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邻菲罗啉衍生物在制备药物中的用途
    【技术领域】

    本发明涉及一种邻菲罗啉衍生物的新用途。 

     背景技术

    众所周知，DNA是储存和传递遗传信息的载体，基因组中许多具有重要生物学功能的区域均富含鸟嘌呤核苷酸(G)，如端粒、免疫球蛋白重链开关区以及一些重要基因的启动子区域。自1978年发现染色体末端的DNA重复序列以来，端粒DNA的分子结构及其功能的研究日益受到广泛的关注。由于与肿瘤细胞的永生性密切相关，使得端粒和端粒酶的研究成为目前抗肿瘤研究的热点问题(Shawn E.H.，et al.，Journal of cellular physiology 1999，180：10)。 

    端粒长度对于细胞的生长、衰老和凋亡控制非常重要，每经过一次复制周期，端粒的长度都会缩短一些，每次大概丢失50～200个核苷酸，经过20～40代重复后，端粒长度达到极限，最后细胞正常凋亡。在多数的恶性肿瘤细胞(85％以上)中，端粒酶的活性被激活，而端粒酶的主要功能是催化端粒末端重度序列的延伸，可以用以补偿正常端粒DNA的缩短，由此使得端粒无法达到临界凋亡长度，从而细胞不能进入老化和衰亡，成为一种“永生性”细胞(Steenel B.V.，et al.，Nature1997，38：740)。 

    G‑四链体是一种特殊的DNA二级结构，是通过Hoogsteen和Watson‑Crick氢键在一个共面环状阵列上结合在一起的一系列堆积的鸟嘌呤四分体(见图1)。G‑四链体在端粒末端形成，可以抑制端粒酶延长端粒末端的作用，使得端粒能够随着复制的进行而缩短，从而破坏肿瘤细胞的永生性，促进肿瘤细胞死亡。以G‑四链体为靶点，以达到抑制恶性肿瘤端粒酶活性的目的有望成为最有效的治疗肿瘤的理想途径。DNA G‑四链体结构具有多样性，其根据链条的取向可以分为平行和反平行结构。其也可以由一条单链形成分子内结构，也可能是两条或多条链形成分子间结构(Wenhu D.，et al.，Molecular Cancer Therapeutics 2001：1103)。 

    目前，G‑四链体已经成为一个世界公认的抗肿瘤药物的设计靶点。现已经发展了一系列分子可以稳定这种特殊的G‑四链体结构，从而达到通过抑制端粒酶活性达到抑制肿瘤细胞的目的(Wheelhouse R.T.，et al.，J.Am.Chem.Soc.1998，120： 3261；Moorhouse A.D.，et al.，J.Am.Chem.Soc.2006，128：15972；Gavathiotis E.，et al.，J.Mol.Biol.2003，334：25；Kern J.T.，Biochemistry2002，41：12568；Davis J.T.，Angew.Chen.Int.Ed.2004，43：668.)。 

    由上可以看出，化合物对G‑四链体的高选择性识别和稳定能力是非常重要的。只有高效的区分开正常的双链DNA和G‑四链体结构，才有可能最大限度的降低化合物对正常细胞的毒性。至今为止的报道中，与G—四链体选择能力最强的是一种含有金属Mn的卟啉衍生物，其与G‑四链体和双链DNA的结合常数之比为10⁴(DixonI.M.，et al.，J.Am.Chem.Soc.2007，129：1502)。目前，以G‑四链体的结构为基础，设计合成高选择性识别的G‑四链体配体已经成为该领域的热点。 

    邻菲罗啉类化合物由于其具有良好的配位特性，又是重要的有机合成反应中间体，因而在许多领域都有得到了广泛的应用。据报道，邻菲罗啉具有杀菌和荧光性质，现已被广泛应用于制备大分子生物探针、发光材料及抗菌等领域(Senthil K.R，et al.，Polyhedron2008，27：1111)。 

    【发明内容】

    本发明的目的是提供邻菲罗啉衍生物的新用途。 

    本发明提供的邻菲罗啉衍生物的新用途为：式(I)所示的邻菲罗啉衍生物或其药物学上可接受的盐在制备抑制真核生物肿瘤细胞增殖的药物中的应用； 

     式(I)； 

    Me为甲基，i‑Bu为异丁基。 

    所述真核生物为哺乳动物。 

    所述肿瘤细胞为癌细胞，如肝癌细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、胰腺癌细胞、肺癌细胞、脑癌细胞、卵巢癌细胞、子宫癌细胞、睾丸癌细胞、皮肤癌细胞、白血病细胞、头颈癌细胞、结肠癌细胞、视网膜癌细胞、膀胱癌细胞、肛门癌细胞和直肠癌细胞等。

