一种TNFR-Fc融合蛋白及其用途 【技术领域】
本发明属于分子生物学领域，涉及一种新的重组TNFR-Fc融合蛋白及其用途。
背景技术
人肿瘤坏死因子(hTNF-α)主要是由一种活化的单核/巨噬细胞产生的细胞因子，这是一种具有多种生物学效应的细胞因子，早期研究发现TNF-α能诱导肿瘤细胞坏死或凋亡，但后来发现TNF-α是介导炎症反应的主要细胞因子，也是引起发热和败血症休克的重要因素，在心衰、移植排斥反应和自身免疫疾病中起重要作用。适量的TNF-α能激活免疫系统、增强免疫力，在宿主抵抗微生物入侵和抑制肿瘤产生的防御系统中起着关键作用。但过量的TNF-α表达时，可以与其它炎性因子一起产生多种病理损伤。因此，TNF-α在体内起着双刃剑的作用。
人们已在多种疾病的研究中证实了TNF-α的水平明显比正常人高，并发现其可能的致病机理(Feldman M，et al.，Ann Rev Immunol 1996；14：397)。由于TNF-α参与了多种疾病的发生和发展过程，在某些疾病中起关键作用，在某些疾病中与其它因素共同作用；因此在不同水平上阻断TNF-α的作用，有可能对与TNF-α有关的疾病产生治疗作用。目前以TNF-α为靶标的治疗疾病，有的已经获准临床使用，获得了预期的效果，有的正在进行临床实验。
细胞表面存在两种不同的TNFR，即分子量分别为55KD的TNFRI(CD120α)和75KD的TNFRII(CD120β)。人TNF-α与TNFR的亲和力较高，与TNFRI和TNFRII的亲和常数分别为1.23±0.23nM和0.36±0.13nM。两型TNFR的膜外区均可脱落，仍然保留结合TNF-α的活性。将受体的膜外区与抗体的Fc段连接，形成的融合蛋白则既可与TNF-α结合，又增加了稳定性，而且通过Fc段可形成二聚体，比天然出现的单体受体对TNF-α有更大的亲和力。
现有技术中，美国Immunex公司开发出了商品化的TNFRII-IgG1/Fc融合蛋白，称为Etanercept，商品名为Enbrel，已被FDA批准上市，用于治疗类风湿性关节炎、强直性脊椎炎和抑制银屑病病人的骨和关节损伤。然而，包含Enbrel在内的多种上市的TNF分子拮抗药物，由于这些药物具有诱导体内ADCC和CDC作用的可能(Tracey D，et al.，Pharmacol Ther.2008；117(2)：244-79)，因此这些药物都存在一定的副作用。
然而，目前发现的结合TNFα的制剂还存在结合能力较低，生物活性不高，体内有效作用时间短的缺陷，因此本领域有必要进一步研究改进的药物，以有效地提高药物疗效。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种融合蛋白，所述的融合蛋白的氨基端是人肿瘤坏死因子II型受体(TNFR II)可溶片段；羧基端是人IgG2的Fc片段。
本发明的另一目的在于提供所述的融合蛋白的用途及组合物。
在本发明的第一方面，提供一种融合蛋白，所述的融合蛋白的氨基端是人肿瘤坏死因子II型受体(TNFR II)可溶片段；羧基端是人免疫球蛋白2(IgG2)的Fc片段。
在另一优选例中，所述的融合蛋白在体内的半衰期高于48小时。
在另一优选例中，所述的人肿瘤坏死因子II型受体具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。较佳的，所述的人II型TNFα受体可溶片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
在另一优选例中，所述地人IgG2的Fc片段具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。较佳的，所述的人IgG2的Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
在本发明的第二方面，提供一种核酸分子，所述的核酸分子编码所述的融合蛋白。
在另一优选例中，所述的核酸分子具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
在本发明的第三方面，提供一种载体，它含有所述的核酸分子。
在另一优选例中，所述的载体中还可操作性地连接有谷氨酰胺合成酶(GS)的编码基因。
在另一优选例中，所述的谷氨酰胺合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
在另一优选例中，所述的谷氨酰胺合成酶的编码基因序列如SEQ ID NO：5所示(或序列信息如Genebank X03495)。
在另一优选例中，所述的载体是pIRES双顺反子表达载体。
在另一优选例中，所述的谷氨酰胺合成酶的编码基因序列位于该表达载体的多克隆位点B；上述的核酸分子位于该表达载体的多克隆位点A。
在本发明的第四方面，提供一种基因工程化的细胞，
所述的细胞含有所述的载体；
或所述的细胞基因组中整合有所述的核酸分子。
在本发明的第五方面，提供一种产生所述的融合蛋白的方法，所述的方法包括：在适合表达所述融合蛋白的条件下，培养所述的宿主细胞，表达和分离出所述的融合蛋白。
在本发明的第六方面，提供所述的融合蛋白的用途，用于制备特异性结合肿瘤坏死因子α的组合物。
在另一优选例中，所述的组合物用于预防或治疗肿瘤坏死因子α异常活化相关疾病。
在另一优选例中，所述的肿瘤坏死因子α异常活化相关疾病包括：类风湿性关节炎、强直性脊椎炎、银屑病、败血症、哮喘、中风、糖尿病、Crohn’s病。
在本发明的第七方面，提供一种特异性结合肿瘤坏死因子α的组合物，所述的组合物含有：
(i)有效量的所述的融合蛋白；和
(ii)药学上可接受的载体。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
【附图说明】
图1.重组质粒的酶切鉴定结果。其中，泳道1为DL250bp Marker；泳道2为PCR验证重组质粒；泳道3为双酶切鉴定重组质粒；泳道4为DL500～15,000bp的Marker。
图2.利用TNFR-IgG2Fc标准品制备的ELISA标准曲线。
图3.利用分离介质rProtein A Sepharose 4Fast Flow和Q Sepharose FF进行亲和层析和离子交换层析，纯化表达蛋白。
图4.纯化后的蛋白的SDS-PAGE检测。其中，
泳道1.蛋白标记； 泳道2.非还原样品(211p080723-2)；
泳道3.非还原样品(211p080723-3)； 泳道4.非还原样品(211p080723-4)；
泳道5.非还原样品(Enbrel)； 泳道6.蛋白标记；
泳道7.还原样品(Enbrel)； 泳道8.还原样品(211p080723-2)；
泳道9.还原样品(211p080723-3)； 泳道10.还原样品(211p080723-4)。
