一种含有抗猪CCK/Urease的双效价卵黄抗体的卵黄粉及其制备方法 【技术领域】
本发明涉及生物制剂领域，尤其涉及一种含有抗猪胆囊收缩素(Cholecystokinin，CCK)/肠道细菌脲酶(Urease)的双效价卵黄抗体(Immunoglublin yolk，IgY)的卵黄粉及其制备方法。
背景技术
如何提高畜禽采食量、改善养殖环境，降低氨对环境的冲击一直是急待解决的问题。目前提高畜禽采食量的途径常见有以下几种：(1)选用优质和易于消化的原料；(2)确定日粮合适的营养水平；(3)哺乳期补料；(4)饲喂液体饲料与发酵饲料；(5)使用诱食调节剂；(6)改善畜禽养殖环境等。利用现代生物工程技术和产品提高动物采食量是目前研究的热点，而利用抗CCK卵黄抗体从动物生理调节的角度调节动物的采食量是其中的方法之一。
另一方面，随着养殖业规模化、集约化程度的提高，畜禽自身代谢过程以及废弃物所产生的氨也大量增加，对养殖场及周边环境带来极大的负面冲击。畜禽养殖场的氨主要是由于畜禽胃肠道蛋白质代谢过程产生的尿素和尿酸在微生物脲酶(Urease)作用下的水解产物，并导致蛋白质的浪费，降低了饲料效率；氨气的积累不仅会危害畜禽的健康，降低其生产性能，还会污染周边环境。因此，畜禽生产过程中必须采取相应措施控制氨气的产生和排放。
目前可采用脲酶抑制剂来抑制脲酶活性，从而减少氨的产生。此类抑制剂包括重金属盐类、天然类固醇萨酒皂角苷(Yucca Sapanion)、二胺、三胺类化合物、氧肟酸类化合物等。这些抑制剂或者价格昂贵，或者对畜禽本身的生长有负面作用，或者没有被批准用于畜禽养殖等，因此开发一种安全、新型脲酶抑制剂很有必要。
【发明内容】
本发明提供一种含有抗猪CCK/Urease的双效价卵黄抗体IgY的卵黄粉的制备方法，该卵黄粉能提高猪只的采食量、降低其料肉比以及减少氨的排放。
本发明的第二个目的在于提供一种含有抗猪CCK/Urease的双效价卵黄抗体IgY的卵黄粉。
为达到上述目的，本发明的技术方案为：
一种含有抗猪CCK/Urease的双效价IgY的卵黄粉的制备方法，包括以下步骤：
1)将纯化浓缩的猪胆囊收缩素39肽(CCK39)/肠道细菌脲酶B亚基(UreB)融合蛋白与弗氏佐剂混合均匀制成疫苗，用该疫苗免疫健康开产母鸡，用酶联免疫检测试验测定卵黄中IgY效价并收集高免鸡蛋；
2)从高免鸡蛋中分离蛋黄，制成卵黄粉。
纯化浓缩的CCK39/UreB融合蛋白与弗氏佐剂等体积混合。
所述免疫步骤具体为：
步骤1)首先在健康开产蛋鸡胸肌两侧分别注射100μL浓度为1mg/mL的含弗氏完全佐剂疫苗；10天后胸肌两侧再分别注射200μL浓度为1mg/mL的含弗氏不完全佐剂疫苗；25天后再分别注射300μL浓度为1mg/mL的含弗氏不完全佐剂疫苗；55天后注射400μL浓度为1mg/mL的不含佐剂疫苗；85天后再注射500μL浓度为1mg/mL的不含佐剂疫苗，共免疫5次。之后用酶联免疫检测试验进行效价测定，当双效价卵黄抗体效价达1∶1600以上时收集高免鸡蛋以制备高免卵黄粉。
步骤2)所述卵黄粉制备步骤具体为：分离卵清与卵黄，收集卵黄，均质后喷雾干燥，或真空冷冻干燥，或均质后与吸附剂等质量混合，于40-50℃干燥等即成卵黄粉。
所述吸附剂为玉米淀粉、轻质碳酸钙或二氧化硅。
一种由上述制备方法制备的含有抗猪CCK/Urease融合蛋白的双效价卵黄抗体的卵黄粉。
由上述方法制备的含有抗CCK39/UreB融合蛋白的双效价卵黄抗体就可以分别中和猪只CCK和肠道细菌脲酶。此双效价卵黄抗体作为饲料添加剂添加到猪饲料中的应用。
