植物挥发性物质 技术领域 本发明涉及农业领域， 特别是对植物的虫害防治。本发明提供了适于驱除或引 诱昆虫害虫 ( 例如粉虱 ) 的包含一种或多种挥发性碳氢化合物的化合物和组合物。本 发明还提供了制备和使用引诱剂或驱除剂化合物 / 组合物的方法， 以及在田间和 / 或温 室里防治昆虫侵染和损害的方法。所述组合物适于防治植物昆虫害虫， 特别是胸喙亚目 (Sternorrhyncha) 吸汁昆虫。胸喙亚目的昆虫包括木虱 (psyllid)、 粉虱 (whitefly)、 蚜虫 (aphid)、 粉蚧 (mealybug) 和介壳虫 (scale insect)， 其具有共同的特质， 即利用 植物汁液作为其食物来源。可进行防治的其它植物昆虫害虫包括蓟马 (thrip)、 螨(例 如叶螨 (spider mite)) 和叶蝉 (leaf hopper)。在一个优选实施方案中， 提供了用于 防治粉虱侵染和粉虱损害农作物的方法和组合物。在一个不同的实施方案中， 所述化 合物和 / 或组合物可用于驱除蚊科 (Culicidae) 昆虫， 尤其是属于按蚊属 (Anopheles) ( 其存在约 400 个物种， 其中的 30 ～ 40 种传播疟疾， 例如冈比亚按蚊复合种 (A.gambiae complex))、 库蚊属 (Culex) 和 / 或伊蚊属 (Aedes) 的物种。根据本发明， 还可引诱或驱除 蠓科 (Ceratopogonidae) 的成员——蠓， 例如吸食脊椎动物血液的库蠓属 (Culicoides)、 铗蠓属 (Forcipomyia)(Lasiohelea) 和细蠓属 (Leptoconops)， 例如光胸库蠓 (Culicoides impunctatus)( 高地蠓 (highland midge) 或苏格兰蠓 (Scottish biting midge))。
背景技术 小 粉 虱 属 (Bemisia)( 甘 薯 粉 虱 (sweet potato whitefly)) 和 蜡 粉 虱 属 (Trialeurodes)( 温室粉虱 (greenhouse whitefly)) 的粉虱是世界范围内的主要作物 害虫， 其造成经济损失， 尤其是由于在进食时传播植物病毒 ( 即， 它们作为 “病毒载体” ) 而导致的经济损失。烟粉虱 (Bemisia tabaci) 能够传播超过 60 种不同的双生病毒科 (Geminiviridae) 以及多种毛形病毒属 (crinivirus) 的病毒， 其中许多属于菜豆金色花叶 病毒属 (Begomovirus)， 例如非洲木薯花叶病毒 (African cassava mosaic virus(ACMV))、 菜 豆 金 色 花 叶 病 毒 (Bean golden mosaic virus(BGMV))、 菜 豆 畸 矮 病 毒 (Bean dwarf virus)、 番 茄 黄 化 曲 叶 病 毒 (Tomato yellow leafcurl virus(TYLCV))、 番茄斑点病毒 (Tomato mottle virus(TMV)) 等。热带和温带作物均受到影响， 例如番茄、 豆、 葫芦、 马铃 薯、 棉花、 木薯和甘薯。 迄今， 主要的防治策略是施用杀虫剂， 目的在于杀死成体、 幼体和卵。 施用杀虫剂， 除了成本高以外， 还严重影响环境。 此外， 由于烟粉虱对活性成分出现抗性， 因 此难以使用杀虫剂来防治。
为了减少杀虫剂的施用， 需要防治田间生长和温室生长的作物中由粉虱引起之作 物损害和损失的方法。 从文献中可了解到， 挥发性组分可直接地影响昆虫行为 ( 例如 Bruce 等， 2005， Trends Plant Sci.10 ： 269-74)。一种防治粉虱传播病毒的方法是鉴定可施加在 农作物上或附近的昆虫驱除剂和 / 或可施加在附近区域以引诱昆虫害虫远离作物的引诱 剂。鉴定引诱剂和 / 或驱除剂中的问题在于已知吸引一个物种的化合物可能驱除另一昆虫 物种。因此， 常常不能对化合物或组合物在可能具有不同感官知觉和摄食行为的物种之间
为引诱剂还是驱除剂得出结论。例如， 粉虱在接入维管组织之前通过唇轻拍 ( 使用机械感 受器和化学感受器 ) 表皮表面来试探其宿主植物 ( 探测 )。 就此来说， 它们的决定受到例如 组成型产生之驱除剂的影响， 然而也有可能受到叶表面性质的影响。发生在探测后的偏好 性直接与表现和病毒传播相关。为了避免病毒传播， 应阻止或至少显著减少探测。这意味 着， 仅在探测发生后杀死粉虱的化合物不适于用作作物保护剂， 因为病毒已经得以传播。 另 外， 粉虱的捕食者不应受到驱除剂或引诱剂的影响， 因为它们可用于减少粉虱群体的数量。
鉴定用于防治粉虱的合适化合物和 / 或组合物的另一个问题是， 天然植物顶空物 质 (headspace) 组合物和植物腺毛成分含有大量不同浓度的不同化合物， 其在物种之间以 及物种内各个植物株系或登记植株之间有所不同。 即使鉴定出植物顶空物质组合物作为整 体对昆虫害虫具有某种作用， 鉴定哪些组分或组分之组合可适用于作为引诱剂或驱除剂仍 然不是容易的工作， 迄今为止， 尚没有合适的用于粉虱及其它吸汁昆虫害虫的驱除剂或引 诱剂。
Zhang 等 (J.Econo Entomolog 2004， 97， 1310-1318 页 ) 测试了 0.25％的姜油溶 液作为银叶粉虱 (B.argentifolii) 的驱除剂。在自由选择测试 (no-choice test) 中， 仅 有 10.2 ～ 16.6％的少数成体粉虱定居在经处理的植物上， 并发现产在植物上的卵的数目 没有差异。 增加姜油的浓度与植物毒性有关， 因此阻碍了姜油作为粉虱驱除剂的有效应用。
EP 0583774 描述了使用植物油来降低食叶昆虫防治剂的植物毒性， 其中可使用任 何类型的昆虫防治剂。
腺毛在番茄属 (Lycopersicon)( 现分类为茄属 (Solanum)) 的叶和茎上非常显著， 并已显示出产生大量的次生化合物， 例如倍半萜烃类、 倍半萜酸类、 甲基酮类和糖酯类。一 些研究试图将腺毛密度与植物害虫 ( 例如玉米棉铃虫 (Heliothis zea) 或科罗拉多甲虫 (Kauffman 和 Kennedy， 1989， J Chem Ecol 15， 1919-1930 ； Antonious， 2001， J Environ Sci Health B 36， 835-848 以及 Antonious 等， 2005， J Environ Sci Health B 40 ： 619-631)) 抗性相关联。另外， 多毛番茄 (L.hirsutum f.glabratum) 腺毛中贮存的甲基酮类 2- 十一 酮和 2- 十三酮显示分别对科罗拉多马铃薯甲虫 (Coloradopotato beetle) 四龄幼虫和成 虫烟粉虱具有毒性作用 (Antonious 等， 2005， JEnviron Sci Health B 40 ： 619-631)。
Antonious 和 Kochhar(J Environm Science and Health B， 2003， B38 ： 489-500) 从野生番茄登记株中提取并定量了姜烯和姜黄烯， 目的在于选择可用于产生用于生产天然 杀虫剂的倍半萜烃类的野生番茄登记株。然而， 尚未公开这些化合物是否能够用作粉虱驱 除剂或引诱剂。已提及， 姜烯与科罗拉多甲虫抗性和甜菜夜蛾 (beet armyworm) 抗性相关， 而姜黄烯与杀虫作用相关。据称野生番茄种 L.hirsutum f.typicum 对银叶粉虱具有抗性 (Heinz 等， 1995， 88 ： 1494-1502)， 但是， 基于腺毛的植物抗性显然可具有多种原因， 从该文 献无法推断出具有引诱或驱除粉虱之性能的化合物的存在或身份。
Kostyukovsky 等 (Acta Horticulturae 2002， 576， 347-358) 发现将植物精油 ( 桉 树脑、 黄樟脑、 来自唇形科 (Labiatae) 或茴香 (Foeniculumvulgare) 的精油或者 M- 溴化 物 ) 的熏蒸剂以 10 ～ 20mg/l 的浓度施加在切花害虫 ( 例如烟粉虱 ) 上导致暴露 2 ～ 4 小 时后死亡 ( 参见表 5)。
Freitas 等 (Euphytica 2002， 127 ： 275-287) 研究了 L.esculentum( 栽培番茄， 姜 烯含量低 ) 和野生 L.hirsutum var.hirsutum( 姜烯含量高 ) 种间杂交中产生倍半萜姜烯和腺毛 I、 IV、 VI 和 VII 型的基因的遗传特性。F2 植物中的姜烯含量与银叶粉虱抗性相关， 这 提示培育同时具有高水平姜烯、 2- 十三酮和 / 或酰基糖 (acylsugar) 的植物具有高水平的 粉虱抗性。然而， 培育害虫抗性在根本上不同于开发害虫驱除剂或引诱剂组合物。没有有 关合成或纯化姜烯如本文用作粉虱驱除剂或者与其它化合物组合用作粉虱驱除剂的提示。 发明内容
本发明人发现 10 种萜 ( 或萜类似物 ) 涉及吸汁昆虫害虫 ( 特别是粉虱 ) 的驱除 / 引诱。这些化合物可单独或组合用于制备有效的昆虫驱除剂和 / 或昆虫引诱剂组合物。 本发明提供了昆虫驱除剂组合物 ( 特别是驱除吸汁农作物昆虫害虫， 优选粉虱 )， 其包含以 下七种化合物中的一种或多种或者由其组成 ： 姜黄烯， 尤其是 α- 姜黄烯 ( 倍半萜 ) ； 月桂 烯， 尤其是 β- 月桂烯 ( 单萜 ) ； 伞花烃， 尤其是对伞花烃 ( 涉及单萜的烃 ) ； 松油烯， 特别 是 γ- 松油烯 ( 单萜 ) 和 / 或 α- 松油烯 ( 单萜 ) ； 姜烯 ( 倍半萜 ) 和 / 或水芹烯， 尤其是 α- 水芹烯 ( 单萜 )。本发明还提供了使用这些的方法， 以及包含这些的分配器或其它容器 或支持材料。
