白蛋白纳米 - 超声微泡载组织型纤溶酶原激活物基因靶向 体系及其制备方法 【技术领域】
本发明涉及血栓防治药物领域， 尤其涉及一种白蛋白纳米 - 超声微泡载组织型纤 溶酶原激活物基因靶向体系及其制备方法。背景技术
在正常生理情况下， 凝血 - 抗凝和纤溶 - 抗纤溶机制互相平衡， 保证血液在体内正 常流动， 既不形成血栓， 也不至于出血。 血栓形成与血栓溶解机制的失衡使得血栓不适当地 形成或者形成后不能被有效清除， 导致组织或器官缺血 / 坏死 ； 另一方面， 抗凝 / 纤溶过度 也会导致出血的发生。
tPA(tissue-type Plasminogen Activator， tPA) 是纤溶系统主要激活因子， 是机 体重要的抗凝成分。它由血管内皮细胞合成， 在各种刺激尤其是纤维蛋白的作用下释放入 血， 作用于血浆素原使其转换为血浆素促进纤维蛋白降解。自 tPA 的 cDNA 克隆成功， 人们 已能够构建其逆转录病毒载体并在体外转导内皮细胞获得 tPA 蛋白的高表达。动物实验证 实， 将这种转导的内皮细胞贴附于球囊支架表面或动脉桥吻合口可防止支架术后或血管搭 桥术后血栓形成和再狭窄的发生， 明显提高手术的远期效果。人重组 tPA 作为生物制剂已 应用于冠心病急性心肌梗塞、 脑栓塞、 肺梗塞等的溶栓治疗并取得了显效， 但由于价格昂贵 未能广泛应用。
白蛋白是近年来研究较多的一种纳米材料， 它的生物相容性好， 生物可降解， 无免 疫源性和细胞毒性， 基因转移效率较高。由于它有精确的纳米结构和表面与内部可携带分 子的特性， 使之成为一个很好的 DNA 导入细胞的载体。
基因导入体内的方式多为将目的基因直接注射于靶组织， 如心血管疾病多采用心 肌内直接注射或心导管注入质粒 DNA 或腺病毒载体。中国发明专利 CN200610033187.0 公 开了一种基因缝线， 该缝线为载有高表达 tPA 基因质粒的外科涤纶缝线， 将该基因缝线直 接缝合于心肌组织， 可消除或避免凝血块的形成。中国发明专利 CN200910106773.7 公开了 用壳聚糖做原料制备了纳米 tPA 基因载体并直接注射于心肌均获得 tPA 的有效表达。但上 述两专利记载的方法存在有创性， 限制其临床应用。 发明内容
为解决上述问题， 本发明的目的在于提供一种安全、 有效、 无创的白蛋白纳米 - 超 声微泡载组织型纤溶酶原激活物基因靶向体系。
本发明的第二个目的在于提供一种制备白蛋白纳米 - 超声微泡载组织型纤溶酶 原激活物基因靶向体系的方法。
为实现上述目的， 本发明采用如下技术方案 ： 一种白蛋白纳米 - 超声微泡载组织 型纤溶酶原激活物基因靶向体系， 包括载重组 tPA 基因质粒白蛋白纳米粒和蔗糖白蛋白超 声微泡。所述重组 tPA 基因质粒含有重组 tPA 基因、 启动子、 终止子和筛选标记基因表达盒。 所述重组 tPA 基因由 1686 个碱基组成， 其碱基序列如 SEQ ID ： NO.1 所示。
所述白蛋白为牛血清白蛋白。
靶向体系中蔗糖白蛋白超声微泡含量为 0.8-1.8×109 个 /ml， 重组 tPA 基因质粒 含量为 0.1-0.3mg/ml。
白蛋白纳米 - 超声微泡载组织型纤溶酶原激活物基因靶向体系的制备方法， 包括 以下步骤 ：
1) 制备载重组 tPA 基因质粒白蛋白纳米粒 ；
2) 制备蔗糖白蛋白超声微泡 ；
3) 用载重组 tPA 基因质粒白蛋白纳米粒和蔗糖白蛋白超声微泡制备白蛋白纳 米 - 超声微泡载组织型纤溶酶原激活物基因靶向体系。
步骤 1) 具体为将重组 tPA 基因质粒加入牛血清白蛋白溶液中孵育后， 在超声场的 存在下滴入乙醇水溶液， 直至溶液出现乳白色并逐滴滴入 0.5％的戊二醛溶液， 搅拌， 室温 下静置， 得到载重组 tPA 基因质粒白蛋白纳米粒。
步骤 2) 具体为无菌制备含蔗糖的牛血清白蛋白液体， 并置于容器中， 依次用氧气 和氟碳气体饱和液体， 超声波发生器处理， 得到氧 - 氟丙烷蔗糖白蛋白超声微泡。
步骤 3) 具体为步骤 1) 制备的白蛋白纳米粒加至步骤 2) 制备的白蛋白微泡中， 加 入戊二醛， 4℃下孵育进行交联， 用生理盐水洗涤、 离心、 分层， 上浮泡沫悬液即为白蛋白纳 米 - 超声微泡载组织型纤溶酶原激活物基因靶向体系。