由本发明所述方法制备的含有抗CCK/Urease的双效价IgY的卵黄粉添加到饲料中饲喂猪只，一方面利用抗CCK39作用中和胃肠道内的CCK，使猪只不产生或延迟产生饱感，从而提高其采食量；另一方面，该双效价IgY还能与猪肠道中大肠菌群产生的脲酶特异性结合，从而抑制肠道微生物的脲酶活性，阻止尿素和尿酸转化成氨气，减少氨气的产生，既能降低养殖场所氨气的浓度，改善养殖环境，又能减少了蛋白质的流失、浪费，提高饲料效率。
【附图说明】
图1是CCK39基因PCR产物电泳分析图，1：DNA marker DL2000；2-7：CCK39 PCR产物；
图2是UreB基因PCR产物电泳分析图，1：DNA marker DL2000；2-5：UreB PCR产物；
图3是本发明CCK39/UreB双基因融合表达载体的构建流程图。
【具体实施方式】
实施例1CCK39/UreB融合蛋白的表达与疫苗的制备
(一)模板制备
(1)CCK39 cDNA地制备：收集新鲜猪十二指肠，按照RNA提取试剂盒提取猪十二指肠总RNA，检测证实其具备完整性后，按照cDNA合成试剂盒要求将该总RNA逆转录为相应的cDNA，置于-20℃保存备用。
(2)产脲酶大肠菌群质粒DNA的制备：从新鲜猪粪中分离培养出产脲酶大肠菌群单菌落，过夜扩大培养，然后收集该新鲜培养物，按照质粒回收试剂盒提取该大肠菌群质粒，溶于TE buffer中并置于-20℃保存备用
(二)CCK39基因的获得
根据GenBank上公布的序列[gi:47523555]，利用Primer Premier5.0设计引物设计一对特异引物(引物由上海英骏生物技术有限公司合成，以下同)，
上游引物如序列SEQ ID NO：2所示：
5’-GATGGATCCTACATCCAGCAGGCTCGAAAAGC-3′，含有BamHI酶切位点；
下游引物如序列SEQ ID NO：3所示：
5’-GATAAGCTTAAAATCCATCCAGCCCATGTAGTC-3，含有HindIII酶切位点，且不含终止密码子。
以CCK39 cDNA为模版，PCR扩增猪十二指肠CCK39目的基因，反应：94℃ 5min，94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 30s，72℃ 10min，30个循环。PCR产物电泳后进行凝胶成像系统分析，参阅图1。
(三)pET43a(+)/CCK39原核表达质粒的构建
回收纯化上述扩增产物CCK39目的基因后，BamHI和HindIII分别双酶切扩增产物和pET43a(+)原核表达质粒，凝胶回收。16℃连接过夜，再转化E.coli DH5α，氨苄青霉素抗性筛选，挑6个阳性菌落，分别进行PCR和BamH I、Hind III双酶切鉴定，符合预期结果的菌株编号为E.coliDH5α/pET43a(+)/CCK39，送往上海英骏生物技术有限公司进行测序，CCK39基因的序列如SEQ ID NO：6，结果在GenBank的Blastn比对，分析其同源性。
(四)UreB基因获得
根据GenBank上公布的序列[gi:148150]，利用Primer Premier5.0设计引物设计一对特异引物，
上游引物如序列SEQ ID NO：4所示：
5’-GGGAAGCTTATGATCCCCG GTGAAATTAA-3’，含有Hind III酶切位点，
下游引物如序列SEQ ID NO：5所示：
5’-AAA GCGGCCGC TTAATTCTCACTCTCTAA-3’，含有Not I酶切位点；
以产脲酶大肠杆菌质粒DNA为模版，PCR扩增UreB目的基因，反应：94℃ 5min，94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 30s，72℃ 10min，30个循环。PCR产物电泳后进行凝胶成像系统分析，参阅图2。