本发明提供了昆虫引诱剂组合物 ( 特别是引诱吸汁农作物昆虫害虫， 优选粉虱 )， 其包含以下三种化合物中的一种或多种或者由其组成 ： 水芹烯， 尤其是 β- 水芹烯 ( 单 萜)； 柠檬烯 (D- 和 / 或 L- 异构体 )( 单萜 ) 和 / 或 2- 蒈烯 ( 单萜 )。本发明还提供了使 用这些的方法以及包含这些的分配器或其它容器或材料。 在本发明的另一实施方案中， 上述驱除剂或引诱剂化合物或组合物用于引诱或驱 除蚊科 ( 双翅目 (Diptera)) 昆虫和 / 或蠓科昆虫， 尤其是具有刺激性并且可能传播疾病给 人和动物的吸血昆虫 ( 例如蚊子 )。
一般性定义
“植物昆虫害虫” 或 “植物害虫” 或 “昆虫害虫” 或 “植物害虫物种” 是通过侵染植 物或植物的部分对作物和 / 或观赏性植物 ( 宿主植物物种 ) 造成侵染和损害的昆虫物种。 “侵染” 是在一个区域 ( 例如田间或温室 ) 中、 在宿主植物的表面上或在任何可能接触宿主 植物的物体上或者在土壤中存在大量害虫生物。昆虫害虫包括吸汁害虫 ( 见下文 ) 以及其 它害虫 ( 例如蓟马、 蝉、 螨 ( 例如叶螨等 ) 和叶蝉 )。
“哺乳动物昆虫害虫” 或 “哺乳动物疾病载体” 在本文中是指双翅目昆虫， 其为吸血 / 蜇咬昆虫， 并且有可能作为人和 / 或哺乳动物疾病 ( 例如疟疾 ) 的载体 ( 不必然如此， 它 们可能仅具有刺激性 )。在本文中提及 “昆虫害虫” 时， 应当理解本文的相应部分也以类似 于针对植物害虫的方式适用于攻击动物 ( 尤其是哺乳动物 ) 的昆虫， 不同之处仅在于它们 是吸血 / 蜇咬昆虫。
“吸汁昆虫害虫” 包括胸喙亚目 ( 昆虫纲 (Insecta)， 半翅目 (Hemiptera)) 的植物 害虫， 即包括木虱、 粉虱、 蚜虫、 粉蚧和介壳虫的昆虫害虫， 其具有共同的特质， 即利用植物 汁液作为其食物来源。
在 本 文 中， “蚜 虫” 包 括 蚜 科 (Aphididae) 植 物 昆 虫 害 虫，例 如 棉 蚜 (Aphisgossypii)、 黑 豆 蚜 (A.fabae)、 大 豆 蚜 (A.glycines)、 夹 竹 桃 蚜 (A.nerii)、 鼠 李 马 铃 薯 蚜 (A.nasturtii)、 桃 蚜 (Myzus persicae)、 黑 樱 桃 蚜 (M.cerasi)、 堇菜瘤 蚜 (M.ornatus)、 Nasonovia( 例 如 莴 苣 蚜 (N.ribisnigri))、长 管 蚜 (Macrosiphum)、
Brevicoryne 等。
“昆虫载体” 是能够携带和传播病毒给植物的昆虫。在哺乳动物疾病载体的情形 中， 昆虫载体是攻击哺乳动物并可能转播疾病给哺乳动物的昆虫 ( 例如蚊子 )， 其能够将寄 生虫疟原虫 (Plasmodium) 传播给人或者将心丝虫传播给犬类。
“粉 虱”是 指 小 粉 虱 属 的 物 种 ( 尤 其 是 烟 粉 虱 (B.tabaci) 和 银 叶 粉 虱 (B.argentifolii)( 也 称 为 烟 粉 虱 B 生 物 型 )) 和 / 或 蜡 粉 虱 属 ( 尤 其 是 温 室 粉 虱 (T.vaporariorum) 和 T.abutinolea( 条纹翅粉虱 (banded wingedwhitefly))。本文中包 括所有生物型， 例如烟粉虱的 Q 和 B 生物型， 以及任何发育阶段 ( 例如卵、 幼虫、 蛹和成虫 )。
“驱除” 化合物或组合物是指一种或多种下述化合物， 即驱除一种或多种昆虫害虫 ( 例如粉虱 )， 并且与未用所述驱除剂处理的相同区域和 / 或表面相比， 显著降低了所施加 区域和 / 或表面的由所述昆虫害虫 ( 例如粉虱 ) 导致的侵染和 / 或损害 ( 其中在施加驱除 剂后的一个或多个时间点进行测量 )。 “显著降低” 是数目减少至少 5％， 优选地至少 10％、 15％、 20％、 30％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％、 95％或更高 (100％ )。可以多种方式来测量 由所述昆虫害虫 ( 例如， 由粉虱 ) 导致的侵染和 / 或损害， 例如通过评估植物健康或者通过 评估例如昆虫害虫数、 所产昆虫卵、 昆虫对组织的探查、 病毒传播或影响、 产量损失、 植物组 织损伤或者昆虫侵染 / 损害的其它任何直接或间接症状等来实现。在哺乳动物昆虫害虫的 情形中， 可使用例如昆虫数、 昆虫蜇咬或疾病症状来评估和 / 或定量所述效果。 “引诱” 化合物或组合物是指一种或多种下述化合物， 即引诱一种或多种昆虫害虫 ( 尤其是吸汁昆虫害虫， 例如粉虱 )， 并且与未施加所述引诱剂的相同区域和 / 或表面相比， 显著增加了所施加区域和 / 或表面的害虫生物数 ( 例如粉虱 )( 其中在施加引诱剂后一个 或多个时间点进行测量 )。 “显著增加” 是数目增加至少 5％， 优选地至少 10％、 15％、 20％、 30％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％、 95％或更多。当将引诱剂施加于植物组织时， 可以用多 种方式测量引诱剂的效果， 例如通过评估施加所述引诱剂后一个或多个时间点的昆虫数或 者通过评估与昆虫侵染 / 损害相关的组织损伤或其它症状来实现。当将所述引诱剂施加于 其它支持材料 ( 例如非生物材料 / 区域 ( 诱捕器、 固体支持物等 )) 时， 评估经处理的材料 / 区域相对于未处理的材料 / 区域的昆虫数。在哺乳动物昆虫害虫的情形中， 可使用例如昆 虫数来评估和 / 或定量所述效果 ( 引诱 )。
驱除剂化合物或组合物的 “有效量” 是指， 与未处理的植物相比， 经处理的植物足 以显著降低由昆虫害虫 ( 尤其是由一种或多种吸汁昆虫害虫， 例如粉虱 ) 引起的侵染和 / 或损害的量。在哺乳动物昆虫害虫的情形中， 驱除剂化合物或组合物的有效量是指足以显 著驱除上述昆虫的量。
引诱剂化合物或组合物的 “有效量” 是指， 与未处理的区域或表面相比， 经处理的 区域中或经处理的表面上足以显著增加昆虫害虫 ( 尤其是一种或多种吸汁昆虫害虫 ( 例如 粉虱 ) 和 / 或其各阶段 ( 例如所产的卵 )) 数目的量。在哺乳动物昆虫害虫的情形中， 驱除 剂化合物或组合物的有效量是指足以显著引诱上述昆虫的量。
“活性成分” 是指制剂中具有生物活性的成分， 例如昆虫载体 / 害虫驱除剂或引诱 剂。 “惰性成分” 或 “非活性成分” 是指不具有生物活性的 ( 至少对于靶标昆虫载体来说 ) 的成分， 例如活性成分的介质 ( 例如水、 油或基于油的介质、 溶剂等 )。
“溶剂” 是溶解固体、 液体或气体溶质从而得到溶液、 分散体系或乳液的液体。
“诱捕器” 是指施加了有效量引诱剂化合物或组合物的材料。一般来说， 诱捕器可 以是施加了引诱剂化合物或组合物的多株植物 (“诱捕作物” 或 “诱捕植物” ) 或者容器 ( 例 如昆虫诱捕器 ) 或者表面或液体， 从而使昆虫被引诱进该诱捕器之中或引诱到该诱捕器之 上。所述引诱剂化合物或组合物也可称为 “诱饵制剂” 。
“杀虫剂” 是指 ( 与驱除剂不同地 ) 杀伤或灭活一个或多个阶段之昆虫的化合物或 组合物 ( 杀卵剂、 杀幼虫剂、 杀成虫剂等 )， 即它们影响死亡率而非昆虫的分布。
本文中的 “昆虫害虫捕食者” 或 “昆虫害虫寄生生物” 是指以昆虫害虫为食或者寄 生于昆虫害虫的生物。例如， 本文中的 “粉虱捕食者” 或 “寄生生物” 是指通过捕食和 / 或寄 生来减少粉虱数量的生物 ( 例如昆虫物种 )， 例如茶黄螨 (Polyphagotarsonemus latus)、 斯氏钝绥螨 (Amblyseius swirskii)、 草蛉、 多种甲虫等， 或者寄生蜂 ( 例如， 恩蚜小蜂属物 种 (Encarsia spp.) 和浆角蚜小蜂属 (Eretmocerus spp.))。
“宿主植物” 是指昆虫害虫的一种或多种天然宿主。例如， 粉虱具有较广的宿主范 围， 诸如但不限于番茄、 甜椒 (pepper)、 茄子、 莴苣 ； 芸苔属 (Brassica) 物种 ( 例如油菜、 西 兰花、 菜花和卷心菜作物 ) ； 葫芦， 例如黄瓜、 甜瓜、 南瓜、 西葫芦 ； 花生、 大豆、 棉花、 菜豆、 木 薯、 马铃薯、 甘薯和秋葵。优选宿主中还有观赏性物种， 例如木槿、 一品红、 百合、 鸢尾、 马缨 丹、 玫瑰和牵牛花。 “作物” 或 “作物植物” 或 “栽培植物” 是指人出于多种目的而培养的植物， 例如但 不限于从植物或植物部分中获得食物、 饲料或任何其它成分， 包括植物衍生产物 ( 例如油、 碳水化合物、 医用成分等 )， 还包括出于观赏性目的或社会经济目而栽培的植物 ( 例如高尔 夫球场、 运动场或公园的草坪 ( 生长草的区域 ) 或者森林或公园中栽培的植物等 )。 作物植 物可以在田间、 花园、 温室中或以任何其它方式培育， 并且可以小规模或大规模栽培。
