抗坏血酸的新用途.pdf

摘要
申请专利号：	CN200910189144.5	申请日：	2009.12.15
公开号：	CN101744808A	公开日：	2010.06.23
当前法律状态：	撤回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):A61K 31/375公开日:20100623\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):A61K 31/375申请日:20091215\|\|\|公开
IPC分类号：	A61K31/375; A61P39/06; A23L1/29; C12N5/0735(2010.01)I	主分类号：	A61K31/375
申请人：	中国科学院广州生物医药与健康研究院
发明人：	裴端卿; 米盖尔.埃斯特班; 王涛; 秦宝明; 杨佳银
地址：	510663 广东省广州市科学城国际企业孵化器A区3楼
优先权：
专利代理机构：	深圳市博锐专利事务所 44275	代理人：	张明
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内容摘要

本发明涉及抗坏血酸具有通过细胞重编程机制抗衰老的新用途。为抗坏血酸应用于抗衰老提供了直接有力的实验依据和理论基础，既有很强的科学性和创新性，又有很高的开发应用价值。

权利要求书

1.  抗坏血酸的新用途，其特征在于抗坏血酸在制备诱导体细胞重编程的药物中的应用。

2.  抗坏血酸的新用途，其特征在于抗坏血酸在制备培养胚胎干细胞的培养基中的应用。

3.  抗坏血酸的新用途，其特征在于抗坏血酸在制备抗衰老药物/保健品中的应用。

4.  根据权利要求3所述的抗坏血酸的新用途，其特征在于所述抗衰老的机制为细胞重编程机制。

5.  一种诱导体细胞重编程的组合物，其特征在于：所述组合物含有抗坏血酸。

6.  一种诱导体细胞重编程的胚胎干细胞培养基，其特征在于：所述培养基的主要成分为血清，所述培养基含有抗坏血酸。

7.  一种诱导体细胞重编程的方法，包括以下步骤：
1)将一个或多个干细胞多能性因子导入体细胞；
2)将步骤1)得到的导入了干细胞多能性因子的体细胞至于胚胎干细胞培养基中培养，将所述体细胞诱导重编程为iPS细胞，所述胚胎干细胞培养基中含有抗坏血酸。