本发明构建重组 tPA 基因质粒并选择白蛋白纳米粒和超声微泡为载体， 将其转导 机体细胞获得有效和持续 tPA 的产生， 可达到长期抗凝和防止血栓形成的作用， 且安全、 无 创；
本发明采用一步法制备载基因白蛋白纳米粒， 这种方法将质粒物理包裹于白蛋白 纳米粒中， 其主要优点是携带被转基因量较高 ； 药物缓释和转基因时间较长 ； 具有较好的 酶保护和防止体内 DNA 酶降解作用 ； 容易设计成靶向载体， 应用于体内研究或制备成纳米 药物应用更具优越性 ；
本发明在制备超声微泡过程中在白蛋白液体中加入 10％蔗糖， 避免蔗糖白蛋白液 体粘滞性强， 制备时超声困难且所需能量较大的问题， 且微泡稳定性良好 ；
含全氟碳的微泡同时加有少量氧气会进一步促进微泡在血液中的稳定性， 从而取 得更强的心肌显影效果 ；
采用超声触发破坏白蛋白纳米 - 超声微泡载组织型纤溶酶原激活物基因靶向体 系， 可使载有基因质粒的白蛋白纳米粒靶向定位释放和靶基因的表达增强， 这种方法是一 种简易有效的靶向纳米基因转移新技术。
附图说明
图 1 是重组 tPA 基因质粒 pSecTag2B-tPA 构建流程图 ；
图 2 是载重组 tPA 基因质粒白蛋白纳米粒 Zetasizer3000 仪粒度分析结果图 ；
图 3 是琼脂糖凝胶电泳 DNA 阻滞实验和 DNA 酶保护实验结果图 ；图 4 是白蛋白超声微泡与白蛋白纳米粒交联后普通光学显微镜下 400 倍放大图 ；
图 5 是超声波靶向治疗前后心脏超声影像学改变图， A 输入微泡前 ； B 输入微泡后 心脏显影增强 ； C 超声波治疗后 ；
图 6 是超声波靶向治疗前后肝脏超声影像学改变图， A 输入微泡前 ； B 输入微泡后 肝脏显影增强 ； C 超声波治疗后 ；
图 7 是超声靶向转基因的心肌组织心肌细胞增大图， 胞浆红染， HE 200× ；
图 8 是超声靶向转基因的骨骼肌组织肌细胞肥大图， 胞浆红染， 细胞核增多， HE 200× ；
图 9A 是对照组心肌组织 tPA 抗体阴性反应免疫组化结果图， 图 9B 实验组心肌组 织 tPA 抗体阳性反应免疫组化结果图， 200× ；
图 10A 是对照组心肌组织 tPA 抗体阴性反应免疫组化结果图， 图 10B 是实验组心 肌组织 tPA 抗体阳性反应免疫组化结果图， 免疫组化 200× ；
图 11 是实验组肝细胞 tPA 抗体阳性反应免疫组化结果图， 400× ；
图 12 是实验组肋软骨基层软骨细胞 tPA 抗体阳性反应免疫组化结果图， 400× ；
图 13 是实验组骨髓细胞 tPA 抗体阳性反应免疫组化结果图， 400×。 具体实施方式
本发明白蛋白纳米 - 超声微泡载组织型纤溶酶原激活物基因靶向体系制备方法 主要包括以下步骤 ：
1、 构建重组 tPA 基因质粒 pSecTag2B-tPA， 下述实施例 1 会详细说明 ；
2、 采用上述重组 tPA 基因质粒和白蛋白， 进行白蛋白纳米 - 超声微泡载组织型纤 溶酶原激活物基因靶向体系的制备， 下述实施例 2 会详细说明。
实施例 1 重组 tPA 基因质粒 pSecTag2B-tPA 的制备
1、 主要试剂
A、 质粒 pSecTag2B， 购自美国 Invitrogen 生物公司，
B、 感受态细胞 E.Coli JM109， 购自 Promega 公司，
C、 限制性内切酶 HindIII， KpnI， BamHI 和 XhoI， 购自宝生物工程有限公司，
D、 T4-DNA 连接酶， 购自 New England Biolabs 公司，
E、 QIAquick Gel Extraction Kit、 QIAGEN PCR Product
Purification Kit， 购自 QIAGEN 公司。
2、 方法
人工合成三个 EST ： tPA-1 如 SEQ ID NO.2 所示、 tPA-2 如 SEQ ID NO.3 所示和 tPA-3 如 SEQ ID NO.4 所示， 分别连接克隆载体， 制备成质粒 pOTB6、 pOTB7 和 pCMV-SPORT6。