最 近，番 茄 被 重 新 分 类 到 茄 属 中。 在 本 文 中， “栽 培 番 茄 (Lycopersiconesculentum)” 和 “栽培番茄 (Solanum lycopersicum)” 可互换地用于指代 栽培的番茄植物。类似地， 当指代野生番茄时， 可互换地使用潘那利番茄 (Lycopersicon pennelli) 和潘那利番茄 (Solanum pennelli)， 以及多毛番茄 (Lycopersicon hirsutum f.Glabratum) 和 多 毛 番 茄 (Lycopersiconhirsutum f.Typicum) 和 多 毛 番 茄 (Solanum habrochaites)。 类似地， 当指代野生番茄属物种时， 应理解这些现在被重新分类为茄属， 这 些属名可互换地使用。
“萜类” 是具有衍生自异戊二烯单元之碳骨架的烃类， 根据其碳数进行分类， 例如 C10 单萜、 C15 倍半萜、 C20 二萜、 C25 二倍半萜、 C30 三萜、 C40 四萜和 C5n 多萜。本文中它 们一般由惯用名表示， 例如在 Kirk-Othmer， Encyclopedia of Chemical Technology， 第 4 版， 23 卷， 833-882 页， 1997 中所述。本文中所用的术语 “萜 ( 类 )” 还包括通常称为 “类 萜” 、 萜和 / 或类萜类似物的化合物， 例如这些中任一的醇、 酯、 醛和酮， ( 天然或合成的 ) 异 构体， 以及合适的立体异构体和 / 或互变异构体。当提及本文中的具体异构体时 ( 例如 α 和 / 或 β 异构体 )， 应当理解还包括其它异构体， 并且只要其它异构体或异构体混合物是有 功能的则可替代所具体提及的异构体。
单萜还可根据碳骨架结构来区分， 可分为 “非环单萜” ( 例如月桂烯、 (Z)- 和 (E)- 罗勒烯、 芳樟醇、 香叶醇、 橙花醇、 香茅醇、 月桂烯醇、 香叶醛、 柠檬醛 a、 橙花醛、 柠檬醛 b、 香茅醛等 )， “单环单萜” ( 例如， 柠檬烯、 α- 和 γ- 松油烯、 α- 和 β- 水芹烯、 异松油烯、
薄荷醇、 香芹醇等。)， “二环单萜” ( 例如， α- 蒎烯、 β- 蒎烯、 桃金娘烯醇、 桃金娘烯醛、 马 鞭草烷醇、 马鞭草烷酮、 松香芹醇等 ) 和 “三环单萜” ( 例如， 三环萜 )。参见 Kirk-Othmer， Encyclopedia of Chemical Technology， 第 4 版， 23 卷， 834-835 页， 1997。
在本文及其权利要求中， 动词 “包含 / 包括” 及其动词变化以非限制性含义用于表 示包含该词之后的项， 但是不排除未具体提及的项。 另外， 无数量词修饰的要素不排除存在 多于一个 ( 种 ) 该要素的可能性， 除非上下文明确要求有且只有一个 ( 种 ) 该要素。因此， 无数量词修饰时通常指 “至少一个 ( 种 )” 。
应当理解， 除非另有指明， 本文中提及 “植物” 时还涵盖植物的部分 ( 细胞、 组织或 器官、 种子、 切下或收获的部分、 叶、 苗、 花、 花粉、 果实、 茎、 根、 愈伤组织、 原生质体等 )、 保留 亲本之区别特征的植物后代或营养繁殖体 ( 例如通过自交或杂交获得的种子， 例如杂交种 子 ( 通过使两株近交亲本株系杂交获得 ))、 从其产生的杂交植物和植物部分。
发明详述
在一个实施方案中， 本发明涉及具有昆虫驱除剂或昆虫引诱剂性能的化合物以及 包含一种或多种这些化合物的组合物或由这些化合物组成的组合物。
化合物和组合物
粉虱利用视觉线索和化学线索来发现其寄主植物。在使用番茄植株的自由选择 捕回测定 ( 其中除去了视觉线索 ) 中发现， 与多种野生番茄物种 ( 潘那利番茄 (Solanum pennelli)， LA716 ； 多 毛 番 茄 (Solanumhabrochaites f.Typicum)， PI27826 ； 多毛番茄 (Solanum habrochaites f.glabratum， 也称为 L.hirsutum f.Glabratum)， PI126449) 相 比， 粉虱更偏好栽培的 L.esculentum(Moneymaker 栽培品种 )。 当取下野生番茄植株的顶空 物质， 将其溶于戊烷 - 醚并 ( 利用滤纸载体 ) 加至栽培的 Moneymaker， 该栽培品种对粉虱 ( 烟粉虱， Q 生物型 ) 的引诱降低了多达 60％， 而施加对照 ( 溶剂戊烷 - 醚 ) 则对引诱 / 驱 除无影响。参见实施例 1。
在大型实验中 ( 参见实施例 2)， 对 16 株野生番茄登记株和 5 株栽培番茄株系的顶 空物质取样并进行分析 ( 重复 6 次 )。总共鉴定出 51 种化合物存在于所取样的顶空物质 中。此外， 在自由选择生物测定中使用烟粉虱 (Q 生物型 ) 确定 21 株番茄登记株中每一株 的驱除 / 引诱水平， 其中使用 1 ～ 7 的分级 (1 ＝最高驱除性， 至 7 ＝最低驱除性 )。然后， 通过线性回归分析将所鉴定的挥发性化合物与每个番茄登记株的驱除 / 引诱得分相关联。 最终， 发现 7 种挥发性组分与粉虱驱除性有关， 3 种挥发性组分显示与粉虱引诱性有关 ( 表 1)。
表 1- 挥发性芳香烃
表 1 中所述的各种纯化合物 ( 化学合成或购自市售供应商 ) 的粉虱驱除剂或引诱 剂性能经过生物测定的证实 ( 实施例 3)。此外， 对两种或更多种驱除剂或者两种或更多种 引诱剂之混合物的效力和可能的协同效应进行了测试。在使用经改造之嗅觉检测器端口 (Olfactory Detector Port) 的触角电生理学实验中证实了烟粉虱应答与表 1 化合物 ( 单 独的或其混合物 ) 的直接相关性 ( 实施例 4)。以这种方式， 将表 1 的各种挥发性化合物或 者表 1 中两种或更多种化合物的混合物通过电极与粉虱的触角直接接触， 并确定 EAD- 电势 ( 触角电位检测， Electro-antennographic detection)。
上述研究发现可扩展至其它昆虫害虫， 例如其它吸汁的昆虫、 蓟马、 螨等， 例如 哺乳动物昆虫害虫。蓟马包括例如烟蓟马 (Thrips tabaci)、 西花蓟马 (Frankliniella occidentalis)、 褐翅蓟马 (Thrips fuscipennis)、 美棘蓟马 (Echinothrips americanus) 等。 螨 包 括 例 如 所 谓 的 叶 螨 类 ( 叶 螨 科 (Tetranychidae))、 跗线螨类 ( 跗线螨科 (Tarsonemidae)) 以及瘿螨类。
因此， 在一个实施方案中， 本发明提供了昆虫驱除剂 ( 尤其是吸汁昆虫的驱除剂、 蓟马和 / 或螨驱除剂， 优选至少是粉虱的驱除剂 ) 组合物， 其包含有效量的一种或多种下列 化合物或者由其组成 ： α- 姜黄烯、 β- 月桂烯、 对伞花烃、 γ- 松油烯、 α- 松油烯、 α- 水 芹烯和 / 或姜烯。
两种或更多种驱除剂化合物的组合包括下列优选组合 ：
- 表姜烯 (epizingiberene) 与 S- 姜黄烯组合 ；
-β- 月桂烯与对伞花烃和 / 或 γ 或 α 松油烯、 S- 姜黄烯和 / 或姜烯组合 ；
- 对伞花烃与 β- 月桂烯和 / 或 γ- 松油烯 ；
- 对伞花烃和 α- 松油烯和 / 或 α- 水芹烯 ；
-2、 3、 4、 5、 6 或 7 种驱除剂化合物的任意组合， 其中所述组合优选不存在于自然界 中和 / 或不以本文提供的纯度 ( 不含其它化合物 )、 浓度和 / 或比例存在 ；
在另一实施方案中， 本发明提供了昆虫引诱剂 ( 尤其是吸汁昆虫的引诱剂、 蓟马 和 / 或螨引诱剂， 优选至少是粉虱的引诱剂 ) 组合物， 其包含有效量的下列一种或多种化合 物或者由其组成 ： β- 水芹烯、 柠檬烯和 / 或 2- 蒈烯。因此， 两种或更多种引诱剂化合物的 组合包括下列组合 ：
-β- 水芹烯和柠檬烯 ；
-β- 水芹烯和 2- 蒈烯 ；
- 柠檬烯和 2- 蒈烯 ； 以及
-β- 水芹烯、 柠檬烯和 2- 蒈烯。
对于一种或多种不同的昆虫害虫来说， 上述化合物针对引诱或驱除效果的排位可 有所不同。可通过本文其它部分所述的生物测定或从其改造的生物测定来测试 7 种驱除剂 化合物中哪种作为一种或多种昆虫害虫之驱除剂单独施加时最有效， 3 种引诱剂化合物中 哪种作为一种或多种昆虫害虫之引诱剂最有效 ( 优选吸汁昆虫害虫、 蓟马和 / 或螨 ； 最优选 至少为粉虱 )。
类似地， 对于引诱或驱除一种或多种昆虫害虫而言， 可使用本文其它部分所述的 生物测定而无需过度实验来测试选自 7 种驱除剂或选自 3 种引诱剂的两种或更多种化合物 的哪种组合最有效。协同作用组合是这样的组合， 即共同施加所述化合物的作用 ( 例如， 作 为混合物或者先后施加到同一区域 ) 大于单独施加该化合物所实现的效果。
当使用两种化合物的混合物时， 多种比例可以在引诱或驱除一种或多种昆虫害虫 中是最有效的。可能合适的比例有 100 ∶ 1、 50 ∶ 1、 10 ∶ 1、 5 ∶ 1、 2 ∶ 1、 1 ∶ 1、 1 ∶ 2、 1 ∶ 5、 1 ∶ 10、 1 ∶ 50、 1 ∶ 100 或其间的任意比例。
当 使 用 三 种 化 合 物 的 混 合 物 时， 合 适 的 比 例 可 包 括 1 ∶ 1 ∶ 1、 1 ∶ 2 ∶ 1、 1 ∶ 2 ∶ 2、 1 ∶ 10 ∶ 10 等。合适的比例也参见表 3。本领域技术人员能够确定何种比值 对于特定昆虫物种来说是最合适的。
