一种合成普兰林肽的方法.pdf

本发明公开了一种固相合成普兰林肽的方法，包括以下步骤：1)由Fmoc-Tyr(tBu)-OH和取代度为0.3-1.5mmol/g的氨基树脂，得到Fmoc-Tyr(tBu)-氨基树脂；2)将Fmoc-Tyr(tBu)-氨基树脂依肽序逐步偶联剩余的保护氨基酸；3)利用碘进行固相氧化使巯基成环；4)裂解普兰林肽-树脂得到普兰林肽粗肽；5)纯化得到普兰林肽。本发明工艺采用Fmoc固相合成策略，利用多种偶联剂体系和二肽片段偶联法，采用固相氧化，具有反应操作简单、成本低、且收率较高等特点，适合规模化生产。

1.  一种合成普兰林肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)用固相合成方法由Fmoc-Tyr(tBu)-OH和取代度为0.3-1.5mmol/g的氨基树脂，得到Fmoc-Tyr(tBu)-氨基树脂；
2)将Fmoc-Tyr(tBu)-氨基树脂依肽序逐步偶联剩余的保护氨基酸
3)使两个半胱氨酸巯基侧链保护基脱除，利用碘进行固相氧化；
4)裂解普兰林肽-树脂得到普兰林肽粗肽；
5)经过纯化得到普兰林肽；
其中，所述的步骤1)中氨基树脂为Rink Amide MBHA树脂，Sieber树脂，Rink Amide AM树脂，Rink Amide树脂或Rink Amide BHA树脂。

2.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤1)中氨基树脂的取代度为0.3-0.5mmol/g。

3.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)中采用氨基酸偶联体系进行逐步偶联，偶联体系为：DIC或DIEA中的一个或两个，与HOBT、HOAT、Cl-HOBT、HBTU、HATU、PyBOP或PyAOP中的任意一个或一个以上，组成偶联体系。

4.  如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的偶联体系为：HOBT、HOAT、Cl-HOBT中的任意一个或一个以上与DIC；或DIEA与HOBT、HOAT或Cl-HOBT中的任意一个或一个以上与HBTU、HATU、PyBOP或PyAOP中的任意一个或一个以上组成偶联体系。

5.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)合成C端第四位氨基酸、C端第五位氨基酸的偶联采用Fmoc-Gly-Ser(ΨMe，Me pro)-OH。

6.  如权利要求1、2、3或5任意一项所述的方法，其特征在于，所述步骤3)碘用量为普兰林肽摩尔比的5-20倍，氧化时间为4至16小时。

7.  如权利要求1、2、3或5任意一项所述的方法，其特征在于，所述步骤4)裂解普兰林肽-树脂采用的裂解试剂是：TFA/苯甲硫醚/乙二硫醇/苯甲醚体积比为90/5/3/2。

8.  如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤4)裂解普兰林肽-树脂采用的裂解试剂是：TFA/苯甲硫醚/乙二硫醇/苯甲醚，体积比为90/5/3/2。

9.  如权利要求1、2、3或5任意一项所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中的裂解液用量是肽树脂重量的10-12倍，沉降乙醚用量是裂解液体积的10-12倍。

10.  如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中的裂解液用量是肽树脂重量的10-12倍，沉降乙醚用量是裂解液体积的10-12倍。

一种合成普兰林肽的方法
技术领域
本发明涉及一种合成多肽的合成方法，尤其涉及降血糖多肽药物的固相合成方法。
背景技术
最先，人们从胰岛的β细胞分泌物中发现了一种能减缓食物在小肠吸收速度的多肽，即由37个氨基酸残基构成的多肽激素(amylin)。该多肽激素通过抑制高血糖素来减少肝糖的产生，减少患者食欲，协助机体调节血糖水准，但该多肽激素在溶液中并不稳定，易水解，粘稠性大，易凝结的特性，不适合做成药物用于治疗。经人工筛选，进行结构改造，合成了一种稳定的类似物，上述多肽激素与合成的类似物之间的差异在于前者第25，28和29位上氨基酸被脯氨酸所取代，这种合成的类似物就是普兰林肽。
普兰林肽用于辅助治疗I型及II型糖尿病，主要用于单用胰岛素，以及联合应用胰岛素和磺脲类药物无效的患者。
普兰林肽的化学分子式为：

