一点相一致的是，不同改变可以产生于编码重组基因组或反基因组的分离的多核苷酸序列。更为特定的是，为了在重组PIV中获取预期的结构及表型改变，本发明允许这样的修饰引入：缺失、替换、引入或重排一所选择的核苷酸或来自亲本基因组或反基因组的多数核苷酸，以及在亲本基因组或反基因组中发生整个基因或基因片段的的缺失、替换、引入或重排。

    减毒重组病毒的预期修饰一般被选择以表征一预期的表型改变，例如病毒生长，温度敏感性，引发宿主免疫反应的能力，减毒的改变等等。这些改变可以在供体或受体中基因组或反基因组中通过例如亲本克隆的诱变而实现，以缺失、引入或重排一特定的基因或基因区域(例如，一个编码蛋白结构区域例如细胞质、跨膜或胞外功能区、一个免疫原性抗原决定簇、结合区域、活性位点等等的基因片段)。这里的相关基因可以包括任一病毒基因，例如，3’-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5’(以RSV为例)，和来自其它病毒的异源基因。

    同样被提供的是在一个候选重组疫苗中的修饰，其改变或消除了所选择基因的表达，例如通过在所选择的RSV编码序列中引入一终止密码子，改变基因相对于操作性连接的启动子的位置，引入一上游启始密码子以改变表达的速率，修饰(例如，通过改变位点，改变已存在的序列，或使用一异源序列替换已存在的序列)转录信号以改变表型(例如，生长、转录的温度限制等等。)。还提供了各种其他的缺失、替换、增加及重排，这些都表征在所选择基因的转录、所选择蛋白的翻译、病毒的复制上数量及质量的改变。

    分析及合并其他类型的减毒突变进入重组候选疫苗中去的能力扩展至一个很广泛的集合，其中靶定在重组克隆中的变化。例如，在RSV中SH基因的缺失产生了一个具有新表型特征(其包括生长发育的提高)的重组RSV。这样，在本发明的重组RSV中一个SH基因缺失(或其他的非必需基因或基因片段缺失)，在一个重组病毒中与一个或多个附加的表征减毒表型的突变结合。这些突变例如为一个或多个来自异源病毒的点突变，其选择性地为一个或多个来自生物学上获得的减毒突变株的进一步减毒突变所补充。在一些实施方案中，RSV的SH基因或NS2基因缺失并结合了一个或多个选自cpts248/404、cpts530/1009、cpts530/1030或其他所选择的RSV突变株的cp和/或ts突变以产生一个具有提高病毒产量、增强减毒、表型反转的抗性等归于不同突变的结合所产生的效应的重组RSV。

    在SH减少的RSV克隆中的一个典型实例中，所修饰的病毒基因组是14,825 nt长度，其与野生型相比较少398个核苷酸。通过引发可以减少基因组大小的相似的突变，例如在RSV基因组的其他的编码区或非编码区，例如在P、M、F及M2基因中，本发明提供数个易于获得的方法及实验材料，其用于提高嵌合RSV的生长。

    此外，按照本发明所述方法，其他多种遗传学改变也可产生于一个重组基因组或反基因组以被引入一感染性的减毒病毒颗粒。另外的异源基因或基因片段(例如获自不同病毒基因或不同病毒株或类型)可以被全部或部分插入，基因序列被改变，移去基因重叠序列，基因组启动子被反基因组相应位点所替换，部分基因被除去或替换，有时甚至全部基因缺失。序列中的不同的或附加修饰可被用于促进操作，例如在不同的基因间隔区域或其他位点独特的限制位点的插入。非翻译基因序列缺失以增加外源序列插入的可能性。

    在本发明中同样也提供了在一个减毒重组候选疫苗病毒株中的遗传学修饰，其改变或消除了一个选择基因或基因片段的表达，同时并未从重组克隆中除去基因或基因片段。例如，这些通过在一个所选择的编码序列中引入一个终止密码子，改变一个基因的位点或引入一个上游启动密码子以改变其表达的速率，或改变转录信号以改变表型(例如，生长、转录的温度限制性等)而实现。

    在本说明书中优选的突变包括朝向顺式作用信号的突变，其可以被鉴别，例如，通过病毒微基因组的突变分析。例如前导序列、非转录尾区及侧翼序列的插入或缺失分析可鉴别病毒启动子及转录信号且提供了一系列与RNA复制或转录减少程度的改变相关的突变。顺式作用信号的饱和诱变(由此每一位置被修饰至每一可选择的核苷酸)同样鉴别出许多突变，其减少了(或者，在两种情况下增加)RNA的复制或转录。这些突变的任意一个可以被插入进一个本文所述的重组的反基因组或基因组中去。

    反式作用蛋白及顺式作用RNA序列使用完全的反基因组cDNA进行评价和操作并且其使用病毒的微基因组作为辅助(参见，例如Grosfeld等，J.Virol.69：5677-5686(1995)，所述文献引入本文作为参考)，其依赖辅助病毒的状态在描述这些突变株的特征中是非常有用的，这些突变株也是太受抑制而不能在复制非依赖性的感染病毒中回收。

    本发明重组病毒的其他突变涉及到基因组3’末端的替换，其为来自于反基因组的相应位点所替换。其与RNA复制及转录中的改变是相关的。此外，基因间隔区(Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：4594-4598(1986)，所述文献引入本文作为参考)可以被切短或延长或序列的内容发生改变及天然存在的基因重叠(Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5134-5138(1987)，所述文献引入本文作为参考)可以通过本文所述的方法被除去或改变成不同的基因间隔区。

    在另一个典型的实施方案中，特定蛋白例如RSV蛋白保护性F及G抗原的表达水平，可通过使用一个已被设计为与有效翻译相一致的，且被装配进入合成的CDNA中的密码子替换天然密码子而得以增加。在本说明书中，已经显示密码子选择对于哺乳动物病毒蛋白的翻译水平是一个至关重要的因素(Haas等，Current Biol.6：315-324(1996))。编码RSV的F及G蛋白的mRNA的密码子选择的确定，显示了该选择与较弱表达一致，所述F及G蛋白为主要的保护性抗原。这样，通过本发明的重组方法，密码子选择得以改进以实现所选择基因的提高的表达。

    在另一个典型实施方案中，一个所选择病毒基因的围绕一个翻译起始位点的序列(优选是包括一个-3位置的核苷酸)被修饰，其单独或联合一上游起始密码子的引入，从而通过针对翻译的正或负调控以调节减毒重组病毒的基因表达。

    在一个更为详细的实施方案中，减毒的RSV基因的表达可以通过改变一个病毒所选择基因的转录GS信号而调控。在另一个实施方案中，NS2的GS信号被修饰以包括一个定义的突变(例如，下文描述的404(M2)突变)从而在病毒的复制中添加一个ts限制。此外另一个减毒RSV克隆可以将修饰引入至一个转录GE信号。例如，RSV克隆可以被产生，其具有对于N基因来说一个替换的或突变的NS1及NS2基因GE信号，其结果在于通读mRNA水平的减少及来自下游基因的蛋白表达的增加。所得的重组病毒将展示生长动力的提高，噬斑大小的增大，条件是通过在RSV基因组中顺式作用调控序列的修饰而改变RSV的生长特性仅为一例。

    在另一个实施方案中，减毒重组的RSV的G蛋白的特定表达通过修饰G mRNA而被提高。G蛋白作为一种膜结合型及一种分泌型蛋白而被表达，后者通过在一个G翻译开放阅读框的起始位点开始翻译而被表达。分泌形式大约可占表达的G蛋白中的一半。内部起始位点的切除(例如，通过序列变化、缺失等等)，单独或与上游起始位点序列的改变结合以产生预期的G蛋白表达改变。G蛋白分泌形式的切除同样将提高宿主针对典型的嵌合RSV的免疫反应的质量，因为G蛋白的可溶解形式被认为是诱骗捕获中和抗体而起作用的。同样，可溶解性G蛋白还与免疫病理学的提高相关，因为其对Th2偏向的反应有优先刺激作用。

    在另一个实施方案中，减毒重组病毒基因表达的水平在转录水平被修饰，在另一方面，在RSV基因图谱中一个所选择基因的位置可以被改变至一个更邻近启动子或远离启动子的位点，由此基因将被或多或少地分别有效表达。按照这一点，特定基因的表达调控可以被完成，产生相比较野生型水平减少或增加两倍的基因表达，典型的是4倍，直至10倍或更多。在一个实施方案中，RSV的NS2基因(在RSV基因图谱中位于第二位)在该位置为SH基因(排在第六位)所替换，产生了一个预期的NS2的表达减少。因为位置改变而发生的所选择的RSV基因的表达提高可以被完成，上至10倍或更多，常伴有在互补位置上替换的基因中产生一个表达水平的相应的减少。

    在另一个典型实施方案中，病毒基因可以单独或和其他一同被转座至重组病毒基因图谱中更接近启动子或更疏远启动子的位点上，以分别实现基因表达水平的较高或较低值。这些及其他的转座改变产生一具有减毒表型例如涉及RNA复制中所选择病毒蛋白的减量表达等的新的克隆。

    在本发明更为详细的方面，减毒重组病毒可以通过消除病毒基因如RSV的NS2基因的表达而在翻译水平上进一步修饰，并且并未缺失基因或基因片段，例如，通过将两个一前一后的翻译终止密码子引入翻译开放阅读框(ORF)中。这样产生的活病毒其中的一个所选择基因在翻译水平是沉默的，且并未缺失该基因。这些“剔除”病毒形式在组织培养物中表现出生长缓慢及噬斑变小。这样，本发明的方法及组合物提供了一种附加的、新型的减毒突变，其可以消除并非主要病毒保护性抗原或病毒生长所必需的病毒基因的表达。在本说明书中，在不缺失基因或基因片段的情况下产生的“剔除”病毒表型也可以如这里所述的通过缺失诱变而产生，从而有效地排除了回复目标蛋白合成的校正性突变。产生这些及其他剔除的方法在本领域内是共知的(正如Kretzschmar等，Virology 216：309-316(1996)；Radecke等，Virology 217：418-412(1996)；及Kato等，EMBO J.16：178-587(1987)；及Schneider等，Virology 277：314-322(1996)所述那样，所述文献均引入本文作为参考)。

    本发明的感染性重组病毒克隆同样可按照本文所揭示的方法及组合物进行制作以提高免疫原性及诱导强于野生型或亲本重组病毒诱导反应的较高水平的免疫保护反应。例如，来自一个异源病毒株或类型例如PIV的免疫原性抗原决定簇可以加入到一个重组克隆例如RSV中，通过在编码嵌合基因组或反基因组的多核苷酸序列中合适的核苷酸改变而实现。此外，也可以操作病毒以增加或消除(例如，通过氨基酸插入、替换或缺失)与预期或非预期免疫反应相关的免疫原性抗原决定簇。

    在本发明所述方法中，附加的基因或基因片段可被插入或靠近一个受体基因组或反基因组。这些基因可与受体基因一起受调控或处于单独一组转录信号的控制下。感兴趣的基因包括编码细胞因子(例如，IL-2至IL-15，尤其是IL-2、IL-6及IL-12等)的基因、编码γ-干扰素的基因及编码富含T辅助性细胞抗原决定簇的蛋白的基因。这些附加蛋白或者作为一单独蛋白被表达，或者作为从一个病毒蛋白例如SH的另一拷贝中获得的嵌合体而表达。这样就提供了改进及提高抗病毒免疫反应的数量及质量的能力。

    在本发明的一个实施方案中，外源基因或基因片段，或有时是非编码核苷酸序列插入到重组病毒基因组中去，结果导致有附加预期表型效果的基因组长度的预期增加。增加的基因组长度结果使得病毒减毒，减毒的程度部分依赖于插入的长度。此外，从异源至本发明所述重组减毒病毒的一定蛋白例如细胞因子的表达因为蛋白活性而导致病毒的进一步减毒。这在IL-2在疫苗病毒中表达中已经证实(例如Flexner等，Nature 33：-259-62(1987))，同样在γ干扰素中也预期出现类似情况。

    在本发明所述重组病毒中涉及整个病毒基因或基因片段的改变的缺失、插入、替换及其他突变产生高稳定性的候选疫苗，其在免疫抑制个体中是尤为重要的。许多这种改变结果导致疫苗株的减毒，而其他将表征预期表型改变的不同类型。例如，一定的病毒基因已知可以编码与宿主免疫性特别干扰的蛋白(参见，例如，Kato等，EMBO.J.16：578-87(1997)，所述文献引入本文作为参考)。消除重组疫苗病毒中的该基因，预期可以减少毒性及致病性和/或提高免疫原性。

    附加的突变可以进一步使本发明所述的重组病毒减毒，其包括异源基因或顺式作用元件的引入，其提供了宿主范围限制及其他的一些适于疫苗使用的预期表型。在一个实施方案中，牛RSV序列被选择引入人类RSV中，这是基于牛RSV结构及功能的已知方面，正如，例如，Pastey等，J.Gen.Virol.76：193-197(1993)；Pastey等，Virus Res.29：195-202(1993)；Zamora等，J.Gen.Virol.73：737-741(1992)；Mallipeddi等，J.Gen.Virol.74：2001-2004(1993)；Mallipeddi等，J.Gen.Virol.73：2441-2444(1992)；及Zamora等，Virus Res.24：115-121(1992)所提供的那样，所述文献均引入本文作为参考，并且其与本文所公开的一致。在本发明的另一个实施方案中，建立了用于引入到嵌合RSV中的感兴趣的突变，模仿一个组织培养物适应型鼠肺病毒的非致病株(相应于人类RSV的鼠中的RSV)，其缺乏一个G蛋白的细胞质尾部(Randhawa等，Virology 207：240-245(1995))。因此，在本发明的一个方面，一个或更多的人类RSV糖蛋白F、G及SH的细胞质和/或跨膜区域，在减毒重组RSV中使用异源对应序列进行添加、缺失、修饰或替换(例如，来自一个鼠肺病毒的F、G及SH蛋白的细胞质或跨膜区域的序列)，以获取预期的减毒。在其他实施方案中，在F蛋白的切割位点或G蛋白推定的附着区或靠近该位点的核苷酸序列可以通过点突变、位点特异性改变或者全部基因或基因片段的改变进行修饰以对病毒在组织培养物中的生长和/或感染性及致病性有一个新的影响。

    除了上述对重组疫苗病毒的修饰，也可以使用病毒克隆中不同的或附加的修饰来促进操作，例如在不同基因间隔区或其他位点单一限制位点的插入。非翻译基因序列可被移去以提高外源序列插入的能力。

    在本发明的另一方面，组合物(例如，分离的多核苷酸及含有具有在异源病毒中所鉴别的突变的重组负链RNA病毒基因组的载体)被提供以产生一个分离的减毒感染性病毒。使用这些组合物及方法，感染性病毒及亚病毒颗粒产生于一个重组基因组或反基因组及选择的病毒蛋白，例如，一个核壳(N)蛋白、一个核壳磷蛋白(P)、一个大的(L)聚合酶蛋白及在一个的RNA聚合酶延伸因子(针对RSV而言)。在本发明相关的方面，提供了组合物及方法以在重组病毒中引入前述结构及表型改变，以产生一感染性、减毒的疫苗病毒。

    通过一系列上面已作为参考的已知的方法来将前述确定的突变引入一个感染性的重组病毒中去。这里“感染性克隆”意指cDNA或其产物(合成或经其他途径获得)，其可以被转录进入一个基因组或反基因组RNA中去，其能够作为一个模板以产生感染性病毒或亚病毒颗粒。这样，通过传统技术(例如定点诱变)一定的突变可被引入基因组或反基因组的一个cDNA拷贝中去。使用反基因组或基因组cDNA亚片段以组合一如本发明所述完整的反基因组或基因组cDNA，其具有每一区域都可以被单独操作的优势(小的cDNA相比较大的易于操作)，且很容易被装配进入完整的cDNA中去。这样，完整的反基因组或基因组cDNA，或其亚片段可被用作一个模板以进行寡聚核苷酸指导的诱变。这可途经一个单链质粒形式例如使用Bio-Rad实验室的Muta-gene试剂盒(Richmond，CA)或使用一个双链质粒直接作为模板例如Stratagene的Chameleon诱变试剂盒(La Jolla，CA)的方法或通过聚合酶链反应使用一含有相关突变的寡聚核苷酸引物或模板的方法进行操作。一个突变的亚片段然后被装配进入一个完整的反基因组或基因组cDNA。许多其他的诱变技术已知且适于使用以在反基因组或基因组cDNA中产生一个感兴趣突变，突变可以从单一核苷的改变到含有一个或多个基因或基因组区域的大的cDNA片段的替换进行变化。