在本发明的一个实施方案中， 包含 ( 有效量的 ) 至少一种、 两种、 三种或更多种 的选自上述组的引诱剂或驱除剂化合物的组合物或者由其组成的组合物基本上 ( 即， ＞ 90％， 尤其是＞ 95％、 ＞ 98％或＞ 99％ ) 或完全 ( 即， 100％ ) 不含其它未选的萜或类萜化 合物， 尤其是未选的植物天然产生的萜和 / 或类萜化合物。因此， 所述组合物的活性成分仅 包含有效量的所选化合物或化合物之组合。因此， 所述组合物不是天然植物顶空物质的组 合物 ( 即， 在非转基因植物 ( 例如栽培或野生植物 ) 天然产生的顶空物质组合物 )， 因为这 些天然顶空物质组合物含有多种萜类和类萜。 这些天然顶空物质组合物可随时间或不同环 境条件而发生变化。与之不同的是， 本发明的组合物是确定的组合物。
所述化合物可通过化学合成制备 (Millar 等， 1998， J.Nat.Prod61 ： 1025-1026)， 或者从天然来源 ( 例如， 植物、 植物组织或顶空物质 ) 进行纯化， 其中使用本领域已知 的方法 ( 例如， 如常用于从植物获得精油 / 香精油组分的蒸馏 (Agarwal 等， 2001， Pest Man.Sci.， 57 ： 289-300)、体 内 产 生 (Colby 等， 1998， PNAS 95 ： 2216-2221 ； Chang 等， 2007， Nat.Chem.Biol.， 3： 274-277) 和 / 或常规溶剂提取方法 ( 参见例如 Peng 等， 2004， J.Chromatogr.A.， 1040 ： 1-17 ； Eikani 等， 2006， J.Food Eng.， 80 ： 735-740 ； Durling 等， 2006， Food Chem.， 101 ： 1417-1424) 来实现。对于蒸馏来说， 将原始植物材料 ( 例如叶、 根、 花、 果皮等 ) 置于水上的蒸馏器中并加热。蒸汽使挥发性物质蒸发， 然后浓缩并收集蒸汽。 然后， 可进一步对馏出物进行分级分离 ( 例如通过溶剂提取来实现 ) 或者富集特定的化合 物。或者， 所述原料主要包含待纯化的挥发性物质。
从组织进行溶剂提取使用例如己烷或超临界状态的二氧化碳和 / 或乙醇来提取 挥发性物质， 其任选地与蒸馏步骤相结合。还可使用溶剂 ( 例如戊烷醚 ) 提取顶空挥发性 物质。优选地， 使用相对纯的化合物， 即不含植物组织、 蜡、 树脂或其它植物来源杂质的 化合物， 并且基本上不含不期望的萜类， 优选使用合成化合物和 / 或重组产生的化合物和 / 或基本上纯的化合物。因此， 在本发明的一个实施方案中， 各种化合物均 “基本上是纯的” ， 其中杂质 ( 例如不期望的烃类、 蛋白质、 蜡、 树脂、 DNA、 RNA、 糖、 细胞壁或其它植物组分 ) 少 于 10％， 更优选少于 5％， 优选少于 3％、 2％或 1％。
所述化合物还可从供应商处获得， 例如 Sigma-Aldrich( 参见 www.sigmaaldrich. com)。 例 如， β- 月 桂 烯 (Sigma-Aldrich 产 品 号 ： 64643， 纯 度 ≥ 95 ％ )、 对伞花烃 (Sigma-Aldrich 产品号 ： 30039， 纯度≥ 99.5 ％ ) 和 γ- 松油烯 (Sigma-Aldrich 产品号 ： 86476， 纯度≥ 98.5％ ) 可获得自 Sigma-Aldrich， (+)- 柠檬烯和 (-)- 柠檬烯或者这两种 对 映 体 (Sigma-Aldrich 产 品 号 ： 62118、 62128、 89188) 以 及 (+)2- 蒈 烯 (Sigma-Aldrich 产品号 ： 21984)、 α- 水芹烯 (Sigma-Aldrich 产品号 ： 77429， 纯度≥ 95％ ) 和 α- 松油烯 (Sigma-Aldrich 产品号 ： 88473， 纯度≥ 95％ ) 亦可获得自 Sigma-Aldrich。
姜烯和姜黄烯还可分离自姜油， 例如通过化学修饰和随后的蒸馏来实现， 如 Millar(1998， J.Nat.Proc.61 ： 1025-1026) 所述。可从头化学合成化合物 ( 例如 β- 水芹 烯 )( 参见例如 US 4,1361,26)。
还可以在重组微生物 ( 例如细菌 ( 如大肠杆菌 (E.coli)) 或真菌 ( 如酵母， 例如毕 赤酵母 (Pichia) 或汉逊酵母 (Hansenula)) 中产生上述单萜和 / 或倍半萜化合物。在微生 物中表达一种或多种基因 ( 优选化合物分泌到培养基中 ) 允许更大量、 更廉价的产生待制 备的纯化合物 ( 不含其它单萜和倍半萜 )。例如， WO2006/065126 描述了萜的羟基化， 其中 例如柠檬烯可由表达细胞色素 P450 酶之微生物宿主中合适的底物而产生。 还参见 Reiling 等人 (Biotechnol.Bioeng.2004， 87 ： 200-212)， 其描述了在大肠杆菌中产生单萜和二萜。
包含一种或多种上述这些或者由其组成的化合物和 / 或组合物可采用挥发性物 质 / 气体、 液体、 半固体 ( 例如， 凝胶珠、 霜、 泡沫等 ) 或者固体 ( 颗粒、 粉末等 ) 的形式。因 此， 它们可含有惰性介质， 例如溶剂 ( 例如醇 ( 例如乙醇 ) 或醚 ( 例如戊烷醚 ) 或另外的有 机溶剂 ( 例如己烷 ))， 其优选对粉虱的行为没有任何作用。除了溶于溶剂 ( 例如醇或醇混 合物或醚 ) 中以外， 还可使用基于油的介质。水通常不是非常合适的介质， 因为这些亲脂性 化合物在水中的互溶性低或不互溶。所述化合物的配制应采用如下方式 ： 易于施加到目标 位置， 并且影响昆虫的行为 ( 优选显著影响所施加区域中昆虫的分布 )。在一个实施方案 中， 将所述驱除剂化合物和 / 或组合物施加于多株作物植物， 同时优选将所述引诱剂组合 物施加到不同于所述作物植物的位置 ( 例如， 间植于作物行之间的较宽诱捕作物或 “诱捕 行” 。当施加于植物时 ( 例如在田间或温室中 )， 可优选采用可喷洒或散布在地上植物表面 上的气体、 液体 ( 例如， 其接触空气后蒸发 ) 或半固体形式。固体制剂包括颗粒、 粉末、 缓慢 释放基质 ( 例如， 活性成分外周的使活性成分缓慢释放的包衣或基质 ) 等。所述活性成分 和介质 ( 例如溶剂 ) 还可置于固体容器中， 例如挥发性物质从中缓慢释放的橡胶隔板 ( 有 市售 )。
然而， 本文中设想了用于本发明引诱剂制剂和驱除剂制剂的所有制剂类型。本 领域技术人员会了解如何制备合适的制剂， 其考虑下列因素 ： 1. 活性成分百分比， 2. 操作 和混合的简便性， 3. 对于人和非靶标动物 ( 例如昆虫害虫捕食者或寄生生物 ) 的安全性， 4. 待施用制剂的环境 ( 田间、 温室等 )， 5. 靶标昆虫 ( 例如粉虱和 / 或其它昆虫害虫 ) 的习性， 6. 待保护的作物以及可能对作物的伤害。 一般来说， 适用于植物杀虫剂的制剂可用于或 经改造用于制备本发明的驱除剂或引诱剂制剂。制剂类型包括 ：
a) 乳化浓缩物 (EC) 制剂， 其为液体制剂， 其中活性成分溶于油或其它溶剂中并且 其中加入乳化剂使得该制剂可与油或水混合以用于喷洒。
b) 高浓度液体、 喷洒浓缩物和 ULV 浓缩物 (ultra low volumeconcentrate， 超低 容量浓缩物 )， 其含有高浓度的活性成分并且通常通过与油或水混合进行稀释， 或者不经稀 释直接使用。
c) 低浓度液体或油溶液， 其通常无须进行另外稀释并包含合适施用剂量的活性成 分。
d) 对于不能很好地溶于水或油的活性成分， 可制备可流动液体。所述活性成分是 经粉碎或细粉末形式的固体。然后， 将微细固体悬于液体中 ( 连同助悬剂、 辅料和 / 或其它 成分 )。
e) 溶液或水溶性浓缩物， 其为通过将活性成分溶解于溶剂 ( 例如水或有机溶剂 ) 中制得的液体制剂。
f) 胶囊化制剂， 其中活性成分包含在小的胶囊或包衣中， 所述胶囊或包衣可继而 例如悬于液体中 ( 例如用于喷洒 )。 g) 粉尘制剂， 其以干燥形式施用。它们包含任选地与其它粉末 ( 例如滑石等 ) 混 合的 ( 例如粉碎得很细的 ) 固体形式活性成分。
h) 颗粒剂， 其由已施加活性成分的干燥多孔材料制备。 颗粒制剂常施加于土壤， 但 也可将它们施加于植物。
i) 可湿性粉剂， 其为干燥的粉末制剂。 与粉尘制剂不同的是， 该制剂中存在润湿剂 和 / 或分散剂。它们常含有较之粉尘制剂浓度更高的活性成分， 例如 15％～ 95％的活性成 分。
j) 可溶性粉剂， 其类似于可湿性粉剂， 但是完全溶解于溶液中。
k) 干燥的可流动制剂， 其看似颗粒， 但是以与可湿性粉剂同样的方式使用。
l) 液化气和 / 或熏剂， 其为液化的挥发性或气体制剂。某些挥发性物质可例如在 压力下形成液体， 在某些条件下 ( 例如压力一经释放时 ) 又会变为蒸汽 ( 挥发性物质 )。汽 化的活性成分 ( 挥发性的 ) 一经释放便会具有所期望的作用。所述制剂可释放到土壤中或 者遮盖物 ( 例如防水布 ( 帆布 )) 之下， 或者释放到 ( 相对 ) 封闭的环境中。还可将 ( 液化 的或气态的 ) 活性成分掺入胶囊、 凝胶或其它基质中， 其将汽化的活性成分缓慢释放到大 气中。
m) 饵剂是指含有本发明一种或多种引诱剂化合物的制剂。任选地， 它们可含有其 它引诱剂或者对靶标昆虫物种和 / 或其它昆虫物种具有毒性的化合物， 例如它们可含有在 被摄入或接触后杀伤靶标昆虫 ( 和 / 或其它昆虫 )( 例如粉虱 ) 的一种或多种杀虫剂。因 而这些毒剂不需要包含在所述引诱剂制剂中， 而是也可作为单独的组分施用于靶标区域或 靶标植物 ( 例如， 在施用所述引诱剂化合物或组合物之前、 之后或同时 )。这样的组合物试 剂盒也是本发明的实施方案。