图5.纯化后的蛋白的western印迹检测。其中，
泳道1.蛋白标记； 泳道2.非还原样品(211p080723-2)；
泳道3.非还原样品(211p080723-3)； 泳道4.非还原样品(211p080723-4)；
泳道5.非还原样品(Enbrel)； 泳道6.蛋白标记；
泳道7.还原样品(Enbrel)； 泳道8.还原样品(211p080723-2)；
泳道9.还原样品(211p080723-3)； 泳道10.还原样品(211p080723-4)。
图6.TNFα体外毒性结合实验的原始结果。
【具体实施方式】
本发明人经过深入的研究，意外地发现将人肿瘤坏死因子II型受体(TNFRII)可溶片段与人IgG2的Fc片段相融合，获得的融合蛋白具有极其优异的结合TNFα的效果，且稳定性好、半衰期长、副作用低。
如本文所用，除非另外说明，TNFR，TNFR II，hTNFR II可互换使用，都指人肿瘤坏死因子II型受体。
如本文所用，除非另外说明，IgG2Fc或hIgG/Fc是指人免疫球蛋白2的Fc片段，其不同于人免疫球蛋白1的Fc片段(IgG1Fc)。
如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
如本文所用，除非另外说明，所述的融合蛋白是一种分离的蛋白，与其它蛋白、多肽或分子无联系，是重组宿主细胞培养的纯化产物或作为一种纯化的提取物。
本发明提供了一种融合蛋白，包含人可溶性肿瘤坏死因子II型受体可溶片段，人免疫球蛋白2的Fc片段(IgG2Fc)。该融合蛋白能够用于制备特异性结合肿瘤坏死因子α的组合物。该融合蛋白简写为“TNFR-IgG2/Fc”或“hTNFR II-IgG2/Fc”。
所述的融合蛋白中，氨基端是TNFR II可溶片段；羧基端是IgG2Fc片段，所述的IgG Fc片段具有铰链区、CH2和CH3区。
本发明的TNFR-IgG2/Fc融合蛋白相对分子量为150千道尔顿，其中氨基酸残基占100千道尔顿左右，其余为糖链。每条肽链含3个N糖基化位点，2条多肽链可通过半胱氨酸残基形成二硫键，成为等二聚体。由于TNFR II也属于免疫球蛋白超家族的成员，所以它的二级结构为多个同源性结构(CH样结构)，链内形成二硫键。
本发明所述的融合蛋白中，所述的TNFR II可溶片段与IgG2Fc片段之间，可以含有或不含有连接序列。所述的连接序列通常是对两个蛋白不产生影响作用的序列。作为本发明的优选方式，所述的TNFR II可溶片段与IgG2Fc片段之间不含有连接序列。
本发明的TNFR-IgG2/Fc融合蛋白，其稳定的类抗体二聚体结构相对单独的TNFR分子有效的延长了体内半衰期，同时获得了高于Enbrel的TNF-α的体外结合能力，具有更高的生物活性。更为重要的是，由于IgG2分子铰链区序列和CH2区序列的特点，其结合补体和Fc受体的能力要远弱于IgG1分子，因此极大降低了诱导ADCC和CDC作用的可能。在治疗类风湿性关节炎或其他新的适应症时，本发明的TNFR-IgG2/Fc分子能有效降低游离TNF-α浓度，同时减少了不良免疫反应的发生。
根据本发明提供的氨基酸序列，本技术领域人员可方便地用各种已知方法制得本发明的融合蛋白。这些方法例如但不限于：重组DNA法，人工合成，等[参见Murray KM，Dahl SLAnn；Pharmacother 1997Nov；31(11)：1335-8]。
在得知了本发明的融合蛋白的氨基酸序列后，本领域人员可以方便地根据所述的氨基酸序列获得编码本发明的融合蛋白的基因序列。
作为本发明的优选方式，本发明的融合蛋白的编码基因具有SEQ ID NO：3所示的序列，采用该序列，特别适合于在真核细胞(优选CHO细胞)中高表达本发明的融合蛋白。
根据本文所述的核苷酸序列，本技术领域人员可方便地用各种已知方法制得本发明的编码核酸。这些方法例如但不限于：PCR，DNA人工合成等，具体的方法可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。作为本发明的一种实施方式，可通过分段合成核苷酸序列再进行重叠延伸PCR的方法来构建本发明的编码核酸序列。
本发明还提供了一种表达载体，包含编码本发明的融合蛋白的序列以及与之操作性相连的表达调控序列。所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。
表达载体可采用市售的例如但不限于：pIRES、pDR，pUC18等可用于真核细胞系统表达的载体。本领域技术人员可以根据宿主细胞来选择合适的表达载体。作为本发明的优选方式，当在真核细胞特别是CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)中进行表达时，采用pIRES表达载体。作为本发明的优选方式，在构建重组载体时，在载体中引入本发明的融合蛋白编码基因的同时，还引入中国仓鼠谷胺酰胺合成酶(Glutamine Synthetase，GS)基因、引入GS基因有利于后续阳性克隆的筛选，通过载体上的IRES启动子弱化了GS基因的基础转录水平。G418可以有效的筛选稳定转染细胞，而同时加入谷氨酰胺合成酶的抑制物(MSX)，可以优选高表达的稳定转染细胞株。
根据已知空载表达载体的酶切图谱，本领域技术人员可按照常规方法通过限制性酶剪切与拼接，将本发明的融合蛋白的编码序列插入合适的限制性位点，制得本发明的重组表达载体。
本发明还提供了表达本发明融合蛋白的宿主细胞，其中含有本发明的融合蛋白的编码序列。所述的宿主细胞优选的是真核细胞，例如但不限于CHO，COS细胞，293细胞，RSF细胞等。作为本发明的优选方式，所述的细胞是CHO细胞，其可良好地表达本发明的融合蛋白，可获得结合活性良好，稳定性良好的融合蛋白。
本发明还提供一种用重组DNA制备本发明融合蛋白的方法，其步骤包括：
1)提供编码融合蛋白的核酸序列(如SEQ ID NO：3序列)；
2)将1)的核酸序列插入到合适的表达载体，获得重组表达载体；
3)将2)的重组表达载体导入合适的宿主细胞；
4)在适合表达的条件下培养转化宿主细胞；
5)收集上清液，并纯化融合蛋白产物。
将所述编码序列导入宿主细胞可采用本领域的多种已知技术，例如但不限于：磷酸钙沉淀，原生质体融合，脂质体转染，电穿孔，微注射，反转录法，噬菌体转导法，碱金属离子法。
有关宿主细胞的培养和表达可参见Olander RM Dev Biol Stand1996；86：338。可通过离心去除悬浮液中的细胞和残渣，收集清液。可通过琼脂糖凝胶电泳技术进行鉴定。