说明书

抗坏血酸的新用途
技术领域
本发明涉及抗坏血酸的用途，尤其涉及抗坏血酸通过细胞重编程机制抗衰老的新用途。
背景技术
抗坏血酸，又名维生素C，是一种水溶性维生素，主要功能有：1、促进骨胶原的生物合成，利于组织创伤口的更快愈合；2、促进氨基酸中酪氨酸和色氨酸的代谢，延长肌体寿命；3、改善铁、钙和叶酸的利用；4、改善脂肪和类脂特别是胆固醇的代谢，预防心血管病；5、促进牙齿和骨骼的生长，防止牙床出血，防止关节痛、腰腿痛；6、增强肌体对外界环境的抗应激能力和免疫力；7、水溶性强抗氧化剂，主要作用在体内水溶液中；8、坚固结缔组织；9、促进胶原蛋白的合成，防止牙龈出血。至今未见抗坏血酸具有通过细胞重编程机制抗衰老作用的报道。
体细胞重编程(somatic reprogramming)指的是分化的体细胞在特定的条件下被逆转后恢复到全能性状态，或者形成胚胎干细胞系，或者进一步发育成一个新的个体的过程。诱导体细胞重编程的方法有许多，如核移植、细胞融合、细胞提取物诱导、化学诱导以及分子调控诱导等。但到目前为止，唯一能诱导体细胞产生有功能个体的重编程的方法只有核移植，其他的方法只能在细胞、分子或生化水平上产生诱导。然而所有这些诱导体细胞重编程的技术都很不成熟，效率很低，体细胞重编程的机制还不清楚。虽然如此，但是体细胞重编程却有着非常广泛的应用前景，不仅在基础理论研究中，而且在应用研究中，例如家畜繁殖、动物保护以及人口健康等领域都有着重要的作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗坏血酸的新用途，具体为抗坏血酸在制备诱导体细胞重编程的药物中的应用。
抗坏血酸的新用途，具体为抗坏血酸在制备培养胚胎干细胞的培养基中的应用。
抗坏血酸的新用途，具体为抗坏血酸在制备抗衰老药物/保健品中的应用。
所述抗衰老的机制为细胞重编程机制。
本发明还提供了一种诱导体细胞重编程的组合物，所述组合物含有抗坏血酸。
一种诱导体细胞重编程的胚胎干细胞培养基，所述培养基的主要成分为血清，所述培养基含有抗坏血酸。
一种诱导体细胞重编程的方法，包括以下步骤：
1)将一个或多个干细胞多能性因子导入体细胞；
2)将步骤1)得到的导入了干细胞多能性因子的体细胞至于胚胎干细胞培养基中培养，将所述体细胞诱导重编程为iPS细胞，所述胚胎干细胞培养基中含有抗坏血酸。
一种利用抗坏血酸或其衍生物作为主要添加成分用于产生iPS细胞的具体方法，包括以下步骤：
(1)将一个或多个干细胞多能性因子导入体细胞；
(2)用本发明提到的添加抗坏血酸或其衍生物的胚胎干细胞培养基，培养(1)中经导入的体细胞，将体细胞诱导重编程为iPS细胞；
(3)利用内源报告基因激活表达或形态观察初步确定(2)中形成克隆的状态；
(4)挑出符合(3)条件的单克隆，即内源报告基因激活或克隆呈现胚胎干细胞在相同培养基中生长的形态；
(5)利用含有抗坏血酸的胚胎干细胞培养基培养(4)中的单克隆细胞；
(6)利用多种检测手段，鉴定(5)中单克隆细胞的状态是否达到类似胚胎干细胞的状态，主要包括定量PCR分析干细胞特异基因表达，分析体内自发分化形成畸胎瘤的能力，对于非人iPS细胞，检测嵌合能力，是否有生殖细胞转移(germ line transmission)。
本发明的抗坏血酸一般以药物组合物的形式使用，这种组合物含有治疗有效剂量的作为活性成分的抗坏血酸和可药用辅料。含有抗坏血酸的药物组合物可通过口服、注射或粘膜给药，可以制成片剂、胶囊、粉剂、颗粒、锭剂，或口服液等剂型供临床应用。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。含有抗坏血酸的营养品可以口服。
本发明提供了抗坏血酸具有协助细胞重编程的作用，具体为使已经分化的细胞重新回到原始的多能干细胞状态，并且具有维持这种状态的功能；这是抗坏血酸具有抗衰老的主要原因。
本发明提供了抗坏血酸具有抗衰老功能，从而为抗坏血酸应用于通过细胞重编程机制抗衰老提供了直接有力的实验依据和理论基础，既有很强的科学性和创新性，又有很高的开发应用价值。
附图说明