采用三对引物 tPA-1F(SEQ ID NO.5) 和 tPA-1R(SEQ ID NO.6)、 tPA-2F(SEQ ID NO.7) 和 tPA-2R(SEQ ID NO.8)、 tPA-3F(SEQ ID NO.9) 和 tPA-3R(SEQ ID NO.10) 分别扩 增上面描述的所述质粒 pOTB6、 pOTB7 和 pCMV-SPORT6， 扩增 tPA-1 和 tPA-3 的 PCR 程序为 ： 94℃预变性 4min， 94℃ 45sec， 55℃ 45sec， 72℃ 1min， 共 25 个循环， 最后 72℃延伸 5min ； 扩 增 tPA-2 的 PCR 程序为 ： 94 ℃预变性 4min， 94 ℃ 45sec， 60 ℃ 45sec， 72 ℃ 1min， 共 25 个循 环， 最后 72℃延伸 5min。将所得产物经 QIAGEN PCR Product Purification Kit 纯化后分别用三对限制 性内切酶 HindIII 和 KpnI、 KpnI 和 BamHI、 BamHI 和 XhoI 进行消化， 同时用限制性内切酶 HindIII 和 XhoI 消化质粒 pSecTag 2B， 纯化方法见 QIAGEN PCR Product Purification Kit 说明书。
将上述酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳， QIAquick Gel ExtractionKit 回收目的 DNA 片段， 纯化方法见 QIAquick Gel Extraction Kit 说明书， 用 T4-DNA 连接酶连接上述收 回产物， 构建出重组 tPA 基因质粒 pSecTag2B-tPA， 构建流程见图 1。
实施例 2 白蛋白纳米 - 超声微泡载组织型纤溶酶原激活物基因靶向体系的制备
利用实施例 1 制得的重组 tPA 基因质粒 pSecTag2B-tPA 和白蛋白制备白蛋白纳 米 - 超声微泡载组织型纤溶酶原激活物基因靶向体系， 包括以下步骤 ：
1、 一步法制备载重组 tPA 基因质粒白蛋白纳米粒， 具体为 ： 100mg 牛血清白蛋白 加入 5ml 双蒸水溶解， 用 0.1N HCI 调整 pH 值至 5.5。将已构建的 1mg 重组 tPA 基因质粒 加入上述白蛋白溶液中， 孵育 30min 后在超声场的存在下缓慢滴入乙醇水溶液 ( 乙醇∶水 ＝ 2 ∶ 1)， 直至溶液出现乳白色并逐滴滴入 0.5％的戊二醛溶液 30ul， 适当搅拌， 室温下静 置 2h。减压使残余的乙醇挥发后， 所得溶液 17000r/min 离心 30min 以除去游离的白蛋白 和多余的交联剂， 所得沉淀为载基因白蛋白纳米粒。沉淀用双蒸水重悬并用超声波 ( 条件 ： 180W， 固定频率 20kHz， 30sec) 分散成乳胶状， 4℃下储存备用。 取部分制备扫描电镜标本观察纳米粒形态、 做包封率检测和凝胶阻滞实验， 并用 Zetasizer3000 仪测定粒径大小和表面 Zeta 电位。 扫描电镜结果显示， 白蛋白纳米粒球形， 大小较均匀且分散良好。Zetasizer3000 仪粒度分析显示， 白蛋白粒径大小呈正态分布， 平 均粒径大小为 132.0nm， 最大粒径为 152.4nm， 最小粒径为 49.1nm。多分散指数平均 0.33， 见图 2。表面 Zeta 平均 +31.32-+41.42mV。样品的包封率用紫外分光光度计进行检测， 测 量加入的总的质粒 DNA 含量。 将包裹基因后的纳米溶液离心并测量上清液中游离质粒 DNA， 包封率 (％ ) ＝ (W 总 -W 游 )/W 总 ×100％ (W 总 ： 的加入量 ； W游： 上清液中质粒 DNA 测得 量 )。测定结果显示包封率平均为 73.58％， 符合实验要求。
0.9％琼脂糖凝胶电泳结果如图 3 所示， 可见经白蛋白纳米包裹后 DNA 完全阻滞于 加样孔中未能移动 (DNA ： 白蛋白为 1/100)。质粒 DNA 未被白蛋白纳米粒包裹经 DNase I 消 化后降解， 电泳未见条带显现。而包裹纳米粒的质粒 DNA 则保持完好， 被完全阻滞于加样孔 内， 表明白蛋白纳米粒对质粒 DNA 具保护作用。