可将上述制备获得的融合蛋白纯化为基本均一的性质，例如在SDS-PAGE电泳上呈单一条带。例如，当重组蛋白为分泌表达时，可以采用商品化的超滤膜来分离所述蛋白，例如Millipore、Pellicon等公司产品，首先将表达上清浓缩。浓缩液可采用凝胶层析的方法进一步加以纯化，或采用离子交换层析的方法纯化。例如阴离子交换层析(DEAE等)或阳离子交换层析。凝胶基质可为琼脂糖、葡聚糖、聚酰胺等常用于蛋白纯化的基质。Q-或SP-基团是较为理想的离子交换基团。最后，还可用羟基磷灰石吸附层析，金属螯合层析，疏水相互作用层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)等方法对上述纯化产物进一步精制纯化。上述所有纯化步骤可利用不同的组合，最终使蛋白纯度达到基本均一。
可利用含有所述融合蛋白的特异性抗体、受体或配体的亲和层析柱对表达的融合蛋白进行纯化。根据所使用的亲和柱的特性，可利用常规的方法，如高盐缓冲液、改变pH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合性多肽。可选择地，所述的融合蛋白的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，6-His或8-His等。这些标签可用于对融合蛋白进行纯化。
作为本发明的优选方式，本发明人构建了所述的融合蛋白基因，在CHO细胞中表达并纯化获得蛋白。先设计出融合基因，将基因序列通过引物合成、退火拼接的方法，构建了包含了谷氨酰胺合成酶(GS)筛选基因和TNFR-IgG2/Fc基因的重组质粒，并利用电击转染的方法将质粒导入CHO宿主细胞，通过培养基中筛选药物MSX的生长压力，选择出稳定整合目的基因并持续高水平表达重组蛋白的细胞株。细胞株在无血清商业化培养基中大规模培养，并通过protein A亲和层析和离子交换层析获得纯度较高的目的蛋白。本发明人还利用免疫学的原理和方法验证了TNFR-IgG2/Fc融合蛋白的理化性质验证和体外活性。通过SDS-PAGE验证了蛋白的表观分子量；利用ELISA和Western-Blot，证明了目的蛋白的TNFR-IgG2/Fc融合蛋白的结构特性，并利用N-端和C-端测序证实了蛋白序列的准确性。体外TNFα毒性拮抗实验的结果表明，目的蛋白和TNFα分子有很强结合能力。
本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.000001-40wt％；较佳的0.1-50wt％；更佳的，5-40wt％)的本发明的融合蛋白，以及药学上可接受的载体。
通常，可将本发明的融合蛋白配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的组合物含有安全有效量的本发明的融合蛋白以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。
本发明所述的融合蛋白的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的融合蛋白的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的融合蛋白每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
本发明的融合蛋白或含有所述融合蛋白的药物组合物可用于结合TNFα，从而可用于预防或治疗TNFα异常活化相关疾病。所述的TNFα异常活化相关疾病包括但不限于：类风湿性关节炎、强直性脊椎炎、银屑病、败血症、哮喘、中风、糖尿病、Crohn’s病等一系列TNF-α分子引起的病症。
本发明的融合蛋白或含有所述融合蛋白的药物组合物也可与其它药物联合用药。在用于预防或治疗TNFα异常活化相关疾病时，所述的融合蛋白可全身性给药，或者局部给药，具体可视疾病的种类、生长部位、进展程度等因素决定。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明的融合蛋白可特异性结合人TNFα，有效降低人体内游离TNFα浓度，治疗TNFα引起的相关疾病；所述的融合蛋白不仅保留了结合TNF-α的活性，而且具备很高的TNFα亲和力和低副作用(ADCC和CDC)的特点。
(2)本发明的融合蛋白稳定性高，体内半衰期长，克服了现有技术中TNFα受体类制剂稳定性差的技术缺陷。
下面通过实施例进一步描述本发明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如Sambrook等，分子克隆-实验室手册，第二版(Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Second Edition)，冷泉港实验室出版社，纽约(1989)一书和在Ausubel等(1994)现代分子生物学技术，现代技术(Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocol)的第一、二卷中所述的标准方法进行操作。
以下实施例使用的载体、菌种、试剂及来源：
pUC18-T、Extaq为Takara公司产品；
PfuUltra Hotstart DNA Polymerase为Stratagene公司产品；
双表达载体pIRES为Clontech公司产品；
DNA连接酶，限制性内切酶MluI、XbaI、SalI、NotI为NEB公司产品；
质粒提取、酶切产物回收和PCR产物回收分别采用Invitrogen公司的Purelink quick plasmid miniprep kit、Purelink quick gel extraction kit和PurelinkPCR purification kit。
实施例1.hTNFRII-Fc融合基因表达质粒的获得
1.hTNFRII-hIgG2/Fc基因的获得
hTNFRII-hIgG2/Fc为融合蛋白，其基因序列具有1389bp，编码463个氨基酸的蛋白。其中N末端hTNFRII胞外区可溶片段(成熟蛋白)基因(705bp/235aa)，序列如SEQ ID NO：1(来源于Genebank NM001066)；C末端hIgG2-Fc基因(684bp/228aa)，序列SEQ ID NO：2(来源于Genebank AK131045)。
设计合成基因的寡核苷酸片段(表1)：片段长度一般为70个碱基左右，相邻的两条寡核苷酸片段间约有15个碱基互补，尽量保证各寡核苷酸片段互补碱基的退火温度一致。用重叠延伸PCR的方法组装合成hTNFRII基因。
表1人工合成的hTNFRII-hIgG2/Fc寡核苷酸片段序列
拼接合成顺序：
(1)将片段1和2，3和4，5和6，7和8，9和10，11和12，13和14，15和16，17和18，19和20，21和22，23和24，25和26分别混合，进行重叠延伸PCR，得到1-2，3-4，5-6，7-8，9-10，11-12，13-14，15-16，17-18，19-20，21-22，23-24、25-26。