    本发明还提供了一种抑制真核生物肿瘤细胞增殖的药物，它的有效成分为式(I)所示的邻菲罗啉衍生物或其药物学上可接受的盐。 

    所述真核生物为哺乳动物。 

    所述肿瘤细胞为癌细胞，如肝癌细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、胰腺癌细胞、肺癌细胞、脑癌细胞、卵巢癌细胞、子宫癌细胞、睾丸癌细胞、皮肤癌细胞、白血病细胞、头颈癌细胞、结肠癌细胞、视网膜癌细胞、膀胱癌细胞、肛门癌细胞和直肠癌细胞等。 

    本发明提供的邻菲罗啉衍生物的另一种新用途为：式(I)所示的邻菲罗啉衍生物或其药物学上可接受的盐在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用。 

    所述肿瘤为癌，如肝癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、脑癌、卵巢癌、子宫癌、睾丸癌、皮肤癌、白血病、头颈癌、结肠癌、视网膜癌、膀胱癌、肛门癌和直肠癌等。 

    本发明还提供了一种预防和/或治疗肿瘤的药物，它的有效成分为式(I)所示的邻菲罗啉衍生物或其药物学上可接受的盐。 

    所述肿瘤为癌，如肝癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、脑癌、卵巢癌、子宫癌、睾丸癌、皮肤癌、白血病、头颈癌、结肠癌、视网膜癌、膀胱癌、肛门癌和直肠癌等。 

    PD分子可以高选择性结合平行结果G‑四链体结构DNA，对肿瘤细胞较高的毒性，可以抑制癌细胞增殖，有希望成为一种新型的高效、低毒抗肿瘤药物。 

    以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。 

    【附图说明】

    图1为G‑四链体DNA的结构示意图。 

    图2为不同结构的DNA在PBS‑K⁺缓冲液或PBS‑Na⁺缓冲液中的结构示意图；其中，2‑A为Hu22在PBS‑K⁺溶液中的结构示意图；2‑B为Hu22在PBS‑Na⁺溶液中的结构示意图；2‑C为Hu24A在PBS‑K⁺溶液中的结构示意图。 

    图3为Hu22与PD分子混合后的荧光光谱(K⁺环境中)；其中，3‑A为Hu22G‑四链体对PD分子的荧光滴定光谱图；3‑B为F₀/F对Hu22G‑四链体浓度直线图；3‑C为PD与Hu22G‑四链体结合常数测定图。 

    图4为Hu22与PD分子混合后的荧光光谱(Na⁺环境中)；其中，4‑A为Hu22G‑四链体对PD分子的荧光滴定光谱图；4‑B为F₀/F对Hu22G‑四链体浓度直线图；4‑C为 PD与Hu22G‑四链体结合常数测定图。 

    图5为Hu24与PD分子混合后的荧光光谱(K⁺环境中)；其中，5‑A为Hu24G‑四链体对PD分子的荧光滴定光谱图；5‑B为F₀/F对Hu24G‑四链体浓度直线图；5‑C为PD与Hu24G‑四链体结合常数测定图。 

    图6为Hu24A与PD分子混合后的荧光光谱(K⁺环境中)；其中，6‑A为Hu24AG‑四链体对PD分子的荧光滴定光谱图；6‑B为F₀/F对Hu24A G‑四链体浓度直线图；6‑C为PD与Hu24A G‑四链体结合常数测定图。 

    图7为双链DNA与PD分子混合后的荧光光谱(K⁺环境中)；其中，7‑A为双链DNA对PD分子的荧光滴定光谱图；7‑B为F₀/F对双链DNA浓度直线图；7‑C为PD与双链DNA结合常数测定图。 

    图8为PD对平行结构G‑四链体Hu22的CD稳定实验(K⁺环境中)；其中，8‑A：Hu22(对照)；8‑B：PD与Hu22的摩尔比为1；8‑C：PD与Hu22的摩尔比为2。 

    图9为PD对反平行结构G‑四链体Hu22的CD稳定实验(Na⁺环境中)；其中，9‑A：Hu22(对照)；9‑B：PD与Hu22的摩尔比为1；9；C：PD与Hu22的摩尔比为2。 

    图10为PD对混合结构G‑四链体Hu4的CD稳定实验(K⁺环境中)；其中，10‑A：Hu24(对照)；10‑B：PD与Hu24的摩尔比为1；10‑C：PD与Hu24的摩尔比为2。 