(五)pET43a(+)/CCK39/UreB/双基因融合表达质粒的构建
请参阅图3，回收纯化上述扩增产物UreB目的基因后，Hind III和Not I分别双酶切扩增产物和pET43a(+)/CCK39原核表达质粒，凝胶回收。16℃连接过夜，再转化E.coli DH5α，氨苄青霉素抗性筛选，挑6个阳性菌落，分别进行PCR和Hind III、Not I双酶切鉴定。符合预期结果的菌株编号为E.coli DH5α/pET43a(+)/CCK39/UreB，送往上海英骏生物技术有限公司进行测序，CCK39/UreB双融合基因的序列如SEQ ID NO：1所示，结果在GenBank的Blastn进行比对，分析其同源性。
(六)CCK39/UreB融合蛋白的表达及疫苗的制备
将培养至对数生长期的表达工程菌E.coli BL-21(DE3)/pET43a(+)/CCK39/UreB按1％(V/V)的比例接种于含氨苄青霉素的发酵培养基2×YT液体培养基中，28℃培养4h后，当发酵液A600≈0.8时，加入200g/L的乳糖至终浓度为10g/L，28℃诱导5h后，4℃、10000r/min离心10min，收集沉淀，沉淀经PBS洗涤和重悬菌体后，超声破碎(300W、超声时间6s，间隔时间7s，共超声40次)，4℃、10000r/min离心15min，收集裂解上清。经Ni2+-NTA镍柱纯化后SDS-PAGE凝胶电泳分析，再经透析、浓缩，然后采用Bradford检测法测定融合蛋白含量。按体积比1∶1的比例与弗氏佐剂混合制成浓度为1mg/mL的疫苗。
实施例2免疫方法
选22周龄开产健康产蛋母鸡，设免疫组和对照组两组，并留取免疫前的鸡蛋作对照，按该种属鸡饲养要求进行饲养。将已纯化的重组CCK39/UreB融合蛋白与等体积弗氏佐剂混合均匀制成疫苗，采用胸部多点肌肉注射的方式进行免疫。免疫程序与接种剂量如表1所示。
表1蛋鸡免疫程序与免疫剂量
免疫时间 (天) 疫苗 免疫途径 接种量/只 1d CCK39/UreB融合蛋白 +弗氏完全佐剂 胸肌多点 100μg 10d CCK39/UreB融合蛋白 +弗氏不完全佐剂 胸肌多点 200μg 25d CCK39/UreB融合蛋白 +弗氏不完全佐剂 胸肌多点 300μg 55d CCK39/UreB融合蛋白 胸肌多点 400μg 85d CCK39/UreB融合蛋白 胸肌多点 500μg
实施例3高免鸡蛋的处理
首免后开始每日收集鸡蛋并编号，4℃保存备用。取卵黄时先磕开蛋壳，分离蛋黄与蛋清，用灭菌蒸馏水反复冲洗蛋黄表面，尽量去除蛋清，用针头刺破蛋黄膜，吸出蛋黄，测量蛋黄体积，加入9倍灭菌蒸馏水稀释，并用HCl调节pH值至5.0-5.5之间，稀释液于4℃静置6h以上，待出现明显分层后，吸取上清；4℃、12000r/min离心30min，取上清，计量体积，加入0.01％硫化汞，小分装，-20℃保存。
实施例4间接ELISA检测
1、酶标抗体工作浓度的测定选择
用0.05moL/L pH9.6的碳酸盐缓冲液将鸡抗CCK39/UreB阳性IgY作1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280稀释，包被酶标板第1-8列，100μL/孔，37℃恒温1h后转入4℃过夜；洗涤、封闭后，用pH7.4 PBS将酶标抗体做1∶200、1∶400、1∶800、1∶1000稀释后，分别加入酶标板第1-4行，37℃水浴1h后，按间接ELISA方法进行检测，测定各孔OD490的值，当OD490值为1.0左右且鸡抗CCK39/UreB阳性IgY稀释度最大时所对应的酶标抗体浓度，作为酶标抗体最佳工作浓度。最佳酶标抗体浓度工作稀释度为1∶12800。