发明内容
本发明提出了一条较适当的路线，操作方便、时间较短，收率较高、适合规模化生产。
为实现上述目的，本发明提供一种合成普兰林肽的方法，包括以下步骤：
1)用固相合成方法由Fmoc-Tyr(tBu)-OH和取代度为0.3-1.5mmol/g的氨基树脂，得到Fmoc-Tyr(tBu)-氨基树脂；
2)将Fmoc-Tyr(tBu)-氨基树脂依肽序逐步偶联剩余的保护氨基酸；
3)使两个半胱氨酸巯基侧链保护基脱除，利用碘进行固相氧化；
4)裂解普兰林肽-树脂得到普兰林肽粗肽；
5)经过纯化得到普兰林肽。
所述的步骤1)中Fmoc-Tyr(tBu)-氨基树脂取代值范围在0.3-1.5mmol/g，优选为0.3-0.5mmol/g。固相合成方法特指多肽的固相合成法。氨基树脂一般为Rink Amide MBHA树脂，Sieber树脂，Rink AmideAM树脂，Rink Amide树脂或Rink Amide BHA树脂，优选Rink Amide树脂。
所述的步骤2)中“保护氨基酸”是指C端采用Fmoc保护的氨基酸，有些氨基酸如，Lys，Cys，Asn，Thr，Gln，Arg，His，Ser，Tyr也需要其它保护基保护，详细参见下文的“本发明合成方法示意”。其中，氨基酸偶联体系为固相偶联体系：DIC或DIEA中的一个或两个，与HOBT、HOAT、Cl-HOBT、HBTU、HATU、PyBOP或PyAOP中的任意一个或一个以上，组成偶联体系。例如：DIC+HOAT，DIEA+HBTU，DIEA+HOAT+HBTU或DIEA+HOBT+PyBOP等。
偶联体系优选的组合为：HOBT、HOAT、Cl-HOBT中的任意一个或一个以上与DIC组合；例如：HOBT+DIC，Cl-HOBT+DIC或者HOBT+Cl-HOBT+DIC；
或偶联体系优选的组合为：DIEA与HOBT、HOAT或Cl-HOBT中的任意一个或一个以上与HBTU、HATU、PyBOP或PyAOP中的任意一个或一个以上组成多组分偶联体系。例如：DIEA+HOBT+HBTU，DIEA+HOAT+HATU，DIEA+HOBT+HOAT+PyAOP，DIEA+HOBT+HATU+PyBOP，DIEA+Cl-HOBT+PyBOP或DIEA+HOBT+HOAT+HBTU+PyAOP。其中所述的“多组分偶联剂”可以是3组分偶联剂、4组分偶联剂、5组分偶联剂、6组分偶联剂、7组分偶联剂或8组分偶联剂。
实验发现，采用本发明的多种偶联剂体系，能够显著提高反应效率。
进一步说步骤2)合成C端第四位氨基酸、C端第五位氨基酸的偶联采用Fmoc-Gly-Ser(ΨMe，Me pro)-OH。选用Fmoc-Gly-Ser(ΨMe，Mepro)-OH效果好于单独选用Fmoc-Ser(tBu)-OH和Fmoc-Gly-OH。Fmoc-Gly-Ser(ΨMe，Me pro)-OH为受Fmoc保护2肽片段。其中Fmoc-Gly-Ser(ΨMe，Me pro)即Fmoc-Gly-Ser(psiMe Me pro)-OH，默克公司上海办事处品牌商标名为：Novabiochem，产品货号：05-20-1127-1GM。
实验发现，受Fmoc保护二肽片段溶解性好，易于偶联，与单独选用Fmoc-Ser(tBu)-OH和Fmoc-Gly-OH相比，反应会更加完全，且得到的副产物少；有利于纯化，并能大大提高收率；
所述的步骤3)利用碘进行固相氧化，目的是使巯基成环。碘用量范围是普兰林肽摩尔比的5-20倍，优选15倍；氧化时间范围是4-16小时，优选6小时。固相氧化法反应时间较短，方便操作，容易控制，对设备要求低，成本低，适合规模化生产；
所述的步骤4)裂解试剂是：切割试剂是三氟乙酸(TFA)，捕获试剂是水、三异丙基硅烷、三乙基硅烷、苯甲硫醚、苯甲醚和乙二硫醇等试剂的一种或几种的组合。优选TFA/苯甲硫醚/乙二硫醇/苯甲醚体积比为90/5/3/2，室温下反应2-3小时，其中乙二硫醇是指1，2-乙二硫醇。裂解液用量是肽树脂重量的10-12倍，沉降乙醚用量是裂解液体积的10-12倍。
步骤5)经过反相高效液相纯化得到普兰林肽。
本发明工艺采用Fmoc固相策略合成长肽，中间采用二肽片段而非通常的逐个偶联法，同时利用固相氧化，具有反应操作简单、成本低、且收率较高等特点，反应的总收率可达20％，适合规模化生产，具有可观的经济实用价值，同时在多肽药物设计合成领域具有广泛的应用前景。
本发明合成方法示意如下：