    这样，在一个说明性实施方案中，通过使用获自Bio-Rad公司的Muta-gene噬菌粒诱变试剂盒而引入突变。编码一部分RSV基因组或反基因组的cDNA被克隆进入一个质粒pTZ18U中，且被用于转化CJ236细胞(生命技术公司)。如手册推荐那样准备噬粒试剂。通过在基因组或反基因组的预期位点引入一个改变的核苷酸进行诱变而设计寡聚核苷酸。含有遗传学改变的基因组或反基因组片段的质粒然后被扩增且突变片段被重新引入全长的基因组或反基因组克隆中去。

    本发明同样也提供了产生一含有在从一个或多个分离的多核苷酸例如一个或多个cDNA中获得的异源病毒中鉴别的减毒突变的减毒感染性重组病毒的方法。一个编码一主题病毒基因组或反基因组的cDNA被构建以在胞内或体外与必需病毒蛋白一起共表达以产生一个例如感染性的RSV。这里“反基因组”意指一个分离的正义多核苷酸分子，其用作合成后代病毒基因组的模板。更适宜的是构建一个cDNA，其为一个正义基因组合成的模板，其相应于复制的中间体RNA或反基因组，从而减少与编码有助于转录复制核壳的产生的蛋白的互补序列的正义转录物进行的杂交。对于本发明的这个目的，重组病毒的基因组或反基因组仅仅需要含有这些基因或其中必须的部分，以使所编码的感染性的病毒或亚病毒颗粒具有感染性。更进一步，基因或其一部分可以通过多于一个的多核苷酸分子而提供，也就是说，通过互补或类似途径从一个单独的核苷酸分子中提供一个基因。

    这里重组病毒意指一个完整的病毒或类似病毒的亚病毒颗粒，其直接或间接衍生于一个重组表达系统或从由此产生的病毒或亚病毒颗粒繁殖得到。重组表达系统具有一个重组表达载体，其含有一个可操作性连接的转录单元其具有至少一个遗传元件或在病毒基因表达过程中起控制作用的元件的集合体，例如，一个启动子，一个转录进入病毒RNA的结构或编码序列，一个合适的转录启动或终止序列。

    为了从cDNA表达的基因组或反基因组中产生感染性病毒颗粒，按照已知方法表达基因组或反基因组以(i)产生一个能够进行RNA复制的核壳，及(ii)使后代核壳能够进行RNA复制及转录。通过基因组核壳进行的转录提供了其他的蛋白并引发了一个大规模的感染。作为一种替换，其他的对于大规模感染所必须的病毒蛋白可以通过共表达而产生。

    一个病毒反基因组可以被构建而在本发明中使用，例如，通过装配克隆的cDNA片段，其集合形式代表完全的反基因组，通过使用病毒信使RNA及基因组RNA的反转录拷贝的聚合酶链反应(PCR；参见美国专利4,683,195及4,683,202以及PCR手册：实践及使用方法指南(PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications)，Innis等编辑，Academic Press，San Diego(1990)，所述文献引入本文作为参考)。例如，含有反基因组或其中一部分的cDNA被装配进入一个合适的表达载体，例如质粒或各种可得的装配型质粒、噬菌体或DNA病毒载体。载体可以通过诱变和/或插入合成的多接头进行修饰，所述多接头含有被设计用于促进装配的单一限制位点。在某些如RSV的情况下，特殊载体(pBR322)的使用可以稳定病毒序列，其在其他情况下可能还会维持核苷酸缺失或插入。此外，质粒的繁殖可以通过特定的菌株(例如DH10B)的选择而得以促进，以避免人工复制或插入，其在其他情况下会发生(例如，在RSV中临近4499位核苷酸)。

    在本发明的一些实施方案中，编码一对产生一为转录、复制病毒核壳所必须的蛋白的互补序列可以通过一个或更多的辅助病毒来进行提供。这些辅助病毒可以是野生型或突变株。优选的情况是，辅助病毒可以从为cDNA编码的病毒中因表型差异而区别出来。例如，预期提供一个单克隆抗体，其与辅助病毒发生免疫反应但并不与CDNA编码的病毒发生反应。这样的抗体可以是中和抗体。在一些实施方案中，抗体可以被用于亲和色谱，以从重组病毒中分离出辅助病毒。为了帮助这些抗体的取得，可以在cDNA中引入突变以从辅助病毒中提供一抗原多样性，例如RSV HN或F糖蛋白基因。

    在病毒基因组或反基因组中可以插入或缺失许多核苷酸以产生一个修饰的减毒病毒克隆。副粘病毒及麻疹病毒属中的成员一般都遵守一个“六原则”，也就是说，基因组(或微基因组)仅仅当其核苷酸长度为6的倍数时复制最为有效(被认为是核苷酸残基相对于核壳N蛋白的精确间距的需要)

    构建编码含有在异源病毒中鉴别的突变的重组负链RNA病毒的cDNA的可替换性的方法包括使用改良的PCR条件(例如，如Cheng等所述，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：5695-5699(1994)，所述文献引入本文作为参考)进行反转录以减少cDNA组分亚基的数量至一个或两个片段。在另一个实施方案中可以用到不同的启动子(例如，T3，SP6)或不同的核酶(例如，丁型肝炎病毒的核酶)。不同的DNA载体(例如装配型质粒)其可被用于增殖，以承载大的基因组或反基因组。

    单独或共同编码病毒基因组或反基因组和必要的病毒蛋白的分离的多核苷酸(例如cDNA)通过转染、电穿孔、机械插入、转导或类似方法被插入到能够支持有效病毒感染产生的细胞例如HEp-2、FRhL-DBS2、MRC及Vero细胞中去。分离的多核苷酸片段的转染可以被引入到培养的细胞中去，通过例如磷酸钙介导的转染(Wigler等，Cell 14：725(1978)；Corsaro及Pearson，Somatic Cell Genetics 7：603(1981)；Graham及Van der Eb，Virology 52：456(1973))、电穿孔(Neumann等，EMBO J.1：841-845(1982))、DEAE-右旋糖酐介导的转染(Ausubel等(编辑)Current Protocols in Molecular BiologJohn Wiley and Sons，Inc.，NY(1987)、阳离子型脂质介导的转染(Hawley-Nelson等，Focus 15：73-79(1993))或一商业上可获得的转染试剂，例如，LipofectACE(Life Technologies)(下述每一个参考资料均引入本文作为参考)。

    病毒蛋白为一个或多个表达载体所编码，所述表达载体可以与编码基因组或反基因组及其不同组合的载体相同或不同。附加的蛋白可以如期被包括，其为自己的载体或编码必要病毒蛋白的载体所编码。基因组或反基因组及来自感染性质粒的蛋白的表达可以获得，例如通过每一个在T7 RNA聚合酶启动子调控下的cDNA，其回过来也可以通过用一个T7 RNA聚合酶表达系统进行感染、转染或转导而取得，所述表达系统，例如一个疫苗病毒MVA株重组体，其表达T7 RNA聚合酶(Wyatt等，Virology，210：202-205(1995)，所述文献引入本文作为参考)。病毒蛋白和/或T7 RNA聚合酶，可以同样从转化的哺乳动物细胞中获得或通过预先形成的mRNA或蛋白的转染而获得。

    作为一种选择，基因组或反基因组的合成可以在已结合的转录翻译反应中体外完成，随后转染进入细胞。或者，基因组或反基因组RNA也可以体外合成，然后转染进入表达病毒蛋白的细胞。

    按照本发明为了选择候选疫苗病毒，存活的标准、减毒及免疫原性可以按照已知的方法进行确定。将很可能成为本发明疫苗的病毒必须保持存活，具有稳定的减毒表型，在免疫的宿主中可以复制(即使是在很低的水平)，及有效引发足够的免疫反应来抵抗由野生型病毒引发的严重的感染疾病。在本说明书中，本发明的病毒不仅仅是活的及比以前突变株减毒的，而且相比较以前研究的突变株来说，其在体内是遗传学上更稳定的—能够激发保护性免疫应答和在某些情况下可以通过多种修饰而扩展这种保护，例如，诱导抗不同种、亚型病毒的反应，或者通过不同的免疫基础例如抗血清免疫球蛋白分泌能力，细胞免疫及其类似情况等等来进行保护。

    为了繁殖携有在异源病毒中所鉴别的突变的重组负链RNA病毒，可以用到一些允许病毒生长的细胞系。用于繁殖用作疫苗使用的减毒突变病毒株的理想细胞系包括DBS-FRhL-2、MRC-5及Vero细胞。RSV的高产量经常可以通过使用上皮细胞系例如Vero细胞而获得。细胞用病毒在不同的感染范围例如从大约0.001至1.0或更多进行接种且培养在允许病毒复制的条件下，例如在大约30-37℃及大约3-5天或者更长以使病毒达到一个足够的滴度。病毒从细胞培养物中移出且通过已知的分离技术例如离心从细胞组分中分离，且可以使用本领域共知技术进一步纯化达到预期目的。

    本文所述已经减毒的重组病毒可以通过许多已知的且被普遍接受的体内或体外模式进行测试以证实其足够的减毒、对表型反转的抗性及用作疫苗使用的免疫原性。在体外的实验过程中，修饰的病毒(例如，一个多重减毒的、生物学上获得的或重组病毒株)被测试病毒复制的温度敏感性即ts表型，及小噬斑表型。修饰的病毒在病毒感染的动物模型中作进一步测试。许多用于RSV的动物模型已被描述且为Meignier等编辑的呼吸道合胞病毒感染的动物模型(Animal Models ofRespiratory Syncytial Virus Infection)Merieux基金出版社，(1991)，所述文献引入本文作为参考)所概括。一个RSV感染的棉鼠模型为美国专利4,800,078及Prince等，Virus Res，3：193-206(1985)(所述文献引入本文作为参考)所描述，并且可以用于合理地推测在人类或非人类的灵长类中减毒及其中的效果。此外，一个使用黑猩猩的RSV感染的灵长类动物模型用于合理性推测其在人类中的减毒及有效性，其已为Richardson等所描述，J.Med.Virol.3：91-100(1978)；Wright等，感染免疫学(Infect.Immun.)37：397-400(1982)；Crowe等，疫苗11：1395-1404(1993)，所述文献均引入本文作为参考。其他一些用于很宽范围的负链RNA病毒的动物模型均已知。获自这些动物模型中的数据与重组负链RNA病毒的减毒水平及免疫原性的相关性均被普遍接受。例如，在感染的棉鼠中RSV中和抗体的医疗效果已被显示与随后的使用猴子或人类使用RSV感染所进行的实验有很高的关联性。事实上，棉鼠显示出其为对于使用RSV中和抗体进行免疫治疗的合理的可信赖的被感染的猴子、黑猩猩及人类的实验替代品。例如，RSV中和抗体的数量与在棉鼠中的疗效相关，其可以通过该抗体在治疗动物的血清中的水平来进行测定(也就是说，血清RSV中和滴度为1∶302至1∶518)，其与在猴子中(为1∶539的滴度)或在人类婴幼儿或小孩中(其为1∶877)所证实的范围是一致的。棉鼠中的疗效可以通过在肺中病毒滴度减少100倍或更多而证实(Prince等，J.Virol.61：1851-1854)，而在猴子中观察到一个疗效为肺部病毒滴度减少了50倍(Hemming等，J.Infect.Dis.152：1083-1087(1985))。最后，在因为严重的RSV感染而致支气管炎或肺炎而住院的婴儿或幼小儿童中的疗效可以通过在治疗群体中氧合作用的显著增加及RSV从治疗病人的上呼吸道中可回收量的显著减少而证实。(Hemming等，Antimicrob.Agents Chemother.31：1882-1886(1987))。因此，基于这些研究，棉鼠组成一相关的模型，用于预测嵌合或非嵌合RSV疫苗在婴幼儿中的成功性。其他的啮齿类包括小鼠将同样是非常有用的因为这些动物允许RSV的复制且具有一个更近似人类的体内温度(Wright等，J.Infect.Dis.122：501-512(1970)及Anderson等，J.Gen.Virol.71：(1990))。类似的模型对于其他的负链RNA病毒来说是可获得的且广为所知的。

    与前述一致且基于下述实施方案，本发明同样提供了经分离的用于疫苗使用的感染减毒病毒组合物。该减毒的作为疫苗的一个组分的病毒是分离的且纯化的形式。这里的“经分离的”指的是RSV其并非处于野生型病毒的天然环境中，例如在一个感染个体中的鼻咽中。更为一般的情况是，“经分离的”意指包括减毒病毒作为细胞培养及其他人工介质的一个组分。例如，本发明的减毒的RSV其可以为感染性细胞培养物中所产生，从细胞培养物中分离且被加入一个稳定剂。

    本发明的疫苗含有作为一个活性成分的免疫有效量的重组负链RNA病毒，其携有如本文所述在一个异源病毒中所鉴别的突变。重组病毒可以直接用作疫苗形式或者冻干形式。冻干病毒一般保存在大约4℃。当准备使用时，冻干病毒在一个稳定的溶液例如盐或含有SPG、Mg++及HEPES，有或者没有佐剂，这些下面将进一步描述。生物学上获得的或经重组修饰的病毒可利用生理学上可接受的载体和/或佐剂引入宿主中。有用的载体在本领域内是已知的，其包括，例如，水、缓冲液、0.4％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。所得的液体溶液可以被包装使用或者冻干使用，冻干试剂在给药前结合一无菌液如上所述进行使用。组合物可以包括可药用的辅助成分以接近一个生理学上可以接受的条件，例如pH调整及缓冲试剂、渗涨度调节剂、湿化剂等。例如，醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、单月桂酸脱水山梨酯、油酸三乙醇胺等。可以接受的佐剂包括不完全的弗氏佐剂、磷酸铝、氢氧化铝或者明矾，其均为本领域所共知的材料。优选的佐剂同样包括StimulonTM QS-21(Aquila生物制药公司，Worchester，MA)，MPLTM(3-0-脱酰单磷酰脂质A；RIBI免疫化学研究公司，Hamilton，MT)，及IL-12(遗传学研究所，剑桥，MA)。

    使用减毒病毒疫苗组合物如本文所述经过气溶胶、滴剂、口服、局部或其他途径进行免疫，宿主的免疫系统对疫苗发生反应，其产生特异于一个或多个病毒蛋白例如RSV F和/或G糖蛋白的抗体。免疫的结果是，宿主变为一个对于主题病毒感染产生至少一部分或者全部的免疫抵抗力或者抵抗中度至严重的疾病的发展。

    本发明的疫苗可以包括减毒病毒，其引发抗单一病毒株或者抗原亚型例如RSV A或B或抗多个株或亚型的免疫反应。在本说明书中，一个嵌合疫苗病毒可以引发单一特异性的免疫反应或者多特异性的免疫反应来抵抗多个株或亚型。具有不同免疫源性特征的嵌合病毒也可被结合进一个疫苗混合物中或在一个联合治疗方案中单独给予，以引发更为有效的抗一个RSV株或抗多个RSV株或亚型的免疫保护反应。

    被给予疫苗的宿主可以是任意的对主题病毒或其相关病毒感染易感的哺乳动物，且其能够产生一种针对疫苗病毒抗原的保护性免疫反应。因此，适宜的宿主包括人类、非人类灵长类、牛、马、猪、绵羊、公山羊、兔、啮齿类动物等等。相应地，本发明提供了对不同的人及家畜应用的疫苗的生产方法。

    含有本发明减毒重组病毒的疫苗组合物被给予到在“免疫有效量”(在该剂量足以引发或提高个体抗主题病毒的免疫反应能力)下易感或者处于主题病毒感染的高风险性的患者中。以人类为例，按照已建立的人类疫苗免疫程序给予本发明的减毒病毒，例如，对于RSV，参见Wright等，Infect Immun.37：397-400(1982)，Kim等，Pediatrics52：56-63(1973)，及Wright等，J.Pediatr.88：931-936(1976)，所述文献均引入本文作为参考。简而言之，成人或小孩在鼻腔中通过滴剂被接种免疫有效量的RSV，其通常在一个生理学上可接受的稀释液或载体中，且总体积为0.5ml。与肠胃外免疫接种非复制性疫苗相比较，其具有简单及安全的优点。其同样提供了对局部呼吸道免疫的直接刺激，局部呼吸道免疫在抗RSV中发挥着重要的作用。更进一步讲，这种接种模式有效地避开了来自母亲的RSV特异性血清抗体的免疫抑制效果，这在幼龄中更为常见。同样，RSV抗原的肠胃外给予有时与免疫病原性并发症相关，但是在活病毒中却从未发现这种情况。