n) 气雾剂是在压力下储存的气体制剂， 例如在罐中。
上述 1) 中的制剂是本文中尤其优选的。
制剂还可类似于用于昆虫驱除剂 DEET(N， N- 二乙基 -m- 甲苯甲酰胺或 N， N- 二乙 基 -3- 甲基苯甲酰胺 ) 的制剂， 尤其是当驱除哺乳动物疾病载体时。 DEET 可制备于大于 200 种制剂中， 例如气雾剂喷雾、 非气雾剂喷雾、 霜剂、 洗剂、 泡沫、 棒、 受控释放制剂 ( 包裹于蛋 白质中 ) 等， 其具有 4 ～ 100％的活性成分。关于挥发性昆虫驱除剂制剂和缓慢释放制剂， 另外参见 US4774082 和 US6180127。
类似地， 本发明可使用常用于挥发性除草剂的制剂 ( 例如挥发性酯除草剂 )， 参见 例如 US 3,725,031 或 Day， Weed Research， 第 1 卷， 第 3 期， 177-183 页， 1961 年 9 月， 其描 述了施加于叶的挥发性制剂茅草枯 (Dalapon) 减少土壤污染。
任选地， 可将其它组分加入所述活性成分 ( 驱除剂或引诱剂 ) 中， 例如营养物、 渗 透剂、 一种或多种合适介质、 稀释剂、 乳化剂、 润湿剂、 表面活性剂、 分散剂、 辅料、 挥发性物 质、 稳定剂等。 “介质” 是指与所述活性成分联用但是其本身至少对于靶标昆虫物种 ( 例如 粉虱 ) 来说没有显著生物活性的化合物。优选地， 所用的介质对植物 ( 例如宿主作物 ) 也 不具有负面的生物学作用， 即它们优选不具有或具有极小的植物毒性。 介质可以是气体、 液 体 ( 例如挥发性液体 ) 或固体， 并且它们可以是水、 油、 包含油的溶液 ( 例如乳剂 )、 溶剂等。
取决于所述活性成分的活性、 制剂类型、 施加位点和模式等， 最终引诱剂或驱除剂 组合物中活性成分百分比可有很大的不同。 活性成分的百分比因此可以是组合物的至少约 1％、 2％、 5％、 10％、 30％、 50％、 70％、 80％、 90％、 95％或者甚至 100％ ( 重量 / 体积 )。 因此， 可以将包含一种或多种活性成分 ( 一种或多种驱除剂或者一种或多种引诱 剂 ) 的组合物施加到待处理的植物或区域， 例如从运载体 (carrier) 通过喷洒或通过汽化 来实现。另外， 还可将驱除剂组合物置于植物之间 ( 例如利用运载体来实现 )， 而包含一种 或多种引诱剂或者由其组成的组合物优选置于诱捕器中 / 上或者待保护植物附近的位置 中 / 上。
本发明的组合物还可包含其它生物活性化合物， 例如本领域已知的其它昆虫引诱 剂或驱除剂、 杀虫剂等。另外， 不同阶段的靶标昆虫可能对于一种化合物比另一种更加敏 感， 因此可以将靶向不同阶段害虫物种的化合物 ( 本发明的化合物和 / 或本领域已知的化 合物 ) 相组合。类似地， 可通过组合有效量的针对每种害虫物种的化合物 ( 本发明的化合 物和 / 或本领域已知的化合物 ) 来靶向不同的害虫物种。
驱除剂或引诱剂组合物还可包含杀虫剂、 除草剂 ( 如果待处理宿主植物是除草剂 抗性的， 例如转基因除草剂抗性植物 )、 杀真菌剂和 / 或其它生物活性成分 ( 例如生长增强 剂、 除草剂安全剂 (safener)、 肥料等。
昆虫引诱剂组合物还可含有一种或多种杀虫剂， 以破坏昆虫存活和 / 或繁殖。还 可将引诱靶标昆虫 ( 例如粉虱 ) 的昆虫信息素添加到所述引诱剂组合物中。类似地， 针对 靶标昆虫之捕食者的引诱剂也可包含在所述组合物中。
优选地， 所述组合物不包含对植物 ( 例如宿主作物或诱捕植物 ) 具有负面生物学 效应的物质， 即它们优选地对宿主植物和 / 或诱捕植物物种不具有或者具有很小的植物毒 性。可以简单地通过将所述组分或组合物与植物组织 ( 例如叶 ) 接触来检测各组分或组合 物的植物毒性。另外， 所述组合物优选地对非靶标昆虫 ( 例如粉虱的捕食者 ) 不具有负面 作用。
所述组合物中应存在用于引诱或驱除靶标害虫 ( 例如粉虱 ) 的有效量。合适的量
在下文表 2 中提供 ( 尤其针对粉虱， 但不仅限于此 )。合适的量可以是在 24 小时中释放至 少约 0.5、 1、 2、 3、 4 或 5μg 挥发性化合物至每 24 小时释放至少约 10、 20、 30、 50、 100、 200、 300、 400、 500、 600、 800、 900 或 1000μg 或者更多所述挥发性化合物， 或与其等价的量。 合适 的量还可以表示为每千克待处理生物量 ( 鲜重 ) 的量， 例如每千克生物量每 24 小时至少约 0.01mg 化合物至每千克待处理生物量每 24 小时至少约 60、 70、 80、 90 或 100mg 化合物。例 如， 有效量包括至少约 0.05mg/kg/24h， 0.1、 0.2、 0.5、 1.0、 2.0、 3.0、 4.0、 5.0、 6.0、 7.0、 8.0、 9.0、 10、 15、 20、 30、 40、 50mg/kg/24h， 或者更多 ； 非限制性的实施例另见表 2。对于其它昆虫 害虫来说， 可能需要不同的量， 但是其可以使用例如生物测定而无需进行过度实验来测试。 因此， 所述有效量可以在不使用过度实验的情况下通过实验确定。其可根据制剂和应用区 域而有所变化。温室 ( 封闭环境 ) 需要的量可以比田间环境低。重要的是， 与未处理的对 照植物相比， 靶标害虫 ( 其已探查与包含驱除剂或由其组成之组合物相接触的植物组织 ) ( 例如粉虱 ) 的数目显著降低， 因而对经处理植物的病毒传播和病毒损害也降低。
表 2- 昆虫驱除剂或引诱剂的合适量 ( 尤其针对粉虱 )
FW ＝鲜重
在一个实施方案中， 包含一种或多种驱除剂化合物或由其组成的所述组合物与在 不同的非引诱 ( 驱除 ) 野生番茄植株中所测的浓度和 / 或化合物比例相似 ( 参见下表 3)， 但是缺乏这些植物中天然存在的其它萜和 / 或萜品烯 (terpenene) 化合物。
表 3. 有效化合物的比例
显然， 还可适当地使用上文表 2 和表 3 中未列出的其它量和其它比例， 例如用于其 它昆虫或者昆虫 - 宿主组合。使用例如生物测定 ( 见下文 ) 或田间测定， 本领域技术人员 无需过度劳动就可确定最合适的量和 / 或比例。
可容易地测试一种或多种活性成分的量对于引诱或驱除靶标害虫 ( 例如粉虱 ) 来 说是否是 “有效量的” 。例如， 下列生物测定可用于粉虱和 / 或其它靶标害虫。显然， 本领域 技术人员可设想到类似的生物测定。
合适的生物测定包括例如下列步骤 ：
(a) 提供多株宿主植物， 例如番茄栽培品种 ；
(b) 将所述植物与一种或多种化合物和 / 或与一种或多种浓度的化合物或化合物 混合物 ( 或者包含这些的组合物 ) 直接或间接地接触。可通过在植物上或其附近包含已添 加了所述化合物的支持物 ( 例如橡胶隔板 ( 例如 Sigma Aldrich Z167258) 或滤纸盘 ) 来 进行间接接触。例如， 可将负载有一种或多种挥发性化合物的橡胶隔板添加到植物 ( “经处 理” 植物 )， 但不添加到对照 ( 对照或参照植物， 或 “未处理” 植物 )。参照植物与对照组合 物 ( 例如， 缺乏活性成分的组合物 ) 接触或者不与所述化合物 / 组合物接触 ；
(c) 将靶标昆虫释放到所述经处理和未处理植物的区域， 使所述昆虫落在所述 植物上 ； 优选使所述靶标昆虫以这样的方式释放， 即释放本身不导致针对经处理或未处理 / 对照植物的偏好性 ； 另外， 还优选减少或消除可影响昆虫行为的其它线索 ( 例如视觉线 索 )， 从而使所述昆虫针对经处理和未处理 / 对照植物的降落、 探查和 / 或进食不受其它线 索的影响 ( 或者尽可能小的影响 ) ；
(d) 在释放后的一个或多个时间点 ( 例如在释放后 10、 20、 40、 60 分钟或更长时 间 ) 分析所述昆虫的植物偏好， 并对所述经处理植物上的昆虫数与未处理植物上的昆虫数 进行比较。
优选地， 对数据进行统计学分析， 以确定一种或多种化合物是否具有引诱剂或驱 除剂作用或者引诱剂或驱除剂化合物或化合物混合物的最佳浓度。 针对粉虱的合适生物测 定另见实施例。
取决于昆虫物种， 实验设置可作略微变动。 例如， 对于粉虱而言， 优选至少 50、 100、 150 或更多只粉虱在经处理和未处理 / 对照植物之间做出选择。
本发明的用途
本发明提供了 α- 姜黄烯 (α-curcumene)、 β- 月桂烯 (β-myrcene)、 对伞花 烃 (para-cymene)、 γ- 松油烯 (γ-terpinene)、 α- 松油烯 (α-terpinene)、 α- 水芹烯 (α-phellandrine) 和 / 或姜烯 (zingiberene) 中的一种或多种用于制备昆虫驱除剂组合
物 ( 优选吸汁害虫的驱除剂组合物， 最优选粉虱驱除剂组合物 ) 的用途。
在另一实施方案中， 本发明提供了 β- 水芹烯、 柠檬烯和 / 或 2- 蒈烯中的一种或 多种用于制备昆虫引诱剂组合物 ( 优选吸汁害虫的引诱剂组合物， 最优选粉虱引诱剂组合 物 ) 的用途。
在又一实施方案中， 本文提供了一种或多种上述驱除剂或引诱剂组合物用于驱除 或引诱哺乳动物昆虫害虫 ( 例如蚊子 ( 例如疟蚊、 黄热病蚊等 )) 的用途。其它哺乳动物 昆虫害虫包括例如苏格兰蠓或其它吸血蠓。这样的组合物 ( 尤其是驱除剂 ) 可作为喷雾、 霜剂、 溶液等施用到例如皮肤、 衣物、 布、 织物、 户外区域或室内区域等， 以发挥其作用。 尤其 是， 提供了驱蚊剂和 / 或蠓驱除剂， 其包含一种或多种有效量的表 1 中七种化合物或者由其 组成。在施加到皮肤或衣物后或者施加到人或动物驻留的环境 ( 例如作为气雾剂 ) 后， 或 者施加到运载体或支持物之后， 与未处理对照相比， 蚊子 ( 尤其是雌性蚊子 ) 的数量显著减 少。