图1VC显著提高OG2小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的诱导重编程效率。在以血清为基础的小鼠iPS实验中，与其他抗氧化剂(维生素B1，VB1；N-乙酰半胱氨酸，NAC；还原型谷胱甘肽，Gmee；亚硒酸钠，Sel)相比，VC显著提高经典四因子SKOM(Sox2，Oct4，Klf4和cMyc)和三因子SKO(Sox2，Oct4和Klf4)的iPS效率(iPS效率以流式细胞仪分别检测四因子第9天以及三因子第16天转基因Oct4启动子驱动的GFP基因表达效率)。
图2用添加有VC的血清胚胎干细胞培养基制备的iPS克隆具有与胚胎干细胞相似的多能性。(A)用mES+VC培养基制备的不同小鼠iPS克隆细胞内源胚胎干细胞标记基因的表达用实时定量PCR检测结果与小鼠胚胎干细胞系R1基本一致；(B)不同小鼠iPS克隆细胞胚胎干细胞标记基因Nanog启动子甲基化水平检测结果与R1一致，显著低于iPS初始细胞MEF(黑色实心圈代表该位点甲基化，空心圈代表去甲基化)；(C)这些iPS克隆细胞具有多能性，分别体现在在裸鼠畸胎瘤实验中能够形成内(腺体)，中(骨骼)，外胚层(皮肤)细胞，以及形成嵌合小鼠(蓝色胚胎来自OG2小鼠的lacZ转基因染色)。
图3其他抗坏血酸衍生物对小鼠iPS的影响。与对照相比，抗坏血酸(LAA)，稳定型衍生物抗坏血酸磷酸酯(ASCP)均能显著提高四因子和三因子iPS效率，但是氧化型抗坏血酸(DHA)则对iPS无显著影响。
图4VC促进iPS前体细胞(pre-iPS cells)向完全iPS细胞(full-iPS cells)的转变。(A)MEF iPS前体细胞C2，C4和C5用含有VC的培养基处理9代后GFP阳性率显著提高，而对照组不加VC的GFP阳性率持续很低；(B)C2和C4加VC处理后的克隆形态和GFP荧光情况比较相同代数的未处理对照细胞更加接近mES细胞。
图5VC有利于iPS细胞维持自我更新状态。(A)iPS细胞在含VC培养基中能更好的维持Oct4-GFP的表达；(B)iPS细胞在含VC培养基中能更好维持胚胎干细胞形态和GFP克隆比例。
图6用添加有VC的培养基制备的人iPS细胞形态与人ESC没有明显区别。(A)人成体细胞形态；(B，C)以VC为主要添加剂制备的人iPS克隆AP染色及形态图；(D)人iPS克隆在无滋养层培养的形态图。
图7用添加有VC的培养基制备的iPS的效率比较其他经典或已报道的培养基显著提高。在图示中的三次独立实验中，以AP染色阳性克隆数为指标(纵坐标)衡量不同培养基，包括单纯血清(DFBS)，血清加以VC为主的抗氧化剂(DFBS+A)，单纯血清替代物(KSR)，以及血清加丙戊酸(VPA)，结果显示，DFBS+A得到的AP阳性iPS效率显著高于其他培养基，值得注意的是，该组合甚至高于目前国际已报道的显著提高人iPS效率的VPA。
图8含有VC的培养基用于细胞因子对小鼠iPS效率影响的筛选。相比经典的mES培养基，添加以VC为主的抗氧化剂(A)培养基更有利于细胞因子对iPS影响的筛选。具体体现在在mES中没有显著差异的bFGF在mES+A中显著提高iPS效率。
具体实施方式
下列实施例举例了发明人的标准实验室实践，用于示例本发明的模式，而不应将本发明理解为限定于这些实施例的范围。这些实施例。根据本文公开和本领域技术人员的普遍水平，技术人员将理解下列仅用于示例，可以在不超过本发明的范围内进行各种变动、修饰和改造。其中所涉及的技术，除非特别说明，均是本领域技术人员熟知的分子生物学、细胞生物学、生物化学等各个领域的常规技术。
本发明中所用技术概述：
除了特别说明，本文中提及的各种物质均来自英杰生命科学公司(Invitrogen)
包装反转录病毒以及诱导iPS细胞