    在所有情况中，所给予的减毒病毒疫苗的精确量及给予的次数及时间将根据病人身体状态、体重、给予的方式、试剂的性质等进行决定。剂量范围一般从大约103至大约106噬斑形成单位(PFU)或更多的病毒/病人，更为普通的是从大约104至105 PFU剂量的病毒/病人。在每一病例中，疫苗一定提供足够数量的本发明的减毒病毒以有效引发抗病毒的免疫反应，例如，正如补体结合、血小板中和/或酶联免疫吸附试验及其他方法所确定的那样。在这一点，个体同样被监测上呼吸道疾病的症状。至于对黑猩猩的给予，减毒病毒疫苗导致在鼻咽中疫苗的生长水平比野生型降低10倍或更多，或与不完全减毒病毒的水平相比较近似于降低10倍或更多。

    在新生儿或幼儿中，需要多种给予方式以引发足量的免疫反应，对于RSV感染，应该在出生第1个月内给予，并在整个幼儿期间隔给予，例如两个月、六个月、一年或两年，从而保持抗天然(野生型)RSV感染足够水平的保护反应。相同的是，尤其是对易于重复感染或严重RSV感染的成人例如卫生护理工人、日常照顾工人、幼小的家庭成员、老人、心肺功能减弱的个体来说，需要多重免疫以建立和/或保持保护性免疫反应。免疫的水平可以通过测量中和性分泌及血清抗体的数量来监测，有必要的话进行剂量调整及重复接种以达到预期的保护水平。更进一步，不同的疫苗病毒可被指定为给予不同的受体群体。例如，一个表达一细胞因子或富含T细胞抗原决定簇的蛋白的构建的重组体，对成人来说相比较婴幼儿更具优势。按照本发明所产生的疫苗与表达另一株或亚型病毒抗原的病毒相结合以实现抗多种株或亚型的免疫保护反应。作为一种替换，疫苗病毒可以含有多种病毒株或亚型的保护性抗原决定簇如本文所述以加工进另一克隆中去。

    一般情况下当不同的疫苗病毒被使用时，其可以以混合物的形式被同时给予，但是其也可以被分别给予。例如，作为两个RSV亚型的F糖蛋白其区别仅在氨基酸序列大约11％的不同，这种相似性是在使用RSV或F抗原免疫且使用异源株感染的动物中所观察到的交叉保护免疫反应的基础。这样，使用一个株免疫可以免受相同或不同亚型的不同株的感染。然而，非常可能的情况是，在疫苗中更优选具有RSV抗原亚型A或B的G或F糖蛋白。

    本发明的减毒重组疫苗引发一免疫反应的产生，其可以在随后的野生株病毒感染中抵抗严重的疾病例如肺炎及支气管炎。尽管自然传播病毒依然能够导致感染，但是疾病症状却可能有很大的减少，这是因为免疫及随后因野生型病毒株感染而可能提高的抗性的缘故。接种后，宿主产生的血清及分泌抗体中达到可检测到的水平，其可以在体内外中和掉同源(或同一亚型)野生型病毒。在很多病例中，宿主抗体同样也可以中和不同或非疫苗亚型的野生型病毒。

    本发明的优选的减毒病毒当与在人体中自然传播的野生型病毒相比较时毒性有了很大程度的减毒。嵌合病毒被足够地减毒以致于在绝大多数免疫个体中感染的症状不再发生。在一些病例中，减毒病毒依然能够散布至未免疫的个体中。然而，其毒性已经大打折扣以致于在免疫的或偶见宿主中并未发生很严重的下呼吸道感染。

    本发明疫苗病毒的减毒程度可以通过例如测定在免疫宿主呼吸道中存在病毒的数量及其在野生株或其他已被评估为候选疫苗病毒株的减毒病毒中产生数量的比较而确定。例如，本发明的减毒RSV在高易感性宿主中例如黑猩猩中的上呼吸道中的复制的限制的程度与野生株病毒复制的水平相比较较高，例如复制减少10至1000-倍。同样，在黑猩猩上呼吸道中，减毒RSV疫苗株的复制水平应当低于RSV A2 ts-1突变株，其以前已在血清反应阴性的人类婴儿中被证实为不完全减毒。为了进一步减少与上呼吸道中病毒复制有关的鼻液溢的发展，理想的候选疫苗病毒的复制应该在上下呼吸道中处于限制的水平。然而，本发明的减毒病毒在人类中可以是足够感染性的且有免疫原性的，以在接种个体中产生免疫性保护反应。在一个感染性宿主的鼻咽中RSV水平的确定方法在本领域内是共知的。通过呼吸或鼻咽分泌物的洗涤获得样本，并通过实验手段在组织培养物中定量测量其中的病毒，参见，例如，Belshe等.J.Med.Virology 1：157-162(1977)，Friedewald等，J.Amer.Med.Assoc.204：690-694(1968)；Oharpure等，J.Virol.3：414-421(1969)；及Wright等，Arch.Ges.Virusforsch.41：238-247(1973)，所述文献均引入本文作为参考。这些病毒在宿主动物例如黑猩猩的鼻咽中很容易被测定。其他的确定附加负链RNA病毒的毒性及数量水平的方法已被广泛所知且很容易实施。

    本文所公开的发明通过下述实施例来进一步说明，提供这些实施例是为了举例说明而非限制本发明。为了达到本说明书的目的，本文所引用的所有的出版物及专利文献因各种原因以全文引入本发明。实施例1将HPIV3 JS cp45及RSV cp530及仙台病毒中所鉴别的减毒突变定位至异源负链RNA病毒中的保守性序列元件上

    本实施例证明了在一个突变负链RNA病毒株中所鉴别的突变可以被很容易地定位到单负链病毒目中的异源病毒中的相应的保守性氨基酸序列。这些突变的特征在于相应于亲本序列的结构改变，该亲本序列在一个或多个异源负链RNA病毒中是保守性的(同一性的或保守性的)，这些突变提供了在具有亲本蛋白序列元件的重组病毒中引入的候选突变。

    为了例证本发明的这一点，分析HPIV3突变株JS cp45中一系列已知的突变。该一系列突变包括在聚合酶L基因的亲本残基或序列位点Tyr942、Leu992和/或Thr1558上的ts减毒氨基酸替换。更为详细的情况是，JS cp45突变株的L蛋白表现出减毒突变，其中亲本的Tyr942为His所替换，Leu992为Phe所替换，和/或Thr1558为Ile所替换(参见，美国专利申请08/083,793及其相应的国际申请WO 98/53078，所述文献引入本文作为参考)。与本发明的优选方面一致，这些突变不仅仅是图谱与亲本序列相比较来鉴别该变化，且同样在PIV重组体(r942，r992，r1558，r942/992，r992/1558，r942/1558及r942/992/1558)中成功表现出该特征，单一地或相互结合以验证在克隆的感染性病毒中减毒及回收的效果。

    其他典型的突变也在HPIV3 JS cp45突变株中进行评价，该突变株已知在HPIV3的F及C蛋白中编码减毒氨基酸替换。这些突变包括在JS HPIV3 C蛋白的亲本残基/位点Ile96处的非ts减毒性氨基酸替换，例如，由Ile96至Thr的替换。在HPIV3的F蛋白中的另一典型突变编码在亲本残基或位点Ile420及Ala450的替换，例如由Ile420至Val及Ala450至Thr的替换。

    在HPIV3中鉴别的每一减毒突变提供了对于在其他的负链病毒株中同源蛋白的序列对比的索引。为例证本发明的这一点，按照上述所列的方法使用传统的序列对比以定位在HPIV3中L及F蛋白中所鉴别的突变至一系列异源负链RNA病毒(HPIV1、仙台病毒、HPIV2、BPIV3、MeV及RSV)中的相应位点。正如同表2所示那样，这一研究相当明显地揭示了，所选择突变株的亲本序列元件与异源病毒的野生型序列相比较有相当高的同源性。该结果是非常令人吃惊的，因为序列进化的保守性归因于其具有重要的功能，且其被预测可能产生更为重要的表型效果，例如生存能力或者传染性的下降，其比单一减毒突变更为重要。表2：在HPIV3 cp45 F及L蛋白中所鉴别的减毒突变附近的区域的序列对比HPIV3 cp45 F ORF I420V及A450T

                              *                             *                 HPIV3     4071  QGVKIITHKECSTIGINGMLFNTNKEGTLAFYTPNDITLNNSVALDPIDISIE   (SEQ ID NO.1)BPIV3     407    QGIKIITHKECQVIGINGMLFNTNREGTLATYTFDDIILNNSVALNPIDISME   (SEQ ID NO.2)HPIV1     410    RGVTFLTYTNCGLIGINGIELYANKRGRDTTWGNQIIKVGPAVSIRPVDISLN   (SEQ ID NO.3)HPIV2     404    QGISIIDIKRCSEMMLDTFSFRITSTFNATYVTDFSMINANIVHLSPLDLSNQ   (SEQ ID NO.4)RSV       437    NGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFD   (SEQ ID NO.7)麻疹病毒  410    KILTYIAADHCPVVEVNGVTIQVGSRRYPDAVYLHRIDLGPPISLERLDVGTN   (SEQ ID NO.8)HPIV3 cp45 L ORF Y942H

                                     *HPIV3     923    NPNWMQYASL...IPASVGGFNYMAMSRCFVRNIGDPSVAALAD            (SEQ ID NO.9)BPIV3     923    NIHWMQYASL...IPASVGGFNYMAMSRCFVRNIGDPTVAALAD            (SEQ ID NO.10)仙台病毒  923    GKNWLRCAVL...IPANVGGFNYMSTSRCFVRNIGDPAVAALAD            (SEQ ID NO.11)HPIV2     927    HPRLISRIVL...LPSQLGGLNYLACSRLFNRNIGDPLGTAVAD            (SEQ ID NO.12)麻疹病毒  923    NNDLLIRMAL...LPAPIGGMNYLNMSRLFVRNIGDPVTSSIAD            (SEQ ID NO.13)RSV       968    LDNIDTALTLYMNLPMLFGGGDPNLLYRSFYRRTPDFLTEAIVH            (SEQ ID NO.14)HPIV3 cp45 L ORF L992FHPIV3    973  LDRSVLYRIMNQEPGESSFLDWASDPYSCNLPQSQNITTMIKNITA   (SEQ ID NO.15)BPIV3    973  LDRGVLYRIMNQEPGESSFLDWASDPYSCNLPQSQNITTMIKNITA   (SEQ ID NO.16)仙台病毒 973  LDKQVLYRVMNQEPGDSSFLDWASDPYSCNLPHSQSITTIIKNITA   (SEQ ID NO.17)HPIV2    977  LESWILYNLLARKPGKGSWATLAADPYSLNQEYLYPPTTILKRHTQ   (SEQ ID NO.18)麻疹病毒 973  MPEETLHQVMTQQPGDSSFLDWASDPYSANLVCVQSITRLLKNITA   (SEQ ID NO.19)RSV      1036 LNKFLTCIITFDKNPNAEFVTLMRDPQALGSERQAKITSEINRLAV   (SEQ ID NO.20)HPIV3 cp45 L ORF T1558I

                                   *    HPIV3    1537 HPKVFKRFWDCGVLNPIYGPNTASQDQIKLALSICEYSLDLFMREWL  (SEQ ID NO.21)BPIV3    1537 HPKVFKRFWDCGVLNPIYGPNTASQDQVKLALSICEYSLDLFMREWL  (SEQ ID NO.22)仙台病毒 1537 HPKIFKRFWNAGVVEPVYGPNLSNQDKILLALSVCEYSVDLFMHDWQ  (SEQ ID NO.23)HPIV2    1543 HPKLLRRAMNLDIITPIHAPYLASLDYVKLSIDAIQWGVKQVLADLS  (SEQ ID NO.24)麻疹病毒 1535 HPKIYKKFWHCGIIEPIHGPSLDAQNLHTTVCNMVYTCYMTYLDLLL  (SEQ ID NO.25)RSV      1584 EQKVIKYILSQDASLHRVEGCHSFKLWFLKRLNVAEFTVCPWVVNID  (SEQ ID NO.26)*表示在HPIV3 cp45中突变了的氨基酸。下划线表示在不同病毒中共有的氨基酸残基。1全长蛋白中所示序列的首个氨基酸的位置。

    回顾如表2所示的对比，显然所分析的每一种L及F突变改变了一基本保守性的亲本序列元件，其以在所示病毒分类群的相应位点同一性或保守性的氨基酸残基的存在为标记。例如，cp45 L蛋白突变株将亲本残基中的Tyr942改变为His，其具有很高的保守性，例如仙台病毒、HPIV2、HPIV3、BPIV3及MeV L蛋白(表2)中在相应野生型位置上的相同的酪氨酸残基的保留。同样地，cp45 L突变中Leu992为Phe所替换，其被定位至在仙台病毒、HPIV2、HPIV3、BPIV3及MeV L蛋白之间保持同一性的亲本残基或位点。在cp45 F蛋白中两个所鉴别的突变，将Ile420变为Val及将Ala450变为Thr，同样展现出在HPIV3及BPIV3之间的同样保守性残基/位点，而在HPIV1中进一步保持同样保守性的是Ile420变为Val的突变亲本残基。此外的相应于HPIV3 JS cp45中鉴别的减毒突变的相应位点的保守性序列元件如表2所示。

    进行其它的异源序列对比以评价在突变株RSV cp530中鉴别的典型的RSV减毒突变的保守性。该突变株特征在于在cp530 L聚合酶的521位点苯丙氨酸至亮氨酸的替换，其中突变发生在该蛋白较大保守性结构域中。正如表3所示，在Phe521处的突变同样显示出保守性，正如同在13个主题分类群中的每一个的相应的野生型位点的同样保守性丙氨酸残基的保留(表3；图1，A组)。表3：在不同副粘病毒种中的PIV3 PHE-456(*)附近的L聚合酶序列的对比病毒      序列中的                                                              保守性苯   基因库

          首个氨基                                                              丙氨酸的   登记号

          酸的位置                                                              位置PIV3       431    NAYGSNSAISYENAVDYYQSFIGIKFNKFIEPQLDEDLTIY   (SEQ ID NO.27)    456        Z11575RSV        496    YYKLNTYPSLLELTERDLIVLSGLRFYREFRLPKKVDLEMI   (SEQ ID NO.28)    521        P28887麻疹病毒   423    NAQASGEGLTHEQCVDNWKSFAGVKFGCFMPLSLDSDLTMY   (SEQ ID NO.29)    448        P35975仙台病毒   431    NAQGSNTAISYECAVDNYTSFIGFKFRKFIEPQLDEDLTIY   (SEQ ID NO.30)    456        Q06996PIV2       434    EFQHDNAEISYEYTLKHWKEISLIEFRKCFDFDPGEELSIF   (SEQ ID NO.31)    459        P26676CDV        423    NAHASGEGITYSQCIENWKSFAGIRFKCFMPLSLDSDLTMY   (SEQ ID NO.32)    448        P24658SV41       435    ELHHDNSEISYEYTLRHWKELSLIEFKKCFDFDPGEELSIF   (SEQ ID NO.33)    460        P35341PDV        423    NACVSGEGITYSQCVENWKSFAGIKFRCFMPLSLDSDLTMY   (SEQ ID NO.34)    448        Y09630Hendra病毒 430    RLKNSGESLTVDDCVKNWESFCGIQFDCFMELKLDSDLSMY   (SEQ ID NO.35)    455        AF017149SV5        433    ELMNDNTEISYEFTLKHWKEVSLIKFKKCFDADAGEELSIF   (SEQ ID NO.36)    458        Q88434牛瘟病毒   423    NAQASGEGLTYEQCVDNWKSFAGIRFGCFMPLSLDSDLTMY   (SEQ ID NO.37)    448        P41357APV        431    YMNAKTYPSNLELCVEDFLELAGISFCQEFYVPSQTSLEMV   (SEQ ID NO.38)    456        U65312NDV        427    QLHADSAEISHDIMLREYKSLSALEFEPCIEYDPVTNLSMF   (SEQ ID NO.39)    452        X05399粗体氨基酸在所分析的所有病毒种中均为保守性的