    图11为PD对混合结构G‑四链体Hu24A的CD稳定实验(K⁺环境中)；其中11‑A：Hu24A(对照)；11‑B：PD与Hu24A的摩尔比为1；11‑C：PD与Hu24A的摩尔比为2。 

    【具体实施方式】

    下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。 

    以下实施例中的PD分子的制备方法(Hu，Z.，et al.，J.Org.Chem.2006，71：1131.)如下： 

    

    (a)将1mmol8‑氨基‑4‑异丁氧基‑2‑喹啉‑2甲酸甲酯溶于25mL甲醇中，室温下向其中加入1.1mmol丁炔二酸二甲酯。搅拌8小时后，过滤，得到黄色固体。 

    熔点：149‑150℃；¹H NMR(CDCl₃)：δ11.16(s，1H)，7.83(d，J＝8.4Hz，1H)，7.56(s，1H)，7.43(t，J＝8.0Hz，1H)，6.93(d，J＝7.6Hz，1H)，5.57(s，1H)，4.08(s，3H)，4.04(d，J＝6.3Hz，2H)，3.77(s，3H)，3.75(s，3H)，2.35‑2.22(m，1H)，1.13(d，J＝6.7Hz，6H)；¹³C NMR(CDCl₃)：δ169.0，166.1，165.1，162.9，147.4，145.4，139.8，137.4，127.4，122.9，115.0，114.6，101.3，96.6，75.2，53.1，52.8，51.4，28.2，19.2；EI‑MS：m/z416[M]⁺；elementanalysis for C₂₁H₂₄N₂O₇(％)：C60.57，H5.81，N6.73；found：C60.66，H5.82，N6.67. 

    (b)将1mmol(a)所得产物加入到已预热到200℃的25mL二苯醚中后回流30分钟。冷却至室温，加入50mL石油醚搅拌，过滤，所得淡黄色固体用硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝20/1)纯化后用于下一步反应。 

    熔点：182‑183℃；¹H NMR(CDCl₃)：δ10.91(broad，1H)，8.25(d，J＝9.1Hz，1H)，7.93(d，J＝9.1Hz，1H)，7.63(s，1H)，7.15(s，1H)，4.11(s，3H)，4.09(s，3H)，4.05(d，J＝6.5Hz，2H)，2.39‑2.26(m，1H)，1.17(d，J＝6.7Hz，6H)；¹³C NMR(CDCl₃)：δ178.8，165.5，163.0，162.8，148.3，139.4，136.9，135.7，125.6，123.5，123.7，116.9，114.8，104.2，75.6，53.8，53.2，28.2，19.2；EI‑MS：m/z384[M]⁺；element analysis for C₂₀H₂₀N₂O₆(％)：C62.49，H5.24，N7.29；found：C62.12，H5.25，N7.15. 

    (c)将1mmol(b)所得产物，6mmol碳酸钾以及3mmol溴代异丁烷加入到30mLN，N‑二甲基甲酰胺中，然后在80℃反应10小时。过滤，减压除去二甲基甲酰胺(DMF)后，加入二氯甲烷。水洗两次后，将有机相用无水硫酸钠干燥，旋去溶剂，将所得粘稠液体溶于少量甲醇后放入冰箱中，析出白色固体，过滤得0.36g。 

    熔点：179‑181℃；¹H NMR(CDCl₃)：δ9.34(s，2H)，7.86(s，2H)，4.10(s，10H)，2.33(m，2H)，1.17(d，J＝6.7Hz，12H)；¹³C NMR(CDCl₃)：δ166.6，162.8，149.3，146.2，122.8，120.9，104.1，75.4，53.0，28.2，19.2；EI‑MS：m/z440[M]⁺；element analysis for C₂₄H₂₈N₂O₆·1/2H₂O(％)：C64.78，H6.46，N6.30；found：C64.81，H6.58，N6.24。 

    该白色固体即为化合物PD。

    以下实施例中所用试剂均为分析纯，所用水为超纯水，所用的DNA序列均购自于北京擎科生物技术有限公司。 

    实施例1、式(I)所示的邻菲罗啉衍生物(PD)对癌细胞增殖能力的影响 

    将化合物PA进行抑制肿瘤的细胞实验(MTT法)，操作如下： 

    (1)将处于对数期生长的HepG‑2肝癌细胞，用0.25％胰酶消化细胞，使其成为单细胞，用含10％胎牛血清的DMEM培养液制成浓度为1*10⁸个/L的单细胞悬液，将细胞接种于96孔培养板中，每孔200ul(每孔2×10⁴个细胞)。将96孔细胞培养板置于CO₂培养箱中，在37℃，5％CO₂条件下，培养48h。 