2、CCK39/UreB抗原最适包被浓度及阴阳性IgY的最佳稀释度的确定
用0.05mol/LpH9.6的碳酸盐缓冲液将抗原作1∶20、1∶40、1∶80和1∶160的稀释，包被酶标板第1-4行，100uL/孔，37℃ 1h后转入4℃过夜；洗涤、封闭后，将CCK39/UreB阳性、阴性IgY都同时做1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320稀释，然后将阳性IgY分别加入到酶标板的第1、3、5、7、9列，阴性IgY加入到酶标板第2、4、6、8、10列，第11列加入IgY稀释液(pH7.4 PBS)作空白对照，37℃水浴1h后，按间接ELISA方法进行检测。当阳性血清的OD490值接近1.0，而阴性血清小于0.2，且P/N值最大时，所对应的抗原稀释度为最佳包被浓度，对应的阴阳性血清的稀释浓度为最佳阴阳性IgY工作浓度，抗原最适包被浓度为3.125μg/mL。
3、间接ELISA检测
间接ELISA检测具体操作流程如下：
抗原包被→洗板→封闭→洗板→加待检样→洗板→加酶标抗体→洗板→底物显色→终止反应→判定结果
本研究所研制的双效价IgY的抗体最高效价达1∶51200以上。
实施例5含有抗猪CCK39/UreB融合蛋白(即抗猪CCK/Urease)的双效价卵黄抗体的卵黄粉制备。
选取符合条件的免疫鸡蛋，分离卵清与卵黄，收集卵黄，通过均质后喷雾干燥，或真空冷冻干燥，或均质后与吸附剂等质量混合，于40-50℃干燥即成卵黄粉。
所述的吸附材料为玉米淀粉、轻质碳酸钙，以及二氧化硅中的任意一种。
该卵黄粉中含有所述的能够提高猪的采食量与减少猪舍氨的排放量的双效价卵黄抗体。
实验例含有抗猪CCK/Urease融合蛋白的双效价卵黄抗体的卵黄粉饲喂仔猪试验
(一)试验动物与设计
1、试验选择54头出生体重相近(约20kg)的二元杂仔猪，采用单因子试验设计，共分3个处理，每个处理3个重复，每个重复6头的仔猪；
A、处理1：空白对照组(基础日粮)；
B、处理2：基础日粮+阴性鸡蛋，即阳性对照组
C、处理3：基础日粮+含抗CCK/Urease卵黄抗体的阳性鸡蛋，即试验组。
2、试验日粮
该猪场自配粉料：1000g粉料中，玉米：290g，豆粕：145g，预混料：65g。
3、试验方法
I：采食量测定
1)饲养场地进行定期清洁消毒。试验仔猪自由饮水，每天饲喂5次，根据每个重复具体采食情况添补饲料。从早上8:30到下午6:30，每2h检查采食情况1次，每天记录每个处理的耗料量，试验周期为22d。试验开始、结束时，仔猪空腹24h后称个体重，每个星期统计每重复的总耗料量，计算仔猪平均日增重、平均日采食量以及料重比等。
2)数据处理
数据表示为平均数±标准差，采用SAS统计软件对数据进行ANOVA方差分析和DUNCAN多重比较。
4、饲喂含有抗猪CCK/Urease融合蛋白的双效价卵黄抗体的卵黄粉对仔猪生长性能及饲料利用率的影响
试验组猪只采食量分别较阳性对照组和空白对照组提高6.24％和15.29％。猪只平均日增重以试验组(处理3组)最高，显著高于阳性对照组(处理2组)和空白组(处理1组)，分别提高16.07％和23.98％；试验组、阳性对照组和空白对照组的料肉比分别为1.6755、1.8200和1.8167，分别降低了7.97％和7.77％，参见表2。
在为期30天的试验期间，三个处理组的死淘率为零，且没有发生腹泻。除因天气寒冷和空气潮湿致使空白对照组、阳性对照组和试验组各一只猪发生关节炎外，没有发生其他疾病。