    还进行其它的异源序列对比以评价在已知减毒突变的相应位点鉴别保守性结构元件的能力。在该实施例中，在仙台病毒的C蛋白的170位点所鉴别的减毒突变与异源病毒HPIV-1、HPIV-3及BPIV-3(参见，表4；在相应序列的第一残基位点标有数字)C蛋白的相应序列进行图谱对比。另外，这些突变通过在不同分类群中同一性的亲本残基或序列位点上氨基酸的改变而表征。表4

                                164HPIV3  144  MKLERWIRTLLRGKCDNLQMFQARYQEVMTYLQQNKVETVIMEEAWNLSVHLIQDQ*    (SEQ ID NO.40)BPIV3  144  MKLERWIRTLLRGKCDNLKMFQSRYQEVMPFLQQNKMETVMMEEAWNLSVHLIQDIPA*  (SEQ ID NO.41)SeV    150  MKTERWLRTLIRGEKTKLKDFQKRYEEVHPYLMKEKVEQIIMEEAWSLAAHIVQE*     (SEQ ID NO.42)HPIV-1 150  MKTERWLRTLIRGKKTKLRDFQKRYEEVHPYLMMERVEQIIMEEAWKLAAHIVQE*     (SEQ ID NO.43)

                                170

    所有这些发现证明了减毒突变株相应位点序列的令人吃惊的保守性。以此为基础，本发明的合理的设计方案被开发，以输入在一个异源病毒株中所鉴别的减毒序列变化至一个不同的重组病毒中去，例如，通过重组基因组或反基因组的同一性或保守性改变，以产生一个减毒重组克隆。这些方案的实践操作的发展可由下面的实施例进一步直接证明。实施例II减毒突变从RSV cpts530 L至重组的HPIV3候选疫苗的异源转移

    具有在单负链病毒的异源分类群之间相应于保守性结构元件的位点上的如此鉴别的减毒突变，减毒突变穿越系统发生界限的异源转移的概念可以使用重要的疾病病毒RSV作为模型来测试。在本说明书中，本实施例证明了在RSV(在副粘病毒科中的肺病毒属中的一个病毒)中鉴别的减毒(att)突变，可被转移进入PIV3，其为不甚相关的呼吸道病毒属中的一个成员。这些病毒在副粘病毒科中代表两种不同的亚科。其分别为肺病毒亚科和副粘病毒亚科。

    更为明确的是，在第一个异源病毒(RSV cpts530)中的一个减毒突变，其在一个突变的确定位点(RSV L蛋白的Phe521)改变了亲本RSV的序列以表征减毒表型，其已定位至一个在所选择的目标病毒HPIV3(表3)的L蛋白的相应位点(F456L)的同一性保守残基。如此保守的野生型HPIV3序列元件因此被测试作为减毒突变在RSV及HPIV3之间进行异源转移的潜在目标。

    为了完成这一转移，携有突变的保守性序列元件的一部分或全部最好被复制且输入重组病毒以产生一新型减毒衍生体。虽然将突变同一性复制进入一株重组病毒是优选的，但并不要求达到这种保真度。另一方面，如此鉴别的亲本或野生型残基作为一目标可以在含有一个或多个与突变残基无关的残基的突变位点上缺失或通过氨基酸插入被替换。更适宜的是，在主题突变被标记有一个或多个氨基酸替换时，在重组病毒亲本克隆中相应于突变位点的位点上的残基被一个或多个与在突变序列中鉴别的替换性残基保守性相关的残基所替换。更为适宜的是，在重组病毒亲本克隆中相应于突变位点的位点上的残基被一个或多个存在于突变序列中的同一性残基所替换。

    这样，在该实施例中，cpts530的L聚合酶的521氨基酸位点发生的苯丙氨酸至亮氨酸的突变被描述为代表ts及减毒(att)表型。几种不是很相关副粘病毒(表3)L蛋白的该区域序列对比揭示了这种苯丙氨酸是大范围保守的。使用反求遗传学，在野生型PIV3的L蛋白中的456位点同功的苯丙氨酸被诱变至亮氨酸(F456L)。所得的病毒，命名为r456L，为ts(噬斑形成的截止温度为40℃)，且其在仓鼠上呼吸道并非是在下呼吸道中的复制与重组野生型(rwt)PIV3相比较减少了10倍。该结果显示被转移的苯丙氨酸至亮氨酸突变在两个不是很相关的副粘病毒中显示出温度敏感及减毒的相似的水平。

    同样在本实施例中，已经证实F456L突变已引入到两个rPIV3候选疫苗病毒株中，一个具有在L蛋白(rcp45L)中的三个cp45 ts错义突变，另一个携有在体内进一步减毒病毒中的所有15种cp45突变(rcp45)。更明确地说，F456L突变被引入到两个最近发展的重组PIV3候选疫苗中去，一个为rcp45，生物学上获得的PIV3候选疫苗cp45的重组形式，另一个为rcp45L，其中仅存的cp45突变为在L蛋白中的三个氨基酸替换(已公开的国际申请98/53078；Skiadopoulos等，J.Viro1.72(3)：1762-8(1998)；Skiadopoulos等，J.Viro1.73(2)：1374-1381，(1999)，所述文献均引入本文作为参考)。F456L突变增加到rcp45或rcp45L中提高了其体内减毒及对温度的敏感性水平。rcp45-456是免疫原性及表型稳定的。rcp45L-456及rcp45-456病毒在仓鼠中的复制限制性是其rcp45L及rcp45亲本株的100-1000倍。使用rcp45-456进行免疫诱导产生一中度水平的对PIV3攻击病毒复制的抗性。在黑猩猩中，rcp45-456在呼吸道中比起rcp45来说其限制性增加了5倍，并诱导出一个相配的、中度至高水平的PIV3特异性血清抗体。从黑猩猩中分离出来的rcp45及rcp45-456病毒在两周的复制期限内保持其各自输入病毒的温度敏感性水平，从而证明了其表型的稳定性。

    因此，相应于RSVF521L突变株，F456L突变转移进入cp45重组病毒中，其结果在于一个重组病毒减毒的大幅度增加，证明了该转移的突变对于很好地调整PIV候选疫苗的减毒的有用性。转移在本实施例中代表不同的亚科的异源副粘病毒株中鉴别的突变的能力，极大地增强了开发新型副粘病毒的可能性。病毒及细胞

    rPIV3 JS wt(这儿指的是rwt)、rcp45L及rcp45病毒在本实施例中被用作对照，这些病毒述于先前的国际申请98/53078；Durbin等，Virology 235：323-332(1997)；Skiadopoulos等，J.Virol.72(3)：1762-8(1998)；Skiadopoulos等，J.Virol.73(2)：1374-1381(1999)，所述文献均引入本文作为参考)。rPIV3培养于猿猴LLC-MK2细胞(ATCCCCL 7.1)，其先前已被描述(参见Durbin等，Virology 235：323-332，1997；Hall等，Virus Res.22(3)：173-184，1992；Skiadopoulos等，J.Virol.72(3)：1762-8(1998)，所述文献引入本文作为参考)。经修饰的疫苗病毒Ankara(MVA-T7)(Wyatt等，Virology 210(1)：202-205(1995))，其表达T7聚合酶，其为Linda Wyatt及Bernard Moss提供。HEp-2(ATCCCCL 23)及LLC-MK2细胞被保存在补充有2％FBS及硫酸庆大霉素(50μg/mL)的OptiMEMI(Life Technologies，Gaithersburg，MD)中，或保存在补充有10％FBS、硫酸庆大霉素(50μg/ml)及4mM谷氨酰胺的EMEM中。在rwt中点突变的构建

    先前被用于回收感染性病毒的PIV3 JS wt的反基因组cDNA克隆p3/7(131)2G+的一个亚基因组片段(Durbin等，Virology 235：323-332，1997；Skiadopoulos等，J.Virol.72(3)：1762-8，1998；Skiadopoulos等J.Virol.73(2)：1374-1381，1999)，含有PIV3 7437至11312位核苷酸(Xho I-Sph I)，通过标准分子生物学技术被克隆进一个pUC19载体中，该载体已被修饰以接受该基因片段。cDNA利用TransformerMutagenesis试剂盒(Clontech，CA)如前所述引入两个点突变而进行了修饰(Skiadopoulos等，J.Virol.72(3)：1762-8，1998；Skiadopoulos等，J.Virol.73(2)：1374-1381，1999)。这两个改变在位置10011(T至C)及10013(C至G)上，其按照rPIV3反基因组RNA的完整的正义序列进行编号。这样就引进了F456L密码子的改变和一个重叠的、沉默的XmnI位点作为一个标记(如图1)。经过诱变，限制性内切酶片段被完整测序且直接克隆进入全长克隆p3/7(131)2G+，或进入携有cp45突变的衍生体中，其中使用了标准的分子克隆技术。携有F456L突变的重组PIV3的回收

    携有F456L突变的全长反基因组的cDNA衍生体和三个载体质粒pTM(N)、pTM(P no C)及pTM(L)(Durbin等，Virology235：323-332，1997)在6孔平板中使用LipofectACE(Life Technologies，MD)被转染进入HEp-2单层中去(Costar，MA)，所述单层为MVA-T7所感染，如前所述(Durbin等，Virology 235：323-332(1997)；Skiadopoulos等，J.Virol.72(3)：1762-8(1998)。质粒pTM(P noC)是前已描述的pTM(P)的一种形式(Durbin等Virology 235：323-332(1997))，其中C ORF已被修饰，这样其翻译起始密码子从AUG变至ACG(甲硫氨酸变为苏氨酸)。经过在32℃温育4天，转染产物被输入进T-25烧瓶中的LLC-MK2细胞，其在32℃下温育4-8天。澄清的培养上清液如前所述进行LLC-MK2细胞的三轮噬斑纯化(Durbin等，Virology 235：323-332(1997)；Hall等，Virus Res.22(3)：173-184(1992)；Skiadopoulos等J.Virol.72(3)：1762-8(1998))。每一种生物学克隆的重组病毒在LLC-MK2细胞中在32℃下被扩增两次，所产生的病毒作进一步特征分析。通过聚乙二醇沉淀法从澄清培养基中浓缩病毒(Mbiguino和Menezes，J.Virol.Methods 31：161-170(1991))，使用TRIzol试剂(Life Technologies)提取病毒RNA(vRNA)。使用Superscript II预扩增系统(生命技术公司)及任意六联体引物反转录vRNA。Advantage cDNA PCR试剂盒(Clontech，CA)及针对PIV3基因组不同部分的正义及反义引物被用于扩增片段用于限制性酶切和/或序列分析。PCR片段通过测序或限制性酶切进行分析，其中所使用限制性酶的酶切识别位点在突变构建过程中已被产生或切除。在允许的及限制的温度下携有F456L突变的rPIV3的噬斑形成效率(EOP)

    在32℃及一个温度范围35℃至41℃在LLC-MK2细胞单层培养物中(温育约六天)，正如前所述那样，对照组及重组病毒体外噬斑形成的温度敏感性水平被确定(Hall等，Virus Res.22(3)：173-184，1992)。除去甲基纤维素覆层以后使用豚鼠红细胞吸附进行噬斑计数，或者可以替换的是存在于单层中的病毒噬斑通过使用稀释1∶250倍的免疫过氧化酶染色的两个PIV3特异性抗HN鼠单抗101/1及454/11进行鉴别。(Murphy等，Vaccine 8(5)：497-502(1990)；Murphy等，(1990)；van Wyke Coelingh、Winter及Murphy，Virology 143(2)：569-582，(1985)，所述文献均引入本文作为参考)。评价仓鼠中rPIV3突变病毒的att表型

    4周龄的Golden Syrian仓鼠(Charles River Laboratories，NY)(其对于PIV3来说是血清反应阴性的)被接种于鼻腔内，使用含有106.0TCID50的rwt或突变rPIV3之一的0.1ml L15介质。在感染后第四天，杀死仓鼠，收集其肺及鼻甲，病毒如前所述进行测定(Durbin等，Virology 235：323-332，1997；Skiadopoulos等，J.Virol.72(3)：1762-8，1998)。对每一组仓鼠计算32℃下的平均的log10TCID50/克。仓鼠中rcp45-456的免疫原性及效率

    三组各五个仓鼠经鼻腔被接种以0.1ml的(i)L15介质(安慰剂)、(ii)106.0 TCID50的rcp45或(iii)106.0 TCID50的rcp45-456。在感染前和感染后第42天对仓鼠取血，血清对抗PIV3的血凝抑制(HAI)抗体滴度如前所述被确定(van Wyke Coelingh、Winter及Murphy，1985)。在第44天，通过鼻内给予106.0 TCID50 rwt而攻击仓鼠，四天后收集其肺及鼻甲，这些组织匀浆中的rwt滴度如上所述被确定。评价黑猩猩中的rPIV3突变病毒的att表型

    对于RSV及PIV3来说是血清反应阴性的年轻的雌雄黑猩猩，体重6.6-10.0kg，被成对放置于大的玻璃隔离器皿中并如前所述进行饲养(Crowe等，1994a；Hall等，J.Infect.Dis.167：958-962(1993))。使用一毫升含有106.0 TCID50的rcp45或rcp45-456接种体通过鼻内(IN)和气管内(T)在各位点感染黑猩猩组。接种病毒以后，鼻咽擦拭及气管灌洗样品被收集，如前所述用于病毒定量(Hall等，1993；Kairon等，1997)。从第1-10和13天收集鼻咽擦拭样品，在第2、4、6、8及第10天收集气管灌洗样品。每日估计鼻液溢的程度，并分配0-4值(0＝没有鼻漏；1＝痕量；2＝微量；3＝中度；4＝严重)。rcp45及rcp45-456病毒按照相同的程序以两个不同的试验进行评价。在实验1中，两个黑猩猩使用rcp45进行接种且4个使用rcp45-456进行接种，在实验2中，每一病毒同时给予两个动物。进行第二组试验是为了验证在第一组实验中所观测到的两个病毒生长的区别。这两组数据按照病毒生长及免疫原性是不能辨别，它们合在一起进行平均。来自四组通过IN及IT途径接受104 TCID50的PIV3 wt JS株的动物的数据如前所述(Hall等，1993)，列出这些数据是为了进行比较。rPIV在黑猩猩中的复制特征

    在鼻咽擦拭及气管灌洗物中的病毒数量在LLC-MK2单层中在32℃下进行确定且被表示为log10 TCID50/ml，正如前所述(Crowe等，1994a；Hall等，1993)。黑猩猩鼻咽及气管灌洗样品中的病毒在LLC-MK2单层中在24孔平板中在32℃下进行培养直到广泛的致细胞病变效应被检测到。这些rPIV3分离物温度敏感性的水平通过如上所述确定LLC-MK2单层上噬斑形成效率而被评价。所有使用黑猩猩样本或分离物进行的研究包括一个含有氯林可霉素(100μg/ml)、环丙氟哌酸(100μg/ml)、庆大霉素(100μg/ml)及两性霉素B(2.5μg/ml)的抗生素混合物。结果F456L突变株进入一个rwt中给其带来ts表型

    如上所述，对于在鼠呼吸道中复制，RSV cpts530为ts和减毒的(Crowe等，1994b)。在RSV cpts530的L蛋白521位点的苯丙氨酸上的替换带来了温度敏感性(39℃为噬斑形成的截止温度)及减毒(在鼠上呼吸道中复制减少10倍)(Crowe等，1994b；Juhasz等，1997)。13种不同副粘病毒包括RSV及PIV3的L蛋白的序列对比揭示了在RSV L的521位点苯丙氨酸是高度保守性的(表3；图1，A组)。以HPIV3为例，在PIV3 L聚合酶中相应的氨基酸发生在456位点。在RSV(521)对PIV3(456)中该残基的位点的不同与先前所观察到的结果是一致的，所述结果即为RSV L蛋白与其它属的副粘病毒相比较大约有70个氨基酸的氨基末端延伸(Stec等，Virology 183：273-287(1991))。为了确定PIV3中L蛋白的456位点的突变是否可以提供类似于异源RSV cpts530突变株的ts及att表型，rwt 456位点的苯丙氨酸直接被诱变为亮氨酸(F456L)。该编码改变被设计为涉及到两个核苷酸的替换，这是为了减少其转变为wt的可能性。同样，通过引入一沉默的Xmn I限制性核酸内切酶识别位点(图1，C组)，该突变被标记。该突变被引入至全长的感染性rwt cDNA质粒中，且重组病毒如前所述被回收(Durbin等，Virology 235：323-332(1997)，Skiadopoulos等，J.Virol.72(3)：1762-8(1998)及Skiadopoulos等，J.Virol.73(2)：1374-138l(1999))。基于纯化的vRNA的RT-PCR且经过限制性酶切分析及测序，回收的r456L突变株(图1，B组)被证实具有Xmn I标记和F456L突变。F456L突变引入到rwt中给予一个40℃的截止温度(表5)，高于RSV cpts530 1℃，证明了一个发生在肺病毒中的ts突变可以被转移进入一个不是很相关的呼吸道病毒中去，给予其相似的、尽管不是相同的ts表型。表5：对照组病毒及携有F456L突变的病毒在LLC-MK2细胞中在许可及非许可温度下的温度敏感性