PCR反应体系：dNTP 8μl；0.5μl PfuUltra酶；10×缓冲液10μl；DNA片段2×20μl；水41.5μl，共100μl。循环参数：94℃×5min→(94℃×30s→60℃×30s→2℃×45s)×25→72℃×10min。
(2)1-2，3-4，5-6，7-8，9-10，11-12，13-14，15-16，17-18，19-20，21-22，23-24，25-26分别混合进行重叠延伸PCR，得到1-4，5-8，9-12，13-16，17-20，21-24和25-26。
取反应(1)产物各40μl，补加0.5μl PfuUltra酶，20μl水，循环参数不变。
(3)将1-4，5-8，9-12，13-16，17-20和21-24分别混合，进行重叠延伸PCR，得到1-8，9-16和17-24。
取反应(2)产物各40μl，补加0.5μl PfuUltra酶，20μl水，循环参数不变。
(4)将1-8，9-16，17-24和25-26混合，进行重叠延伸PCR得到基因全长。
取反应(3)产物各30μl，补加0.5μl PfuUltra酶，10μl水，循环参数不变。
(5)用上下游引物对组装的基因进行扩增，得到基因全序列。
PCR反应体系：dNTP 8μl；0.5μl PfuUltra酶；10×缓冲液10μl；DNA片段10μl；引物各2μl；水67.5μl，共100μl。循环参数：94℃×5min→(94℃×30s→60℃×30s→72℃×60s)×30→72℃×10min→4℃。
引物：5-ATGGCGCCCGTCGCCGTCTGGGCCGCGCT-3(SEQ ID NO：32)
5-TCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC-3(SEQ ID NO：33)
2.中国仓鼠GS(Glutamine Synthetase)基因的获得
根据GS基因序列SEQ ID NO：5(Genebank X03495)序列，合成该基因的寡核苷酸片段，用重叠延伸PCR的方法组装合成GS基因。
3.hTNFRII-Fc融合基因表达质粒的构建
(1)SalI和NotI双酶切GS基因及pIRES载体，反应体系：
37℃水浴2h。
(2)琼脂糖胶电泳，回收酶切产物，采用Purelink quick gel extraction kit，按试剂盒说明操作。
(3)连接目的基因与载体，反应体系：
16℃水浴过夜。
(4)将连接产物转化大肠杆菌，LB平板培养。挑取多个克隆培养后，次日提取质粒酶切鉴定，选阳性克隆测序鉴定，获得GS基因整合在pIRES多克隆位点B的pIRES-GS重组质粒。
(5)MluI和XbaI双酶切hIgG-Fc基因及pIRES-GS载体，反应体系同(1)。
(6)琼脂糖胶电泳，回收酶切产物，采用Purelink quick gel extraction kit，按试剂盒说明操作。
(7)连接目的基因与载体，反应体系同(3)。
(8)将连接产物转化大肠杆菌，LB平板培养。挑取多个克隆培养后，次日提取质粒酶切鉴定(见图1)，选阳性克隆测序鉴定，获得hTNFRII-hIgG/Fc基因整合在pIRES多克隆位点A的hTNFRII-Fc融合基因表达质粒。
实施例2.hTNFRII-Fc融合基因的表达和纯化
1.CHO细胞的转染和筛选
细胞系及培养条件：FreeStyle CHO-S细胞(Invitrogen)，培养条件为freestyle medium(Invitrogen)，含10％透析血清(Hyclone)，培养于10％CO2、37℃温箱。G418、MSX(Sigma)。
转染采用Invitrogen公司生产的LipofectamineTM 2000脂质体转染试剂盒，按照说明书操作。对照采用pIRES空载体转染CHO-S细胞。采用G418(200μM)和MSX(50μg/ml)联合加压筛选，3天更换一次培养基，加压20天后按有限稀释法转移至96孔板培养筛选，培养1周后取培养上清进行ELISA测定。
鼠抗人TNFR一抗(Sigma)包被酶标板(Corning)4℃过夜，5％牛奶封闭后加入细胞培养上清，孵育后加入鼠抗人IgG-Fc/HRP一抗(Sigma)，孵育后TMB试剂显色，450nm测OD值。以新鲜培养基为阴性对照。利用TNFR-IgG2Fc标准品制备的ELISA标准曲线见图2。各细胞株在96孔板中培养时的抗体表达量结果如表2所示。
表2各细胞株在96孔板中培养时的抗体表达量
样品 测量值(OD450) 稀释倍数 滴度(ng/ml) 211p080723-2 2.06 100 13766 211p080723-3 2.181 100 20714
样品 测量值(OD450) 稀释倍数 滴度(ng/ml) 211p080723-4 2.212 100 24172 阴性对照 0.046 100 低于线性范围
2.单克隆的扩大培养和融合蛋白纯化
细胞培养条件：培养于无血清EX-CELL 302(SAFc)，培养在10％CO2、37℃温箱。
选择表达水平最高的多个克隆扩增至24孔板，培养3天后检测蛋白表达，选择表达高的克隆进入下一轮扩增；多轮扩增后选择表达水平最高的6个克隆扩增至T75培养瓶中，将细胞标号保藏。将表达水平最高的克隆接种到1L转瓶中，用含5％小牛血清的EX-CELL 302培养基培养，待细胞长满瓶壁时，换为无血清培养基，隔天收液，连续收液3-5次。
利用蛋白A对IgG的特异性吸附作用，采用分离介质rProtein A Sepharose4Fast Flow(Amersham Biosciences)和Q Sepharose FF(Amersham Biosciences)进行亲和层析和离子交换层析，纯化表达蛋白，如图3。操作方法参见产品说明。纯化后，以紫外分光光度计测定A260和A280值。蛋白定量公式：蛋白含量(mg/ml)＝OD280值×1.45-OD260值×0.74。
实施例3.hTNFRII-Fc融合蛋白的理化活性检测
1.SDS-PAGE蛋白电泳和Western印迹
取20μl纯化蛋白进行SDS-PAGE电泳，电泳分离胶浓度选取10％，结果如图4。具体操作步骤详见《分子克隆》第二版及蛋白质电泳实验技术。
样品经SDS-PAGE电泳分离后转移于硝酸纤维素膜。膜用含0.5％吐温的5％牛奶溶液封闭后结合抗体，一抗为小鼠抗人TNFR(Sigma)，二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(Calbiochem)，PBS/0.5％Tween洗3次后TMB显色，结果如图5。
2.L929细胞毒性中和试验
材料和试剂：L929(ATCC)，培养条件为RPMI 1640(Sigma)，含10％胎牛血清(Invitrogen)，培养于5％CO2、37℃温箱。TNFα(Sigma)用RPMI 1640溶解至10000u/ml，分装0.1ml/支。放线菌素D用RPMI 1640溶解至1mg/ml。TNFR-Fc参考品(standard)：Enbrel。同仁生化CCK-8细胞计数试剂盒。