表2含有抗猪CCK/Urease融合蛋白的双效价卵黄抗体的卵黄粉对仔猪生长性能及饲料利用率的影响
空白对照组 阳性对照组 试验组 初始仔猪头数 30 30 30 最后仔猪头数 30 30 30 仔猪平均始重(kg/头) 6.0 6.6 6.1 仔猪平均末重(kg/头) 17.00 18.37 19.75 平均总增重(kg) 11.00 11.77 13.65 平均日增重(kg/头) 0.367 0.392 0.455 平均日采食量(kg/头) 0.6614 0.7177 0.7625 料肉比(F/G) 1.8167 1.8200 1.6755 腹泻头次 0 0 0
II：粪便中脲酶活性的测定
分别在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和22d收集每个处理的新鲜粪便样置于适当的容器中备用。采用pH增值法测定脲酶活性。
具体操作方法如下：
准确称取2.0g样品两份，分别置于两支25ml试管中，其中一支加入20ml磷酸盐缓冲液，作为空白试验(A管)；另一支加入20ml尿素磷酸盐缓冲液，作为试验管(B管)，立即盖好试管塞并剧烈摇动，置于30±0.5℃恒温水浴中，每隔5min振摇一次，准确计时，保持30min后，每管立即分别加入4滴饱和氯化汞溶液，以终止反应。分别测定其pH值。
结果计算：酶活性＝B-A
式中：B——B管的pH值
A——A管的pH值
5、含有抗猪CCK/Urease融合蛋白的双效价卵黄抗体的卵黄粉对仔猪肠道微生物脲酶活性的影响
表3列出了不同处理组猪粪样品的微生物脲酶活性。从表3可知，空白对照、阳性对照以及添加卵黄抗体的试验组的试管中粪便的pH值差分别为0.342、0.322以及0.269。由于pH值差越大，脲酶活性越强，因此添加卵黄抗体组脲酶活性比空白、阳性对照组分别下降了21.35％和16.46％。此试验结果说明：添加抗CCK/Urease融合蛋白的双效价卵黄抗体的卵黄粉后对仔猪肠道的细菌脲酶活性有明显的抑制效果，从而有效的阻止尿素转变成氨，减少了氮源的流失，为提高蛋白质利用率提供了条件。
表3各组试验仔猪粪便中细菌脲酶活性
处理组别 脲酶活性ΔpH 空白对照组 0.342 阳性对照组 0.322 添加卵黄抗体试验组 0.269
SEQU ENCE LISTING
<110>文锋，胡
<120>一种含有抗猪CCK/Urease的双效价卵黄抗体的卵黄粉及其制备方法
<160>6
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>619
<212>DNA
<213>人工序列
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acgaacgttg gtctggttcc cggggcagcg cgggttctgg tacgattgat gacgacgaca 60
agagtccggg agctcgtgga tcctacatcc agcaggctcg aaaagcacct tctggccgag 120
tatctatgat taagaatctg cagagcctgg accccagcca cagaataagt gaccgggact 180
acatgggctg gatggatttt aagcttatga tccccggtga aattaaggtt aatgcagcat 240
taggcgatat tgaactgaat gctggtcgcg agacaaaaac catacaggtg gctaatcatg 300
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