从Addgene公司购置包含小鼠Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的DNA的反转录病毒载体(pMXs)。按照现有技术进行病毒的产生和感染(Qin，D.，Li，W.，Zhang，J.& Pei，D.Direct generation of ES-like cellsfrom unmodified mouse embryonic fibroblasts byOct4/Sox2/Myc/Klf4.Cell research 17，959-962(2007)；Qin，D.等人Mouse meningiocytes express Sox2 and yield high efficiency ofchimeras after nuclear reprogramming with exogenous factors.JBiol Chem 283，33730-33735(2008).)简言之，利用常规方法将这些质粒转染到PlatE细胞中。48小时后收集病毒上清液并且过滤，以感染MEF，其中补充有1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物。在第二天重复相同的步骤。添加病毒上清液的当天被定义为第0天(D0)。将病毒感染后(即已经转染了Sox2、Klf4、Oct4和/或c-Myc，下文中，如无特殊说明，3因子感染代表用Sox2、Klf4和Oct4感染，4因子感染代表用Sox2、Klf4、Oct4和c-Myc感染)的成纤维细胞培养在mES培养基中，在感染后13-15天(4因子感染实验)或23-25(3因子感染实验)挑取iPS集落，这是基于Oct-GFP(即在荧光显微镜下发射荧光的集落)和典型的ES形态来挑取的。随后如ES细胞样延展和保持挑取的集落(如上所述Qin，D.，Li，W.，Zhang，J.& Pei，D，2007；以及Qin，D.等人，2008)。
重编程效率的定量
用于定量重编程效率的主要方法有：1，直接利用流式细胞仪对D9-10天的四因子SKOM或D15-16天的三因子iPS测定Oct3/4-GFP阳性细胞比例；2，在感染原盘或孔中(未分到滋养层细胞上)计数Oct3/4-GFP阳性克隆数；3，将感染后的细胞以确定细胞数分到滋养层细胞上，培养一定时间后，AP染色，计数AP阳性克隆和Oct3/4-GFP阳性克隆。
iPS细胞的表征：
进行碱性磷酸酶和免疫荧光染色(如上所述Qin，D.，Li，W.，Zhang，J.& Pei，D，2007；以及Qin，D.等人，2008)。使用下列一抗：小鼠抗-Oct4(Santa Cruz公司)、小鼠抗-SSEA1(Abcam公司)，小鼠抗-Nanog(Abcam公司)。
实施例1 利用VC提高小鼠体细胞重编程效率。
a，将四因子(SKOM)或三因子(SKO)的病毒以等体积混合(每种病毒1ml)后感染到12孔板的一孔中共计2.0万个OG2小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中，在37度5％CO2培养在mES培养基中。从两次感染结束后D2天起，添加VC或其他化合物(VC，50ug/ml；Vb1，9ug/ml；NAC，1mM；GMEE，1.5ug/ml；Selenite，20nM；抗氧化剂混合物Antiox，即VC+Vb1+GMEE+Selenite)；对四因子，D9-10天消化，对三因子，D15-16天消化，流式检测GFP阳性细胞比例。
如图1所示，与对照组相比，添加VC或含有VC的多种抗氧化剂均显著提高SKOM和SKO的iPS效率。
b，如上所述，将三因子SKO-iPS细胞分到滋养层细胞上，继续用含VC或含VC的抗氧化剂的mES培养基(Vc，50ug/ml)培养，10-14天后挑出GFP阳性的mESC形态的克隆，这些细胞经过去除滋养层细胞，使用Trizol(Takara公司)试剂，按照制造商说明提取总RNA。用M-MLV(Takara公司)试剂盒进行逆转录，并使用Premix Ex Taq试剂盒(Takara公司)，ABI 7300荧光定量PCR仪(ABI公司)进行Real-TimePCR。所有上述PCR条件均使用常规PCR条件，按照制造商说明进行。其中鉴定iPS各标志物使用引物列表如表1所示。
表1RT-PCR所用引物