2、 制备氧 - 氟丙烷蔗糖白蛋白超声微泡， 具体为 ： 无菌制备含 10 ％蔗糖的 5 ％ -1 (g.ml ) 牛血清白蛋白液体 10ml ； 并置于有盖 50ml 塑料离心管中， 依次用氧气和氟碳气 -1 体饱和液体 ( 流量 ： 6ml.min )， 约 10min， 超声波发生器处理 1min( 条件 ： 180W， 固定频率 20kHz) ； 将制备的微泡 4℃下密闭保存备用。
取部分显微镜观察微泡形态、 测量大小并计数 ； Zetasizer3000 仪测定粒径大小 和表面 Zeta 电位。普通光学显微镜显示制备的糖蛋白超声微泡园球形囊泡状， 大小较一 致， 分散良好， 直径最小 0.9μm， 最大 9.8μm， 95％以上微泡直径 2-5μm， 可满足微血管超 声造影需求。含 10％蔗糖的白蛋白微泡经 4℃保存 30 天形态学上未发生改变， 且对热稳定 性良好 (40℃， 30min)。
3、 用载基因白蛋白纳米粒和氧 - 氟丙烷蔗糖白蛋白超声微泡制备白蛋白纳米 - 超
声微泡载组织型纤溶酶原激活物基因靶向体系， 具体为 ： 将一次制备的白蛋白纳米粒 ( 含 1mg 质粒 ) 加至 5ml 白蛋白微泡中， 加入 50％戊二醛 10ul 溶液 4℃下孵育 2h 进行交联 ( 戊 二醛溶液终浓度为 0.1％ )。用生理盐水洗涤、 离心、 分层， 离心速度 200 转 /min， 1min， 取 上浮泡沫悬液即得白蛋白纳米 - 超声微泡载组织型纤溶酶原激活物基因靶向体系。调整微 泡浓度使 5ml 靶向体系中含微泡 0.8-1.8×109 个 /ml， 基因质粒含量为 1mg。4℃下保存备 用。白蛋白超声微泡与白蛋白纳米粒交联后形态、 大小等性状亦未发生明显变化， 见图 4。
实施例 3 白蛋白纳米 - 超声微泡载组织型纤溶酶原激活物基因靶向体系超声治疗 效果
1. 材料 ： 纯种新西兰白兔 25 只， 雄性， 体重 2.3-2.5kg， 南方医科大学动物中心提 供。
2. 主要试剂 ： 羊抗人 tPA 多克隆抗体、 兔抗羊多克隆抗体、 牛血清白蛋白、 tPA ELISA 检测试剂盒由晶美生物工程有限公司提供。 全氟丙烷气体 (Halocarbon-218) 由广东 佛山捷锐公司提供。
3. 主要仪器 ： 超声波发生器系宁波新芝生物科技有限公司产品 ； 治疗性超声仪 (US-700， 系德国产品 )。 4. 方法 ：
4.1 兔用 5％戊巴比妥钠静脉麻醉 (20-25mg/kg) ； 用二维超声观察心、 肝等脏器显 影。经耳缘静脉注入载 tPA 基因纳米白蛋白微泡剂 5ml 并观察到相关脏器显影明显增强。 分组 ： (1) 实验组 (n ＝ 16) ： 进一步分心脏组 6 例， 肝脏组 6 例和肌肉组 4 例。静脉注入载 tPA 基因纳米白蛋白微泡剂 5ml 后立即经胸前壁正对心脏前壁及肝区、 经皮肤左后腿内收 肌群等超声照射 30min 并观察到将微泡击碎 ( 二维超声观察 )， 超声频率 1MHz ； 强度 1.5W/ 2 cm 。(2) 对照组 (n ＝ 9) ： 单纯微泡组 3 例， 经耳缘静脉注入载 tPA 基因纳米白蛋白微泡剂 5ml ； 不用超声照射 ； 纳米基因组 3 例， 静脉输入白蛋白纳米 tPA 基因及超声照射 ； 空白对照 组 3 例， 静脉输入 5ml 生理盐水和超声治疗。超声治疗条件同前。后 2 组靶器官为肝脏。术 后普通饲料喂养， 观察期 4 周。
4.2 病理和免疫组化观察 ： 动物经常规饲养和观察 4 周后分别处死， 取心脏、 肝脏、 大腿内收肌组织以及超声场通过的胸壁肋软骨组织， 4％多聚甲醛固定， 石蜡包埋， 常规切 片和 HE 染色病理检查 ； 间接免疫组化法染色检测 tPA 基因在各组织和细胞中的表达， 阳性 反应细胞为细胞浆内黄褐色颗粒状沉淀。取肺脏、 肾脏组织作为对照。动物于术前和观察 结束分别取血液检测 D- 二聚体含量并用 ELISA 法检测血 tPA 含量
5. 结果
5.1 超声显像和靶向治疗 ： 经兔耳缘静脉注入载 tPA 基因纳米白蛋白微泡剂 5ml 后超声显像心脏、 肝脏等设定的靶组织， 观察到与注射前相比相关脏器显影明显增强。 经超 声波治疗 30min 后组织显像回复至注射前水平。非超声治疗的单纯微泡组、 纳米基因组和 空白对照组超声显像无明显改变， 见图 5 和图 6。