                    在指定温度下平均的log10pfu/ml减小值a病毒    在32℃下  35℃   36℃   37℃   38℃    39℃     40℃     41℃

        平均滴度Rwt          7.5  -0.2    0.0    0.0    -0.1    0.1      0.3      0.8r456L      7.3     -      -     0.3     0.2    0.6      2.5    ≥5.5rcp45L     7.3     -      -     0.5     1.9    4.3    ≥6.0       -rcp45L-456 6.5    2.5  ≥4.5  ≥5.2   ≥5.2  ≥5.2    ≥5.2       -rcp45       7.8    0.6    1.0    1.4     2.4  ≥5.6    ≥6.8       -rcp45-456   7.7    0.2    1.0    2.2   ≥4.9  ≥7.3    ≥6.9       -

    a接种后6天在设定的温度通过免疫过氧化物酶染色对噬斑进行计数，所列数据是三组或更多实验的平均值，粗体标出的值表明其最低的限制温度，在此条件下噬斑形成效率减少100倍，该温度被确定为噬斑形成的“截止温度”。通过从许可温度(32℃)下的滴度值中减去指定温度下的滴度值而得出滴度的减少量。在重组rcp45基减毒病毒中引入F456L突变提高了其温度敏感性

    cp45具有在L蛋白中的三个具体的氨基酸替换，其先前被显示为其ts及att表型的主要确定因素(Skiadopoulos等，J.Virol.72(3)：1762-8(1998)。cp45同样含有L蛋白外其他的12种突变，其包括ts及att突变(Skiadopoulos等，J.Virol.73(2)：1374-1381(1999)。F456L突变被引入至rcp45且同样进入一个仅仅携有三个rcp45 L基因突变的病毒株中去(rcp45L)。这样做是为了确定为F456L突变所表征的温度敏感性是否可附加为其他三种cp45 L突变所表征或为15个cp45的全部突变所表征的温度敏感性。显著的是，rcp45L-456证明了温度敏感性的极大提高(表5)，其具有一个35℃的截止温度，而rcp45L为39℃。rcp45-456突变株具有一个中间的截止温度37℃，其与rcp45的38℃相比较。尽管由F456L突变所表征的温度敏感性附加于由rcp45L及rcp45的突变所表征的ts，这两种病毒的效果范围却是完全不同。这样，含有较大量突变的rcp45-456具有比rcp45L-456较低的温度敏感性。cp45 ts突变中复杂的相互作用的证据已经由其他的含有cp45突变的不同组合的rPIV3病毒中观察到，尽管产生这些效果的基础并不完全理解(Skiadopoulos等，J.Virol.72(3)：1762-8(1998)及Skiadopoulos等，J.Virol.73(2)：1374-1381(1999)。仓鼠中突变的rPIV3的免疫原性及复制

    使用106.0 TCID50的rwt或使用另一较厉害的突变rPIV3之一，包括携有单独或与其他cp45特异性突变(表6)结合的F456L突变的病毒，通过IN接种仓鼠。4天后，收集肺及鼻甲，确定每一病毒的复制水平。单独的F456L突变对于r456L的复制有一个适度的效果，结果在于复制在鼻甲中10倍的降低且在肺中无明显的复制限制。减毒的水平近似于鼠上呼吸道中的RSV cpts530突变株(Crowe等，Vaccine12(8)，691-699(1994a))。惊人的是，F456L突变加入到任一rcp45L或rcp45结果产生上呼吸道中复制显著受限制的重组株。其显示F456L突变可以很大地增强这些突变病毒的减毒，从则影响在仓鼠中的上呼吸道中的复制。表6：含有F456L突变的rwt及rcp45衍生体在仓鼠呼吸道中的复制a

               平均病毒滴度(指定组织中的log10TCID50/g±S.E.b)   病毒  仓鼠数量    鼻甲         肺rwt         10      6.9±0.1     6.3±0.4r456L     10      6.0±0.1     5.7±0.5rcp45L    10      3.8±0.2     1.9±0.2rcp45L-456 5      ≤1.5±0     ≤1.5±0rcp45      10      4.9±0.2     2.1±0.2rcp45-456   5      ≤1.5±0     1.6±0.1

    a以0.1mL接种物经鼻内给予仓鼠106.0TCID50的病毒。4天后收集肺及鼻甲并在32℃下测定病毒滴度。两组实验的平均值。

    bS.E.：标准误差

    为了确定是否rcp45-456转移突变株引发一免疫反应，血清反应阴性的仓鼠经IN被给予106.0 TCID50的rcp45-456、rcp45或L15培养基，42天后，收集血清样品，然后在第44天使用rwt攻击动物。使用rcp45-456或rcp45所作的免疫分别引发中度到高滴度的HAI抗体，且诱导对rwt攻击病毒复制的抗性(表7)。由rcp45-456感染所诱发的抗体的水平及抗性低于由rcp45所诱发的。低水平的免疫反应及由rcp45-456所诱发的保护反映出仓鼠呼吸道中病毒复制水平的显著降低。表7：用rcp45及rcp45-456感染仓鼠诱发出其对rwt攻击的抵抗性a

                   平均攻击rwt滴度b(log10TCID50/g±S.E.)：病毒         鼻甲           肺    HAI滴度clog2±S.E)L15对照组  5.6±0.1      4.8±0.2     ＜2.0±0Rcp45      ＜1.5±0      ＜1.5±0     10.4±0.2rcp45-456  3.1±0.6      2.1±0.6     4.8±0.9a5个仓鼠的组经鼻内给药106.0TCID50的病毒，每个动物0.1mL接种体。接种后44天，使用106.0TCID50的rwt攻击动物。4天后收集肺及鼻甲。b每一组织样品中的病毒数量在LLC-MK2细胞中在32℃下确定。c第42天即攻击后2天的血清抗PIV3的血凝抑制抗体滴度。S.E：标准误差。HAI倒数平均值log2滴度在感染前的血清中＜2。rcp45-456突变株在黑猩猩中比rcp45更为减毒

    因为rcp45-456突变株在仓鼠中表现出过度减毒，我们试图确定其在黑猩猩中的复制及免疫原性水平，黑猩猩是非人灵长类，其与人类亲源性较近。两组独立的验证性实验中，黑猩猩分别经过IN或IT使用106.0TCID50/位点的rcp45-456或者rcp45进行接种，感染后10及13天期限内分别收集气管灌洗及鼻咽擦拭样品，且每一样品中的病毒滴度被确定。rcp45-456及rcp45与PIV3 wt(表8)相比较在上下呼吸道中的复制都是严格限制的，其表明每一突变病毒株在黑猩猩中的复制都是被减毒的。正如上所述(表6)，F456L突变增加到cp45中去的效果就是在仓鼠的上呼吸道中减少病毒复制超过2500倍。相反，当在黑猩猩中进行评估时，在上下呼吸道中病毒复制降低仅5倍(表8及图2)。上述两组实验的区别已经被观察到。其中之一试验，两个动物接受rcp45且四个接受rcp45-456，在另一组实验中每一病毒都给予两个动物。表8：对于在黑猩猩上下呼吸道中复制，rcp45-456比起rcp45表现出更为减毒

                                          病毒复制

                                鼻咽擦拭液            气管灌洗液用于感染动  动物    剂量a    带病   滴度b    带病   滴度b     平均流出   平均峰值鼻物的病毒    数目   (log10    毒的            毒的               天数     液溢程度

                TCID50/ml)   数目            数目rcp45-456    6       6.0       6   3.4±0.1c   3    1.2±0 4   0.7±0.3    0.2±0.1drcp45        4       6.0       4   4.1±0.3c   3    1.9±0.5   1.8±0.6    1.0±0.3dPIV3e       4       6.0       4    6.3±0.5    4    5.2±0.8   3.8±0.5    3.3±0.5

    a在各位点上将指定量的病毒在1ml接种物中给药到鼻及气管中。

    b平均峰值病毒滴度(log10TCID50/ml)。病毒滴度在LLC-MK2细胞中在32℃下通过TCID50确定。

    c指定值之间在统计学上具有显著性差异；p＜0.025(斯氏t检验)。

    d指定值之间在统计学上具有显著性差异；p＜0.01(斯氏t检验)。

    ePIV3野生型JS株(来自Hall等的数据，1992)。

    在上呼吸道中每日流出病毒的对比显示出rcp45-456病毒相对于rcp45来说达到一较低的峰值病毒滴度，但是其减少的速度却是很缓慢的(图2)。该种模式先前已被显示其为RSV突变株在非人灵长类中减毒水平增加的特征(Prince等，Infect.Immun.26(3)：1009-13，1979)。该种减毒水平的增加同样反映在平均峰值鼻溢液程度的显著降低(表8)。因此，F456L突变引入rcp45的结果在于黑猩猩呼吸道中病毒减毒的显著增加。在黑猩猩中复制后rcp45及rcp45-456的ts表型的保持

    使用rcp45及rcp45-456分别感染黑猩猩，从其中获得的分离物的温度敏感性的水平被测定，用来确定两个重组体在高允许性宿主中复制后是否保持他们的ts表型。鉴于获得了大量分离物，从两个研究组中分离物被分别评价。对实验1的两个动物的分离物进行分析，结果如表9所示，所有动物的情况显示于表10。同一对照组病毒悬浮物温度敏感性的水平在两组实验中为1℃的区别(表10)，显示出在分析中存在实验性的变化。例如，在实验1中对于rcp45-456及rcp45来说并未观察到噬斑的温度分别为38℃及39℃，而实验2为39℃及40℃(表10)。有时候观察到实验性变化的水平。最重要的是，在所有试验中噬斑形成截止温度的区别在rcp45-456与rcp45之间的差别保持为1℃。因为这两组试验存在实验性变化，它们在表10中被分别描述。每一分离物保持ts表型，分离物的温度敏感性水平在黑猩猩呼吸道中病毒的整个复制过程中与对照组输入病毒并无明显区别。值得注意的是，rcp45-456的分离物噬斑形成的百分率在38℃及39℃低于rcp45分离物，其显示在体外所观察到的rcp45-456的较高水平的温度敏感性在体内复制后中仍然保持。表9：在血清反应阴性黑猩猩中复制后rcp45及rcp45-456均保持其ts表型：来自实验1的两个动物的样品分析及来自两个实验的对照组的比较病毒分离物或对照         分离物c          在设定温度下的病毒滴度d(log10pfu/ml)

                   组织          天数   32℃   36℃    37℃     38℃     39℃      40℃rcp45-456病毒       NP            1      7.1   ＜3.7   ＜2.7    ＜0.7    ＜0.7    ＜0.7(动物＃1614)        NP            2      7.3   ＜3.7   ＜2.7    ＜0.7    ＜0.7    ＜0.7

                    NP            3      7.7   ＜3.7   ＜2.7    ＜0.7    ＜0.7    ＜0.7

                    NP            4      8.0     4.4     4.2    ＜0.7    ＜0.7    ＜0.7

                    NP            5      7.8     4.3     4.2    ＜0.7    ＜0.7    ＜0.7

                    NP            6      7.3     4.2     4.0    ＜0.7    ＜0.7    ＜0.7

                    NP            7      6.9     3.7     3.0    ＜0.7    ＜0.7    ＜0.7

                    NP            8      7.7   ＜3.7     3.0    ＜0.7    ＜0.7    ＜0.7

                    NP            9      7.5     5.3     4.8    ＜0.7    ＜0.7    ＜0.7

                    NP           10      7.8     5.4     4.2    ＜0.7    ＜0.7    ＜0.7

                    TL            2      7.8     4.7     2.7    ＜0.7    ＜0.7    ＜0.7

                    TL            4      7.4     4.0   ＜2.7    ＜0.7    ＜0.7    ＜0.7rcp45               NP            1      7.0     ND      4.7      4.2    ＜0.7    ＜0.7(动物#1616)         NP            2      7.5     ND      4.4      3.7    ＜0.7    ＜0.7

                    NP            3      7.3     ND      3.7    ＜0.7    ＜0.7    ＜0.7

                    NP            4      7.4     ND      4.5    ＜0.7    ＜0.7    ＜0.7

                    NP            5      6.3     ND      4.0    ＜0.7    ＜0.7    ＜0.7

                    NP            6      7.2     ND      4.9      3.4    ＜0.7    ＜0.7

                    NP            7      5.8     ND    ＜3.7    ＜0.7    ＜0.7    ＜0.7

                    NP            8      5.9     ND      4.5      2.2    ＜0.7    ＜0.7

                    NP           13      6.9     ND      4.3      3.4    ＜0.7    ＜0.7

                    TL            2      7.5     5.3     4.3      3.3    ＜0.7    ＜0.7

                    TL            4      7.2     5.7     4.5    ＜0.7    ＜0.7    ＜0.7rcp45-456a                              8.4     6.0     4.6    ＜0.7    ＜0.7    ＜0.7rcp45a                                  8.0     7.0     5.8      3.4    ＜0.7    ＜0.7rwtaa                                   7.2     7.2     7.3      7.0      6.9      7.0rcp45-456b                              8.3     7.0     5.0      3.0    ＜0.7    ＜0.7rcp45b                                  7.8     7.5     6.3      4.8      2.3    ＜0.7rwtb                                    7.8     7.6     7.4      7.5      7.4      7.2a对照组病毒悬浮液，研究#1。b对照组病毒悬浮液，研究#2(参见表10)。c黑猩猩鼻咽擦拭和气管灌洗样品在LLC-MK2细胞中在30℃下传代之后，收集病毒分离物。d在LLC-MK2单层培养物中在指定的温度下测定病毒分离物6天，通过使用抗HPIV3 HN单抗进行免疫过氧化物酶染色来进行噬斑计数。ND＝未检测到。表10：在血清反应阴性黑猩猩中复制后rcp45及rcp45-456均保持其温度敏感性表型：两组实验的概括   用于感染                   具有在设定温度下检测到的病毒噬斑的分离物的百分数  动物的病毒    分离物    36℃    37℃    38℃    39℃    40℃  (动物数量)    总数量  实验1

    rcp45(2)      20a     100      95     70       0        0

    rcp45-456(4)  42b      83      60      0       0        0  实验2

    rcp45(2)      25c     100     100    100      72        0

    rcp45-456(2)  22d     100      86     91       5        0正如材料及方法中所描述而获得的分离物，噬斑形成的截止温度通过在设定温度下的噬斑形成效率而确定(参见材料与方法及表9)。a 总数量包括18个鼻咽分离物和2个气管灌洗分离物b 总数量包括39个鼻咽分离物和3个气管灌洗分离物c 总数量包括20个鼻咽分离物和5个气管灌洗分离物d 总数量包括21个鼻咽分离物和1个气管灌洗分离物

    前述的结果证明了RSV cpts530中的突变，即在L蛋白的521位点的亲本苯丙氨酸的替换，当其导入到PIV3的L蛋白的相应位点(456)中时其给予了相似水平的温度敏感性及减毒。RSV及PIV3在副粘病毒科中代表不同的亚科，其分别被命名为肺病毒亚科及副粘病毒亚科。这两组病毒的L蛋白具有明确的、统计学上十分重要的序列相关性(Stec等，Virology 183：273-287(1991))，尤其是在临近氨基末端的540-570个氨基酸的区域(RSV的422-938位氨基酸及PIV3的357-896位氨基酸)，其包括四个高度保守性的的聚合酶基元(参见Poch等，J.Gen.Virol.5：1153-62(1990)；及Stec等，Virology183：273-287(1991))。本文所描述的在RSV的521位及PIV3的456位上的突变，处在这一区域，却在Poch等所述的第一个保守性基元上游约175个残基处。更为特别的是，该残基是严格保守的，且在本研究中测试的13个异源副粘病毒中均有一个亮氨酸残基位于该位置的羧基端12位置处(表1，A组)。尽管其严格保守性，如果在RSVcpts530突变株中以前并未鉴别出521的L突变且该突变并未成功转移到HPIV3 L蛋白的保守性位置上，则不可能从PIV3 L蛋白的氨基酸序列的2233个位点中预测此种残基是诱变以产生条件致死性减毒突变株的合适位点。考虑到这些结果，非常有可能扩展本发明的方法，以包括单负链病毒不同株，尤其是在副粘病毒中鉴别的大量减毒突变(Bukreyev等，J.Virol.71(12)，8973-8982(1997)；Garcin等，Virology238(2)：424-431(1997)；Juhasz等，Vaccine 17：1416-1424(1999)；Juhasz等，J.Virol.71(8)：5814-5819(1997)；Kato等，EMBO J.16(3)：578-587(1997a)；Kato等，J.Virol.71(10)：7266-7272(1997b)；Kondo等，J.Biol.Chem.268(29)：21924-21930(1993)；Kurotani等，Genes Cells 3(2)：111-124(1998)；Skiadopoulos等，J.Virol.72(3)：1762-8(1998)；Whitehead等，J.Virol.73：871-877及：3438-3442(1999)；Whitehead等，Virology 247(2)：232-239(1998a)；Whitehead等，J.Virol-73(2)：871-877(1999b)；Whitehead等，J.Virol.72(5)：4467-4471(1998b)，所述文献均引入本文作为参考)。