SEQ ID NO：引物名称(前：因子名称) F：正向；R反向引物序列 SEQ ID NO：11 pMX-F GACGGCATCGCAGCTTGGATACAC SEQ ID NO：12 pMX-R TTATCGTCGACCACTGTGCTG SEQ ID NO：13 c-Myc-S1093 CAGAGGAGGAACGAGCTGAAGCGC SEQ ID NO：14 Sox2-S768 GGTTACCTCTTCCTCCCACTCCAG

SEQ ID NO：引物名称(前：因子名称) F：正向；R反向引物序列 SEQ ID NO：15 Klf4-S1236 GCGAACTCACACAGGCGAGAAACC SEQ ID NO：16 Oct3/4-AS210 TGCGGGCGGACATGGGGAATCC

如图2A所示，使用本申请的方法获得的iPS表达较高水平与mESC细胞R1一致的多能性因子Nanog和Rex1，而这些因子在原始MEF细胞中均没有可检测到的表达。
c，根据制造商的说明，使用CpGenome修饰试剂盒(Chemicon公司)进行亚硫酸氢盐处理。处理过程中使用的Nanog启动子的PCR引物见下表2。将上述PCR产物克隆到pMD18-T(Takara公司)载体中，随机选择克隆用于对每个基因测序，所述测序用M13正向和M13反向引物。
表2：PCR所用引物
SEQ ID NO：引物名称F：正向； R反向引物序列 SEQ ID NO：19 mNanogU AATGTTTATGGTGGATTTTGTAGGT SEQ ID NO：20 mNanogL CCCACACTCATATCAATATAATAAC