5.2 组织病理学改变和 tPA 基因表达 ： 超声靶向处理的心肌细胞、 骨骼肌细胞和肝 细胞等体积增大， 细胞浆深染， 细胞核增大， 骨骼肌细胞核增多。 部分细胞胞浆可见空泡。 未 经超声照射的组织和细胞未见明显改变 ； 对照组织如肾组织、 肺组织等未见明显异常， 见图 7 和图 8。 超声靶向转染 4 周后可见心脏、 肝脏、 骨骼肌组织和骨组织中的实质细胞表达 tPA
抗原。tPA 抗原表达阳性心肌和骨骼肌细胞呈散在分布， 这些细胞体积增大， 胞浆横纹减少 或消失呈细颗粒状， 部分间质细胞和小血管壁可见弱的阳性反应。 tPA 反应阳性的肝细胞呈 散在或放射状分布， 主要分布在肝小叶门管区， 其它细胞未见阳性反应。 骨组织中阳性反应 细胞主要分布在软骨生发层细胞和骨髓造血细胞和部分间质细胞 ( 图 9、 10、 11、 12)。
5.3 血 D- 二聚体和 tPA 含量 ： 靶向转基因前后血 D- 二聚体和 tPA 含量检测结果 如表 1 所示， 转基因后 4 周血液 2 项反应纤溶活性的指标均显著增高 ( 表 1)。
表1： 兔靶向转 tPA 基因术前和术后 4 周血 D- 二聚体和 tPA 含量 (μg/L， x±s)
*0.025 ＜ P ＜ 0.01， **P ＜ 0.01， 术前与术后相比
在获得靶组织表达 tPA 的同时检测到血 tPA 含量增高以及 D- 二聚体含量增高， 反 应了 tPA 抗凝活性明显增强。
8101850124 A CN 101850125序列表1/4 页SEQUENCE LISTING<110> 姬， 尚义 季， 军 <120> 白蛋白纳米 - 超声微泡载组织型纤溶酶原激活物基因靶向体系及其制备方法 <130>P11498 <160>10 <170>PatentIn version 3.3 <210>1 <211>1686 <212>DNA <213> 人工序列 <400>1 atggatgcaa tcgcccagcc tgcagagatg ctcagaagca gtgcccgtca ctgtacttct atagatacca acagcggaga tacagcgggc aacccagatc gagttctgca tcagcctacc tccatgatcc ctgggcaaac ctgaagaacc ctgagacagt tcccacccct ctgtgtgggg gagaggtttc ggcgaggaggtgaagagagg aggaaatcca aaaaaacgca accgggtgga aaagttgcag cagatttcgt gggccagctg gtggcgccga ggaggccaga gagactcaaa gcacccctgc gtggtaccca tgataggcaa ataattactg gcaggctgac acagccagcc ggcaggctgc gcatactcat cgccccacca agcagaaattgctctgctgt tgcccgattc gatgatatac atattgctgg cgagccaagg gtgccagtgc ctacgaggac gtgcaccaac cgccatcagg gccctggtgc ctgctctgag cagcctcacc ggtttacaca ccggaatcct gtgggagtac tcagtttcgc catctttgcc cagctcctgc cctgacggtg tgaagtcgaagtgctgctgc agaagaggag cagcaacatc tgcaacagtg tgtttcaacg cccgaaggat cagggcatca tggaacagca ctgggcctgg tacgtcttta ggaaacagtg gagtcgggtg gcacagaacc gatggggatg tgtgatgtgc atcaaaggag aagcacagga tggatcctct atcttgggca aaatacattg9tgtgtggagc ccagatctta agtcatggct gcagggcaca ggggcacctg ttgctgggaa gctacagggg gcgcgttggc ggaaccacaa aggcggggaa actgctactt cctcctgcct ccagtgccca ccaagccctg cctcctgctc ggctcttcgc