确定一种或多种化合物和 / 或组合物之有效量的方法与针对植物害虫所用的方 法类似。 例如， 可使用类似的测定， 包括例如选择测定 (choiceassay)， 其中将所述昆虫置于 Y 形管中， 并使之沿着 Y 形管的任一分支逆风移动。在一个管中， 放置所述驱除剂或引诱剂 化合物， 并对作出特定选择的昆虫数进行计数。体内测试可包括 ：
(a) 提供多个哺乳动物对象 ；
(b) 将所述对象与一种或多种化合物和 / 或与一种或多种浓度的化合物或化合物 混合物 ( 或者包含这些的组合物 ) 直接或间接地接触。可通过将所述化合物或组合物添加 至衣物来实现间接接触。参照对象与对照组合物 ( 例如缺乏活性成分的组合物 ) 接触或者 不与所述化合物 / 组合物接触 ；
(c) 将所述靶标昆虫释放到经处理和未处理对象或其部分 ( 例如， 手臂或手 ) 的区 域， 并允许昆虫落下。
(d) 在释放后的一个或多个时间点 ( 例如在释放后 5、 10、 20、 40、 60 分钟或更长时 间 ) 分析所述昆虫的叮咬数， 并对所述经处理对象上的昆虫数与未处理对象上的昆虫数进 行比较。
本发明描述植物昆虫害虫的部分因而以类似方式适用于哺乳动物昆虫害虫， 并且 在涉及 “植物昆虫害虫” 时， 也类似地涵盖哺乳动物昆虫害虫， 其具有明显的变动 ( 例如， 支 持材料优选衣物或容器， 例如喷雾容器、 洗液容器等 )。
可根据下文进一步描述的方法使用所述组合物。
包含引诱剂化合物或组合物的支持材料
在另一实施方案中， 本发明提供了 β- 水芹烯、 柠檬烯和 / 或 2- 蒈烯中的一种或 多种用于制备包含昆虫害虫 ( 例如粉虱 ) 引诱剂组合物之支持材料的用途。包含本发明引 诱剂化合物或组合物的支持材料本身也是本发明的一个实施方案。 所述材料优选为所述引 诱剂组合物置于其上或其中的容器、 支架或其它固体支持物。 所述固体材料可以是诱捕器， 例如已知的昆虫诱捕器。或者， 所述固体材料可以是如上所述的挥发物质分配器。所述支 持材料还可以是一种或多种诱捕植物或者其部分 ( 例如叶 )。优选的诱捕植物是易受靶标 昆虫 ( 例如粉虱 ) 影响并且是所述靶标昆虫害虫物种之天然宿主的植物物种和 / 或品种。 例如， 可使用栽培的番茄物种， 其中将所述引诱剂施加于地上植物材料上。或者， 可将包含所述引诱剂的材料 ( 例如橡胶隔板或滤纸 ) 添加至植物或者植物之间， 从而避免所述组合 物可能的植物毒性作用。通过将所述化合物或组合物添加至所述支持材料， 避免了所述化 合物或组合物与所述植物组织的直接接触。
可使用任何支持材料。因此， 所述固体材料可以是例如滤纸 ( 所述引诱剂已通过 例如点样、 喷洒或浸渍施加于其上 ) 或者橡胶或合成材料 ( 例如橡胶隔板 )。所述固体材 料可以由塑料、 固体合成材料、 聚合物、 金属、 玻璃、 纸、 硬纸板 (carton)、 生物材料 ( 例如木 料、 软木等 ) 等制成。其可以采用管、 盘、 块、 盒、 立方体、 珠、 ( 纳米 ) 颗粒或微粒等形式。合 适的橡胶隔板例如可得自 Sigma-Aldrich(Z167258)。 半固体支持材料可以是凝胶 ( 例如琼 脂 )、 泡沫或霜。
包含驱除剂化合物或组合物的支持材料
在另一实施方案中， 本发明提供了 α- 姜黄烯、 β- 月桂烯、 对伞花烃、 γ- 松油烯、 α- 松油烯、 α- 水芹烯和 / 或姜烯中的一种或多种用于制备包含昆虫害虫 ( 例如粉虱 ) 驱 除剂组合物之支持材料的用途。 包含本发明驱除剂化合物或组合物的支持材料本身也是本 发明的一个实施方案。 所述材料可以是所述驱除剂组合物置于其上或其中的容器或其它固 体材料。 所述固体材料可以是缓慢释放材料 ( 例如凝胶或其它基质或容器 )， 其在较长时间 内缓慢释放挥发性物质。例如， 固体材料可以是如上所述的挥发性物质分配器。所述材料 还可以是一种或多种作物植物。优选的作物植物是待保护免受靶标昆虫害虫 ( 例如粉虱 ) 损害的植物物种和 / 或品种。例如， 通过向地上植物材料上或者种植田地中施加所述驱除 剂 ( 例如利用整个田地中均匀间距放置的运载体或分配器 ) 可保护栽培的宿主物种 ( 例如 番茄、 棉花、 葫芦科植物 (Curcubitaceae)、 马铃薯等免受昆虫害虫 ( 例如粉虱 ) 损害。 可将 包含所述驱除剂的支持物 ( 例如橡胶隔板或滤纸 ) 添加至一株或多株作物植物或者植物之 间， 从而避免所述组合物可能的植物毒性作用。通过将所述化合物或组合物添加至支持材 料， 避免了所述化合物或组合物与植物组织的直接接触。
如上文针对引诱剂支持物所述地， 可使用任何支持材料。
另见下文的方法。
使用本发明的化合物或组合物驱除和 / 或引诱昆虫害虫的方法
提供了用于减少昆虫害虫对栽培植物侵染的方法， 即用于驱除和 / 或引诱昆虫害 虫 ( 例如粉虱和 / 或其它昆虫害虫 ) 的方法， 其包括下列步骤 ：
(a) 提供包含选自 S- 姜黄烯、 β- 月桂烯、 对伞花烃、 γ- 松油烯、 α- 松油烯、 α- 水芹烯和 / 或姜烯之一种或多种驱除剂化合物或者由其组成的组合物 ； 和
(b) 将所述组合物向多株作物植物添加一次或多次 ； 和/或
(c) 提供包含选自 β- 水芹烯、 柠檬烯和 / 或 2- 蒈烯之一种或多种引诱剂化合物 或者由其组成的组合物， 和
(d) 将所述组合物向一株或多株诱捕植物或者一个或多个诱捕材料添加一次或多 次。
(a) 和 (c) 中的组合物如上文所述。任选地， 步骤 (a) 和 (b) 可重复多次。同样， 任选地， 步骤 (c) 和 (d) 可重复多次。很明显， 当需要保护作物时， 可将引诱剂组合物与驱 除剂组合物分开使用， 反之亦然， 或者二者可同时使用， 用以例如从作物驱除昆虫以及将昆 虫引诱至诱捕器， 其例如可位于所述作物附近或者散布于作物之间。 因此， 实质上提供了三种方法 ： (a) 通过驱除昆虫害虫来保护作物， (b) 通过引诱昆虫害虫远离作物植物来保护作 物， 以及 (c) 同时使用上述两种策略来减少昆虫对作物的侵染。
在步骤 (b) 中， 可将所述组合物直接添加到作物植物或其部分 ( 与之接触 )， 例如通过喷洒到所述植物上、 通过喷洒各株植物或各片叶子或者通过定点施加 (spot application) 至单片叶子、 通过熏蒸、 通过人工放置液体、 固体或半固体制剂于多株植物或 多个植物部分上、 通过喷撒等来实现。 因此， 可使用所述植物材料与所述化合物或组合物的 “直接接触” ( 即物理接触 )。
或者， 在另一实施方案中， 使用所述作物植物与所述化合物或组合物之间的 “间接 接触” ， 其中首先将所述组合物或化合物与支持物 ( 或运载体 ) 材料接触， 然后将所述支持 材料 ( 包含所述化合物或组合物 ) 置于一株或多株植物或植物部分之上或附近 ( 例如行 间， 植物之间或者植物生长或将要生长的土壤之中 / 之上 )。
在宿主作物上或附近施加所述驱除剂的最佳位置以及施加频率取决于多种因素， 例如作物的种植结构 (architecture) 和生理状况、 作物的年龄、 制剂、 区域中的昆虫害虫 侵染等。对于很快挥发的制剂来说， 可能需要更频繁的施加， 以有效驱除靶标昆虫害虫 ( 例 如粉虱 )。 类似地， 在降雨很充沛的区域， 地上施加可能很快被冲走， 因而需要一次或多次额 外的施加或者更短的施加间隔。 本领域技术人员可容易地确定充分减少侵染的最佳施用频 率。 因此， 可以每天、 每周或每月施用一次或多次， 或者甚至低至每个作物生长季 1、 2、 3或4 次。在一个实施方案中， 包含本发明一种或多种驱除剂化合物的组合物还可在播种前或作 物种植前施加于作物将要生长的区域， 从而在出现幼苗前就已经减少了侵染。
因此， 合适的施用频率可以是例如在种植与收获作物之间 1、 2、 3、 4 或更多次。所 述作物可以生长于封闭环境 ( 例如温室或大棚 )、 半封闭环境 ( 例如由帆布遮盖的田间作 物 ) 或者开放环境中。得益于本发明引诱剂和 / 或驱除剂组合物的作物显然是易受所述昆 虫害虫影响的天然宿主， 所述昆虫害虫的行为被本文所述的化合物和组合物改变。因此， 在一个实施方案中， 所述作物植物是吸汁昆虫 ( 特别是粉虱 ) 的宿主植物物种。温室粉虱 (Trialeurodes vaporariorum) 具有非常广泛的宿主物种范围， 例如大多数植物物种和观 赏性物种。银叶粉虱和甘薯粉虱 (Bemisia argentifolii 和 B.tabaci) 也具有非常广泛的 宿主范围， 包括大多数植物物种。
在一个优选的实施方案中， 所述作物植物是番茄植物， 优选栽培的番茄。 所述作物 植物也可以是经遗传修饰的植物， 即转基因或顺化基因 (cisgenic) 植物， 包括例如除草剂 抗性基因。
由于减少了经处理作物中吸汁害虫成虫 ( 例如粉虱 ) 以及植物组织探查， 因而施 用包含所述驱除剂的组合物优选地显著降低病毒传播。 因此， 与未处理作物相比， 经处理作 物中病毒传播的显著降低也可用作对所述处理效果的度量。或者， 可对靶标昆虫 ( 例如粉 虱 ) 的数目进行计数 / 估计， 或者可以对经处理和未处理作物之间的作物产量和 / 或品质 进行比较， 以确定本发明任意组合物的最有效剂量和施加方案。