(1)取对数生长期的L929细胞，消化计数，加入96孔板，3×105/ml×0.1ml/孔，培养过夜。
(2)次日取12ml RPMI 1640稀释放线菌素母液0.12ml至终浓度10μg/ml，取2ml作为对照(培养基A)，其余10ml加入TNFα母液至浓度为10μg/ml(培养基B)。
(3)取一支分装的TNFR-Fc参考品，用1ml培养基B溶解并稀释至浓度256ng/ml。
(4)根据待测样品的蛋白定量，用无菌PBS溶解至0.1mg/ml，然后在1.5ml无菌离心管中用培养基B进行梯度稀释。
(5)分别在无菌离心管中用培养基连续倍比稀释参考品或样品的稀释液。每个稀释液的体积为0.4ml。
(6)用培养液A作为阴性对照，培养液B作为阳性对照。
(7)在已接种细胞的孔板中，加入稀释好的样品、标准品和阴、阳性对照液，0.1ml/孔，每个测量点设3个复孔。5％CO2、37℃温箱继续培养。
(8)孵育5-10h后，弃去培养基，加入新鲜配制的含10％CCK-8的RPMI1640，0.1ml/孔，继续孵育15min。
(9)加入10μl/孔10％SDS终止反应，用酶标仪测量其值A450，参比为A650。
从测定结果(如图6)可以看出，在TNFα体外毒性结合实验中，由多个细胞株(211P80723-2，211P80723-3，211P80723-4)获得的样品都具有很强的TNFα结合能力，其对TNFα的拮抗能力都要显著高于同一剂量的Enbrel蛋白，分别是Enbrel活性的2.66，1.26和1.26倍，如表3。
表3TNFα体外毒性结合实验的结论
样品名称 Enbrel 211P80723-2 211P080723-3 211P080723-4 EC50值(μg/μl) 0.0258 0.00971 0.0205 0.0205 相关系数(R2) 0.9973 0.9992 0.9963 0.9977 EC50工作参考品 /EC50样品 / 2.657 1.259 1.259
实施例4.hTNFR II-Fc融合蛋白在大鼠体内的药代动力学研究
大鼠504只，随机分为6组，自制样品为hTNFR II-IgG2/Fc融合蛋白，对照样品为市售的Wyeth公司Enbrel，分别按0.5、3、18mg/kg皮下注射给药，于给药后1、2、4、8、12、24、28、32、36、48、72、96、120、144h等14个时间点心脏采血，每个时间点6只动物(3♂、3♀)，离心，分取血清，用试剂盒测定血清hTNFR II的含量，计算不同时间的血药浓度，应用药代动力学与3P87软件对血药浓度(c)与时间(t)数据进行c-t曲线拟合，并计算出有关的药物动力学参数。
酶标法测定不同时间rhTNFR血药浓度，药物浓度-时间数据拟合处理皮下注射hTNFR II-IgG2/Fc药时曲线符合单室模型非血管给药的特征，0.5、3、18mg/kg三种剂量的主要的结果参数如表4所示。在同等剂量下，hTNFR II-IgG2/Fc比Enbrel有显著更高的代谢周期，其体内半衰期比Enbrel高25.64％。
表4
t1/2(ka)表示：吸收半衰期；
t1/2(ke)表示：消除半衰期；
Tpeak表示：达峰时间。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
【序列表】
<110>欣润(上海)生物药业有限公司
<120>一种TNFR-Fc融合蛋白及其用途
<130>085756
<160>33
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>235
<212>PRT
<213>智人(Homo Sapiens)
<400>1
Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser
1 5 10 15
Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys
20 25 30
Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr
35 40 45
Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu
50 55 60
Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser
65 70 75 80
Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys
85 90 95
Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys
100 105 110
Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala
115 120 125
Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro
130 135 140
Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His
145 150 155 160
Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly Asn Ala Ser Met Asp Ala
165 170 175
Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val
180 185 190
His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr
195 200 205
Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly
210 215 220
Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly Asp
225 230 235
<210>2
<211>228
<212>PRT
<213>智人(Homo Sapiens)
<400>2
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
65 70 75 80
Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Pro Gly Lys
225
<210>3
<211>1392