图2B中显示iPS克隆与R1中内源性Nanog启动子区域没有甲基化，而MEF细胞中，上述基因组区域均呈现相对高度甲基化。也就是说，经过诱导重编程的iPS细胞中，内源性多能性干细胞因子Nanog的启动子区去甲基化，从而其表达得以被激活。
d，将消化重悬在PBS中的2百万iPS克隆细胞注射到裸鼠腋下，经过2-3周，解剖裸鼠取出肿瘤，固定，包埋，切片，HE染色观察畸胎瘤分化情况。如图2C所示，iPS细胞成功分化为三个胚层的不同组织细胞，如外胚层的皮肤，中胚层的骨骼，以及内胚层的腺体。
e，将消化重悬在培养基中的iPS细胞注射到ICR小鼠囊胚中的内细胞团中进行嵌合实验，在E12-16天解剖母鼠，对胚胎进行beta-半乳糖酐酶染色，结果如图2C显示，iPS细胞成功嵌合到皮肤组织中。
实施例2  利用VC促进小鼠iPS前体细胞向完全iPS细胞的转化。
用经典的mES培养基诱导产生的多数四因子SKOM-iPS克隆没有GFP表达，初步显示这些细胞没有最终达到完全iPS细胞的状态。我们将这些克隆挑出并连续传代，如图4所示，经过5-9代VC处理，约3/4的克隆出现明显的GFP表达。这些克隆的形态也明显接近mESC细胞，而这些克隆在经典mES培养基中连续传代导致其丧失mESC形态。因此，VC对iPS的促进作用至少一部分体现在将多数前体iPS细胞转化为完全iPS细胞。
实施例3  利用VC维持小鼠iPS细胞稳定传代。
与实施例2类似，我们挑取GFP阳性的iPS克隆，体外以经典mES培养基以及加VC的培养基分别连续传代，经过约5代，如图5所示，在经典mES培养基中，iPS克隆荧光显著丧失，同时克隆也丧失mESC形态；而加有VC的培养基可以相对稳定的维持iPS的GFP荧光表达以及细胞的mESC形态。这说明VC能够维持小鼠iPS细胞的mESC状态。
实施例4  VC提高人iPS效率。
a，细胞的制备和培养
由外科手术废弃物中分离人体组织，培养得到原代细胞，用高葡萄糖DMEM(Dulbcco′s Modifed Eagle Medium)培养基(4.5g/L的葡萄糖，HyClone公司)培养所得到的细胞，培养基中包含10％胎牛血清(HyClone公司)、非必需氨基酸(NEAA，1％)、2mM L-谷氨酰胺、青霉素(100u/ml)和链霉素(100μg/ml)。
在多能干细胞诱导过程中使用DFBS(defined-FBS)培养基和DFBS+A(以VC为主的抗氧化剂组合混合物，详情如下所述)培养基。所述的DFBS+A培养基包含高葡萄糖DMEM培养基，20％特级胎牛血清(DefinedFBS，Hyclone)，4ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、青霉素/链霉素、1％L-谷氨酰胺、0.1mM β-巯基乙醇和1％非必需氨基酸(NEAA)；所述的DFBS+A培养基为在DFBS基础上添加如下三种组分，50ug/ml VC，9ug/ml维生素(VB1)，10uM还原型谷胱甘肽。
将人胚胎干细胞(hES)和用于扩增的诱导的多能干细胞(inducedpluripotent stem cells，iPS细胞)培养在用丝裂霉素(10ug/ml)处理的MEF(小鼠胚胎成纤维细胞)上，并且培养在KSR培养基中：DMEM/F12(HyClone公司)，20％血清替代物(KSR，Invitrogen公司)，4ng/mlbFGF、青霉素/链霉素、1％L-谷氨酰胺、0.1mM β-巯基乙醇和1％非必需氨基酸。
b，病毒感染人体细胞
根据实施例1所述的方法，在p6孔培养板中按每孔约6×104个细胞接种人的人体细胞，在37℃、5％CO2的常规培养条件下培养过夜，用收集的病毒上清液感染培养的人体细胞。所述病毒上清液是通过用包含人Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的cDNA的反转录病毒pMX载体(Addgene)按常规方法转染293T细胞(Lipofectamine 2000，Invitrogen)获得的(参见Sambrook，Fritsch和Maniatis，分子克隆实验指南，第3版(2002))。
c，感染细胞的继续培养和克隆筛选
在感染后第2天，将感染后的人体细胞的培养基，替换为实施例1中所述的DFBS+A培养基，在37℃、5％CO2的常规培养条件下培养7天，每天更换一次培养基，用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)于37℃消化为单细胞悬液，将消化后的细胞按每培养皿约10000个细胞的密度接种到100mm培养皿中，所述培养皿按a中描述的方法，预先用滋养层细胞包被。接种后的细胞在37℃、5％CO2的常规培养条件下培养14天，显微镜检可见hESC样克隆(如图6所示)，其中A为人体细胞感染SKOM前的形态，B为人体细胞在感染SKOM后26天在滋养层上形成典型的hES样克隆形态；C为人体细胞hiPS克隆挑取至新的滋养层上传代扩增仍保持很好的hESC样形态，该图为传代2代后的形态，使用KSR培养基；D是人体细胞hES样克隆在Matrigel预包被的6孔平板上生长形态，此处所用培养基为mTeSRTM1。
使用玻璃针分割边缘光滑，细胞核清晰，人胚胎干细胞样的单个克隆(见图6C)，然后用玻璃管吸取这些分割开的克隆接种到12孔板的单个孔中，每个孔接种一个ES样克隆，一共挑取12个。所述12孔板按a中描述的方法，预先用滋养层细胞包被。接种后的细胞在KSR培养基中，37℃、5％CO2的常规培养条件下培养。
这些挑取出的克隆具有典型的hES致密形态，在12孔板培养一周后，每孔选择部分克隆进行AP染色，结果为100％AP染色阳性(数据未显示)。
挑取部分hES样克隆后将剩余100mm培养皿AP染色，计数AP阳性克隆数目，第7天时向100mm培养皿共种下10000个SKOM感染的人体细胞，计算诱导iPS细胞效率如图7所示；AP染色后，依据克隆形态及AP结果对hES样的克隆计数，我们这种加VC的方法的总体效率为大约2.2％，与传统用KSR培养基培养的0.01-0.02％的效率相比超过100倍，与本实验中设置的DFBS和KSR对照相比效率提高超过70倍。
实施例5  利用含有VC的培养基筛选能够显著影响iPS的化合物或细胞因子。
由于小鼠三因子iPS GFP效率在D15-16天大大高于四因子D9-10天效率，我们将感染S、K、O三因子的iPS细胞分别加入要筛选的不同细胞因子，包括表皮生长因子(EGF，20ng/ml)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，10ng/ml)，肝细胞生长因子(HGF，10ng/ml)，胰岛素(insulin，10ug/ml)，D16天流式检测GFP阳性细胞比例，结果如图8所示，不含VC的培养基中，HGF和insulin经过统计显示比对照效率有所提高；而在含有VC的培养基中，除了HGF和insulin外，bFGF显示了显著提高的iPS效率。因此，含有VC的培养基更有利于细胞因子或化合物的筛选。