    本发现提供了新型的PIV候选疫苗且能够同样进行从RSV至其他副粘病毒的减毒突变的转移，其中突变位于一保守性的亲本残基或位点。在本说明书中更进一步说明，RSV的521 L突变被适宜性输入最近刚发展的嵌合PIV3重组体，其具有JS wt PIV3的血凝素—神经氨酸酶(HN)及F基因，其为PIV1的那些所替换(Tao等，J.Virol.72(4)，2955-2961(1998)，所述文献引入本文作为参考)。该嵌合重组体可以通过结合在cp45突变株中所发现的一个或多个附加突变而被进一步减毒，其中这些突变已作为一个整体(发生在F及HN基因中的三种突变除外)被引入在一个感染性、减毒的、嵌合PIV3-1克隆中，该克隆携有在一个JS wt PIV3背景中进行了替换的PIV1 HN及F基因。实施例III在仙台病毒C蛋白中的减毒突变被异源转移进入一个重组候选HPIV3疫苗中去

    本实施例描述了仙台病毒(SeV)C蛋白中的一个已知减毒突变的异源转移，其特征在于在170位点苯丙氨酸(F)至丝氨酸(S)的替换(Itoh等，J.Gen.Virol.78：3207-3215(1997)，所述文献引入本文作为参考)，所述减毒突变被转移至重组HPIV3克隆中的一个相应位点。正如如上所述及在表4中所说明的那样，F170亲本序列元件被定位至在HPIV3 C蛋白中同样保守的序列位点/残基F164，该元件在SeV及BPIV-3中也是保守的。

    SeV的FI70S突变通过在HPIV3的C ORF中引入一点突变而被转移进入一个重组HPIV3病毒株rF164S中，相应的氨基酸改变为164位点从苯丙氨酸(F)至丝氨酸(S)的改变。所得的rF164S重组株在上呼吸道中比其在下呼吸道中有令人更为吃惊的减毒。该模式与所观察到的温度敏感性减毒突变是相反的，由此在重组的、活减毒的疫苗病毒中包含有该新型的突变被证明在减少在上呼吸道中残留的毒性中是有用的。rF164S重组株同样产生抗野生型HPIV3的免疫保护反应。

    HPIV3的P及C蛋白从mRNA中分离的、重叠的ORF进行翻译(图3)。尽管所有的副粘病毒编码一个P蛋白，仅仅呼吸道病毒及麻疹病毒属编码一个C蛋白。从C ORF表达的蛋白数量在不同病毒中不一样且其在体内及体外进行复制的重要性也会不同。仙台病毒(SeV)表达了来自C ORF的四个独立起始的蛋白：C′、C、Y1及Y2，其翻译起始位点在mRNA中也是这个顺序(Curran等，Enzyme44：244-9(1990)；Lamb等，p.181-214，D.Kingsbury(编辑)，TheParamyxoviruses，Plenum Press，New York(1991)，而HPIV3及麻疹病毒(MeV)仅仅表达一个单一的C蛋白(Bellini等，J Virol.53：908-19，(1985)；Sanchez等，Virology 147：177-86(1985)；Spriggs等，J.Gen.Virol.67：2705-2719(1986))。

    其中所有四个C-衍生蛋白被消除的一株活的重组SeV被发现在体外复制时极端低效(Kurotani等，Genes Cells 3：111-124(1998))，然而个别C蛋白的清除具有复杂的效果(Cadd等，J Virol.70：5067-74(1996)；Curran等，Virology 189：647-56(1992)；Latorre等，J Virol.72：5984-93(1998))。

    携有单点突变的一个重组的SeV在小鼠中被减毒，所述单点突变的结果在于在C蛋白的170位一个苯丙氨酸(F)至丝氨酸(S)的氨基酸替换，但是其在细胞培养物中的复制并未被削弱(Garcin等，Virology 238：424-431(1997)；Itoh等J.Gen.Virol.78：3207-15(1997))。和SeV形成对照，一个C-减少的麻疹病毒(MeV)在Vero细胞中有效地复制(Radecke等，Virology 217：418-21(1996))，尽管其显示出在人类外周血细胞中复制的限制性并且仅仅在体内表现出一定程度的减毒(Escoffier等，J.Virol.73：1695-8(1999)；Valsamakis等，J.Virol.72：7754-61(1998))。

    不同MeV及SeV C突变株在动物中的复制的改变表明该蛋白对于在开发活减毒HPIV3疫苗中引进有用减毒突变是一个潜在的靶子。在本实施例中，使用反求遗传学方法以在HPIV3的C ORF中引进一个突变，其在164位氨基酸产生一个F-S的改变，其对应于异源减毒SeV突变株中170位氨基酸上的F→S变化。细胞及病毒

    HEp-2及猿猴LLC-MK2单层细胞培养物被保持在OptiMEM 1(Life Technologies，Gaithersburg，MD)中，其补充有2％胎牛血清、硫酸庆大霉素(50μg/mL)及4mM谷氨酸盐。修饰的疫苗株Ankara(MVA)重组病毒，其表达细菌噬菌体T7 RNA聚合酶，为L.Wyatt及B.Moss(Wyatt等，Virology 210：202-205(1995))所提供。PIV3的JS野生型(wt)株及其减毒ts衍生株JS cp45，在LLC-MK2细胞中进行繁殖，如前所描述的那样(Hall等，Virus Res.22：173-184(1992))。cDNA

    编码JS wt病毒全部的15462 nt反基因组{p3/7(131)2G}的全长cDNA克隆以前已被描述(Genebank登记号为#Z11575)(Durbin等，Virology 235：323-332(1997))。该克隆被用作构建一编码C ORF的164位苯丙氨酸至丝氨酸改变的突变cDNA的模板(表11，图3)。p3/7(131)2G的PmlI至BainHI片段(PIV3反基因组的nt 1215-3903)被亚克隆进入质粒pUC119{pUC119(PmlI-BamHI)}，其已被修饰为包括多克隆区域中的PmlI位点。然后，使用Kunkel的方法(Kunkel等，Methods Enzymol.154：367-382，1987)在pUC119(PmlI-BamHI)上定点诱变以在C ORF中引入突变。

    表11：在rPIV3中引入核苷酸改变以产生rF164S病毒

                   野生型/突变的核苷酸序列1RPIV3    氨基酸替换                                        SEQ.ID

                                                            NO.rF164S Phe-164至Ser  2276-GCA AAT GTT CCA AGC GAG ATA TC    5

                          GCA AAT GTC CCA AGC GAG ATA TC    6

    1显示了突变区域的核苷酸序列，并将其与野生型(wt)序列进行了比较。序列中的首个核苷酸按照其在完整反基因组RNA中的位置进行编号。截取的序列为P开放阅读框，下划线标出的核苷酸为C ORF的164位氨基酸上针对HP103的密码子。编码在C ORF中具有F164S突变的病毒的反基因组cDNA(rF164S)的构建

    在C ORF的164位氨基酸上的苯丙氨酸(F)至丝氨酸(S)的改变使用在全长反基因组2284位核苷酸上引入A至G改变的诱变引物来实现。该突变在P ORF中也是沉默的。全长克隆的PmlI至BamHI片段按其全部进行了测序，以证实所引入的突变的存在，并证实其他突变并未意外引入。该片段然后被分别克隆回全长克隆p3/7(131)2G中去，如前所述(Durbin等，Virology 235：323-332(1997))，以产生反基因组cDNA克隆。回收来自cDNA的重组C F164s突变株

    携有C F164S突变的全长反基因组cDNA与载体质粒{pTM(N)、pTM(P no C)和pTM(L)}一起使用LipofectACE(Life Technologies)转染进六孔板(Costar，Cambridge，MA)上的HEp-2细胞中，并如前所述与MVA-T7一起感染(Durbin等，Virology 235：323-332，1997)。PTM(P no C)与pTM(P)质粒如前所述是同一性的(Durbin等，Virology234：74-83(1997))，除了C转录起始位点已由ATG突变为ACG之外，其使C ORF中的第一个氨基酸由甲硫氨酸变为苏氨酸。经过在32℃下温育3天，转染产物，然后传代移种到T25烧瓶中新鲜的LLC-MK2细胞单层上并在32℃下温育5天(指传1代)。存在于F164S产物中的病毒数量由在LLC-MK2单层培养物中的噬斑滴度进行确定，而噬斑其如前所述用PIV3 HN-特异性单抗进行免疫过氧化物酶染色而显示(Durbin等，Virology 235：323-332(1997))。

    存在于传1代产物上清液中的F164S重组病毒然后在LLC-MK2如前所述那样噬斑纯化三次(Hall等，Virus Res.22：173-184(1992))。从第三次蚀斑纯化所获得的生物学重组克隆病毒在LLC-MK2细胞中在32℃下被扩增两次以产生用于进一步表征的病毒。所回收的重组病毒的序列分析

    病毒从澄清的培养基中从感染细胞单层经过聚乙二醇沉淀如前所述进行浓集(Durbin等，Virology：323-332(1997))。使用TRIzol试剂按照手册推荐程序纯化RNA(Life Technologies)。RT-PCR使用Advantage RT-for-PCR试剂盒(Clontech，Palo Alto，CA)按照手册推荐的程序进行操作。除了反转录酶从反应试剂中剔除以外，对照反应都是相同的，其证实了PCR产物单独获自病毒RNA且并非获自可能的杂质cDNA质粒。使用引物以产生PCR片段，其覆盖全长反基因组的核苷酸1595-3104位。该片段包括重组病毒的全部的C、D及VORF。所得的PCR产物然后使用循环二脱氧核苷酸序列分析进行测序(New England Biolabs，Beverly，MA)。通过免疫沉淀进行蛋白分析

    两个PIV3 C-特异性抗血清通过使用加倍抗原多肽(MAP)技术从兔中诱导产生，其针对两种不同的C肽(Research Genetics，Huntsville，AL)。这两个多肽覆盖C蛋白氨基酸区域30-44及60-74。每一C蛋白多肽的八个拷贝放置于一个分支载体心上且使用弗氏佐剂分别注射于兔中(每一多肽注射两个兔)。在2及4周使用指定的MAP加强免疫且在第4、8及10周取血，每一抗血清以很高的滴度识别用作免疫原的C肽，并经过放射免疫沉淀方法(RIPA)从HPIV3感染细胞中沉淀C多肽。

    LLC-MK2细胞的T25细胞单层在感染复数(MOI)为5时使用rF164S、重组JS wt病毒(rJS)进行感染或被模拟感染且在32℃温育。感染后24小时，使用除甲硫氨酸DMEM(Life Technologies)对单层细胞进行洗涤且在10uCi/μl的35S甲硫氨酸在除甲硫氨酸DMEM(Life Technologies)下培养附加的6小时。收集细胞，洗涤三次，且重悬浮于1ml RIPA缓冲液{1％(w/v)去氧胆酸钠、1％(v/v)TritonX-100、0.2％(w/v)SDS、150mM NaCl、50mM Tris-HCl，pH7.4}，冷冻解冻且在6500XG下凝集成小球。细胞抽提液被转移进入一个新鲜的微量离心试管中且两个C抗血清(每一个5μl)的混合物被加入到每一样品且在40度下被持续混合两小时进行温育。mAb 454/11及101/1的混合物的10μl，其识别HPIV3(van Wyke Coelingh等，J Virol.61：1473-1477(1987))的HN糖蛋白，被加入到每一样品中以证实回收的病毒确实是HPIV3。通过加入200μl的10％A蛋白琼脂糖珠(Sigma，St.Louis，MO)悬浮液至每一样品随后在4℃持续混合过夜以进行免疫复合体的沉淀。每一样品被变性，减少且在4-12％聚丙烯酰胺凝胶(NuPAGE，Novex，San Diego，CA)上按照手册推荐的方法进行分析。凝胶被晾干且使用放射自显影技术进行分析。rPIV3的多循环复制

    单层LLC-MK2细胞在T25烧瓶中用rF164S或rJS在0.1MOI下平行两份进行感染，并32℃在5％CO2下温育。250μl样品从每一烧瓶中按照24小时间隔移去，经过连续5天后，然后被瞬时冻结。一个同样体积的新鲜培养基在每一时间点用于更换。在LLC-MK2细胞单层中(其在96孔平板中在32℃下温育7天)测定每一样品。通过红血球吸附检测病毒且以log10 TCID50/ml进行记录。动物实验

    每组21只4-6周龄的黄金叙利亚仓鼠使用每个动物105PFU的rF164S、rJS、cp45(生物学上获得的活减毒的JS wt病毒衍生体)或呼吸道合胞病毒(RSV)的0.1ml EMEM(Life Technologies)进行鼻腔内接种。在接种后第3，4及5天，每一组中的5个欧洲鼠，除了那些接受RSV的，全被杀死且收集肺及鼻甲。鼻甲及肺被匀质化以分别在L-15(Quality Biologicals，Gaithersburg，MD)中准备一个10％或20％w/v悬浮液且该样品被快速冷冻。样品中的病毒在LLC-MK2的细胞单层的96孔平板中(在32℃下温育7天)进行效价测定。通过红血球吸附检测病毒且按照每天每组5个仓鼠计算均值log10 TCID50/克。在每一组中其余的六个仓鼠中在接种后第0及28天收集血清。对每一病毒的血清抗体反应通过血凝抑制(HAI)试验如前所述进行评价(van Wyke Coelingh等，Virology 143：569-582(1985))。在第28天每一组中剩余的仓鼠，包括那些使用RSV免疫的鼠，使用106pFU的生物学上获得的PIV3 JS wt病毒进行鼻腔内攻击。在攻击后第4天杀死动物，收集其肺及鼻甲，操作程序如上所述。攻击样品中的病毒数量如上进行确定。

    在4个动物每组的非洲绿猴(AGM)使用106PFU的rF164S或者JS wt或cp45如较早前在恒河猴中的研究进行鼻腔内或支气管内接种(Durbin等，Vaccine 16：1324-30(1998))。接种后12天连续每日收集鼻咽擦拭样品及在接种后第2、4、6、8及10天收集气管灌洗样品。这些样品被迅速冷冻并储存在-70℃直到所有样品被收集完。样品中的病毒在96孔板中于32℃温育7天的LLC-MK2细胞单层上进行效价测定。通过红血球吸附检测病毒，对每一天计算均值log10 TCID50/毫升。在第0及28天收集每一猴的血清，确定对用不同突变株和PIV3野生型(JS)进行的实验性感染的PIV3 HAI抗体反应。在接种后第28天，AGM使用106PFU的生物学上获得的PIV3野生株病毒以1ml鼻腔内及气管内接种进行攻击。在攻击后第0、1、2、4、6、8、10及12天收集鼻咽擦拭样品，在攻击后第2、4、6、8及10天收集气管灌洗样品。样品被快速冷冻，储存，如上进行病毒滴度测定。结果重组突变株rF164S的回收