不需要向同一作物施加两次或更多次同样的驱除剂组合物， 但是也考虑到处理的 变动以及处理的组合。例如， 用包含所述 7 种驱除剂之一 ( 或由其组成 ) 的组合物进行处 理可改为用包含所述 7 种驱除剂化合物另外任一种 ( 或由其组成 ) 的组合物进行处理， 或 者与其组合。类似地， 用包含所述 7 种驱除剂之两种 ( 或由其组成 ) 的组合物进行处理可改为用包含所述 7 种驱除剂化合物另外任一种的组合物或者由两种其它驱除剂化合物组 成的组合物等进行处理， 或者与其组合。因此， 在步骤 (a) 中， 还可提供继而可同时或先后 施加到步骤 (b) 中的几种不同组合物。
类似地， (a) 中提供的活性成分与 (b) 中施加的活性成分的制剂和 / 或浓度不必 相同。 例如， 可以在作物的整个生长季节增加或减少所述活性成分的浓度， 这例如取决于昆 虫害虫 ( 例如粉虱 ) 的侵染或其预警。
然而， 在一个实施方案中， (a) 中提供的活性成分和 (b) 中施加的活性成分的化学 性质相同， 并且还优选采用同样的制剂和 / 或浓度。
在一个优选实施方案中， 所述活性成分在较长的时间内从所述组合物中缓慢释 放。因此， 一种优选制剂是缓慢释放或受控释放制剂。可使用本领域已知的方法来制备 此类制剂， 例如， 对于杀虫剂来说使用 ( 微 ) 胶囊化、 层压条、 聚氯乙烯条、 橡胶丸等方法 或者其它用于缓慢释放和 / 或受控释放的方法。参见例如 Barlow， F(1985， Chemistry and formulation.In ： Pesticide Application ： Principles and Practice.Ed ： P T Haskell.OxfordScience Publications ： Oxford.1-34 页 ) ； Dent， D R(1995， Integrated PestManagement.Chapman&Hall ： London， Glasgow， Weinheim， New York， Todyo， Melbourne， Madras) ； Rombke， J&J M Moltmann(1995， AppliedEcotoxicology.Lewis Publishers ： Boca Raton， New York， London， Tokyo) 或者 Ware， G W(1991， Fundamentals of Pesticides.A self-instruction guide.Thomsom Publications ： Fresno USA)。
用驱除剂处理作物可与用引诱剂或诱饵组合物处理所述作物附近的植物或区域 相结合。 或者， 使用引诱剂或诱饵组合物本身就可足以保护作物免受昆虫害虫 ( 例如粉虱 ) 损害， 在这种情形中， 无需对作物本身进行处理。
上述对步骤 (a) 和 (b) 的描述也适用于步骤 (c) 和 (d)， 不同之处在于步骤 (d) 中所述植物不必是所述作物植物， 甚至不必与所述作物植物是同一物种 ( 尽管它们也可以 是 )。所述诱捕植物可以是任意植物物种， 但优选它们是天然易受所述昆虫害虫 ( 例如粉 虱 ) 影响的植物。
所述植物可以生长于所述作物附近， 用以从所述作物处引诱所述昆虫， 从而减少 对所述作物的侵染。例如， 诱捕植物带或边界可以生长在所述作物植物之一个或多个边缘 周围。或者， 作物植物和诱捕植物可以平行的行生长。显然， 也可以将诱捕植物种植在作物 植物内的不同区域， 例如在作物田的中间。
这同样也适用于诱捕材料， 其可以散布在作物田或温室种植的植物附近或之内。 优选地， 所述诱捕植物或诱捕材料足够靠近所述作物植物以引诱粉虱远离该作物植物。所 述诱捕材料可以是添加有本发明组合物的传统昆虫诱捕器。 附图说明
图1：
野生番茄顶空物质对四株栽培番茄 (S.lycopersicum) 植物之设置中一株植物 的处理效果 ( 表示为未处理组的百分比 )。空 ： 空运载体 ； pe ： 含有戊烷 ： 醚的运载体 ； pennelli ： 含有潘那利番茄 (S.pennelli) 整个顶空物质的运载体 ( 经 24 小时收集 ) ； typicum ： 含有多毛番茄 (S.habrochaites f.typicum) 整个顶空物质的运载体 ( 经 24 小时收集 )。短线代表 3 次实验的平均值 (±SE)。
图2：
挥发性化合物 ( 或混合物 ) 对四株栽培番茄 (S.lycopersicum) 之设置中一株植 物的处理效果 ( 表示为未处理组的百分比 )。A) 用对伞花烃处理 ； B) 用 γ- 松油烯处理 ； C) 用 β- 月桂烯处理 ； D) 用对伞花烃、 γ- 松油烯和 β- 月桂烯的混合物处理 ； E) 用 α- 松 油烯处理 ； F) 用 α- 水芹烯处理 ； G) 用表姜烯处理 ； H) 用 S- 姜黄烯处理 ； I) 用姜烯处理 ； J) 用 R- 姜黄烯处理。短线是 8 次实验的平均值 (±SE)。nt ： 未添加挥发性物质的组中的 植物。
图3：
72 个 渐 渗 系 (introgression-lines)(S.lycopersicum cv Moneyberg×S. pennelli LA716)( 浅色柱 ) 与双亲 ( 深色柱 ； 分别为 Moneyberg 和 LA716) 相比的针对烟 粉虱的相对引诱性 (％ )。n ＝ 3±SE。
以下非限制性实施例举例说明了本发明的不同实施方案。 除非在实施例中另有指 明， 否则使用本领域已知的标准实验方案。
实施例
实施例 1- 番茄顶空挥发性物质以及粉虱偏好
1.1 材料和方法
2005 年 10 月在 Santa Maria del Aguila(Almeria， Spain) 常见的温室中收集烟 粉虱群。通过 PCR 分析鉴定该群体属于 Q 生物型。在人工气候室 (climate chamber) 中利 用混合的番茄和黄瓜植株饲养该群体 (28℃， 16 小时光照 )。 在自由选择生物测定中测试所 述昆虫对特定植物 ( 经处理的或未处理 / 对照处理的 ) 的偏好。
已知粉虱利用视觉线索以及嗅觉来找到其宿主植物。本发明人显示， 在将番茄置 于网眼覆盖物之下的 “盲” 测定中， 烟粉虱可忽略视觉线索而使用挥发性物质线索来区分不 同的番茄。
为了测试番茄植物的气味对粉虱之宿主偏好的作用， 将更加具有驱除性 ( 如 本 发 明 人 先 前 所 确 定 的 ) 的 野 生 番 茄 植 物 登 记 株 LA716(S.pennelli)， PI27826(S. habrochaites f.typicum) 和 PI126449(S.habrochaitesf.glabratum) 的 含 信 息 化 学 物质 (semiochemical) 完全混合物的所取顶空物质施加到非驱除性 / 引诱性植物 (cv Moneymaker)。 种 子 获 得 自 1)C.M.Rick Tomato Genetic Resource Center(TGCR)， Department of PlantSciences， University of California-Davis， One Shields Avenue， Davis， CA95616， United States of America， 或者获得自 2)The United StatesDepartment of Agriculture-Agricultural Research Service， Plant GeneticResources Unit， Cornell University， 630 West North Street， Geneva， NY14456， United States of America。
番茄顶空物质取样
通过将三周龄野生番茄植株放置于大型干燥器的人工气候室 (climatised room) 中 24 小时来收集挥发性物质， 其中包括 16 小时的白天。用经碳过滤之加压空气以 400ml/ 分钟向干燥器通风。根据 Kant 等人 (2004)， 利用含有 300mg Tenax 树脂的采样管捕获挥 发性物质。然后， 用 1ml 戊烷∶二乙醚 (4 ∶ 1) 将挥发性物质从 Tenax 上洗脱下来， 其中包含 BA 作为内标。如下进行鉴定 ： 将 1μl 洗脱物注射到 50℃下的光学注射端口 (Optic injection port)(ATAS GL International， Zoeterwoude， Nl)， 其以 4℃ / 秒的速率加热到 275℃。分流 0ml 保持 2 分钟， 然后是 25ml/ 分钟。利用毛细管 DB-5 柱 (10×180μm， 膜厚 0.18μm ； Hewlett Packard) 在 40℃下分离化合物 3 分钟， 然后以 30℃ / 分钟升至 250℃， 用氦气作为载气 (carrier gas)。柱流速是 3ml/ 分钟保持 2 分钟， 之后 1.5ml/ 分钟。利用 时间飞行 MS(Leco Pegasus III， St.Joseph， MI， USA) 以 70eV(200℃下的离子源 ) 产生并 收集洗脱化合物的质谱， 其在 1597eV 下具有 90 秒获取时滞， 获取速率为 20 张谱 / 秒。
样品鉴定和定量是基于已知浓度的合成外标 (Fluka， MI， USA)。各番茄登记株测 量 6 次。
另 外， 使 用 1ml 样 品 ( 含 有 番 茄 挥 发 性 物 质 的 戊 烷 - 二 乙 醚 ) 浸 渍 滤 纸 卡 (Whatman， 25mm 直径 ) 以用于使用烟粉虱的生物测定中。
使用烟粉虱和番茄的自由选择生物测定