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>多核苷酸
<400>3
ttgcccgccc aggtggcatt tacaccctac gccccggagc ccgggagcac atgccggctc 60
agagaatact atgaccagac agctcagatg tgctgcagca aatgctcgcc gggccaacat 120
gcaaaagtct tctgtaccaa gacctcggac accgtgtgtg actcctgtga ggacagcaca 180
tacacccagc tctggaactg ggttcccgag tgcttgagct gtggctcccg ctgtagctct 240
gaccaggtgg aaactcaagc ctgcactcgg gaacagaacc gcatctgcac ctgcaggccc 300
ggctggtact gcgcgctgag caagcaggag gggtgccggc tgtgcgcgcc gctgcgcaag 360
tgccgcccgg gcttcggcgt ggccagacca ggaactgaaa catcagacgt ggtgtgcaag 420
ccctgtgccc cggggacgtt ctccaacacg acttcatcca cggatatttg caggccccac 480
cagatctgta acgtggtggc catccctggg aatgcaagca tggatgcagt ctgcacgtcc 540
acgtccccca cccggagtat ggccccaggg gcagtacact taccccagcc agtgtccaca 600
cgatcccaac acacgcagcc aactccagaa cccagcactg ctccaagcac ctccttcctg 660
ctcccaatgg gccccagccc cccagctgaa gggagcactg gcgacgagcg caaatgttgt 720
gtcgagtgcc caccgtgccc agcaccacct gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc 780
ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg 840
gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900
cataatgcca agacaaagcc acgggaggag cagttcaaca gcacgttccg tgtggtcagc 960
gtcctcaccg tcgtgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020
aacaaaggcc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg gcagccccga 1080
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1140
ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200
gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccatgc tggactccga cggctccttc 1260
ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320
tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380
ccgggtaaat ga 1392
<210>4
<211>373
<212>PRT
<213>仓鼠(Cricetidae)
<400>4
Met Ala Thr Ser Ala Ser Ser His Leu Asn Lys Asn Ile Lys Gln Met
1 5 10 15
Tyr Leu Cys Leu Pro Gln Gly Glu Lys Val Gln Ala Met Tyr Ile Trp
20 25 30
Val Asp Gly Thr Gly Glu Gly Leu Arg Cys Lys Thr Arg Thr Leu Asp
35 40 45
Cys Glu Pro Lys Cys Val Glu Glu Leu Pro Glu Trp Asn Phe Asp Gly
50 55 60
Ser Ser Thr Phe Gln Ser Glu Gly Ser Asn Ser Asp Met Tyr Leu Ser
65 70 75 80
Pro Val Ala Met Phe Arg Asp Pro Phe Arg Arg Asp Pro Asn Lys Leu
85 90 95
Val Phe Cys Glu Val Phe Lys Tyr Asn Arg Lys Pro Ala Glu Thr Asn
100 105 110
Leu Arg His Ser Cys Lys Arg Ile Met Asp Met Val Ser Asn Gln His
115 120 125
Pro Trp Phe Gly Met Glu Gln Glu Tyr Thr Leu Met Gly Thr Asp Gly
130 135 140
His Pro Phe Gly Trp Pro Ser Asn Gly Phe Pro Gly Pro Gln Gly Pro
145 150 155 160
Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Ala Asp Lys Ala Tyr Gly Arg Asp Ile Val
165 170 175
Glu Ala His Tyr Arg Ala Cys Leu Tyr Ala Gly Val Lys Ile Thr Gly
180 185 190
Thr Asn Ala Glu Val Met Pro Ala Gln Trp Glu Phe Gln Ile Gly Pro
195 200 205
Cys Glu Gly Ile Arg Met Gly Asp His Leu Trp Val Ala Arg Phe Ile
210 215 220
Leu His Arg Val Cys Glu Asp Phe Gly Val Ile Ala Thr Phe Asp Pro
225 230 235 240