其中：
Fmoc-Tyr(R1)-OH代表：N-芴甲氧羰基-侧链R1保护酪氨酸
Fmoc-Thr(R1)-OH代表：N-芴甲氧羰基-侧链R1保护苏氨酸
Fmoc-Asn(R2)-OH代表：N-芴甲氧羰基-侧链R2保护天冬酰胺
Fmoc-Ser(R2)-OH代表：N-芴甲氧羰基-侧链R2保护丝氨酸
Fmoc-Gly-OH代表：N-芴甲氧羰基甘氨酸
Fmoc-Val-OH代表：N-芴甲氧羰基缬氨酸
Fmoc-Pro-OH代表：N-芴甲氧羰基脯氨酸
Fmoc-Leu-OH代表：N-芴甲氧羰基亮氨酸
Fmoc-Ile-OH代表：N-芴甲氧羰基异亮氨酸
Fmoc-Phe-OH代表：N-芴甲氧羰基苯丙氨酸
Fmoc-Ser(R₁)-OH代表：N-芴甲氧羰基-侧链R₁保护丝氨酸
Fmoc-His(R₂)-OH代表：N-芴甲氧羰基-侧链R₂保护组氨酸
Fmoc-Ala-OH代表：N-芴甲氧羰基丙氨酸
Fmoc-Arg(R₃)-OH代表：N-芴甲氧羰基-侧链R₄保护精氨酸
Fmoc-Gln(R₂)-OH代表：N-芴甲氧羰基-侧链R₂保护谷氨酰胺
Fmoc-Cys(R₂)-OH代表：N-芴甲氧羰基-侧链R₂保护半胱氨酸
Boc-Lys(R₄)-OH代表：N-叔丁氧羰基-侧链R₄保护赖氨酸
DICPDI代表：二异丙基碳二亚胺
PyBOP代表：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷
HOBt代表：1-羟基苯并三氮唑
TFA代表：三氟乙酸
DIPEA代表：二异丙基乙胺，即DIEA
DCM代表：二氯甲烷
DMF代表：N，N’-二甲基甲酰胺
DBLK代表：哌啶的DMF溶液
R1代表：tBu(叔丁基)；
R₂代表：Trt(三苯基甲基)；
R₃代表：Pbf(2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基)；
R₄代表：Boc(叔丁氧羰基)；
氨基树脂高分子载体为Rink Amide树脂、Rink Amide-MBHA树脂、Rink Amide-BHA树脂、Rink Amide-AM树脂或Sieber树脂。