    一个HPIV3反基因组cDNA被制备以编码突变病毒株rF164S，其中C蛋白164位氨基酸残基由F改变为S。突变在重叠P ORF(表11)中是翻译上沉默的。

    反基因组cDNA与三个PIV3载体质粒{pTM(P no C)，pTM(N)，pTM(L)}一起被转染进入HEp2细胞，使用表达T7 RNA聚合酶的MVA同时转染细胞。含有C ORF突变的rPIV3的回收效率与相似的使用p3/7(131)2G转染的HEp-2细胞培养物相比较，p3/7(131)2G表达全长PIV3基因组的质粒，先前从其中回收得到重组JSwt PIV3(rJS)(Durbin等，Virology 235：323-332(1997))。在32℃下温育3天以后，收集被转染的细胞，上清液被移种至T25烧瓶中新鲜LLC-MK2细胞单层上，在32℃下温育5天(传1代)。在32℃下5天后，rJS及rF164S的LLC-MK2细胞单层显示出3-4+的致细胞病变效果(CPE)。通过噬斑分离进行了3循环的生物学克隆以后，重组突变株在LLC-MK2细胞中被扩增两次以产生病毒悬浮液用于进一步表征。

    为了证实回收的病毒确实是预期的rF164S突变株，克隆的病毒使用一对引物通过RT-PCR进行分析，该引物可以扩增HPIV3反基因组的核苷酸1595-3104范围的DNA片段，包括含有C、D及V ORF的P基因的一部分。PCR产物的产生依赖于RT的引入，其指示产物来自RNA而并未来自杂质cDNA。对RT-PCR产物进行核苷酸序列分析以证实所引入的突变的存在。所引入的突变被证实存在于跨越1595-3104位核苷酸的RT-PCR片段中，其扩增自克隆的重组体，且其他偶发突变并未被发现。

    通过放射免疫沉淀试验(RIPA)比较rJS wt病毒及rF164S突变病毒。细胞被感染且自感染后24至30小时在35S甲硫苷酸存在下温育，准备细胞溶解物。使用相同量的总蛋白与抗C及抗HN抗体进行温育，然后抗体被结合至蛋白A琼脂珠中。rJS及rF164S分别编码HN及C蛋白(图4)。为rF164S所表达的C蛋白与由亲本株rJS表达的C蛋白相比较有同一的大小且表达的数量也有着很好的相似性(图4)。rF164S在细胞培养物中的复制

    LLC-MK2细胞单层的双份培养物使用rF164S或rJS在MOI为0.1下进行感染且温育在32℃下5天。来自每一培养物的培养基在每24小时间隔采样且该材料被随后滴定以评价每一病毒在细胞培养物中的复制水平。关于病毒生产的速度及最终的滴度(图5)以及其在提高温度下进行复制的能力，rF164S的复制与其亲本株rJS wt基本没有明显的区别。仓鼠中rF164S的复制

    rF164S突变病毒株进一步与rJS wt亲本株进行比较该病毒在仓鼠中上下呼吸道中复制的能力。仓鼠的组使用rF164S或cp45，即生物学上获得的候选疫苗以每一动物105PFU进行进行鼻腔内接种。相比较于rJS，rF164S的复制在上呼吸道中被减少100-150倍且其在仓鼠的下呼吸道中被减少的量超过10倍(表12)。使用rFI64S及rJS感染的仓鼠对于HPIV3来说有一很明显的抗体反应且其显示出对PIV3攻击病毒的复制的高度限制性(表13)。表12：rF164S病毒在仓鼠上下呼吸道中是减毒的        

                  感染后的平均病毒滴度(log10TCID50/g±S.E.2)                     峰值病毒滴度

               第3天                    第4天                   第5天        (log10TCID50/g±S.E.)病毒1   鼻咽         肺          鼻咽         肺          鼻咽        肺         鼻咽         肺cp45    4.7±0.2    2.7±0.2    5.0±0.5    2.8±0.5    5.4±0.3    1.6±0.2    5.4±0.3    2.8±0.5

                                                                                  (C)3        (C)3rF164S  4.0±0.2    5.3±0.3    4.7±0.3    5.4±0.2    4.4±0.6    4.3±0.1    4.7±0.3    5.4±0.2

                                                                                  (B)         (B)RJS     6.7±0.3    6.8±0.5    7.4±0.2    6.6±0.4    6.6±0.2    7.2±0.2    7.4±0.2    7.2±0.2

                                                                                  (A)         (A)

    1各5个仓鼠的组使用105pfu的设定病毒进行鼻内接种。cp45为生物学上获得的病毒，其它为重组病毒。

    2标准误差。

    3使用不同字母的各栏中的平均值具有显著性差异(a＝0.05)，其使用邓肯多差距测验确定，而那些具有同一字母的不具有显著差异。表13：rF164S在仓鼠中具有免疫原性且可抵抗PIV3 wt病毒的攻击对攻击的反应免疫    血清HAI抗体滴度        平均PIV3滴度2(log10TCID50/g)±S.E.病毒1  (倒数平均值log2±S.E.)      鼻咽            肺RF164S    10.8±0.2             ＜1.5±0.0    ＜1.2±0.0Cp45      11.8±0.3             ＜1.5±0.0    ＜1.2±0.0rJS       12.1±0.2             ＜1.5±0.0    ＜1.2±0.0RSV       ＜2.0±0.0              7.0±0.2      4.7±0.0

    1表明在第0天用于免疫各6个仓鼠组的病毒。

    2在第28天，所有的仓鼠被取血以确定血清HAI抗体滴度并使用106PFU生物学上获得的JS wt HPIV3攻击。肺及鼻甲在攻击后4天收集。rF164S在灵长类动物中的复制

    为了进一步评价rF164S的减毒表型及保护效果，该重组突变株被给予一个4个AGM的一组中，且其在上下呼吸道中的复制与cp45及JSwt进行比较。rF164S的复制在AGM的上呼吸道中被减少100倍或者更多。该病毒在上呼吸道中的减毒性与cp45(表14)相比较，rF164S在AGM下呼吸道中受到中度(＜10倍)限制。该重组病毒对HPIV3诱导一HAI抗体(表14)。该免疫的AGM在第28天使用106PFU生物学上获得的JS wt病毒通过IN及IT进行攻击。已经接受rF164S或cp45候选疫苗的动物可以受到完全保护以抵抗攻击病毒在AGM上下呼吸道中的复制。表14：rF164S在非洲绿猴中是减毒的且诱发血清HAI抗体反应

       平均峰值滴度                 在第28天的血清        平均峰值滴度

    (log10TCID50/g)±S.E.2           HAI抗体滴度      攻击病毒的(log10TCID50/g)±S.E.4病毒1    鼻咽        气管      动物  (倒数平均值           鼻咽               气管

         擦拭        灌洗      数量  log2±S.E.)3          擦拭               灌洗rF164S  4.3±0.3    5.8±0.2    4     12.5±0.3          ＜0.5±0.0         ＜0.5±0.0

          (C)5        (B)5cp45    5.1±0.4    5.3±0.1    4     12.0±0.6          ＜0.5±0.0         ＜0.5±0.0

          (B)         (C)JSwt    6.3±0.2    6.6±0.1    6     13.2±0.2

          (A)         (A)

    1在第0天使用106PFU的指定病毒通过鼻内接种及气管内接种AGM。

    2平均方差。

    3第0天的平均血清HAI抗体滴度(倒数平均值log2)为±2.0。

    4在第28天使用106 PFU HPIV3 JS野生型病毒通过鼻内和气管内攻击动物。

    5使用不同字母的各栏中的平均值具有显著性差异(α＝0.05)，其使用邓肯多差距测验确定，而使用相同字母的平均值不具有显著性差异。

    6在该组中两个动物接受重组JS wt病毒rJS，4个动物接受生物可获得的JS wt病毒。这两个病毒的峰值平均滴度没有差异(在上呼吸道中为6.4对6.3，在下呼吸道中为6.6对6.7)。因为峰值滴度没有差异，所以这些组被结合起来进一步分析。

    简要概括上述实施例，在SeV株中的F170S突变通过使病毒在LLC-MK2猿猴细胞中生长(Garcin等，Virology 238：424-431(1997)，及Itoh等，J.Gen.Virol.78：3207-15(1997))而进行生物学生产。尽管具有F170S突变的重组SeV证实了其在体外复制的增强，该突变株在鼠中复制却是高度限制性的，如同SeV C′/C突变株的复制是削弱的(Gamin等，Virology 238：424-431(1997)及Latorre等，J Virol.72：5984-93，1998))。由于SeV及HPIV3的C蛋白仅仅具有38％的同源性，非常令人吃惊的是发现SeV的F170S突变输入到HPIV3导致体内减毒。

    HPIV3重组株rF164S，其相应于SeV的170位点携有HPIV3氨基酸的突变，其在体外复制并不受限制但是在仓鼠及AGM中的上下呼吸道中是明显减毒的。rF164S相比较wt PIV3感染诱发可比的血清抗体反应且其完全保护仓鼠及AGM抵抗wt HPIV3攻击。这些结果表明F164S突变对于开发抗HPIV3的活减毒疫苗是非常有用的。生物材料的保藏

    按照布达佩斯条约，下列生物材料被保藏在美国典型培养物收集中心(ATCC)，10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209。病毒               保藏号           保藏日期p3/7(131)2G        (ATCC 97989)     1997年4月18日p3/7(131)          (ATCC 97990)     1997年4月18日p218(131)          (ATCC 97991)     1997年4月18日cpts RSV 248       (ATCC VR 2450)   1994年3月22日cpts RSV 530/1009  (ATCC VR 2451)   1994年3月22日RSV cpts530        (ATCC VR 2452)   1994年3月22日cpts RSV 248/955   (ATCC VR 2453)   1994年3月22日cpts RSV 248/404   (ATCC VR 2454)   1994年3月22日cpts RSV 530/1030  (ATCC VR 2455)   1994年3月22日RSV B-1 cp52/2B5   (ATCC VR 2542)   1996年9月26日A2 ts530-s c11cp   (ATCC VR 2545)   1996年10月17日或者ts530-位点RSV B-1 cp-23      (ATCC VR 2579)   1997年7月15日