ggtcgcccgg ctgccgccca gaacataccg tccataaggtagtcttcgtt ccaagtgatc gcgccctgtg gtgccactca ccagcaggcc gtgctgtgaa cacgtggagc ccagaagccc ctactgcaga gtacagctca tgggaatggg cccgtggaat ggcactgggc gtgccacgtg cacctgcggc cgacatcgcc agagcggttc ctgcttccag ggtggtccct tttcgatgat60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200101850124 A CN 101850125序acaatgacat gcgtggtccg gtgagctctc aggaggctca gaacagtcac acttgcacga gcatgacttt gtgtgtacac tgcgctgctg cactgtgtgc cggctacggc tgtcagactg cgacaacatg cgcctgccag ggtgggcatc caaggttacc列表cggattcgtc cggacctgca ccttgtctcc gccgctgcac gagacactcg gaggccccct gcctgggctg actggattcg ccgctgtgcc gctgccggac tttctattcg atcacaacat gagcggcggg ggtgtgtctg tggacagaag tgacaacatg2/4 页gacacttacg caggagagca tggacggagt gagcggctga ttacttaaca ccccaggcaa aacgatggcc gatgtcccgg cgaccgcagctgaaat cttcccccgg aagcatgagg tacccatcca ctgtgtgctg ggcgattcgg atcagctggg aactacctag1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1686<210>2 <211>678 <212>DNA <213> 人工序列 <400>2 atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt tcgcccagcc aggaaatcca tgcccgattc tgcagagatg aaaaaacgca gatgatatac ctcagaagca accgggtgga atattgctgg gtgcccgtca aaagttgcag cgagccaagg ctgtacttct cagatttcgt gtgccagtgc atagatacca gggccagctg ctacgaggac acagcggaga gtggcgccga gtgcaccaac tacagcgggc ggaggccaga cgccatcagg aacccagatc gagactcaaa gccctggtgc gagttctgca gcacccctgc ctgctctgag tcagcctacc gtggtacc <210>3 <211>385 <212>DNA <213> 人工序列 <400>3 ggtacccaca ataggcaagg aattactgcc aggctgacgtgtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt agaagaggag cagcaacatc tgcaacagtg tgtttcaacg cccgaaggat cagggcatca tggaacagca ctgggcctgg tacgtcttta ggaaacagtg ccagatctta agtcatggct gcagggcaca ggggcacctg ttgctgggaa gctacagggg gcgcgttggc ggaaccacaa aggcggggaa actgctactt ccaagtgatc gcgccctgtg gtgccactca ccagcaggcc gtgctgtgaa cacgtggagc