Lys Pro Ile Pro Gly Asn Trp Asn Gly Ala Gly Cys His Thr Asn Phe
245 250 255
Ser Thr Lys Ala Met Arg Glu Glu Asn Gly Leu Lys His Ile Glu Glu
260 265 270
Ala Ile Glu Lys Leu Ser Lys Arg His Arg Tyr His Ile Arg Ala Tyr
275 280 285
Asp Pro Lys Gly Gly Leu Asp Asn Ala Arg Gly Leu Thr Gly Phe His
290 295 300
Glu Thr Ser Asn Ile Asn Asp Phe Ser Ala Gly Val Ala Asn Arg Ser
305 310 315 320
Ala Ser Ile Arg Ile Pro Arg Thr Val Gly Gln Glu Lys Lys Gly Tyr
325 330 335
Phe Glu Asp Arg Arg Pro Ser Ala Asn Cys Asp Pro Phe Ala Val Thr
340 345 350
Glu Ala Ile Val Arg Thr Cys Leu Leu Asn Glu Thr Gly Asp Glu Pro
355 360 365
Phe Gln Tyr Lys Asn
370
<210>5
<211>1122
<212>DNA
<213>仓鼠(Cricetidae)
<400>5
atggccacct cagcaagttc ccacttgaac aaaaacatca agcaaatgta cttgtgcctg 60
ccccagggtg agaaagtcca agccatgtat atctgggttg atggtactgg agaaggactg 120
cgctgcaaaa cccgcaccct ggactgtgag cccaagtgtg tagaagagtt acctgagtgg 180
aattttgatg gctctagtac ctttcagtct gagggctcca acagtgacat gtatctcagc 240
cctgttgcca tgtttcggga ccccttccgc agagatccca acaagctggt gttctgtgaa 300
gttttcaagt acaaccggaa gcctgcagag accaatttaa ggcactcgtg taaacggata 360
atggacatgg tgagcaacca gcacccctgg tttggaatgg aacaggagta tactctgatg 420
ggaacagatg ggcacccttt tggttggcct tccaatggct ttcctgggcc ccaaggtccg 480
tattactgtg gtgtgggcgc agacaaagcc tatggcaggg atatcgtgga ggctcactac 540
cgcgcctgct tgtatgctgg ggtcaagatt acaggaacaa atgctgaggt catgcctgcc 600
cagtgggaat tccaaatagg accctgtgaa ggaatccgca tgggagatca tctctgggtg 660
gcccgtttca tcttgcatcg agtatgtgaa gactttgggg taatagcaac ctttgacccc 720
aagcccattc ctgggaactg gaatggtgca ggctgccata ccaactttag caccaaggcc 780
atgcgggagg agaatggtct gaagcacatc gaggaggcca tcgagaaact aagcaagcgg 840
caccggtacc acattcgagc ctacgatccc aaggggggcc tggacaatgc ccgtggtctg 900
actgggttcc acgaaacgtc caacatcaac gacttttctg ctggtgtcgc caatcgcagt 960
gccagcatcc gcattccccg gactgtcggc caggagaaga aaggttactt tgaagaccgc 1020
cgcccctctg ccaattgtga cccctttgca gtgacagaag ccatcgtccg cacatgcctt 1080
ctcaatgaga ctggcgacga gcccttccaa tacaaaaact aa 1122
<210>6
<211>70
<212>DNA
<213>寡核苷酸
<400>6
atggcgcccg tcgccgtctg ggccgcgctg gccgtcggac tggagctctg ggctgcggcg 60
cacgccttgc 70
<210>7
<211>70
<212>DNA
<213>寡核苷酸
<400>7
gccgcgtgcg gaacgggcgg gtccaccgta aatgtgggat gcggggcctc gggccctcgt 60
gtacggccga 70
<210>8
<211>70
<212>DNA
<213>寡核苷酸
<400>8
gagcacatgc cggctcagag aatactatga ccagacagct cagatgtgct gcagcaaatg 60
ctcgccgggc 70
<210>9
<211>70
<212>DNA
<213>寡核苷酸
<400>9
tttacgagcg gcccggttgt acgttttcag aagacatggt tctggagcct gtggcacaca 60
ctgaggacac 70
<210>10
<211>70
<212>DNA
<213>寡核苷酸
<400>10
tgtgtgactc ctgtgaggac agcacataca cccagctctg gaactgggtt cccgagtgct 60
tgagctgtgg 70
<210>11
<211>70
<212>DNA
<213>寡核苷酸
<400>11
cacgaactcg acaccgaggg cgacatcgag actggtccac ctttgagttc ggacgtgagc 60
ccttgtcttg 70
<210>12
<211>70
<212>DNA
<213>寡核苷酸
<400>12
actcgggaac agaaccgcat ctgcacctgc aggcccggct ggtactgcgc gctgagcaag 60
caggaggggt 70
<210>13
<211>70
<212>DNA
<213>寡核苷酸
<400>13