    (2)当孔内细胞长满(90％满时即可)，按实验分组加入不同剂量的PD分子溶液(200ul/孔)，使PD分子的终浓度分别为5uM、10uM、30uM、50uM、100uM，每组设3个复孔。培养96h。 

    (3)各个孔中加入20ul浓度为5g/L的MTT，继续培养4h，使MTT还原为甲瓒(Formazan)。吸出全部上清液后，每孔入200ul的DMSO，震摇15min，使甲臜充分溶解后，运用酶联免疫检测仪测定490nm处的吸光度(OD值)。 

    按下式进行计算，结果列于表1。 

    

    表1  PD分子对肝癌细胞株的抑制率 

      PD对HEPG‑2抑制率％5uM‑2.7％10uM40.2％30uM81.0％50uM87.2％100uM97.8％

    所以，PD分子对肝癌细胞株HepG‑2的IC₅₀(药物的半数抑制浓度)为25μM。结果表明PD分子对癌细胞具有很好的抑制效果，抑制率随剂量的递增而提高，IC₅₀值为25μM。综合考虑到PD分子的高选择性和对肿瘤细胞较高的毒性，我们相信PD分子非常有希望成为一种新型的高效、低毒抗肿瘤药物。 

    实施例2、式(I)所示的邻菲罗啉衍生物(PD)抑制癌细胞增殖的机理G‑四链体DNA的制备：

    将Hu22溶解于17.20mM PBS‑K⁺缓冲液(K₂HPO₄/KH₂PO₄)中，4℃冰箱保存。 

    将Hu22溶解于17.20mM PBS‑Na⁺缓冲液(Na₂HPO₄/NaH₂PO₄)中，4℃冰箱保存。 

    将Hu24溶解于17.20mM PBS‑K⁺缓冲液(K₂HPO₄/KH₂PO₄)中，4℃冰箱保存。 

    将Hu24A溶解于17.20mM PBS‑K⁺缓冲液(K₂HPO₄/KH₂PO₄)中，4℃冰箱保存。 

    Hu22(序列表的序列1)：5′‑AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG‑3′； 

    Hu24(序列表的序列2)：5′‑TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG‑3′； 

    Hu24A(序列表的序列3)：5′‑TTGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGA‑3′。 

    双链DNA(24bp)的制备：将两条完全互补的d[(TTAGGG)₄]和d[(AATCCC)₄]按照摩尔比1：1，溶解于17.20mM PBS‑K⁺缓冲液(K₂HPO₄/KH₂PO₄)中。混合均匀后，加热至85℃，保持15分钟后，逐步冷却至室温。使用前，4℃下静置24小时。 

    图2为不同结构的DNA在PBS‑K⁺缓冲液或PBS‑Na⁺缓冲液中的结构示意图。图2中，A为Hu22在PBS‑K⁺溶液中的结构示意图；B为Hu22在PBS‑Na⁺溶液中的结构示意图；C为Hu24A在PBS‑K⁺溶液中的结构示意图。 

    Hu22在PBS‑K⁺溶液中为平行四链体结构。Hu22在PBS‑Na⁺溶液中为反平行四链体结构。Hu24A在PBS‑K⁺溶液中为混合四链体结构。 

    一、PD分子与G‑四链体的结合能力 

    邻菲罗啉类衍生物均具有很强的荧光，加入DNA后发生荧光猝灭现象。利用荧光猝灭滴定实验可以计算出PD分子与不同结构G‑四链体之间的结合常数(Bi，S.，et al.，Journal of Molecular structure.2004，703：37)。检测PD分子(Hu，Z.，et al.，J.Org.Chem.2006，71：1131.)与不同结构DNA(Hu22、Hu24、Hu24A、双链DNA)的结合能力，试验中的参数如下：仪器型号：Hitachi F‑4500；激发波长：330nm；狭峰宽度：5nm；PD分子浓度为3μM。进行三次重复试验，结果取平均值。 

    结合常数(k_a)测定原理如下： 

    将PD分子加入到DNA的溶液中，该体系主要存在下列平衡： 

     $P+\mathrm{nD}\stackrel{\mathrm{ka}}{\↔}P-D---\left(1\right)$

    上式中，n为两者的结合比，P为溶液中游离的PD分子，P‑D为结合态的PD分子，k_a为结合常数。 

    则，结合常数k_a可以通过下式进行计算： 

    [P‑D]＝ka[P][D]ⁿ(2) 