ccagaagccc ctactgcaga gtacagctca tgggaatggg60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 678gcctcaccga tttacacagc ggaatcctga gggagtactggtcgggtgcc acagaacccc tggggatgcc tgatgtgccctcctgcctcc agtgcccagg aagccctggt tcctgctcca10cgtggaattc cactgggcct gccacgtgct cctgcggcctcatgatcctg gggcaaacat gaagaaccgc gagacagtac60 120 180 240101850124 A CN 101850125序列表3/4 页agccagcctc agtttcgcat caaaggaggg ctcttcgccg acatcgcctc ccacccctgg caggctgcca tctttgccaa gcacaggagg tcgcccggag agcggttcct gtgtgggggc atactcatca gctcctgctg gatcc <210>4 <211>642 <212>DNA <213> 人工序列 <400>4 ggatcctctc tcttgggcag aatacattgt agctgaaatc ttcccccggc agcatgaggc acccatccag tgtgtgctgg300 360 385agcggcgggc gcgattcggg aggccccctg gtgtgtctga tcagctgggg cctgggctgt ggacagaagg actacctaga ctggattcgt gacaacatgc <210>5 <211>30 <212>DNA <213> 人工序列 <400>5 cccaagctta tggatgcaat gaagagaggg <210>6 <211>27 <212>DNA <213> 人工序列 <400>6 ggggtaccac ggtaggctga cccattc <210>7 <211>26tgccgcccac aacataccgg ccataaggtt ggattcgtcc ggacctgcag cttgtctcct ccgctgcaca agacactcggtgcttccagg gtggtccctg ttcgatgatg cgctgtgccc ctgccggact ttctattcgg tcacaacattagaggtttcc gcgaggagga acacttacga aggagagcag ggacggagtg agcggctgaa tacttaacag cccaggcaaa acgatggccg atgtcccggg gaccgcctcggccccaccac gcagaaattt caatgacatt cgtggtccgc tgagctctcc ggaggctcat aacagtcaccctgacggtga gaagtcgaaa gcgctgctgc actgtgtgcc ggctacggca gtcagactgt gacaacatgc60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 642cttgcacgac gcctgccagg catgactttg gtgggcatca tgtgtacacc aaggttacca ag302711101850124 A CN 101850125序列表4/4 页<212>DNA <213> 人工序列 <400>7 ggggtaccca cagcctcacc gagtcg <210>8 <211>30 <212>DNA <213> 人工序列 <400>8 cgggatccag caggagctga tgagtatgcc <210>9 <211>26 <212>DNA <213> 人工序列 <400>9 cgggatcctc tctgccgccc actgct <210>10 <211>26 <212>DNA <213> 人工序列 <400>10 ccctcgaggc ggtcgcatgt tgtcac26302626