在温室区室 (28℃， RH 65％ ) 中进行使用烟粉虱的自由选择实验。通过高压钠灯 (Hortilex Schréder SON-T PIA GP 600W) 以 250W/ 平方米的辐射提供光。在使用不同野 生番茄 (LA1777、 LA2560、 GI1560) 和 Moneymaker 栽培番茄的生物测定中比较烟粉虱 Q 生物 型 (Almeria 群 ) 和 B 生物型 (labculture Netherlands) 的行为偏好。将植物置于塑料覆 盖的装满土壤的木盘内 (170×100×20cm)， 彼此间距相等。捕获两百只粉虱成虫， 置于 4℃ 下 5 分钟， 然后释放到所述设置中。释放后 10 分钟和 20 分钟， 记录每株植物上的粉虱数。 由于未发现烟粉虱 B 生物型和 Q 生物型之间的行为差异， 因此用 Almeria(Q) 群进行所有另 外的生物测定。
对于使用顶空物质 ( 总顶空物质或单一化合物 ) 的生物测定， 将四株盆栽番茄 (S.esculentum cv Moneymaker) 以 50cm 的间距置于正方形设置中。 释放 150 只成体粉虱， 如上所述进行记录。为了测试所选顶空物质组分对驱除性的作用， 将合成标准 (FLUKA) 施 加于 10 个滤纸盘 (Whatman， 25mm 直径 ) 或 10 个橡胶隔板 (Sigma Aldrich， Z167258)。加 样之前， 将隔板置于 CH2Cl2 24 小时， 风干 3 天 (Heath 等， 1986)。使用金属丝将含有挥发性 物质的该纸盘或隔板附着于四株植物之一。使经处理番茄的位置随机化。将所述挥发性物 质置于植物上五分钟后， 释放粉虱。 对于每种组分， 进行至少 8 次复制。 进行处理， 其中化合 物总是施加到同一植物上， 而将空运载体施加于另外 3 株植物上。在用挥发性物质进行每 个测定之前， 对 4 株植物在相同的位置进行了非处理实验， 以使得在相同背景中进行比较。
1.2 结果
结果在图 1 中显示。这些测定显示， 当将形成更具驱除性之番茄登记株的气味的 总顶空物质组分施加到所述番茄栽培品种 Moneymaker 的顶空物质时， 相比于其背景气味， 其可降低引诱性最多达 60％。戊烷 - 醚 ( 在其中洗脱顶空物质的溶剂 ) 显示对驱除性 / 引 诱性没有任何作用。
实施例 2- 涉及烟粉虱驱除性的顶空物质组分的测定
2.1 材料和方法
将总共 16 种野生型和 5 种栽培番茄放在一起 ( 表 4)。对于这些栽培品种中的每 一种来说， 在开放温室中的自由选择生物测定里， 在随机化六边形设置中确定粉虱驱除性 水平。在每个实验中， 将 300 只新的幼稚成体粉虱 (Almeria 群 ) 释放到 6 种随机选择的植物中间， 释放二十分钟后， 对每种植物上的粉虱数进行计数。每种设置重复 3 次， 然后用两 种新的测试植物取代驱除性最低的两种植物。 逐步的依次测试最终得到具有明显的差异驱 除性的 7 级排名 ( 表 4)。
收集 16 种野生型番茄和 5 种栽培番茄 ( 表 4) 的顶空物质。将未受干扰的 3 周龄 番茄植株转移到 40L 干燥器。 在包括 16 小时光周期的 24 小时中， 通过如上所述截留挥发性 组分来对顶空物质取样。对每一种番茄登记株， GC-MS 分析得到独特的挥发性组分 “指纹” 。 每个登记株取样 6 次。
2.2 统计分析
在统计分析中， 将所鉴定的番茄顶空物质组分与生物测定中所测量的粉虱驱除性 排名之间建立关联。 使用两种方法——逐步线性回归分析和 MANOVA( 多变量方差分析 )， 鉴 定了 8 种与粉虱驱除性相关的挥发性物质， 而另外 24 种挥发性化合物由于与驱除性或引诱 性无关而排除。
2.3 结果
表 4.16 种野生番茄和 5 种栽培番茄登记株对烟粉虱的驱除性排名， 分 1-7 级， 其 中 1 代表最高驱除性， 7 代表最低驱除性 / 最高引诱性。
从表 4 中可见， 栽培番茄 (cv) 的顶空物质对于粉虱是最弱的驱除剂 / 最强的引诱 剂， 而野生番茄登记株的顶空物质更具有驱除性。
鉴定造成粉虱驱除性或引诱性的化合物并示于表 5 中。β- 月桂烯、 对伞花烃、 α- 水芹烯、 α- 松油烯和 γ- 松油烯是与潘那利番茄 (S.pennelli) 相关的驱除剂化合物， 而 S- 姜黄烯和 7- 表姜烯显示造成多毛番茄 (S.Habrochaites)( 先前称为 typicum) 更不 具有引诱性。β- 月桂烯、 柠檬烯和 2- 蒈烯与更具有引诱性的栽培番茄 (S.lycopersicum) 植物显著相关。
表 5. 经鉴定的与烟粉虱驱除性和引诱性相关的信息化学物质。对选择测定中的 烟粉虱行为以及烟粉虱触角对多种信息化学植物之应答 (mV) 的作用显著性。
表 1. 基 于 对 粉 虱 的 相 对 驱 除 性 进 行 排 名 的 野 生 番 茄 登 记 株 ( 潘 那 利 番 茄 (S.pennelli)、 多毛番茄 (S.habrochaites) 和秘鲁番茄 (S.peruvianum) 以及栽培番茄 (S.lycopersicum)。1 ＝最高驱除性， 7 ＝最低驱除性。与在所有登记株中均存在的石竹烯 相比， 野生番茄和栽培番茄释放的与驱除性相关的信息化学物质 (μg 24h-1`10g-1FW)。数 值表示平均值 (±SE)(n ＝ 6)。
实施例 3- 使用所选组分和这些组分的混合物进行的生物测定 3.1 材料和方法β- 水芹烯、 姜烯和姜黄烯没有市售的， 因此必须进行合成。 姜烯和 R- 姜黄烯从姜 油分离， 7- 表姜烯和 S- 姜黄烯来自多毛番茄 (S.Habrochaites， PI27826) 叶材料， 其根据 Millar(1998， J.Nat.Prod 61， 1025)。
在自由选择测定中， 研究烟粉虱在顶空物质经操作和未经操作的情况下的宿主偏 好。在每种设置中， 如上所述测试四种栽培番茄 (cv.Moneymaker)。对于使用挥发性物质 的生物测定来说， 用 CH2Cl2 提取橡胶隔板 (SigmaAldrich Z167258)24 小时， 风干 3 天。在 100μl 己烷中将所期望之挥发性物质混合物添加到橡胶隔板。 如上所述进行使用纯组分或 者纯组分混合物的生物测定。
3.2 结果
为了确定地证实 7 种候选组分与烟粉虱行为之间的相关性， 在使用纯组分的生物 测定中测定宿主偏好。如上所述， 向滤纸片上的 Moneymaker 背景添加所期望的纯的挥发性 化学物质 ( 混合物 )。在没有外源挥发性物质时， 四株 Moneymaker 植株的每一株上重新捕 获的烟粉虱的百分比没有显著偏离预期的 25％ ( 数据未显示 )。 但是， 当用 10μg 对伞花烃 处理植株之一时， 与未处理设置中的相同植株相比， 前者的引诱力水平显著降低。 到达经处 理植株的粉虱百分比平均下降 44％ (p ＜ 0.001)( 图 2A)， 而未处理的植株上拥有数量增加 的烟粉虱。 一般说来， 当合成组分具有对烟粉虱的驱除作用时， 带有空运载体的植株就会变 得更加具有引诱力 ( 图 2)。 向 Moneymaker 背景施加松油烯显示改善了驱除性， 然而没有显 著的行为影响 (p ＝ 0.102)( 图 2B)。 为了评估这三种组分的总和是否会产生比单独的对伞 花烃更大的作用， 测试对伞花烃∶ γ- 松油烯∶ β- 月桂烯的混合物 ( 其与 LA2560 登记株 中发现的比例相同 (1 ∶ 12 ∶ 3))。这使得到达植株平均减少 45％ (p ＜ 0.001)( 图 2D)。 来自渐渗系分析 (introgression-line analysis) 的另外单萜—— α- 水芹烯和 α- 松油 烯都显著降低了番茄引诱性 ( 分别为 p ＝ 0.030 和 0.014)( 图 2E、 F)。最后， 所测试的两种 倍半萜——番茄来源的表姜烯及其氧化产物 S- 姜黄烯也具有明显的驱除作用 (p ＜ 0.001) ( 图 2G、 H)。
实施例 4- 将番茄挥发性物质与烟粉虱应答直接相关联
使用触角电位测量系统 (electroantennography， EAG) 来验证触角对在石蜡油 -3 (Uvasol， Merck) 中以 10 稀释的所述化学物质的应答。用 100μl 标准稀释物或仅用石蜡 油 ( 对照 ) 浸湿小片滤纸 (2cm2 ； Schleicher&Schuell， Dassel， Germany)。 将滤纸插入 10ml 玻璃注射器 (Poulten&GrafGmbH， Wertheim， Germany)。通过用 5ml 空气吹动触角提供可重 现的刺激 (Schutz 等， 1999)。对每个标准 (10-3) 稀释物记录 EAG 应答。对石蜡油的应答作 为阴性对照， 并且从所有报告的 EAG 测量值中被减去。针对不同纯化学物质的表示为跨电 极电势差 (mV) 的 EAG 应答在表 5 的右栏中给出。
实施例 5- 渐渗文库 (introgression library) 中的生物测定
由于在潘那利番茄登记株中发现令人感兴趣的驱除性水平， 因此随后在生物测定 中筛选渐渗文库 ( 亲本 S.pennelli LA716×S.lycopersicum cvMoneyberg)( 图 3)。选择 与易受影响之亲本相比引诱性显著降低的若干株系。鉴定这些所选株系以及 Moneyberg 亲 本的顶空物质组合物。与 Moneyberg 顶空物质相比， 所选株系中 α- 水芹烯、 α- 松油烯和 对伞花烃的浓度显著较高。