    令未加入G‑四链体时溶液中PD的浓度为[P]₀，则上式可以写为：

     $k_a=\frac{{\left[P\right]}_0-\left[P\right]}{\left[P\right]{\left[D\right]}^n}$          (3) 

    在静态猝灭中,荧光体系的荧光强度F与其游离的浓度成正比，即： 

     $\frac{F}{F_0}=\frac{\left[P\right]}{{\left[P\right]}_0}---\left(4\right)$

    将(4)式代入(3)中，可得： 

     ${\left[P\right]}_0(1-\frac{F}{F_0})=\mathrm{ka}\frac{F}{F_0}{\left[P\right]}_0{\left[D\right]}^n---\left(5\right)$

    整理得： 

     $\lg \frac{F_0-F}{F}=\mathrm{lg\; ka}+\mathrm{n\; lg}\left[D\right]---\left(6\right)$

    根据上式以对1g[D]作图，可以求得PD与DNA之间的结合常数k_a。 

    Hu22与PD分子混合后(PBS‑K⁺溶液)的荧光光谱见图3。Hu22与PD分子混合后(PBS‑Na⁺溶液)的荧光光谱见图4。Hu24与PD分子混合后(PBS‑K⁺溶液)的荧光光谱见图5。Hu24A与PD分子混合后(PBS‑K⁺溶液)的荧光光谱见图6。双链DNA与PD分子混合后(PBS‑K⁺溶液)的荧光光谱见图7。 

    PD分子与不同结构DNA的结合常数结果见表2。 

    结果表明，PD可以选择性识别平行结构的G‑四链体，并增加其稳定性。PD与平行G‑四链体的结合常数和PD与双链结合常数之比高达10⁵，是目前最强的G‑四链体选择剂。 

    机理分析如下：分子的结构决定了分子的性质。对于邻菲罗啉类化合物，因其均具有较好的平面性结构，所以很容易嵌插入DNA的碱基层之间。在PD分子结构中的取代基，例如4，7位上的异丁基，因均具有较大的结构位阻，所以使得PD分子无法嵌插进入双链DNA的碱基层之间，使得其与双链的结合能力减弱。PD分子与G‑四链体采取端部堆积的方式进行结合，取代基的存在不会影响其结合能力的大小。而恰是由于该种结合模式，相对于平行结构G‑四链体端部较小的loop结构，反平行结构中较大的loop结构阻碍了PD与其结合，由此使得PD分子可以高效的选择性识别平行结构的G‑四链体结构。 

    二、PD分子与G‑四链体结合后G‑四链体的热稳定性。 

    目前，CD光谱已被广泛的用于研究G‑四链体的热力学行为。可以通过检测G‑四链体特征CD吸收峰的摩尔椭圆率的变化来判断G‑四链体结构变化，如平行结构 G‑四链体检测262nm，反平行结构G‑四链体检测295nm。温度的升高可使得DNA G‑四链体结构发生变化，且变化是在很窄的温度范围内发生，导致CD摩尔椭圆率降低，以温度对CD吸收峰的摩尔椭圆率的变化作图，摩尔椭圆率达到一半时的温度就成为G‑四链体的熔点，以Tm表示(Rachwal，P.A.，et al.，Methods.2007，43：291；Fu，B.，et al.，Chem.Commun.2007：3264)。 

    分别检测不同G‑四链体(Hu22、Hu24、Hu24A)与PD分子结合后的熔点变化。试验采用的参数如下：仪器型号：Jasco‑815；扫描范围：200‑400nm；温度范围20‑90℃，升温速率2℃/min。G‑四链体浓度为3μM。进行三次重复试验，结果取平均值。 

    图8为Hu22与PD分子混合后的CD谱(K⁺环境中)。图9为Hu22与PD分子混合后的CD谱(Na⁺环境中)。图10为Hu24与PD分子混合后的CD谱(K⁺环境中)。图11为Hu24A与PD分子混合后的CD谱(K⁺环境中)。 

    PD分子与不同G‑四链体结合后的熔点变化(ΔT_m)见表2。 

    表2PD分子与不同结构DNA的结合常数和稳定性实验结果 

    

    结果表明，PD分子与G‑四链体结合后，可以使G‑四链体的熔点显著增加。

    序列表 

    <110>中国科学院化学研究所 

    <120>邻菲罗啉衍生物的新用途 

    <130>CGGNARY81773 

    <160>3 

    <210>1 

    <211>22 

    <212>DNA 

    <213>人工序列 

    <400>1 

    

    <210>2 

    <211>24 

    <212>DNA 

    <213>人工序列 

    <400>2 

    

    <210>3 

    <211>24 

    <212>DNA 

    <213>人工序列 

    <400>3