RinkAmide-MBHA树脂

RinkAmide-BHA树脂

RinkAmide-AM树脂

具体实施方式
实施例1、Fmoc-Tyr(tBu)-Rink Amide Resin的合成
在500ml的反应柱中加入30克Rink Amide Resin(Sub＝0.8mmol/g)，加入DMF洗涤两次，每次5分钟，再用DMF溶胀30分钟。用20％DBLK脱除Rink Amide Resin的Fmoc保护基，脱除完毕用DMF洗4遍，DCM洗两遍，并用茚三酮检测法进行检测。称取Fmoc-Tyr(tBu)-OH(2.89g，6.3mmol)，HOBt(1.02g，7.56mmol)，HBTU(2.37g，6.24mmol)，全部混合后，加入DMF(30ml)、DCM(30ml)，冰浴下加入DIEA(2.14ml、12.6mmol)搅拌5min，活化完后加入反应柱，开始反应。2小时后结束反应，洗涤完毕，取样检测替代度，量取乙酸酐(16.2ml、180mmol)、吡啶(13.8ml、180mmol)加入反应柱中进行封闭，封闭两小时，茚三酮检测法检测，树脂无色，可停止封闭，再进行洗涤，取样测得取代值为0.4mmol/g。
利用同样的策略分别可以得到Fmoc-Tyr(tBu)-Sieber树脂、Fmoc-Tyr(tBu)--Rink Amide BHA树脂、Fmoc-Tyr(tBu)--Rink Amide AM树脂等氨基树脂；
实施例2、Fmoc-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Rink Amide树脂及AA1-35-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Rink Amide树脂的合成。其中AA1-35-Thr(tBu)-Tyr(tBu)是指全保护线型普兰林肽。
将Fmoc-Tyr(tBu)-Rink Amide MBHA树脂用DMF洗涤干净后，用20％DBLK脱除Fmoc保护基，脱除完毕后用DMF洗四遍，DCM洗两遍，并用茚三酮检测法进行检测。称取Fmoc-Thr(tBu)-OH(7.15g，18mmol)，HOBt(2.91g，21.6mmol)，全部混合后，加入DMF(30ml)、DCM(30ml)，冰浴下加入DIC(4.2ml、27mmol)，活化完后加入反应柱，开始反应。反应2小时，用茚三酮检测法检测，树脂透明，则再继续反应0.5小时后结束反应，用DMF洗三遍。重复上述步骤依肽序偶联下一个保护氨基酸。得到全保护线型普兰林肽-Rink Amide MBHA树脂。
利用同样的策略分别可以得到全保护线型普兰林肽--Rink Amide树脂、全保护线型普兰林肽-Rink Amide BHA树脂、全保护线型普兰林肽-Rink Amide AM树脂及全保护线型普兰林肽-Sieber树脂。
实施例3、普兰林肽的固相氧化
称取碘(15.24g、60mmol)，溶解在DMF(100ml)中，溶解完毕后加入反应柱，开始氧化反应。氧化4小时结束反应。DMF洗涤，每次100ml，洗至树脂恢复浅黄色，再用DCM洗涤100ml，洗两次。甲醇收缩树脂，得到全保护普兰林肽-氨基树脂。
实施例4、普兰林肽的固相氧化
称取碘(7.6g、30mmol)，溶解在DMF(100ml)中，溶解完毕后加入反应柱，开始氧化反应。氧化6小时结束反应。DMF洗涤，每次100ml，洗至树脂恢复浅黄色，再用DCM洗涤100ml，洗两次。甲醇收缩树脂，得到全保护普兰林肽-氨基树脂
实施例5、称取碘(22.84g，90mmol)溶解在DMF(100ml)中，溶解完毕后加入反应柱，开始氧化反应。氧化16小时结束反应。DMF洗涤，每次100ml，洗至树脂恢复浅黄色，再用DCM洗涤100ml，洗两次。甲醇收缩树脂，得到全保护普兰林肽-氨基树脂
实施例6、普兰林肽的裂解
称取50g全保护普兰林肽-氨基树脂至1L圆底烧瓶中。加入配制好的裂解液(三氟乙酸∶苯甲硫醚∶乙二硫醇∶苯甲醚按体积比90∶5∶3∶2)，冰浴、搅拌2h。反应结束后，分离树脂与裂解液，将裂解液倒入准备好的冷冻乙醚中，用离心机分离粗肽，冷冻乙醚洗3遍，得到普兰林肽粗肽。粗肽经过纯化，得到普兰林肽精肽。纯度＞97％，总收率20％。
综上所述，本发明采用Fmoc固相策略合成普兰林肽，利用二肽片段代替常用的氨基酸逐个偶联和固相氧化的方法，反应操作简单、后处理容易、收率高、成本低适于规模化生产等特点，具有可观的经济实用价值和广泛的应用前景。