cgttcgtcct ccccacggcc gacacgcgcg gcgacgcgtt cacggcgggc ccgaagccgc 60
accggtctgg 70
<210>14
<211>70
<212>DNA
<213>寡核苷酸
<400>14
cggcgtggcc agaccaggaa ctgaaacatc agacgtggtg tgcaagccct gtgccccggg 60
gacgttctcc 70
<210>15
<211>70
<212>DNA
<213>寡核苷酸
<400>15
ggcccctgca agaggttgtg ctgaagtagg tgcctataaa cgtccggggt ggtctagaca 60
ttgcaccacc 70
<210>16
<211>70
<212>DNA
<213>寡核苷酸
<400>16
tctgtaacgt ggtggccatc cctgggaatg caagcatgga tgcagtctgc acgtccacgt 60
cccccacccg 70
<210>17
<211>70
<212>DNA
<213>寡核苷酸
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gtgcaggggg tgggcctcat accggggtcc ccgtcatgtg aatggggtcg gtcacaggtg 60
tgctagggtt 70
<210>18
<211>70
<212>DNA
<213>寡核苷酸
<400>18
tccacacgat cccaacacac gcagccaact ccagaaccca gcactgctcc aagcacctcc 60
ttcctgctcc 70
<210>19
<211>70
<212>DNA
<213>寡核苷酸
<400>19
ggaggaagga cgagggttac ccggggtcgg ggggtcgact tccctcgtga ccgctgctcg 60
cgtttacaac 70
<210>20
<211>70
<212>DNA
<213>寡核苷酸
<400>20
cgagcgcaaa tgttgtgtcg agtgcccacc gtgcccagca ccacctgtgg caggaccgtc 60
agtcttcctc 70
<210>21
<211>70
<212>DNA
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ggcagtcaga aggagaaggg gggttttggg ttcctgtggg agtactagag ggcctgggga 60
ctccagtgca 70
<210>22
<211>70
<212>DNA
<213>寡核苷酸
<400>22
cccctgaggt cacgtgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccccgag gtccagttca 60
actggtacgt 70
<210>23
<211>70
<212>DNA
<213>寡核苷酸
<400>23
caagttgacc atgcacctgc cgcacctcca cgtattacgg ttctgtttcg gtgccctcct 60
cgtcaagttg 70
<210>24
<211>70
<212>DNA
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<400>24
gaggagcagt tcaacagcac gttccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcgt gcaccaggac 60
tggctgaacg 70
<210>25
<211>70
<212>DNA
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<400>25
tcctgaccga cttgccgttc ctcatgttca cgttccagag gttgtttccg gagggtcggg 60
ggtagctctt 70
<210>26
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<212>DNA
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agcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta 60
caccctgccc 70
<210>27
<211>70
<212>DNA
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<400>27
cacatgtggg acgggggtag ggccctcctc tactggttct tggtccagtc ggactggacg 60
gaccagtttc 70
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<212>DNA
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cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc 60
agccggagaa 70
<210>29
<211>70
<212>DNA
<213>寡核苷酸
<400>29
acccgtcggc ctcttgttga tgttctggtg cggagggtac gacctgaggc tgccgaggaa 60
gaaggagatg 70
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<211>70
<212>DNA
<213>寡核苷酸
<400>30
tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 60
ttctcatgct 70
<210>31
<211>83
<212>DNA
<213>寡核苷酸
<400>31
tgcagaagag tacgaggcac tacgtactcc gagacgtgtt ggtgatgtgc gtcttctcgg 60
agagggacag aggcccattt act 83
<210>32
<211>29
<212>DNA
<213>引物
<400>32
atggcgcccg tcgccgtctg ggccgcgct 29
<210>33
<211>28
<212>DNA
<213>引物
<400>33
tcatttaccc ggagacaggg agaggctc 28