    尽管为了清楚地理解本发明已详细地以图例及实施例对上述发明作了描述，但很明显，对本发明的修改及改进都在所附权利要求的保护范围内。

    序列表 <110>  美国政府健康及人类服务部 <120>  从克隆的核苷酸序列制备减毒负链RNA病毒疫苗 <130>  NIH-0160 <150>  60/129,006 <151>  1999-04-13 <150>  PCT/US00/09695 <151>  2000-04-12 <160>  53 <170>  PatentIn version 3.1 <210>  1 <211>  53 <212>  PRT <213>  人类副流感病毒3 <400>  1 Gln Gly Val Lys Ile Ile Thr His Lys Glu Cys Ser Thr Ile Gly Ile 1               5                   10                  15 Asn Gly Met Leu Phe Asn Thr Asn Lys Glu Gly Thr Leu Ala Phe Tyr         20                  25                  30 Thr Pro Asn Asp Ile Thr Leu Asn Asn Ser Val Ala Leu Asp Pro Ile     35                  40                  45 Asn Ile Ser Ile Glu 50 <210>  2<211>  53 <212>  PRT <213>  牛副流感病毒3 <400>  2 Gln Gly Ile Lys Ile Ile Thr His Lys Glu Cys Gln Val Ile Gly Ile 1               5                   10                  15 Asn Gly Met Leu Phe Asn Thr Asn Arg Glu Gly Thr Leu Ala Thr Tyr         20                  25                  30 Thr Phe Asp Asp Ile Ile Leu Asn Asn Ser Val Ala Leu Asn Pro Ile     35                  40                  45 Asp Ile Ser Met Glu 50 <210>  3 <211>  53 <212>  PRT <213>  人类副流感病毒1 <400>  3 Arg Gly Val Thr Phe Leu Thr Tyr Thr Asn Cys Gly Leu Ile Gly Ile 1               5                   10                  15 Asn Gly Ile Glu Leu Tyr Ala Asn Lys Arg Gly Arg Asp Thr Thr Arg         20                  25                  30 Gly Asn Gln Ile Ile Lys Val Gly Pro Ala Val Ser Ile Arg Pro Val     35                  40                  45 Asp Ile Ser Leu Asn      50 <210>  4 <211>  53 <212>  PRT <213>  人类副流感病毒2 <400>  4 Gln Gly Ile Ser Ile Ile Asp Ile Lys Arg Cys Ser Glu Met Met Leu 1               5                   10                  15 Asp Thr Phe Ser Phe Arg Ile Thr Ser Thr Phe Asn Ala Thr Tyr Val         20                  25                  30 Thr Asp Phe Ser Met Ile Asn Ala Asn Ile Val His Leu Ser Pro Leu     35                  40                  45 Asp Leu Ser Asn Gln 50 <210>  5 <211>  23 <212>  DNA <213>  人类副流感病毒3 <400>  5 gcaaatgttc caagcgagat atc                                                 23 <210>  6 <211>  23 <212>  DNA <213>  人工序列 <220> <223>  编码F164S突变的核苷酸序列<400>  6 gcaaatgtcc caagcgagat atc                                        23 <210>  7 <211>  53 <212>  PRT <213>  呼吸道合胞病毒 <400>  7 Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp Thr Val Ser Val 1               5                   10                  15 Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly Lys Ser Leu Tyr         20                  25                  30 Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro Leu Val Phe Pro     35                  40                  45 Ser Asp Gln Phe Asp 50 <210>  8 <211>  53 <212>  PRT <213>  麻疹病毒 <400>  8 Lys Ile Leu Thr Tyr Ile Ala Ala Asp His Cys Pro Val Val Glu Val 1               5                   10                  15 Asn Gly Val Thr Ile Gln Val Gly Ser Arg Arg Tyr Pro Asp Ala Val         20                  25                  30Tyr Leu His Arg Ile Asp Leu Gly Pro Pro Ile Ser Leu Glu Arg Leu     35                  40                  45 Asp Val Gly Thr Asn 50 <210>  9 <211>  41 <212>  PRT <213>  人类副流感病毒3 <400>  9 Asn Pro Asn Arg Met Gln Tyr Ala Ser Leu Ile Pro Ala Ser Val Gly 1               5                   10                  15 Gly Phe Asn Tyr Met Ala Met Ser Arg Cys Phe Val Arg Asn Ile Gly         20                  25                  30 Asp Pro Ser Val Ala Ala Leu Ala Asp     35                  40 <210>  10 <211>  41 <212>  PRT <213>  牛副流感病毒3 <400>  10 Asn Ile His Trp Met Gln Tyr Ala Ser Leu Ile Pro Ala Ser Val Gly 1               5                   10                  15 Gly Phe Asn Tyr Met Ala Met Ser Arg Cys Phe Val Arg Asn Ile Gly         20                  25                  30Asp Pro Thr Val Ala Ala Leu Ala Asp     35                  40 <210>  11 <211>  41 <212>  PRT <213>  仙台病毒 <400>  11 Gly Leu Asn Trp Leu Arg Cys Ala Val Leu Ile Pro Ala Asn Val Gly 1               5                   10                  15 Gly Phe Asn Tyr Met Ser Thr Ser Arg Cys Phe Val Arg Asn Ile Gly         20                  25                  30 Asp Pro Ala Val Ala Ala Leu Ala Asp     35                  40 <210>  12 <211>  41 <212>  PRT <213>  人类副流感病毒2 <400>  12 His Pro Arg Leu Ile Ser Arg Ile Val Leu Leu Pro Ser Gln Leu Gly 1               5                   10                  15 Gly Leu Asn Tyr Leu Ala Cys Ser Arg Leu Phe Asn Arg Asn Ile Gly         20                  25                  30 Asp Pro Leu Gly Thr Ala Val Ala Asp     35                  40<210>  13 <211>  41 <212>  PRT <213>  麻疹病毒 <400>  13 Asn Asn Asp Leu Leu Ile Arg Met Ala Leu Leu Pro Ala Pro Ile Gly 1               5                   10                  15 Gly Met Asn Tyr Leu Asn Met Ser Arg Leu Phe Val Arg Asn Ile Gly         20                  25                  30 Asp Pro Val Thr Ser Ser Ile Ala Asp     35                  40 <210>  14 <211>  44 <212>  PRT <213>  呼吸道合胞病毒 <400>  14 Leu Asp Asn Ile Asp Thr Ala Leu Thr Leu Tyr Met Asn Leu Pro Met 1               5                   10                  15 Leu Phe Gly Gly Gly Asp Pro Asn Leu Leu Tyr Arg Ser Phe Tyr Arg         20                  25                  30 Arg Thr Pro Asp Phe Leu Thr Gln Ala Ile Val His     35                  40 <210>  15 <211>  46 <212>  PRT<213>  人类副流感病毒3 <400>  15 Leu Asp Arg Ser Val Leu Tyr Arg Ile Met Asn Gln Glu Pro Gly Glu 1               5                   10                  15 Ser Ser Phe Leu Asp Trp Ala Ser Asp Pro Tyr Ser Cys Asn Leu Pro         20                  25                   30 Gln Ser Gln Asn Ile Thr Thr Met Ile Lys Asn Ile Thr Ala     35                  40                  45 <210>  16 <211>  46 <212>  PRT <213>  牛副流感病毒3 <400>  16 Leu Asp Arg Gly Val Leu Tyr Arg Ile Met Asn Gln Glu Pro Gly Glu 1               5                   10                  15 Ser Ser Phe Leu Asp Trp Ala Ser Asp Pro Tyr Ser Cys Asn Leu Pro         20                  25                  30 Gln Ser Gln Asn Ile Thr Thr Met Ile Lys Asn Ile Thr Ala     35                  40                  45 <210>  17 <211>  46 <212>  PRT <213>  仙台病毒 <400>  17Leu Asp Lys Gln Val Leu Tyr Arg Val Met Asn Gln Glu Pro Gly Asp 1               5                   10                  15 Ser Ser Phe Leu Asp Trp Ala Ser Asp Pro Tyr Ser Cys Asn Leu Pro         20                  25                  30 His Ser Gln Ser Ile Thr Thr Ile Ile Lys Asn Ile Thr Ala     35                  40                  45 <210>  18 <211>  46 <212>  PRT <213>  人类副流感病毒2 <400>  18 Leu Gly Ser Trp Ile Leu Tyr Ash Leu Leu Ala Arg Lys Pro Gly Lys 1               5                   10                  15 Gly Ser Trp Ala Thr Leu Ala Ala Asp Pro Tyr Ser Leu Asn Gln Glu         20                  25                  30 Tyr Leu Tyr Pro Pro Thr Thr Ile Leu Lys Arg His Thr Gln     35                  40                  45 <210>  19 <211>  46 <212>  PRT <213>  麻疹病毒 <400>  19 Met Pro Glu Glu Thr Leu His Gln Val Met Thr Gln Gln Pro Gly Asp 1               5                   10                  15Ser Ser Phe Leu Asp Trp Ala Ser Asp Pro Tyr Ser Ala Asn Leu Val         20                  25                  30 Cys Val Gln Ser Ile Thr Arg Leu Leu Lys Asn Ile Thr Ala     35                  40                  45 <210>  20 <211>  46 <212>  PRT <213>  呼吸道合胞病毒 <400>  20 Leu Asn Lys Phe Leu Thr Cys Ile Ile Thr Phe Asp Lys Asn Pro Asn 1               5                   10                  15 Ala Glu Phe Val Thr Leu Met Arg Asp Pro Gln Ala Leu Gly Ser Glu         20                  25                  30 Arg Gln Ala Lys Ile Thr Ser Gly Ile Asn Arg Leu Ala Val     35                  40                  45 <210>  21 <211>  47 <212>  PRT <213>  人类副流感病毒3 <400>  21 His Pro Lys Val Phe Lys Arg Phe Trp Asp Cys Gly Val Leu Asn Pro 1               5                   10                  15 Ile Tyr Gly Pro Asn Thr Ala Ser Gln Asp Gln Ile Lys Leu Ala Leu         20                  25                  30Ser Ile Cys Glu Tyr Ser Leu Asp Leu Phe Met Arg Glu Trp Leu     35                  40                  45 <210>  22 <211>  47 <212>  PRT <213>  牛副流感病毒3 <400>  22 His Pro Lys Val Phe Lys Arg Phe Trp Asp Cys Gly Val Leu Asp Pro 1               5                   10                  15 Ile Tyr Gly Pro Asn Thr Ala Ser Gln Asp Gln Val Lys Leu Ala Leu         20                  25                  30 Ser Ile Cys Glu Tyr Ser Leu Asp Leu Phe Met Arg Glu Trp Leu     35                  40                  45 <210>  23 <211>  47 <212>  PRT <213>  仙台病毒 <400>  23 His Pro Lys Ile Phe Lys Arg Phe Trp Asn Ala Gly Val Val Glu Pro 1               5                   10                  15 Val Tyr Gly Pro Asn Leu Ser Asn Gln Asp Lys Ile Leu Leu Ala Leu         20                  25                  30 Ser Val Cys Glu Tyr Ser Val Asp Leu Phe Met His Asp Trp Gln     35                  40                  45<210>  24 <211>  47 <212>  PRT <213>  人类副流感病毒2 <400>  24 His Pro Lys Leu Leu Arg Arg Ala Met Asn Leu Asp Ile Ile Thr Pro 1               5                   10                  15 Ile His Ala Pro Tyr Leu Ala Ser Leu Asp Tyr Val Lys Leu Ser Ile         20                  25                  30 Asp Ala Ile Gln Trp Gly Val Lys Gln Val Leu Ala Asp Leu Ser     35                  40                  45 <210>  25 <211>  47 <212>  PRT <213>  麻疹病毒 <400>  25 His Pro Lys Ile Tyr Lys Lys Phe Trp His Cys Gly Ile Ile Glu Pro 1               5                   10                  15 Ile His Gly Pro Ser Leu Asp Ala Gln Asn Leu His Thr Thr Val Cys         20                  25                  30 Asn Met Val Tyr Thr Cys Tyr Met Thr Tyr Leu Asp Leu Leu Leu     35                  40                  45 <210>  26 <211>  47 <212>  PRT <213>  呼吸道合胞病毒<400>  26 Glu Gln Lys Val Ile Lys Tyr Ile Leu Ser Gln Asp Ala Ser Leu His 1               5                   10                  15 Arg Val Glu Gly Cys His Ser Phe Lys Leu Trp Phe Leu Lys Arg Leu         20                  25                  30 Asn Val Ala Glu Phe Thr Val Cys Pro Trp Val Val Asn Ile Asp     35                  40                  45 <210>  27 <211>  41 <212>  PRT <213>  人类副流感病毒3 <400>  27 Asn Ala Tyr Gly Ser Asn Ser Ala Ile Ser Tyr Glu Asn Ala Val Asp 1               5                   10                  15 Tyr Tyr Gln Ser Phe Ile Gly Ile Lys Phe Asn Lys Phe Ile Glu Pro         20                  25                  30 Gln Leu Asp Glu Asp Leu Thr Ile Tyr     35                  40 <210>  28 <211>  41 <212>  PRT <213>  呼吸道合胞病毒 <400>  28 Tyr Tyr Lys Leu Asn Thr Tyr Pro Ser Leu Leu Glu Leu Thr Glu Arg 1              5                   10                  15 Asp Leu Ile Val Leu Ser Gly Leu Arg Phe Tyr Arg Glu Phe Arg Leu         20                  25                  30 Pro Lys Lys Val Asp Lys Glu Met Ile     35                  40 <210>  29 <211>  41 <212>  PRT <213>  麻疹病毒 <400>  29 Asn Ala Gln Ala Ser Gly Glu Gly Leu Thr His Glu Gln Cys Val Asp 1               5                   10                  15 Asn Trp Lys Ser Phe Ala Gly Val Lys Phe Gly Cys Phe Met Pro Leu         20                  25                  30 Ser Leu Asp Ser Asp Leu Thr Met Tyr     35                  40 <210>  30 <211>  41 <212>  PRT <213>  仙台病毒 <400>  30 Asn Ala Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ile Ser Tyr Glu Cys Ala Val Asp 1               5                   10                  15 Asn Tyr Thr Ser Phe Ile Gly Phe Lys Phe Arg Lys Phe Ile Glu Pro        20                  25                   30 Gln Leu Asp Glu Asp Leu Thr Ile Tyr     35                  40 <210>  31 <211>  41 <212>  PRT <213>  人类副流感病毒2 <400>  31 Glu Phe Gln His Asp Asn Ala Glu Ile Ser Tyr Glu Tyr Thr Leu Lys 1               5                   10                  15 His Trp Lys Glu Ile Ser Leu Ile Glu Phe Arg Lys Cys Phe Asp Phe         20                  25                  30 Asp Pro Gly Glu Glu Leu Ser Ile Phe     35                  40 <210>  32 <211>  41 <212>  PRT <213>  犬瘟热病毒 <400>  32 Asn Ala His Ala Ser Gly Glu Gly Ile Thr Tyr Ser Gln Cys Ile Glu 1               5                   10                  15 Asn Trp Lys Ser Phe Ala Gly Ile Arg Phe Lys Cys Phe Met Pro Leu         20                  25                  30 Ser Leu Asp Ser Asp Leu Thr Met Tyr    35                    40 <210>  33 <211>  41 <212>  PRT <213>  猿猴病毒41 <400>  33 Glu Leu His His Asp Asn Ser Glu Ile Ser Tyr Glu Tyr Thr Leu Arg 1               5                   10                  15 His Trp Lys Glu Leu Ser Leu Ile Glu Phe Lys Lys Cys Phe Asp Phe         20                  25                  30 Asp Pro Gly Glu Glu Leu Ser Ile Phe     35                  40 <210>  34 <211>  41 <212>  PRT <213>  海豹瘟热病毒 <400>  34 Asn Ala Cys Val Ser Gly Glu Gly Ile Thr Tyr Ser Gln Cys Val Glu 1               5                   10                  15 Asn Trp Lys Ser Phe Ala Gly Ile Lys Phe Arg Cys Phe Met Pro Leu         20                  25                  30 Ser Leu Asp Ser Asp Leu Thr Met Tyr     35                  40 <210>  35<211>  41 <212>  PRT <213>  Hendra病毒 <400>  35 Arg Leu Lys Asn Ser Gly Glu Ser Leu Thr Val Asp Asp Cys Val Lys 1               5                   10                  15 Asn Trp Glu Ser Phe Cys Gly Ile Gln Phe Asp Cys Phe Met Glu Leu         20                  25                  30 Lys Leu Asp Ser Asp Leu Ser Met Tyr     35                  40 <210>  36 <211>  41 <212>  PRT <213>  猿猴病毒5 <400>  36 Glu Leu Met Asn Asp Asn Thr Glu Ile Ser Tyr Glu Phe Thr Leu Lys 1               5                   10                  15 His Trp Lys Glu Val Ser Leu Ile Lys Phe Lys Lys Cys Phe Asp Ala         20                  25                  30 Asp Ala Gly Glu Glu Leu Ser Ile Phe     35                  40 <210>  37 <211>  41 <212>  PRT <213>  牛瘟病毒<400>  37 Asn Ala Gln Ala Ser Gly Glu Gly Leu Thr Tyr Glu Gln Cys Val Asp 1               5                   10                  15 Asn Trp Lys Ser Phe Ala Gly Ile Arg Phe Gly Cys Phe Met Pro Leu         20                  25                  30 Ser Leu Asp Ser Asp Leu Thr Met Tyr     35                  40 <210>  38 <211>  41 <212>  PRT <213>  鸟肺病毒 <400>  38 Tyr Met Asn Ala Lys Thr Tyr Pro Ser Asn Leu Glu Leu Cys Val Glu 1               5                   10                  15 Asp Phe Leu Glu Leu Ala Gly Ile Ser Phe Cys Gln Glu Phe Tyr Val         20                  25                  30 Pro Ser Gln Thr Ser Leu Glu Met Val     35                  40 <210>  39 <211>  41 <212>  PRT <213>  新城疫病毒 <400>  39 Gln Leu His Ala Asp Ser Ala Glu Ile Ser His Asp Ile Met Leu Arg 1               5                   10                  15Glu Tyr Lys Ser Leu Ser Ala Leu Glu Phe Glu Pro Cys Ile Glu Tyr         20                  25                  30 Asp Pro Val Thr Asn Leu Ser Met Phe     35                  40 <210>  40 <211>  56 <212>  PRT <213>  人类副流感病毒3 <400>  40 Met Lys Leu Glu Arg Trp Ile Arg Thr Leu Leu Arg Gly Lys Cys Asp 1               5                   10                  15 Asn Leu Gln Met Phe Gln Ala Arg Tyr Gln Glu Val Met Thr Tyr Leu         20                  25                  30 Gln Gln Asn Lys Val Glu Thr Val Ile Met Glu Glu Ala Trp Asn Leu     35                  40                  45 Ser Val His Leu Ile Gln Asp Gln 50                  55 <210>  41 <211>  58 <212>  PRT <213>  牛副流感病毒3 <400>  41 Met Lys Leu Gly Arg Trp Ile Arg Thr Leu Leu Arg Gly Lys Cys Asp 1               5                   10        Asn Leu Lys Met Phe Gln Ser Arg Tyr Gln Gly Val Met Pro Phe Leu         20                  25                  30 Gln Gln Asn Lys Met Glu Thr Val Met Met Glu Glu Ala Trp Asn Leu     35                  40                  45 Ser Val His Leu Ile Gln Asp Ile Pro Ala 50                  55 <210>  42 <211>  55 <212>  PRT <213>  仙台病毒 <400>  42 Met Lys Thr Glu Arg Trp Leu Arg Thr Leu Ile Arg Gly Glu Lys Thr 1               5                   10                  15 Lys Leu Lys Asp Phe Gln Lys Arg Tyr Glu Glu Val His Pro Tyr Leu         20                  25                  30 Met Lys Glu Lys Val Glu Gln Ile Ile Met Glu Glu Ala Trp Ser Leu     35                  40                  45 Ala Ala His Ile Val Gln Glu 50                  55 <210>  43 <211>  55 <212>  PRT <213>  人类副流感病毒1<400>  43 Met Lys Thr Glu Arg Trp Leu Arg Thr Leu Ile Arg Gly Lys Lys Thr 1               5                   10                  15 Lys Leu Arg Asp Phe Gln Lys Arg Tyr Glu Glu Val His Pro Tyr Leu         20                  25                  30 Met Met Glu Arg Val Glu Gln Ile Ile Met Glu Glu Ala Trp Lys Leu     35                  40                  45 Ala Ala His Ile Val Gln Glu 50                  55 <210>  44 <211>  41 <212>  PRT <213>  呼吸道合胞病毒 <400>  44 Tyr Tyr Lys Leu Asn Thr Tyr Pro Ser Leu Leu Glu Leu Thr Glu Arg 1               5                   10                  15 Asp Leu Ile Val Leu Ser Gly Leu Arg Phe Tyr Arg Glu Phe Arg Leu         20                  25                  30 Pro Lys Lys Val Asp Leu Glu Met Ile     35                  40 <210>  45 <211>  41 <212>  PRT <213>  人类副流感病毒3<400>  45 Asn Ala Tyr Gly Ser Asn Ser Ala Ile Ser Tyr Glu Asn Ala Val Asp 1               5                   10                  15 Tyr Tyr Gln Ser Phe Ile Gly Ile Lys Phe Asn Lys Phe Ile Glu Pro         20                  25                  30 Gln Leu Asp Glu Asp Leu Thr Ile Tyr     35                  40 <210>  46 <211>  41 <212>  PRT <213>  麻疹病毒 <400>  46 Asn Ala Gln Ala Ser Gly Glu Gly Leu Thr His Glu Gln Cys Val Asp 1               5                   10                  15 Asn Trp Lys Ser Phe Ala Gly Val Lys Phe Gly Cys Phe Met Pro Leu         20                  25                  30 Ser Leu Asp Ser Asp Leu Thr Met Tyr     35                  40 <210>  47 <211>  41 <212>  PRT <213>  仙台病毒 <400>  47 Asn Ala Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ile Ser Tyr Glu Cys Ala Val Asp 1               5                   10                  15Asn Tyr Thr Ser Phe Ile Gly Phe Lys Phe Arg Lys Phe Ile Glu Pro         20                  25                  30 Gln Leu Asp Glu Asp Leu Thr Ile Tyr     35                  40 <210>  48 <211>  18 <212>  PRT <213>  人工序列 <220> <223>  共有序列 <400>  48 Asn Ala Ser Glu Val Asp Ser Phe Gly Lys Phe Phe Leu Asp Asp Leu 1               5                   10                  15 Thr Tyr <210>  49 <211>  12 <212>  DNA <213>  人类副流感病毒3 <400>  49 ttcaataaat tc                                                       12 <210>  50 <211>  12 <212>  DNA <213>  人工序列<220> <223>  编码F456L突变的核苷酸序列 <400>  50 ctgaataaat tc                                                          12 <210>  51 <211>  11 <212>  DNA <213>  人类副流感病毒3 <400>  51 aaaaaagggg g                                                           11 <210>  52 <211>  20 <212>  DNA <213>  人类副流感病毒3 <400>  52 gttgatggaa agcgatgcta                                                  20 <210>  53 <211>  13 <212>  DNA <213>  人工序列 <220> <223>  经修饰的P mRNA编辑位点 <400>  53 aaaaaagggg ggg                                                        13